Разработка иммуноферментной тест-системы для контроля содержания глютена в пищевой продукции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Шаталова Александрина Сергеевна

• Шаталова Александрина Сергеевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Шаталова Александрина Сергеевна

SYNOPSIS

Введение

1. СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПО КОНТРОЛЮ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮТЕНА

1.1 ГЛИАДИН

1.2 ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С ГЛЮТЕНОМ

1.3 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ БЕЗГЛЮТЕНОВОЙ ПРОДУКЦИИ

1.4 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты

2.2 Методы исследования

2.2.1 Экстракция белков-мишеней

2.2.2 Пр оизв одств о антител

2.2.3 Выбор антител

2.2.4 Картирование эпитопа

2.2.5 Предварительная подготовка ИФА тест-системы

2.2.6 Определение характеристик ИФА тест-системы

2.2.7 Количественное определение глютена в проламинах

2.2.8 Оценка специфичности антител с помощью электрофореза и вестерн-блоттинга

2.2.9 MALDI-TOF

2.2.10 Измерение глютена в пищевых продуктах с помощью ИФА

2.2.11 Статистический анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выделение глиадина и гордеина

3.3 Мотив РБР и его значение для распознавания антител

3.4 Специфичность Х6

3.5 ИФА тест-система на основе антитела Х6 подобна стандартам Кодекса Алиментариус

3.6 Установление сопоставимости результатов

3.7 Влияние экстракции на определение содержания глютена

3.8 Определение характеристик полученной методики количественного определения глютена

ВЫВОДЫ

Список литературы

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Список опубликованных работ

Тексты публикаций

Глютен является запасным белком зерен пшеницы, и присутствует в ней в виде двух главных фракций: глютенина - смеси белков, растворимой в щелочах, а также глиадина - спирторастворимой фракции глютена. Глиадины играют основную роль в процессах манифестации целиакии. Белки, гомологичные глиадинам, найдены и в других злаках: в овсе (авенин), ячмене (гордеин), ржи (секалин), и все они обладают способностью запускать процесс целиакии.

В 2000-х были описаны некоторые из иммунодоминантных пептидов глиадина, связанных с индукцией целиакии. В частности, к ним относятся участки а9 - глиадин (57 - 68) ОЬдРЕРдрдЬРУ и а2 - глиадин (62-75) PQPQLPYPQPQLPY. Будучи фрагментами, насыщенными пролином и глутамином, они высокоустойчивы к действию пищеварительных ферментов, что было позже показано в работах другой группы ученых. При проведении экспериментов по т-уйго перевариванию а2 - глиадина, был обнаружен протеолитически устойчивый фрагмент этого белка, состоящий из 33 аминоксилот-33-мер LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF а2-глиадин (фрагмент 57-89). Оба пептида, упомянутые выше, входят в его состав, но при этом сам 33-мер более подвержен дезаминированию тТГ, и соответственно, является наиболее важным триггером воспалительного процесса у больных целиакией.

На сегодняшний день, наиболее эффективным способом профилактики целиакии является безглютеновая диета. Полное исключение глютена и гомологичных белков из рациона питания пациентов приводит к стойкой ремиссии. Поэтому очень важным направлением в пищевом анализе является разработка и развитие методов качественной и количественной детекции глютена и иммуногенных пептидов в пищевых продуктах. Для качественной и количественной оценки содержания глютена в настоящее время разработано множество способов, базирующихся на хроматографии и масс-спектрометрии,

MALDI-TOF, полимеразной цепной реакции. Несмотря на такие достоинства, как высокая чувствительность и специфичность распознавания, данные методы распространены в намного меньшей степени, чем методы иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель и задачи исследования

Цель работы - разработка иммуноферментной тест-системы на глиадин для контроля качества безглютенового сырья, пищевых добавок и продуктов питания. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Синтезировать и выделить моноклональные антитела к глиадину и гордеину и исследовать их на перекрестную реактивность;

2. Обосновать выбор пары антител на глиадин для тест-системы типа «sandwich»;

3. Исследовать эпитопную специфичность антител, образующих пару;

4. Провести валидацию тест-системы на различных пищевых матрицах и подтвердить ее робастность;

5. Определить сопоставимость результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы и имеющихся аналогов;

6. Исследовать влияние параметров экстракции на результаты определения содержания глютена с помощью разработанной тест-системы;

7. Разработать методику количественного определения глютена с помощью предложенной тест-системы;

8. Установить характеристики разработанной методики количественного определения глютена;

9. Разработать инструкцию по применению разработанной тест-системы и метода на её основе для исследования пищевой продукции.

Научная новизна.

С использованием принципов и методов гибридомной технологии получены новые антитела, способные связываться с глиадином и гордеином.

Установлено, что анти-глиадиновое антитело Х6, используемое в разработанной тест-системе, специфично в отношении белков злаков.

Показано, что антитело Х6 не имеет перекрестной реактивности и имеет нулевую или незначительную с белками кукурузы.

Установлено, что для антитела Х6 структурно распознаваемым эпитопом является QXQPFPXP, причем аффинность его сильно зависит от наличия в белке участка PFP, который является наиболее критичным для распознавания антителом.

Установлено, что система на основе антитела Х6 корректно определяет содержание глютена в различных видах пищевых матриц.

Показано, что для тест-системы, основанной на антителе Х6, возможно получение корректных данных по содержанию глютена при стандартной спиртовой экстракции без применения коктейля Мендеса.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Разработана первая отечественная иммуноферментная тест-система для определения содержания глютена в пищевых продуктах.

Обоснована положительная корреляция между данными, получаемыми с помощью разработанной тест-системы и с помощью референсных тест-систем, в том числе одобренных комиссией организации Кодекс Алиментариус.

Подтверждена возможность использования разработанной системы в качестве метода исследования глютена в пищевой продукции, а также в смывах с оборудования и рабочих поверхностей.

В выпускаемую компанией ООО «ХЕМА» аналитическую продукцию внедрена отечественная методика определения глютена во всех видах пищевых матриц.

Подтверждено уменьшение стоимости анализа за счет использования стандартной этаноловой экстракции без применения коктейля Мендеса.

Разработаны протоколы исследования сырья для производства безглютеновой продукции.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты взаимодействия полученных антител с белками ячменя и ржи, а также с 26-мерным и 33-мерным глиадином;

- Данные об эпитопной специфичности антитела Х6, на основе которого разработана новая тест-система;

- Данные о сопоставимости результатов, полученных при помощи разработанной тест-системы и существующего зарубежного аналога, одобренного комиссией Кодекса Алиментариус;

- Экспериментальные данные по содержанию глютена в различных пищевых матрицах;

- Данные о влиянии параметров экстракции на результаты количественного анализа содержания глютена с применением антител Х6.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментной тест-системы для контроля содержания глютена в пищевой продукции»

Апробация работы.

Результаты научной работы представлены и обсуждены на VI Международной научно-практической конференции «Инновационные пищевые технологии в области хранения и переработки сельскохозяйственного сырья: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Краснодар, 2016), XVI Всероссийского конгреса нутрициологов и диетологов с международным участием, посвященного 100-летию со дня рождения основателя отечественной нутрициологии А.А.Покровского «Фундаментальные и прикладные аспекты нутрициологии и диетологии. Качество пищи» (2016), пятидесятой научной и учебно-методической конференции Университета ИТМО (2021), Х конгрессе молодых ученых (2021), а также представлялась на международных выставках LABCompIEX, Киев (2017), World Forum For Medica (Дюсельдорф, 2018 и 2019), Annual Scientific Meeting & Clinical Lab Expo CACLP (Нанчанг, 2018).

Публикации.

Основное содержание научно-исследовательской работы (диссертации) опубликовано в 10 статьях, из них 2 публикации в изданиях, рецензируемых Web of Science или Scopus, 2 публикации в журналах из перечня ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, состояния проблемы (аналитического обзора литературы), экспериментальной части, выводов, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 22 рисунка. Библиография представлена 82 источниками, в том числе 77 зарубежных авторов, количество приложений 5.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлены, обобщены и проанализированы данные по влиянию глютена в различных видах продукции на восприимчивых людей. В обзоре показаны основные источники глютена, болезни, которые им вызываются, приведена современная классификация методов обнаружения глиадина в пищевых продуктах и на рабочих поверхностях, описаны возможные доступные заменители без глютена.

На основании анализа и обобщения информации аналитического обзора литературы обоснованы и сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

Во второй главе описывается порядок проведения исследования и используемые методы.

Эксперимент проводился в два этапа. Первый этап включал в себя получение моноклональных антител, подбор пар и проверку полученных пар на кросс-реактивность с другими белками и чувствительность.

Для получения моноклональных антител использовались методы и протоколы гибридомной технологии.

Согласно принципам гибридомной технологии для иммунизации необходимо было получить белки-мишени - глиадин и гордеин методом этаноловой экстракции.

Для тестирования полученных клонов использовался метод непрямого иммуноферментного анализа для оценки взаимодействия их с иммуногеном и кросс-реактивными белками других зерен.

Для выведения моноклонов использовался метод минимальных разведений.

Для выделения и очистки моноклональных антител из асцитических жидкостей использовались методы аффинной хроматографии на протеине G-сефарозе (подклассы IgG) (GE Healthcare, Упсала, Швеция) или аффинной сорбенте с протеином L (подкласс IgM) (TosohBioscience, Токио, Япония) согласно инструкциям производителя.

Для установления способности полученных моноклональных антител связываться с 26-мерным и 33-мерным глиадином, а также с белками ячменя и ржи использовался метод непрямого иммуноферментного анализа.

Для создания иммуноферментной тест-системы все антитела были помечены пероксидазой хрена (ПХ) с использованием процедуры окисления периодатом натрия.

Для выбора пары для создания новой антиглиадиновой тест-системы использовался метод иммуноферментного анализа типа «сэндвич».

На втором этапе полученную иммуноферментную тест-систему охарактеризовали, валидировали относительно различных видов продукции для проверки работоспособности системы, а также сравнивали уже с существующими

аналогами для демонстрации сопоставимости результатов, используя иммуноферментного анализа типа «сэндвич».

Объектами исследования на втором этапе исследования служили коммерческие образцы продуктов питания. Образцы были разделены на несколько групп: «мука», «выпечка», «снэки», «продукты с высоким содержанием глютена» для валидации разработанной системы относительно референсных. Для установления корреляции между данными, получаемыми различными методами экстракции, и для расширения диапазона пищевых матриц была составлена группа из пищевых продуктов с различными содержанием глютена и из различных категорий: макароны, творожные массы, колбасные изделия, ореховые смеси. Образцы были проэкстрагированы и проанализированы в соответствии со стандартной процедурой, описанной в методах исследования. Все образцы были исследованы в двух повторах.

Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема проведения второго этапа эксперимента.

При проведении исследований были использованы стандартные и современные биотехнологические, микробиологические, молекулярные, биохимические, иммунохимические и протеомные методы исследования клеточных линий-продуцентов антител, различных пищевых матриц, а также

Для расчетов основных характеристик применялись следующие формулы:

1. Предел обнаружения (LOD):

LOD = 0Dq нг/мл + 1,645 х SD0 нг/мл + 1,645 х SDs нг/мл. (1)

где ODoнг/мл и SDoнг/мл- это среднее значение оптической плотности и стандартного отклонения для 20 повторов холостого калибратора (0 - нг/мл глиадина) соответственно; SD5нг/мл- это стандартное отклонение 5 повторов самого низкого калибратора.

2. Предел количественного определения (LOQ) был определен в соответствии с уравнением:

LOQ = ОЯ0нг/мл + Ю X 50онг/мл, (2)

где OD o нг/мл и SD o нг/мл являются средними значениями оптической плотности и стандартного отклонения для 20 повторов холостого калибратора (0 нг/мл глиадина) соответственно.

3. Линейность тест системы рассчитывалась по формуле:

с -С

_ "-ожидаемое "-полученное ^ 100^ (3)

'-полученное

где Сожидаемое и Сполученное - прогнозируемая и полученная концентрация глиадина в образце соответственно.

4. Испытание на извлечение оценивалось по формуле:

Н = [1 — х 100%, (4)

^-полученное J

где Cожидаемое и Cполученное - прогнозируемая и полученная концентрация глиадина в образце соответственно.

Для визуализации использовалась функция boxplot из пакета ggplot языка программирования R. Данные диаграммы или «диаграммы с размахом» используются для оценки разницы между двумя и более группами. Схема построения графиков при помощи данной функции представлено на рисунке 2.

верхний квартиль (0.75 квантиль)

медиана->

нижний квартиль (0.25 квантиль)

Рисунок 2. Схема построения диаграмм c размахом

_ Интерквартильный размах

В R при построении данных диаграмм используются устойчивые оценки центральной тенденции (медиана) и разброса (интерквартильный размах, или ИКР). Верхний «ус» простирается от верхней границы (верхнего квартиля) до наибольшего выборочного значения, находящегося в пределах расстоянии 1,5 интерквартильных размахов от этой границы. Аналогично, для нижнего «уса». Наблюдения, находящиеся за пределами «усов», потенциально могут быть выбросами.

В третьей главе представлены основные результаты работы.

Выделение глиадина и гордеина

Для получения моноклональных антител необходимо было получить белок - мишень. В данном исследовании в качестве белка-мишени выступали глиадин и гордеин. Глиадин выделялся из клейковины, а гордеин выделялся из перемолотого на измельчителе (1500, Борк, Москва, Россия) ячменя методом этаноловой экстракции в соотношении 1:10.

Глиадин: полученная смесь инкубировалась в течение ночи на шейкере для орбитальных колб для лучшей экстракции. После этого суспензия центрифугировалась при 8000 об/мин и температуре центрифугирования 25 °С в течение 30 минут. Полученный супернатант отбирался и инкубировался в течение 12 ч при температуре - 20 °С. После инкубации он центрифугировался при 8000 об/мин центрифугирования 25 °С в течение 30 минут. Полученный осадок растворяли в небольшом объеме 70% этанола при постоянном встряхивании. После растворения осадка, полученную смесь вновь центрифугировали при 8000 об/мин и температуре центрифугирования 25 °С в течение 30 минут для удаления нерастворившихся частиц. Полученный супернатант анализировали при помощи электрофореза.

Гордеин: полученная смесь инкубировалась в течение ночи на шейкере для орбитальных колб для лучшей экстракции. После этого суспензия центрифугировалась при 8000 об/мин и температуре центрифугирования 25 °С в течение 30 минут. Полученный супернатант отбирался, анализировался при помощи электрофореза и использовался для иммунизации животных.

Выведение линий, производящих антитела

Полученные клоны в процессе гибридизации тестировались методом непрямого иммуноферментного анализа на иммуногене: ХН - на гордеине, полученном методом спиртовой экстракции из местных сортов Hordeum vulgare, X/XGY - на глиадине, полученном методом спиртовой экстракции из местных сортов Triticum aestivum, а также на перекрестных белках других злаковых культур, отличных от целевого антигена, полученных тем же методом экстракции, что и иммуноген. Анализ проводился с использованием в качестве положительного контроля крови иммунизированных животных, а в качестве отрицательного контроля - среды, на которой выращивались клоны. По полученным данным, представленным в приложении 2, из двух скринингов отбирались клоны с наилучшим соотношением сигнал/фон, причем, предпочтение отдавалось клонам, у которых наблюдался рост сигнала, и проводилось их клонирование до получения моноклонов, представленных на рисунке 3.

Рисунок 3. Фото двух из полученных моноклонов с увеличением микроскопа

100Х.

Полученные в гибридизациях клоны с высокими сигналами и отсутствием перекрестной реактивности, были в дальнейшем доведены до моноклональности и привиты мышам для получения асцитических жидкостей, с целью их дальнейшей очистки с помощью аффинной хроматографии.

Далее, полученные после очистки антитела проверялись на способность связываться с 26-мерным или 33-мерным глиадинами, которые, как известно, участвуют в манифестации целиакии, Для этого на планшеты с сорбированными 26- мером и 33-мером, а также с белком-носителем в качестве контроля, наносили антитела, растворенные в буфере для ИФА в концентрации 5 мкг/мл в буфере. Реакция протекала при 37 °С в течение 30 мин, после инкубации планшеты промывались 3 раза промывочным буфером. Затем, раствор антимышиного конъюгата, растворенного в буфере для ИФА добавляли в лунки по 100 мкл/лунку, и планшет оставляли при 37 °C на 30 мин. После этого производили 5-кратную промывку, тщательно вытряхивали жидкость из планшета. Затем в лунки планшета добавляли раствор субстрата в количестве 100 мкл/лунку. Инкубировали планшет в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,5М серной кислоты, и оптическую плотность в лунках измеряли при 450 нм спектрофотометрически (Epoch, BioTek, Winooski, VT, US). Полученные результаты представлены в таблице 1.

Название Изотип Реакция Реакция с Реакция с 26-мер 33-мер Контроль

клона с зеином гордеином секалином гамма-глиадин 0051) альфа-глиадин 0052) белка-носителя (2еёиа 0055)

Х0У1 1^01 - +++ +++ ++ - -

Х0У2 ^02а +/- +/- - КА КА КА

Х0У3 - + - КА КА КА

Х4 +/- +++ +++ +++ ++ -

Х0У5 1^01 - + + ++ - -

Х6 1801 +/- ++ ++ ++++ + -

Х0У7 1^01 - + + - - -

Х0У8 1^01 - + - КА КА КА

Х0У9 1^01 +/- ++ ++ - - -

Х10 1801 - ++ ++ ++ ++ -

Х0У11 1^01 - + - КА КА КА

Х0У12 1^01 - ++ - КА КА КА

Х0У13 ++ + + КА КА КА

Х0У14 1^01 - ++ - КА КА КА

Х0У15 1^01 - + - КА КА КА

Х0У16 1^01 + ++ - КА КА КА

Х0У17 1^01 + + - КА КА КА

Х0У18 1^01 - + + - - -

Х0У19 1^01 ++ ++ ++ КА КА КА

ХОУ20 1^01 +/- ++ ++ + - -

Х0У22 1^М - ++ ++ КА КА КА

Х0У24 1^01 +/- +++ ++ - - -

Х0У21 1^01 - - - -

ХОУ23 1^01 ++ + - - -

Х0У25 - КА КА КА

Х0У26 ^02Ь - ++ ++ ++ - -

ХН1 1^01 - +++ ++ - - -

ХН4 1^01 - +++ ++ - - -

* + ++ +++ ++++

Б/К

>5

>10

>15

>20

Мотив PFP и его значение для распознавания антител

Для установления специфичности паратопа антитела необходимо выяснить эпитоп глиадина, с которым он связывается.

При выборе антител для эксперимента были использованы данные о связывании анти-глиадиновых антител с белками других зерен. Для определения способности связываться с 26-мерным и 33-мерным глиадином были выбраны только антитела класса IgG, которые распознают белки ячменя и ржи и не имеют перекрестной реактивности или имеют незначительную ее с белками кукурузы. После проведения реакции с пептидами были отобраны три антитела, X4, Х6, Х10, поскольку они могут распознавать оба иммуногенных пептида и удовлетворять критериям, описанным выше. Список характеристик антител, использованных в эксперименте, приведен в приложении 3. Отобранные mAb использовались для создания тест-системы ИФА типа «сэндвич». Данные (ОП и отношения сигнал/шум) представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Оптическая плотность и отношение S/N для различных пар антител

Верхнее антитело Нижнее антитело Концентрация глиадина, нг/мл

Х4 X6 X10

Х4 0,756 0,756 0,128 0,124 0,314 0,332 0

1,009 1,029 0,777 0,779 0,924 0.964 20

S/N 1,35 6,22 2,81

Х6 0,238 0,257 0,098 0,101 0,156 0,167 0

0,969 0,908 1,197 1,194 0,685 0,732 20

S/N 3,79 12,02 4,39

Х10 0,545 0,598 0,646 0,656 0,558 0,448 0

0,99 0,948 1,129 1,029 1 0,943 20

S/N 1,7 1,66 1,86

В результате было обнаружено, что наилучшее соотношение сигнал/шум было получено для пары Х6/Х6-ПХ, и провели дальнейшие исследования только с этим антителом.

Основываясь на аминокислотной структуре, было обнаружено, что оба пептида содержат повторяющийся фрагмент - QPFPQ. Таким образом, можно предположить, что это часть эпитопа.

Для последующего картирования пептида был выбран более короткий пептид, содержащий указанный мотив - QLQPFPQPQLPY. Посредством внесения аминокислотных замен в каждой из 12 позиций был получен чип, содержащий образованные пептиды (N total = 720). Результаты взаимодействия антитела X6 с полученным набором пептидов представлены на рисунке 4.

Рисунок 4. Тепловая карта реактивности антитела Х6 с исследуемым набором пептидов. Интенсивность окраски пропорциональна интенсивности связывания антитела с конкретным пептидом

Установлено, что внесение замен в определенных позициях приводит как к снижению распознавания полученных пептидов антителом (например, позиции 46), так и увеличению аффинности к данному пептиду (позиция 2), однако в последнем случае наблюдается строгая зависимость от конкретной аминокислоты, на которую происходит замена. В результате визуального анализа тепловой карты можно предположить, что эпитоп для исследуемого антитела

заключен между позициями 1-8, в то время как позиции 9-12 не влияют на распознавание антителом.

На рисунках 5 и 6 представлены результаты сравнения отклонения в связывании с пептидами при внесении замены в определенные позиции. Было установлено, что к наибольшему снижению интенсивности связывания антитела с пептидом приводят аминокислотные замены в позициях 4-6. В этом случае наблюдается практически полная потеря аффинности антитела к полученным пептидам. Стоит отметить, что замены в позициях 1, 3 и 8 также, приводят к, практически, 4-х кратному снижению интенсивности связывания антитела с такими пептидами. В этом случае позиция №1 является более чувствительной, поскольку замены в ней чаще приводят к 75% снижению аффинности в 16 случаях из 19, в то время как сродство антитела при заменах в позициях 3 и 8 снижается также в 13 и 14 случаях из 19, соответственно.

Рисунок 5. Количественное изменение связывания антитела с пептидом QLQPFPQPQLPY при внесении аминокислотных замен: процент отклонения аффинности от исходного пептида.

Позиция

Рисунок 6. Количество вариантов замены аминокислоты в пептиде, приводящее к 75% снижению аффинности антитела к нему.

Исходя из представленных данных, можно установить, что искомый эпитоп представляет собой пептид QXQPFPXP, причем участок PFP является критическим для распознавания антителом.

Специфичность Х6

Для определения специфичности антитела были получены экстракты из Triticum urartu, T. turgidum, T. aestivum, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Dasypyrum villosum, Zea mays и Setaria italica. Хорошо известно, что первые 5 представителей злаковых культур вовлечены в манифестацию целиакии. Площадь и интенсивность полос варьируются у разных видов злаковых, что может быть объяснено гетерогенностью белка (рисунок 7).

*

Рисунок 7. Электрофорез различных проламинов: 1-Triticum urartu, 2-Triticum turgidum, 3-Triticum aestivum, 4-Secale cereale, 5-Hordeum vulgare, 6-маркер молекулярного веса, 7-Avena sativa, 8-Zea mays, 9-Dasypyrum villosum, 10-Setaria italica

После завершения электрофореза гели замачивали в буфере для переноса переносили на PVDF-мембрану с использованием полусухой системы переноса. Далее проводили реакцию с меченым антителом, которое участвует в создании пары Х6/X6-ПХ, и после проведения анализа, получили следующие данные, представленные на рисунке 8.

Рисунок 8. Вестерн-блоттинг: 1-Triticum urartu, 2-Triticum turgidum, 3-Triticum aestivum, 4-Secale cereale, 5-Hordeum vulgare, 6-маркер молекулярного веса, 7-Avena sativa, 8-Zea mays, 9-Dasypyrum villosum, 10-Setaria italica.

При изучении белковой специфичности посредством иммуноблоттинга было установлено, что данное антитело способно связываться с проламинами Triticum urartu, T. turgidum, T. aestivum, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, но не распознает проламины Zea mays и Setaria italica.

Что касается D. villosum, по данным GenBank, последовательность а-глиадина D. villosum (AIY27554.1) содержит повторяющийся мотив QPQPFP, с которым, очевидно, и происходит связывание.

В ходе исследования специфичности методом иммунноблотинга установлено, что все белки злаков, имеющие последовательность варианты эпитопа QXQPFPXP, способны распознаваться антителом X6, причем одновременное присутствие Q^ P8 для распознавания не обязательно. С другой стороны, последовательность авенина не содержит участок PFP, отсутствие которого, как было отмечено выше, является критическим для распознавания антителом. Такое положение приводит к низкой аффинности антитела к этому белку, что отмечено в таблице 3, где приведены измеренные концентрации мг/кг для препаратов различных проламинов в концентрации 1 мг/мл.

№ Приближенность и молекулярный вес Белок Участок (КСБ1 данные) ОХОРБРХР варианты

1 37 у-глиадин ЛСТ03501.1 ОРЕРОР

2 36 у-глидаин ЛС103444.1 ОРРРОР

3 45 НМ-глютенин СЛБ61021.1 ОРОРЕРО

4 36 у-глиадин ОБИ60939.1 ОРЕРОР РООРЕР

5 45 НМ-глютенин ЛЛУ91998.1 ООРЕРО

6 70 75К-секалин ЛБР95485.1 РООРЕРО ОРЕРОР

7 38 у-гордеин СЛЕ45747.1 РООРЕР ОРЕРОР

8 39 Авенин СБЬ51496.1 ОЕОРЕУ ОООРЕУ

Концентрация глютена в экстракте из овса более чем в 900 раз ниже, чем концентрация глютена, определенная в экстрактах пшеницы, ржи и ячменя, согласно результатам, полученным с помощью тест-системы на основе антител Х6. Можно объяснить это наблюдение более низкой специфичностью антител к авенину по сравнению с другими проламинами.

Таблица 4 - Содержание глиадина в этаноловых экстрактах различных злаков (нг/кг)

Белок Источник Концентрация белка, мг/мл Нг/мл

Глиадин ТгШсита еБйуит 1 124654,1

Авенин Луепа Байуа 1 113,5

Гордеин Иогёеит уи^аге 1 141809,8

Секалин Беса1е сегеа1е 1 105209,2

ИФА тест-система на основе антитела Х6 подобна стандартам Кодекса Алиментариус

Иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее распространённым скринниговым средством, с помощью которого можно определить наличие глютена в продуктах питания. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Это обусловлено как высокой аффинностью взаимодействия

«антиген-антитело», так и особенностями конкретного аналитического метода, применяемого для анализа. На сегодняшний день «безглютеновыми» продуктами принято считать те, что содержат не более 20 мг/кг глютена в своем составе. То есть, во избежание получения недостоверных результатов тест-системы, использующиеся для анализа пищевых продуктов, должны быть тщательно откалиброваны в диапазоне до 20 мг/кг.

В данном исследовании была разработана иммуноферментная тест-система типа «сэндвич». Калибровочные пробы были приготовлены с использованием глиадина («SigmaAldrich») и номинированы относительно тест-системы -стандарта Кодекс Алиментариус, основанной на антителе Я5. Посредством 20 измерений, было обнаружено, что ЬОБ и LOQ соответствуют 2,5 и 5 мг/кг, соответственно. В то же время, линейность и степень извлечения глиадина в различных концентрациях варьировались в пределах 90 - 100%. Из-за большой неоднородности своего состава антитела способны распознавать различные образцы, содержащие глютен, по-разному в зависимости от используемого метода. Чтобы оценить правильность определения содержания глютена в пищевых продуктах, была проведена перекрестную валидацию между системой на основе антител Х6, Я5 и 012. По типу продуктов в наборе присутствовали три группы: выпечка (таблица 5), снэки (таблица 6), мука (таблица 7). Также были рассмотрены продукты с высоким содержанием глютена (таблица 8), чтобы оценить поведение тест-системы при высокой концентрации аналита, а также качество ответа ИФА на его разбавление. Результаты представлены на рисунках 9, 10, 11, 12.

Название Производитель 012, мг/кг Х6, мг/кг Я5, мг/кг

ЛМ1 ООО «Агродар БСК» 1,955 8,8112 8,197

#51023 ХЕМЛ

10,267 12,884 17,242

АМ2 МАСЛЯНЫЙ король

31,24 41,256 48,964

#51113 ВКУСВИЛЛ

5,947 7,0432 11,761

ПЕЧЕНЬЕ ХЕМА

КОКОСОВОЕ 1802

0,694 0,01 0,278

КОКОСОВОЕ ХЕМА

ПЕЧЕНЬЕ 2503

1,61 1,2448 0,567

ХЛЕБ ХЕМА

12,139 1,8776 1,018

ПЕЧЕНЬЕ (КИЕВ) ХЕМА

18,542 14,7336 20,223

0 МГ/КГ

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 6,452 6,8512 6,62

0 МГ/КГ

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 0,628 1,7216 0,963

5 МГ/КГ

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 5,384 5,3512 4,212

5 МГ/КГ

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 1,845 2,496 1,439

20 МГ/КГ

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 8,713 9,8616 9,084

20 МГ/КГ

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 9,54 8,5816 7,495

50 МГ/КГ

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 14,023 17,8648 16,257

50 МГ/КГ

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 13,882 17,416 17,891

Рисунок 9. Количественное определение глютена тест-системами, основанными на антителах 012, Х6 и Я5 в различных видах выпечки

При количественном определении глютена в пищевых продуктах, относящихся к группе «выпечка», большинство образцов представляли собой безглютеновые продукты (менее 20 мг/кг), в этой группе не наблюдалось значительных отличий при измерении его содержания тремя методами.

Название Производитель G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

ГРЕЧНЕВАЯ МУКА УВЕЛКА 8,835 11,628 14,473

МУКА КОМПАС ЗДОРОВЬЯ

КОНОПЛЯНАЯ

6,736 5,4328 13,082

МУКА РИСОВАЯ ПУДОВЪ

6,547 2,176 5,204

МУКА ЛЬНЯНАЯ ПУДОВЪ 5,902 14,2672 7

МУКА ЛЬНЯНАЯ ХЕМА 4,856 6,424 3,924

МУКА КУДЕСНИЦА

КУКУРУЗНАЯ

2,007 4,0984 2,649

СОЕВЫЙ изолят РШЕРЯОТЕШ

3,36 4,8392 4,607

КСБ КАЛИНИНГРАД 3,547 0,01 9,167

RU02A ООО "ЗИЛАНДИЯ" 1,431 0,01 0,537

RU03A ХЕМА 1,326 2,1832 1,102

РИСОВАЯ МУКА ПУДОВЪ 6,337 1,5472 1,118

COCOCNUT A245 ХЕМА 0,826 0,01 0,01

СОЯ H02 12-7 ХЕМА 0,242 0,4992 0,704

GLYCINE MAX

CRUSHED ХЕМА 1,096 1,748 0,725

МУКА ГРЕЧНЕВАЯ ПУДОВЪ 16,685 18,396 22,546

МУКА ЛЬНЯНАЯ ПУДОВЪ 8,493 19,8032 11,319

С12 Х6 Р5

Рисунок 10. Количественное определение глютена тест-системами, основанными на антителах 012, Х6 и Я5 в различных видах муки.

При количественном определении глютена в пищевых продуктах, относящихся к группе «мука», большинство образцов представляли собой безглютеновые продукты (менее 20 мг/кг), в этой группе не наблюдалось значительных отличий при измерении его содержания тремя методами.

Название Производитель G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

ГРЕЧНЕВЫЕ ВКУСВИЛЛ

ПАЛОЧКИ

3,529 3,536 5,537

ХЛЕБЦЫ ЛЬНЯНЫЕ ВКУСВИЛЛ

"ТАИСКИЕ"

0,306 0,8904 1,891

КУКУРУЗНЫЕ ВКУСВИЛЛ

ХЛЕБЦЫ 7,219 0,01 0,447

КУКУРУЗНЫЕ ВКУСВИЛЛ

ПАЛОЧКИ С

БАНАНОМ 9,725 0,01 1,237

ХЛЕБЦЫ РИСОВЫЕ ПРОДПОСТАВКА 2,198 0,01 0,224

ХЛЕБЦЫ РИСОВЫЕ С DR КОШБЯ

ЛИМОНОМ И

ИМБИРЕМ 4,064 0,01 0,338

ХЛЕБЦЫ ГРЕЧНЕВЫЕ ПРОДПОСТАВКА 0,01 0,2896 0,01

КОРНЕРСЫ С DR ^RNER

ТОМАТАМИ 16,942 0,01 0,108

РИСОВЫЕ DR ^RNER

ХЛЕБЦЫ 1,285 0,01 0,141

ЧИПСЫ ВКУСВИЛЛ

КУКУРУЗНЫЕ С

МОРСКОЙ

капустой 6,406 2,6488 5,485

АМАРАНТ DI&DI

ЗАВТРАК В

ГЛАЗУРИ 10,604 0,9208 3,651

ГРЕЧНЕВЫЕ DR ^RNER

ХЛЕБЦЫ 0,255 0,01 0,759

ХЛЕБЦЫ ЛЬНЯНЫЕ ВКУСВИЛЛ

«МОРСКИЕ» 2,989 7,6712 11,195

КУКУРУЗНЫЕ FIT PARAD

ХЛОПЬЯ 5,729 6,88 5,772

КУКУРУЗНЫЕ FIT PARAD

ХЛОПЬЯ 7,095 9,3072 7,53

КОРНЕРСЫ С DR ^RNER

ЛУКОМ 8,136 0,01 0,1

ФРУСТИКИ ]№Л^&ФИСА

ТЫКВА И

АБРИКОС 16,427 20,4584 24,291

ХЛОПЬЯ ORGANIC

КУКУРУЗНО-

ГРЕЧНЕВЫЕ 56,035 37,2736 45,956

Рисунок 11. Количественное определение глютена тест-системами, основанными на антителах 012, Х6 и Я5 в различных видах снэков.

Несмотря на то, что в группе «снэков» также присутствовали, в основном безглютеновые продукты, было обнаружено значительное различие при количественном определении глютена тест-системами на основе Х6 и 012. При сравнении содержания глютена в различных группах продуктов достоверное отличие установлено только в группе «снэки» между тест-системами на основе 012 и Х6. Данная группа включала, в основном, безглютеновые продукты, соответственно, полученные отличия могут вызваны особенностями калибровки теста в данном диапазоне (до 20 мг/кг), так и результатом слабовыраженного неспецифического связывания с конкретными антителами.

Название Производитель G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

ХЛЕБЦЫ МУЛЬТИЗЛАК ПРОДПОСТАВКА

13186,5 21767,4 19272

ЗАВТРАК МИНДАЛЬ- ROCKET FROM

ТЫКВЕННЫЕ THE POCKET

СЕМЕЧКИ

19087,5 24954 22673,25

ГРАНОЛА GRANOLIFE

МАНГО-АНАНАС

20420,25 29262,6 27107,25

ГРАНОЛА КОКОС- GRANOLIFE

СЕМЕНА ЧИА

17456,25 24816,6 20173,5

МУКА ГОРОХОВАЯ ПУДОВЪ

3908,25 4044 3145,5

ГРАНОЛА GRANOLIFE

КЛУБНИКА-

МАЛИНА

9756,75 11402,4 10499,25

МУКА ПОЛБОВАЯ КОМПАС

ЗДОРОВЬЯ 42210 78600 69565

HOT CEREALS GRACIE

POWER LABORATORIES

55260 157184 109560

МУКА НУТОВАЯ ПУДОВЪ 96,275 314,02 256,025

FINNISH OAT BRAN 4LIFE 243,975 1102,74 726,375

ОТРУБИ ОВСЯНЫЕ ОГО 1332,45 2727,72 2231,7

ФРУСТИКИ СВЕКЛА Mark& Фиса

И МАЛИНА 5287,5 7983,84 7570,65

150

100

z

о н

2 с

50

ns

ns

ns

\ /

/ \

G12 Х6 R5

Рисунок 12. Количественное определение глютена тест-системами, основанными на антителах G12, X6 и R5 в продуктах с высоким содержанием глютена.

При количественном определении глютена в пищевых продуктах, содержащих высокие его концентрации, не наблюдалось значительных отличий при измерении содержания глютена тремя методами.

Установление сопоставимости результатов

Чтобы установить, насколько полученные различия влияют на интерпретацию результата измерения глютена в пробе, и отнесение продукта к соответствующему типу по содержанию глютена, для этой группы продуктов дополнительно провели тест Мс№тага. В таблице 9 представлены измеренные концентрации глютена в группе «снэки».

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шаталова Александрина Сергеевна, 2021 год

Список литературы

1. Andreasson U. et al. A practical guide to immunoassay method validation //Frontiers in neurology. - 2015. - Т. 6. - С. 179.

2. Andreeva A. M. et al. Involvement of apolipoprotein A in maintaining tissue fluid balance in goldfish Carassius auratus //Fish physiology and biochemistry. - 2019. - Т. 45. - №. 5. - С. 1717-1730.

3. Allred L., Ritter B.W. Recognition of Gliadin and Glutenin Fractions in Four Commercial Gluten Assays//JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL. — 2010. — № 93 (1). — C.190-196.

4. Armbruster D. A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation //The clinical biochemist reviews. - 2008. - Т. 29. - №. Suppl 1. -С. S49.

5. Arranz E. et al. (ed.). Advances in the understanding of gluten related pathology and the evolution of gluten-free foods. - OmniaScience, 2015.

6. Armstrong D., Don-Wauchope A. C., Verdu E. F. Testing for gluten-related disorders in clinical practice: the role of serology in managing the spectrum of gluten sensitivity //Canadian Journal of Gastroenterology. - 2011. - Т. 25. - №. 4. - С. 193-197.

7. Bruins Slot I. D. et al. Evaluating the performance of gluten ELISA test kits: the numbers do not tell the tale //Cereal Chemistry. - 2015. - Т. 92. - №. 5. - С. 513521.

8. Catassi C., Gatti S., Lionetti E. World perspective and celiac disease epidemiology //Digestive diseases. - 2015. - Т. 33. - №. 2. - С. 141-146.

9. Celiac Disease and the Safety of Oats. Health Canada's Position on the Introduction of Oats to the Diet of Individuals Diagnosed with Celiac Disease (CD)// Health Canada. - 2007

Режим доступа: http://hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/allerg/cel-coe/oats_cd-avoine_e.html. (дата обращения: 12.2020)

10.Celiac Disease Foundation//Dermatitis Herpetiformis. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://celiac.org/celiac-disease/understanding-celiac-disease-2/dermatitis-herpetiformis/

11.Codex Alimentarius Commission. Joint Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization Food Standards. Standard for foods for special dietary use for persons intolerant to gluten (CODEX STAN 1181979). 2008.

12.Colgrave M. L. et al. Using mass spectrometry to detect hydrolysed gluten in beer that is responsible for false negatives by ELISA //Journal of Chromatography A.

- 2014. - Т. 1370. - С. 105-114.

13.Comino I. et al. Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease //Gut. - 2011. - Т. 60. - №. 7.

- С. 915-922.

14.Dahinden I., von Büren M., Lüthy J. A quantitative competitive PCR system to detect contamination of wheat, barley or rye in gluten-free food for coeliac patients //European Food Research and Technology. - 2001. - Т. 212. - №. 2. -С. 228-233.

15.Don, C. et al. AACCI Approved Methods Technical Committee Report: Collaborative Study on the Immunochemical Quantitation of Intact Gluten in Rice Flour and Rice-Based Products using G12 Sandwich ELISA//Cereal Foods World. - 2014. - Т. 59 - № 4. - С. 59-70

16.Don C., Koehler P. Enzyme-linked immunosorbent assays for the detection and quantitation of gluten in cereal-based foods //Cereal Foods World. - 2014. - Т. 59. - №. 4. - С. 171-178.

17.Dostalek P. et al. Determination of gluten in glucose syrups //Journal of Food Composition and Analysis. - 2009. - Т. 22. - №. 7-8. - С. 762-765.

18.Dermatitis Herpetiformis// Canadian Celiac Association

Режим доступа: http://www.celiac.ca/page_id=889 (дата обращения: 12.2020)

19.de Lourdes Moreno M. et al. Selective capture of most celiac immunogenic peptides from hydrolyzed gluten proteins //Food chemistry. - 2016. - Т. 205. - С. 36-42.

20.De Souza M. C. P. et al. Pure oats as part of the canadian gluten-free diet in celiac disease: The need to revisit the issue //Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology. - 2016. - Т. 2016.

21.Diaz-Amigo C., Yeung J. M. Critical evaluation of uncertainties of gluten testing: issues and solutions for food allergen detection //Pathogens and Toxins in Foods: Challenges and Interventions. - 2009. - С. 286-300.

22.Diaz-Amigo C. D., Popping B. Labeling regulations, detection methods, and assay validation //Journal of AOAC International. - 2012. - Т. 95. - №. 2. - С. 337-348.

23.Federal Register - Rules and Regulations// U.S. Government. - 2013. -№150(78) [Электронный ресурс]

24.https://www.federalregister.gov/articles/2013/08/05/2013-18813/food- labeling-gluten-free-labeling-of-foods. (дата обращения: 12.2020)

25.Fiedler K. L. et al. Characterization of grain-specific peptide markers for the detection of gluten by mass spectrometry //Journal of agricultural and food chemistry. - 2014. - Т. 62. - №. 25. - С. 5835-5844.

26.Gujral N., Freeman H. J., Thomson A. B. R. Celiac disease: prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment //World journal of gastroenterology: WJG. - 2012. - Т. 18. - №. 42. - С. 6036.

27.Gelinas P. et al. Gluten contamination of cereal foods in Canada //International journal of food science & technology. - 2008. - Т. 43. - №. 7. - С. 1245-1252.

28.Gluten-free labelling claims for products containing specially produced "gluten-free oats"// Health Canada. - 2015[Электронный ресурс.]

Режим доступа: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/allerg/cel-coe/avoine-gluten-oats-eng.php. (Дата обращения: 12.2020)

29.Gluten-Free: How can you Prove it? / Hammer, E.//Food Quality Magazine. -2012 [Электронный ресурс]

Режим доступа: http://www.foodsafetymagazine.com/signature-series/gluten-free-how-can-you-prove-it/ (Дата обращения: 12.2020)

30.Hadjivassiliou M. et al. Effect of gluten-free diet on cerebellar MR spectroscopy in gluten ataxia //Neurology. - 2017. - Т. 89. - №. 7. - С. 705-709.

31.Halbmayr-Jech E. et al. Gluten in rice flour and baked rice products by G12 sandwich ELISA: First action 2014.03 //Journal of AOAC International. - 2015. - Т. 98. - №. 1. - С. 103-111.

32.Haraszi R. et al. Analytical methods for detection of gluten in food—method developments in support of food labeling legislation //Journal of AOAC International. - 2011. - Т. 94. - №. 4. - С. 1006-1025.

33.Joint Food and Agriculture Organization of the United Nations / World Health Organization Food Standards. Report of the Twenty-sixth session of the Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. - 2005.

Режим доступа: http://www.fao.org/3/i3243e/i3243e.pdf (дата обращения: 12.2020)

34.Kanerva P. M. et al. Analysis of barley contamination in oats using R5 and ю-gliadin antibodies //Journal of cereal science. - 2006. - Т. 44. - №. 3. - С. 347352.

35.Kanerva P. et al. Immunochemical analysis of prolamins in gluten-free foods. -2011.

36.Koehler P. et al. AACCI approved methods technical committee report: collaborative study on the immunochemical determination of intact gluten using an R5 sandwich ELISA //Cereal Foods World. - 2013. - Т. 58. - №. 1. - С. 36.

37.Koerner T. B. et al. Gluten contamination in the Canadian commercial oat supply //Food Additives and Contaminants. - 2011. - Т. 28. - №. 6. - С. 705-710. Koppel E. et al. Detection of wheat contamination in oats by polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) //Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A. - 1998. - Т. 206. - №. 6. - С. 399-403.

38.Koerner T. B. et al. Validation procedures for quantitative gluten ELISA methods: AOAC allergen community guidance and best practices //Journal of AOAC International. - 2013. - ^ 96. - №. 5. - C 1033-1040.

39.Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity// Nature. — 1975. — № 256. — C.495-497.

40.La Vieille S. et al. Estimated levels of gluten incidentally present in a Canadian gluten-free diet //Nutrients. - 2014. - ^ 6. - №. 2. - Q 881-896

41.La Vieille S. et al. Celiac disease and gluten-free oats: a Canadian position based on a literature review //Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology. -2016. - ^ 2016.

42.Lee H. J., Anderson Z., Ryu D. Gluten contamination in foods labeled as "gluten free" in the United States //Journal of food protection. - 2014. - ^ 77. - №. 10. -C 1830-1833.

43.Lexmaulova H. et al. ELISA kit for peanut protein determination: collaborative study //Journal of AOAC International. - 2013. - ^ 96. - №. 5. - C 1041-1047.

44.Lundin K. E. A. et al. Oats induced villous atrophy in coeliac disease //Gut. -2003. - ^ 52. - №. 11. - Q 1649-1652.

45.Mena M. C. et al. Comprehensive analysis of gluten in processed foods using a new extraction method and a competitive ELISA based on the R5 antibody //Talanta. - 2012. - ^ 91. - Q 33-40.

46.Melini V., Melini F. Gluten-free diet: Gaps and needs for a healthier diet //Nutrients. - 2019. - ^ 11. - №. 1. - Q 170.

47.Mena M., Sousa C. Analytical tools for gluten detection: Policies and regulation //OmniaScience Monographs. - 2015.

48.Mendez E. et al. Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food //European journal of gastroenterology & hepatology. - 2005. - ^ 17. - №. 10. -C 1053-1063.

49.Meresse B., Malamut G., Cerf-Bensussan N. Celiac disease: an immunological jigsaw //Immunity. - 2012. - ^ 36. - №. 6. - C 907-919.

50.Monaci L., Visconti A. Immunochemical and DNA-based methods in food allergen analysis and quality assurance perspectives //Trends in Food Science & Technology. - 2010. - Т. 21. - №. 6. - С. 272-283.

51.Non-Celiac Gluten Sensitivity: How to Diagnose and Differentiate it from Celiac Disease// Canadian Celiac Association - 2019

Режим доступа: http://www.celiac.ca/?page_id=883 (режим доступа: 12.2020). 52.Office of Food Safety. Health Hazard Assessment for Gluten Exposure in Individuals with Celiac Disease: Determination of Tolerable Daily Intake Levels and Levels of Concern for Gluten/U.S.Food and Drug Administration. - 2011. [Электронный ресурс])

Режим доступа: https://www.fda.gov/media/81500/download (дата обращения 12.2020)

53.Panda R. et al. Detection and quantification of gluten during the brewing and fermentation of beer using antibody-based technologies //Journal of food protection. - 2015. - Т. 78. - №. 6. - С. 1167-1177.

54.Plan d'action pour assurer la sécurité des produitsalimentaires. Allergènes non déclarés dans des sachets d'arômes// Canadian Food Inspection Agency Enquêtesciblées. - 2010-2011.

Режим доступа: https://www.inspection.gc.ca/salubrite-alimentaire-pour-l-industrie/chimie-et-microbiologie-alimentaires/bulletin-d-enquete-et-rapports-d-analyse-sur-la-sa/etudes-ciblees/fra/1585244230305/1585244377704 (дата обращения: 12.2020)

55.Proposed Rule for Gluten-Free Labeling of Fermented or Hydrolyzed Foods// U.S. Food and Drug Administration. - 2016. [Электронный ресурс] Режим доступа:https://www.federalregister.gov/documents/2020/08/13/2020-17088/food-labeling-gluten-free-labeling-of-fermented-or-hydrolyzed-foods (дата обращений 12. 2020).

56.Questions and Answers: Gluten-Free Food Labeling Final Rule// FDA - 2020 [Электронный ресурс]

Режим доступа: https://www.fda.gov/food/food-labeling-nutrition/gluten-free-labeling-foods (дата обращения 12.2020)

57.Rashid M. et al. Consumption of pure oats by individuals with celiac disease: a position statement by the Canadian Celiac Association //Canadian Journal of Gastroenterology. - 2007. - Т. 21. - №. 10. - С. 649-651.

58.Rincon R. A. et al. Enzymatic fuel cells: Integrating flow-through anode and air-breathing cathode into a membrane-less biofuel cell design //Biosensors and Bioelectronics. - 2011. - Т. 27. - №. 1. - С. 132-136.

59.R-Biopharm. SureFood® ALLERGEN Gluten [Электронный ресурс] Режим доступа: http ://www.r-biopharm .com/products/food-feed-analysis/allergens/gliadin-gluten/item/surefood-allergen-gluten (дата обращения 12.2020)

60.Report of the thirty-eighth session of the Codex Committee on nutrition and Foods for special dietary uses// Codex Alimentarius Commission. - 2016. Режим доступа: http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/sh-proxy/en/?lnk=1&url=https%253A%252F%252Fworkspace.fao.org%252Fsites% 252Fcodex%252FMeetings%252FCX-720-

38%252FReport%252FFINAL%252FREP17_NFSDUe.pdf (Дата обращения: 12.2020)

61.Rogers A., Brunner K., Kraus J. Challenges in Allergen Testing: Spiking and Recoveries// Spot On: Diagnostic Solutions. Issue 2. — 2018 [ Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.brcgs.com/media/2167041/11-e-sampling_guide_2018-05-15_eng.pdf (дата обращения: 12.2020)

62.Sandberg M. et al. Real time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten free foods //European Food Research and Technology. -2003. - Т. 217. - №. 4. - С. 344-349.

63.Scherf K. A., Poms R. E. Recent developments in analytical methods for tracing gluten //Journal of Cereal Science. - 2016. - Т. 67. - С. 112-122.

64.Singh P. et al. Global prevalence of celiac disease: systematic review and metaanalysis //Clinical gastroenterology and hepatology. - 2018. - Т. 16. - №. 6. - С. 823-836. e2.

65.Taylor S., Baumert J. Achieving Gluten-Free Status// Food Safety Magazine. — 2014. — C.30-66.

66.The Threshold Working Group. Approaches to Establish Thresholds for Major Food Allergens and for Gluten in Food/ U.S.Food and Drug Administration. -2006. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://www.fda.gov/files/food/published/Approaches-to-EstablishThresholds-for-Major-Food-Allergens-and-for-Gluten-in-Food.pdf(дата обращения 11.2020)

67.Thompson T. Gluten contamination of commercial oat products in the United States //New England Journal of Medicine. - 2004. - Т. 351. - №. 19. - С. 20212022.

68.Vader W. et al. The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides //Gastroenterology. - 2002. - Т. 122. - №. 7. - С. 1729-1737.

69.Van Eckert R. et al. Towards a new gliadin reference material-isolation and characterisation //Journal of cereal science. - 2006. - Т. 43. - №. 3. - С. 331-341.

70.Van Eckert R. et al. Reactivity of gluten detecting monoclonal antibodies to a gliadin reference material //Journal of Cereal Science. - 2010. - Т. 51. - №. 2. -С. 198-204.

71.Volta U. et al. Non-celiac gluten sensitivity: questions still to be answered despite increasing awareness //Cellular & molecular immunology. - 2013. - Т. 10. - №. 5. - С. 383-392

72.Waga J. et al. Structure and allergenicity of wheat gluten proteins-a review //Pol. J. Food Nutr. Sci. - 2004. - Т. 13. - №. 54. - С. 4.

73.Wheat: One of the ten priority food allergens// CFIA & Health Canadaю - 2012. Режим доступа: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/pubs/securit/2016-allergen_wheat-ble/index-eng.php (дата обращения: 12.2020)

74.Wieser H. Chemistry of gluten proteins / H. Wieser // Food Microbiology. — 2007. — № 24. — C.115-119.

75.Yeager D. Gluten Ataxia / D. Yeager // Today's Dietitian. — 2014. — № 16 (3). — C.16-18.

76.Yield trends are insufficient to double global crop production by 2050 / D. Ray, N. Mueller , P. West, J. Foley // PLoS One . — 2013. — № 8. — C.662-664.

77.ГОСТ 31964-2012 Изделия макаронные. Правила приемки и методы определения качества (с Поправкой). Введ. 2012, дораб. - 11.2019

78.Ataxia - Another Symptom of Gluten Induced Damage// Gluten-free Society https://www.glutenfreesociety.org/ataxia-another-symptom-of-gluten-induced-damage/ (дата обращения 12.2020)

79. Базовые графические возможности R https://r-analytics.blogspot.com/2011/11/r_08.html - Загл. с экрана

80. Лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний Санкт-Петербургского государственного университета им.ак. И.П. Павлова. Режим доступа: http://autoimmun.ru, свободный - Загл. с экрана

81. Принципы постановки иммуноферментного анализа. Режим доступа: https://ruo.mbl.co.Jp/bio/e/support/method/elisa.html, свободный - Загл. с экрана

82. Реагенты Sigma Aldrich, M.: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma, свободный - Загл. с экрана

Список исследованных коммерческих образцов

Название Производитель Тип 012, мг/кг Х6, мг/кг Я5, мг/кг

АМ1 ООО «Агродар БСК» Выпечка 1,955 8,8112 8,197

#51023 ХЕМА Выпечка 10,267 12,884 17,242

АМ2 МАСЛЯНЫЙ КОРОЛЬ Выпечка 31,24 41,256 48,964

#51113 ВКУСВИЛЛ Выпечка 5,947 7,0432 11,761

ПЕЧЕНЬЕ ХЕМА Выпечка

КОКОСОВОЕ

1802 0,694 0,01 0,278

КОКОСОВОЕ ХЕМА Выпечка

ПЕЧЕНЬЕ 2503 1,61 1,2448 0,567

ХЛЕБ ХЕМА Выпечка 12,139 1,8776 1,018

ПЕЧЕНЬЕ (КИЕВ) ХЕМА Выпечка 18,542 14,7336 20,223

0 МГ/КГ Выпечка

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 6,452 6,8512 6,62

0 МГ/КГ Выпечка

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 0,628 1,7216 0,963

5 МГ/КГ Выпечка

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 5,384 5,3512 4,212

5 МГ/КГ Выпечка

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 1,845 2,496 1,439

20 МГ/КГ Выпечка

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 8,713 9,8616 9,084

20 МГ/КГ Выпечка

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 9,54 8,5816 7,495

50 МГ/КГ Выпечка

ПЕЧЕНЫЕ ХЕМА 14,023 17,8648 16,257

50 МГ/КГ Выпечка

ЖАРЕНЫЕ ХЕМА 13,882 17,416 17,891

ГРЕЧНЕВАЯ УВЕЛКА Мука

МУКА 8,835 11,628 14,473

МУКА КОМПАС Мука

КОНОПЛЯНАЯ ЗДОРОВЬЯ 6,736 5,4328 13,082

МУКА РИСОВАЯ ПУДОВЪ Мука 6,547 2,176 5,204

МУКА ЛЬНЯНАЯ ПУДОВЪ Мука 5,902 14,2672 7

Название Производитель Тип G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

МУКА ЛЬНЯНАЯ ХЕМА Мука 4,856 6,424 3,924

МУКА КУКУРУЗНАЯ КУДЕСНИЦА Мука 2,007 4,0984 2,649

СОЕВЫЙ PUREPROTEIN Мука

ИЗОЛЯТ 3,36 4,8392 4,607

КСБ КАЛИНИНГРАД Мука 3,547 0,01 9,167

RU02A ООО "Зиландия" Мука 1,431 0,01 0,537

RU03A ХЕМА Мука 1,326 2,1832 1,102

РИСОВАЯ МУКА ПУДОВЪ Мука 6,337 1,5472 1,118

COCOCNUT A245 ХЕМА Мука 0,826 0,01 0,01

СОЯ H02 12-7 ХЕМА Мука 0,242 0,4992 0,704

GLYCINE MAX Мука

CRUSHED ХЕМА 1,096 1,748 0,725

МУКА ПУДОВЪ Мука

ГРЕЧНЕВАЯ 16,685 18,396 22,546

МУКА ЛЬНЯНАЯ ПУДОВЪ Мука 8,493 19,8032 11,319

ХЛЕБЦЫ ПРОДПОСТАВКА Высокое

МУЛЬТИЗЛАК содержание 13186,5 21767,4 19272

ЗАВТРАК ROCKET FROM THE Высокое

МИНДАЛЬ- POCKET содержание

ТЫКВЕННЫЕ

СЕМЕЧКИ 19087,5 24954 22673,25

ГРАНОЛА GRANOLIFE Высокое

МАНГО-АНАНАС содержание 20420,25 29262,6 27107,25

ГРАНОЛА GRANOLIFE Высокое

КОКОС-СЕМЕНА содержание

ЧИА 17456,25 24816,6 20173,5

МУКА ПУДОВЪ Высокое

ГОРОХОВАЯ содержание 3908,25 4044 3145,5

ГРАНОЛА GRANOLIFE Высокое

КЛУБНИКА-МАЛИНА содержание 9756,75 11402,4 10499,25

МУКА КОМПАС Высокое

ПОЛБОВАЯ ЗДОРОВЬЯ содержание 42210 78600 69565

HOT CEREALS GRACIE Высокое

POWER LABORATORIES содержание 55260 157184 109560

МУКА НУТОВАЯ ПУДОВЪ Высокое

содержание 96,275 314,02 256,025

Название Производитель Тип G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

FINNISH OAT BRAN 4LIFE Высокое

содержание 243,975 1102,74 726,375

ОТРУБИ ОГО Высокое

ОВСЯНЫЕ содержание 1332,45 2727,72 2231,7

ФРУСТИКИ Mark& Фиса Высокое

СВЕКЛА И содержание

МАЛИНА 5287,5 7983,84 7570,65

ГРЕЧНЕВЫЕ ВКУСВИЛЛ Снэки

ПАЛОЧКИ 3,529 3,536 5,537

ХЛЕБЦЫ ВКУСВИЛЛ Снэки

ЛЬНЯНЫЕ

"ТАИСКИЕ" 0,306 0,8904 1,891

КУКУРУЗНЫЕ ВКУСВИЛЛ Снэки

ХЛЕБЦЫ 7,219 0,01 0,447

КУКУРУЗНЫЕ ВКУСВИЛЛ Снэки

ПАЛОЧКИ С

БАНАНОМ 9,725 0,01 1,237

ХЛЕБЦЫ ПРОДПОСТАВКА Снэки

РИСОВЫЕ 2,198 0,01 0,224

ХЛЕБЦЫ DR ^RNER Снэки

РИСОВЫЕ С

ЛИМОНОМ И

ИМБИРЕМ 4,064 0,01 0,338

ХЛЕБЦЫ ПРОДПОСТАВКА Снэки

ГРЕЧНЕВЫЕ 0,01 0,2896 0,01

КОРНЕРСЫ С DR ^RNER Снэки

ТОМАТАМИ 16,942 0,01 0,108

РИСОВЫЕ DR ^RNER Снэки

ХЛЕБЦЫ 1,285 0,01 0,141

ЧИПСЫ ВКУСВИЛЛ Снэки

КУКУРУЗНЫЕ С

МОРСКОЙ

капустой 6,406 2,6488 5,485

АМАРАНТ DI&DI Снэки

ЗАВТРАК В

ГЛАЗУРИ 10,604 0,9208 3,651

ГРЕЧНЕВЫЕ DR ^RNER Снэки

ХЛЕБЦЫ 0,255 0,01 0,759

ХЛЕБЦЫ ВКУСВИЛЛ Снэки

ЛЬНЯНЫЕ

«МОРСКИЕ» 2,989 7,6712 11,195

КУКУРУЗНЫЕ FIT PARAD Снэки

ХЛОПЬЯ 5,729 6,88 5,772

КУКУРУЗНЫЕ FIT PARAD Снэки

ХЛОПЬЯ 7,095 9,3072 7,53

КОРНЕРСЫ С DR ^RNER Снэки

ЛУКОМ 8,136 0,01 0,1

Название Производитель Тип G12, мг/кг X6, мг/кг R5, мг/кг

ФРУСТИКИ ТЫКВА И АБРИКОС MARK& ФИСА Снэки 16,427 20,4584 24,291

ХЛОПЬЯ КУКУРУЗНО- ГРЕЧНЕВЫЕ ORGANIC Снэки 56,035 37,2736 45,956

Продукт ХЕМА, Х6 R-biopharm, R5

Концентрация глютена при экстракции коктейлем Мендеса, мг/кг Концентрация глютена при спиртовая экстракция, мг/кг Концентрация глютена при экстракции коктейлем Мендеса, мг/кг Концентрация глютена при спиртовая экстракция, мг/кг

макароны кукурузные Диетика 4,32 3,01 4,52 5,32

макароны безглютеновые МАХБА 3,26 3,32 4,06 4,96

макароны глютеновые МАХБА 69,38 69,05 70,3 71,3

ветчина "ООО Лента" 2,77 3,28 3,07 6,07

молочные сосиски "ООО Лента" 30,95 30,27 29,95 32,95

сосиски классические "ООО 365 дней" 68,23 70,00 67,23 70,03

сосиски "Папа Может" 5,04 3,41 4,94 7,94

творожная масса "Балком" 4,06 5,06 3,96 3,96

творожная масса с вишней "365 дней" 12,68 13,42 12,48 15,48

творожная масса с изюмом "365 дней" 3,51 3,17 4,01 18,01

творожная масса с изюмом "Лента" 5,65 3,49 5,05 6,05

гороховый концентрат "Нордена" 67,23 70,73 68,3 70,3

Кедр 1 2,90 2,89 3,01 3,41

Кедр 2 2,98 3,15 2,98 3,08

Чечевица 0,14 0,16 0,154 0,51

Результаты, полученные для гибридизации «Глиадин»: скрининг № 1, реактивность с целевым антигеном

1 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,215 1,966 2,049 1,87 2,123 2,03 1,985 1,893 1,926 2,303 2,08 1,813

В 2,283 2,047 1,73 2,03 1,894 1,988 1,976 1,759 1,711 1,616 2,078 2,001

С 2,672 2,196 1,945 1,98 1,996 2,273 2,352 1,756 1,521 1,447 1,967 1,806

Б 1,987 1,963 2,03 1,818 1,871 2,062 1,86 1,83 1,601 1,923 2,405 1,828

Е 2,124 2,424 1,859 1,909 1,739 1,86 1,899 1,749 2,162 1,974 1,975 2,448

Б 2,849 2,06 1,915 1,912 2,037 1,67 2,026 1,821 2,062 1,754 1,987 1,807

в 2,515 2,197 1,827 1,895 1,98 1,16 2,083 1,875 2,107 1,92 2,298 2,346

Н 2,339 2,32 1,973 2,434 2,293 1,231 2,2 2,717 2,086 2,489 2,408 2,157

2 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,103 1,671 2,056 2,045 2,184 1,761 1,878 2,417 2,007 1,768 1,794

В 2,12 1,953 1,523 1,91 2,056 1,715 1,915 1,937 1,764 1,682 1,894 2,064

С 2,314 1,808 1,639 1,862 2,023 1,625 1,772 2,042 1,913 1,962 2,315 1,883

Б 2,045 1,75 1,73 1,682 1,826 1,778 1,655 2,539 1,771 ОУЯ 1,926 1,972

Е 1,922 2,02 1,936 1,745 2,799 1,292 1,655 2,053 1,861 2,293 1,679 2,451

Б 1,623 1,876 1,696 1,713 2,627 1,315 1,413 2,361 1,572 1,813 2,109 2,368

в 2,001 2,127 1,757 1,613 2,793 1,961 1,454 2,599 1,624 2,115 1,958 2,303

Н 2,227 2,398 2,043 1,598 2,974 1,853 1,857 2,69 2,052 2,168 1,944 2,352

3 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,501 1,856 2,207 2,323 2,302 2,001 2,072 2,147 2,021 2,263 2,039 2,248

В 1,771 1,994 2,189 2,119 1,947 1,605 1,783 1,817 2,003 2,312 2,168 2,23

С 1,908 2,047 1,859 1,784 1,84 1,868 1,976 1,627 1,907 1,962 1,896 1,951

D 2,159 1,951 1,649 1,814 1,904 1,792 1,807 2,095 1,645 1,875 2,094 OVR

Е 2,006 2,101 1,877 2,028 2,341 1,941 1,73 1,797 2,077 1,824 2,195 1,973

F 2,061 1,667 1,894 2,168 1,544 1,754 1,888 2,14 1,825 1,974 2,084 1,996

G 1,994 2,044 2,042 2,007 2,294 1,71 1,953 1,887 2,145 2,151 2,222 2,011

Н 2,323 1,933 2,251 1,768 2,59 2,056 2,738 2,171 1,983 2,196 2,186 2,196

4 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,163 2,052 1,958 2,416 1,992 2,413 2,22 1,864 2,164 2,479 OVRFLW 2,154

В 2,178 1,771 1,938 2,011 1,946 1,887 2,213 2,75 2,366 2,293 2,348 2,076

С 2,004 1,859 1,509 2,072 2,097 2,171 1,756 2,068 2,948 2,275 2,331 2,213

D 2,131 1,732 2,692 2,062 1,813 1,806 1,944 1,685 1,983 2,258 1,877 2,526

Е 2,1 1,889 2,047 OVR 1,935 1,786 1,904 2,027 2,069 1,944 2,341 OVR

F 2,165 2,099 1,733 2,324 1,787 1,925 2,78 2,43 1,935 2,072 2,142 2,276

G 2,459 1,845 1,934 1,984 2,098 1,951 1,943 1,647 2,284 2,217 1,992 2,141

Н 2,391 2,285 2,125 2,292 2,341 2,15 2,273 2,366 2,06 2,682 2,182 2,244

5 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,265 1,814 2,089 1,94 1,98 2,291 2,292 1,675 2,115 2,459 2,861 2,536

В 2,335 1,934 2,166 2,373 2,127 2,29 2,204 1,77 1,993 1,838 2,41 2,285

С 1,874 1,93 2,102 1,803 2,403 2,224 1,851 1,75 1,921 1,862 1,987 2,407

D 2,281 2,147 2,143 1,952 2,438 1,957 2,102 1,787 2,576 2,04 2,185 2,156

Е 2,116 2,21 1,949 1,683 2,136 1,941 1,658 1,776 2,043 1,897 1,877 2,217

F 2,256 2,002 2,087 2,066 2,121 2,466 1,81 2,164 2,125 1,622 1,986 2,503

G 2,538 2,088 2,16 2,11 1,887 1,91 1,889 1,899 2,626 2,352 1,951 2,317

Н 2,536 2,034 2,131 2,2 2,164 2,502 2,056 2,038 2,379 2,346 2,43 2,564

6 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,014 1,846 2,089 2,041 2,016 1,698 1,726 2,047 1,948 1,718 2,046 OVR

В 1,743 1,989 1,817 1,967 1,752 1,841 1,639 1,758 1,677 2,173 1,846 1,938

С 2,563 2,245 1,696 1,571 1,877 1,617 1,644 1,669 1,672 1,622 2,006 1,964

D 2,952 1,881 1,569 1,694 1,897 1,865 2,067 1,612 1,716 1,662 2,05 2,016

Е 2,183 1,776 1,857 1,8 1,962 1,723 1,744 1,945 1,636 1,875 1,931 1,717

F 2,209 2,122 1,71 2,098 1,635 1,814 1,426 1,743 1,825 1,771 1,769 1,855

G 2,421 2,164 1,883 1,828 1,698 1,536 1,673 2,035 2,871 1,789 1,766 1,932

Н 2,311 2,142 2,18 2,617 1,794 1,99 1,944 0,422 0,694 2,019 1,851 2,251

Результаты, полученные для гибридизации «Глиадин»: скрининг № 1, реактивность с

перекрестными белками

1 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,504 0,48 0,34 0,423 0,435 0,506 0,439 0,391 0,606 0,443 0,484 0,413

В 0,598 0,364 0,482 0,42 0,345 0,476 0,56 0,436 0,333 0,374 0,372 0,459

С 0,513 0,584 0,431 0,387 0,528 0,379 1,476 0,536 0,366 0,274 0,411 0,336

D 0,478 0,499 0,574 0,552 0,463 0,436 0,398 0,449 0,336 0,347 0,473 0,481

Е 0,432 0,489 0,346 0,272 0,315 0,447 0,468 0,395 0,501 0,391 0,468 0,426

F 0,441 0,553 0,462 0,47 0,465 0,326 0,39 0,367 0,748 0,605 0,48 0,464

G 0,731 0,498 0,367 0,383 0,341 0,339 0,558 0,53 0,567 0,829 0,662 0,407

Н 0,64 0,554 0,435 0,563 0,627 0,266 0,548 0,408 0,5 0,571 0,269 0,384

2 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,438 0,277 0,617 0,365 0,585 0,427 0,426 0,832 0,46 0,461 0,502

В 0,351 0,442 0,277 0,395 0,451 0,519 0,424 0,503 0,429 0,315 0,737 0,64

С 0,616 0,366 0,398 0,41 0,547 0,364 0,48 0,683 0,496 0,533 0,397 0,31

D 0,512 0,365 0,506 0,354 0,452 0,315 0,413 0,503 0,472 1,351 0,362 0,535

Е 0,42 0,452 0,246 0,577 1,958 0,187 0,336 0,415 0,614 0,795 0,471 0,633

F 0,437 0,325 0,427 0,333 0,896 0,552 0,287 0,69 0,463 0,393 0,364 0,623

G 0,439 0,402 0,397 0,669 0,847 0,498 0,208 0,846 0,325 0,703 0,552 0,684

Н 0,357 0,863 0,422 0,34 0,913 0,469 0,501 0,878 0,449 0,397 0,396 0,516

3 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,466 0,331 0,607 0,672 0,738 0,472 0,461 0,728 0,537 0,509 0,325 0,606

В 0,381 0,365 0,566 0,535 0,492 0,303 0,472 0,416 0,371 0,91 0,443 0,549

С 0,431 0,469 0,381 0,355 0,565 0,439 0,432 0,438 0,423 0,425 0,588 0,497

D 0,608 0,377 0,471 0,397 0,401 0,349 0,483 0,509 0,367 0,417 0,372 2,631

Е 0,54 0,497 0,311 0,776 0,575 1,223 0,356 0,487 0,34 0,28 0,716 0,327

F 0,556 0,355 0,401 0,33 0,355 0,324 0,628 0,342 0,524 0,409 0,665 0,314

G 0,365 0,406 0,456 0,317 0,711 0,471 0,688 0,376 0,676 0,644 0,564 0,444

Н 0,565 0,332 0,653 0,348 0,517 0,504 0,473 0,478 0,458 0,512 0,529 0,778

4 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,468 0,342 0,436 0,474 0,343 0,668 0,57 0,398 0,43 0,686 1,125 0,321

В 0,501 0,5 0,488 0,569 0,417 0,398 0,405 0,946 0,505 0,488 0,625 0,332

С 0,379 0,347 0,529 0,708 0,571 0,771 0,427 0,706 1,45 0,819 0,421 0,515

D 0,385 0,37 0,39 0,629 0,5 0,635 0,667 0,526 0,638 0,523 0,396 0,618

Е 0,592 0,393 0,525 0,68 0,672 0,45 0,703 0,598 0,789 0,49 0,35 0,277

F 0,469 0,654 0,42 0,607 0,468 0,339 1,286 1,685 0,671 0,65 0,546 0,854

G 0,419 0,405 0,345 0,392 0,486 0,631 0,392 0,383 0,765 0,489 0,502 0,363

Н 0,696 0,411 0,626 0,655 1,005 0,508 0,349 0,668 0,568 0,652 0,361 0,551

5 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,626 0,465 0,387 0,501 0,478 0,349 0,288 0,295 0,397 0,375 1,444 0,477

В 0,47 0,372 0,955 0,681 0,757 0,517 0,523 0,6 0,689 0,604 0,432 0,353

С 0,335 0,512 0,602 0,624 1,269 0,878 0,535 0,537 0,751 0,598 0,472 0,665

D 0,69 0,701 0,768 0,533 0,671 0,554 0,513 0,522 0,651 0,598 0,665 0,378

Е 0,429 0,582 0,647 0,498 0,724 0,583 0,511 0,544 0,655 0,524 0,525 0,499

F 0,481 0,541 0,45 0,652 0,595 1,596 0,541 0,783 0,607 0,469 0,462 0,496

G 0,413 0,51 0,563 0,692 0,457 0,571 0,381 0,595 0,875 0,64 0,636 0,546

Н 0,436 0,396 0,656 0,574 0,579 0,426 0,272 0,424 0,473 0,731 0,698 0,527

6 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 0,31 0,289 0,396 0,444 0,302 0,289 0,453 0,381 0,365 0,386 0,394 0,349

В 0,465 0,457 0,43 0,354 0,362 0,59 0,337 0,363 0,32 0,816 0,279 0,32

С 0,54 0,379 0,32 0,248 0,334 0,515 0,225 0,293 0,268 0,208 0,555 0,27

D 0,335 0,3 0,306 0,378 0,378 0,403 0,401 0,281 0,254 0,386 0,322 0,335

Е 0,533 0,339 0,441 0,332 0,298 0,43 0,523 0,616 0,439 0,333 0,37 0,331

F 0,301 0,407 0,439 0,544 0,338 1,031 0,308 0,345 0,302 0,428 0,311 0,508

G 0,344 0,709 0,322 0,295 0,613 0,35 0,327 0,354 0,332 0,591 0,342 0,364

Н 0,54 0,348 0,359 0,698 0,272 0,387 0,304 0,516 0,341 0,397 0,414 0,465

Результаты, полученные для гибридизации «Глиадин»: скрининг № 2, реактивность с целевым

антигеном

1 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1,501 1,581 1,422 1,759 1,494 1,453 1,207 1,334 1,681 1,557 1,033

В 1,968 1,869 1,278 1,694 1,374 1,477 1,285 1,173 1,036 0,975 1,309 1,273

С ОУЯ 1,825 1,453 1,469 1,529 2,043 ОУ 1,212 1,168 0,874 1,248 1,084

Б 1,644 1,504 1,77 1,489 1,641 1,495 1,337 1,342 1,094 1,34 1,811 1,264

Е 1,912 ОУЯ 1,587 1,524 1,284 1,185 1,53 1,352 1,813 1,561 1,475 ОУЯ

Б ОУЯ 1,67 1,447 1,893 1,865 1,2 1,679 1,402 1,74 1,303 1,448 1,399

в 2,55 2,002 1,587 1,57 1,61 0,517 1,739 1,504 1,627 2,599 1,778 2,382

Н 2,353 2,054 1,767 2,507 2,123 0,461 1,874 ОУ 1,579 2,623 2,322 1,812

2 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1,728 1,49 2,033 1,879 1,636 1,542 2,095 2,986 ОУЯ 2,246 1,391 1,379

В 1,886 1,853 1,293 1,881 1,942 1,471 1,849 1,873 1,394 1,415 1,655 1,668

С 2,429 1,765 1,444 1,799 1,625 1,357 1,812 2,357 1,875 1,987 ОУЯ 1,623

Б 1,781 1,758 ОУЯ 1,454 1,613 1,562 1,498 ОУЯ 1,595 ОУЯ 2,461 1,587

Е 1,623 2,529 2,813 1,597 ОУЯ 0,972 1,383 1,991 1,869 2,935 1,54 2,554

Б 1,496 1,707 2,591 1,504 2,56 1,305 1,492 2,487 1,31 1,68 2,755 2,263

в 1,883 2,003 1,832 1,429 ОУЯ ОУЯ 1,208 ОУЯ 1,04 2,108 2,019 2,136

Н 2,111 2,456 1,696 1,335 ОУЯ 1,477 1,729 2,94 1,763 2,16 1,533 2,327

3 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 2,203 1,165 1,72 1,974 1,624 1,831 1,625 1,654 1,489 1,637 1,229 1,647

В 1,425 1,548 1,541 1,811 2,292 1,031 1,435 1,371 1,552 ОУЯ 1,71 1,699

С 1,413 1,487 1,432 1,278 1,212 1,293 1,545 1,195 1,355 1,475 1,257 1,221

Б 1,869 1,459 1,275 1,428 1,454 1,53 1,275 1,593 1,127 1,457 2,405 ОУЯ

Е 1,568 2,341 1,467 1,638 2,188 2,218 1,46 1,328 1,304 1,188 2,189 1,418

Б 1,769 1,082 1,514 1,764 1,11 1,322 1,783 2,099 1,213 1,41 1,449 1,332

в 1,668 1,406 1,515 1,361 2,228 1,414 1,688 1,273 1,646 1,656 1,755 1,354

Н 2,091 2,263 1,81 1,281 2,816 1,652 ОУЯ 1,485 1,311 1,426 1,13 2,045

4 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1,943 1,453 1,376 2,005 1,331 1,974 1,639 1,343 1,426 1,952 2,627 1,812

В 1,711 1,285 1,42 1,532 1,308 1,393 1,726 2,227 1,577 1,791 1,746 1,369

С 1,848 1,222 1,146 1,415 1,554 1,52 1,208 1,292 2,6 2,136 1,889 1,418

Б 1,678 1,177 ОУЯ 1,528 1,195 1,453 1,386 1,136 1,604 2,621 1,248 2,579

Е 2,118 1,315 2,826 ОУЯ 1,434 1,232 1,609 1,42 2,33 1,547 2,102 1,094

Б 2,761 1,842 1,27 2,364 1,067 1,335 2,795 ОУЯ 1,628 1,714 1,783 1,541

в 2,245 1,279 1,351 1,581 1,536 1,466 1,469 0,979 2,419 ОУЯ 1,509 1,32

Н 1,991 1,547 1,91 2,42 1,781 1,477 1,844 1,486 1,58 2,403 1,394 1,522

5 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1,847 1,371 1,656 1,673 1,776 1,968 1,789 1,08 1,401 ОУЯ ОУЯ 2,184

В 2,214 1,502 2,249 2,117 1,895 2,377 1,572 1,189 1,556 1,417 1,926 1,653

С 1,534 1,438 1,789 1,499 2,34 1,95 1,328 0,91 1,564 1,513 1,348 2,032

Б 2,127 ОУЯ 1,732 1,418 2,53 1,397 1,146 1,766 2,571 1,373 1,862 1,598

Е 2,041 1,915 1,192 1,263 1,63 1,4 1,056 1,069 1,454 1,173 1,224 1,697

Б 2,03 1,575 1,397 1,449 1,511 2,55 1,272 1,457 1,742 1,06 1,626 2,107

в 2,993 1,796 1,685 1,666 1,314 1,494 1,341 1,38 2,229 1,842 1,389 1,733

Н 2,422 1,708 1,786 1,641 1,868 2,055 1,321 1,392 1,658 2,096 2,135 2,275

6 планшет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1,658 1,194 1,761 1,679 1,643 1,46 1,608 1,841 1,589 1,406 1,493 ОУЯ

В 1,505 1,841 1,442 1,46 1,459 1,491 1,508 1,391 1,357 2,387 1,292 1,574

С ОУЯ ОУЯ 1,143 1,185 1,412 1,412 1,267 1,244 1,277 1,178 1,71 1,55

Б ОУЯ 1,685 1,163 1,314 1,616 1,7 2,084 1,226 1,391 1,724 1,618 1,556

Е 2,204 1,531 1,717 1,598 1,988 1,52 1,423 1,838 1,402 1,535 1,559 1,464

Б 2,03 2,104 1,618 1,919 1,609 2,238 1,3 1,469 1,727 1,563 1,542 1,575

в ОУЯ 2,059 1,697 1,734 1,555 1,226 1,57 1,879 ОУЯ 1,439 1,462 2,251