Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.05, кандидат ветеринарных наук Нагорных, Алексей Михайлович

  • Нагорных, Алексей Михайлович
  • кандидат ветеринарных науккандидат ветеринарных наук
  • 2010, МоскваМосква
  • Специальность ВАК РФ06.02.05
  • Количество страниц 124
Нагорных, Алексей Михайлович. Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке: дис. кандидат ветеринарных наук: 06.02.05 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза. Москва. 2010. 124 с.

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Нагорных, Алексей Михайлович

1 введение

2 обзор литературы.

2. 1 История возникновения стафилококковых пищевых отравлений.

2.2 Систематика и общие свойства стафилококков.

2.3 Роль энтеротоксигенных стафилококков в этиологии клинического и субклинического мастита коров.

2.4 Факторы, влияющие на накопление энтеротоксина S. aureus в молоке и продуктах животного происхождения.

2.5 Физико-химические, биологические, антигенные и иммуногенные свойства стафилококковых энтеротоксинов.

2.6 Получение и очистка стафилококковых энтеротоксинов, выделенных из культур S. aureus.

2.7 Методы определения стафилококковых энтеротоксинов.

3. собственные исследования.

3.1 Материалы и методы.

3.2 Результаты исследований.

3.2.1 Определение уровня контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми стафилококками.

3.2.2 Выявление энтеротоксигенных штаммов S. aureus и определение типов энтеротоксинов.

3.2.3 Подбор штамма S. aureus, питательных сред и условий культивирования для получения максимального количества энтеротоксина типа С.

3.2.4 Получение энтеротоксина типа С золотистого стафилококка для иммунизации кроликов.

3.2.5 Выбор оптимальной схемы иммунизации для получения антиэнтеротоксических стафилококковых сывороток.

3.2.6 Получение иммуноглобулинов и конъюгата пероксидазаантиэнтеротоксические иммуноглобулины.

3.2.7 Отработка параметров иммуноферментной тест-системы.

3.2.8 Определение чувствительности и специфичности иммуноферментной те ст-системы.

3.2.9 Определение диагностической чувствительности разработанного иммуноферментного тест-системы в сравнении с референтной тест-системой.

3.2.10 Разработка способа пробоподготовки для эффективного обнаружения энтеротоксина типа С в сыром молоке с помощью разработанного метода обсуждение результатов выводы. предложения для практики.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», 06.02.05 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке»

В современных условиях при непрерывном повышении загрязнения окружающей среды вопросы гигиены сырого молока и контроля его качества становятся приоритетными. Поэтому к высококачественному молоку может быть отнесено лишь то молоко, которое соответствует предъявляемым к нему требованиям не только по пищевой ценности и органолептическим показателям, но прежде всего по безопасности потребления (4, 5).

Среди микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений ведущее место по частоте выделения занимает золотистый стафилококк. Стафилококковые отравления возникают при употреблении разнообразных пищевых продуктов, например, молочных, мясных, кондитерских и кулинарных изделий, и являются результатом нарушения технологических режимов получения сырья, его переработки и реализации готовой продукции (14, 17, 23, 27, 46).

Стафилококковые интоксикации (стафилококковые токсикозы) — наиболее распространенные пищевые отравления, так как стафилококки являются са-профитами и широко распространены во внешней среде, включая и воздух помещений. Стафилококки относительно устойчивы к химическим и физическим факторам воздействия, что обусловливает их выживаемость в пищевых продуктах. Особенностью интоксикаций стафилококковой природы является то, что они возникают в результате воздействия на организм энтеротоксинов, а не живых микробных клеток (32, 33). Другими словами, термическая обработка продуктов убивает стафилококк, но не разрушает его токсины, и отравление наступает даже после длительного проваривания и прожаривания пищи. Это обстоятельство затрудняет выявление причин вспышек микробиологическими методами, заставляя прибегать к методам обнаружения энтеротоксинов (30, 70, 96, 100, 146).

Пищевые отравления, вызванные употреблением продуктов, зараженных энтеротоксигенными стафилококками, занимают первое место по количеству вспышек и числу госпитализированных больных во многих странах мира. Стафилококковые токсины и ферменты нарушают функцию нейтрофилов, макрофагов (подавляют хемотаксис), Т- и В-лимфоцитов, ингибируют иммунный ответ на бактериальные антигены. Выработка стафилококками гиалуронидазы способствует распространению инфекции. В месте размножения возбудителя инфекции скапливаются гранулоциты, кровеносные сосуды тромбируются, формируются фибринные сгустки, в центре которых происходит некроз тканей, гибель лейкоцитов и формирование гнойного очага, содержащего стафилококки. Токсины разносятся кровью и лимфой в различные органы и ткани, вызывая их поражение (17, 20).

Большое негативное влияние на развитие молочного животноводства и повышение его продуктивности оказывают заболевания животных, среди которых наибольшее значение имеет мастит коров, приводящий к недополучению большого количества молока и преждевременной выбраковке. Важную роль в этиологии мастита играют стафилококки. Видовая дифференциация стафилококков, выделенных из молока коров, имеет большое эпизоотическое и эпидемиологическое значение, а также она необходима при организации мероприятий по борьбе с маститом и профилактике пищевых отравлений молочного происхождения (54, 62). Молоко, получаемое от коров-стафилококконосителей внешне не изменено, но телята, питаясь им, заболевают значительно чаще, чем их аналоги, получавшие молоко от здоровых коров (49, 104). Наличие в молоке (молозиве) значительного количества токсигенных стафилококков приводит к тому, что новорожденные телята инфицируются и в тяжелой форме страдают энтеритами стафилококковой этиологии, от чего часто погибают (20, 46, 106).

Изучение энтеротоксигенности стафилококков представляет существенные трудности, обусловленные отсутствием стандартных диагностических коммерческих антиэнтеротоксичных сывороток (антиэнтеротоксинов). В развитых странах определение энтеротоксигенности изолированных культур стафилококков обязательно используется для их идентификации, а промышленность выпускает необходимые иммунологические и другие диагностические препараты. Это дает возможность определять энтеротоксигенность стафилококков в различных режимах (экспрессном, на этапах исследования материала, без выделения чистых культур и т. д.). Широкое распространение получили тест-системы для определения энтеротоксина с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагппотинации (РНГА), латекс-агглютинации и реакции преципитации (51, 55, 65). Применяют также методы изучения генетических маркеров энтеротоксигенности, где результат исследования не зависит от способности конкретных штаммов продуцировать энтеротоксин в условиях in vitro, ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция и др. (14, 18, 47, 83, 60, 91). В отечественных нормативно-методических документах достоверным методом определения токсигенности чаще всего является биопроба на животных (котятах и щенках), что может быть применено очень ограниченно, только в бактериологических лабораториях, которые имеют виварий. Некоторую информацию относительно токсигенности стафилококков косвенно может дать изучение ряда биологических свойств выделенных культур (21,31, 38).

По мнению многих авторов для идентификации золотистых стафилококков наиболее перспективными являются тесты, направленные на обнаружение у них способности образовывать коагулазу, термостабильную нуклеазу и протеин А, а для обнаружения энтеротоксинов — иммуноферментный метод.

Для эффективной оценки роли стафилококков в возникновении пищевых отравлений самого факта выделения культуры стафилококков, даже коагулазопозитивных, недостаточно, тем более, что в пищевых продуктах, содержащих патогенные дозы энтеротоксина, жизнеспособные микробные клетки могут и не выявляться. Поэтому в процессе диагностики стафилококковых пищевых отравлений необходимо преследовать двойную цель: найти энтеротоксигенные стафилококки и выявить энтеротоксин. Оба патогена надо исследовать на всех этапах эпидемического цепи, и тогда определение стафилококков позволит конкретно выяснить источник и механизм развития токсизоза, а нахождение энтеротоксина в продукте и в материале от потерпевших — окончательно подтвердить диагноз пищевой стафилококковой интоксикации.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлась разработка иммуноферментной тест-системы для индикации стафилококкового энтеротоксина типа С в сыром молоке.

Для решения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень контаминации молока и секрета вымени лактирую-щих коров с различным состоянием молочной железы золотистыми, в том числе энтеротоксигенными, стафилококками.

2. Определить типы энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока и секрета вымени лактирующих коров и отобрать наиболее токсигенные штаммы для последующей иммунизации, выделить и очистить энтеротоксин типа С S. aureus.

3. Провести гипериммунизацию кроликов с целью получения антиэнтеро-токсических сывороток, выделить и очистить иммуноглобулины к энтероток-сину типа С золотистого стафилококка.

4. Создать иммуноферментную тест-систему к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка, изучить ее чувствительность и специфичность.

5. Разработать методику индикации энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке и определить ее эффективность.

Научная новизна

Получены результаты, характеризующие высокий уровень контаминации молока и секрета вымени коров энтеротоксигенными золотистыми стафилококками в зависимости от функционального состояния молочной железы. Определен спектр типов энтеротоксинов у золотистого стафилококка и выявлен энтеротоксин типа С как наиболее часто встречающийся в сыром молоке и секрете вымени здоровых и больных маститом коров.

Подобрана оптимальная плотная среда и способ культивирования для накопления стафилококкового энтеротоксина типа С. Получен в виде гомогенного белка очищенный концентрат энтеротоксина типа С. Установлена наиболее эффективная схема иммунизации кроликов, которая позволила за короткий срок с меньшими затратами энтеротоксина и без гибели подопытных животных получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.

Получены очищенные иммуноглобулины, которые были использованы для разработки тест-системы на основе ИФА для определения энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке, отработаны основные параметры тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции.

Разработан доступный способ пробоподготовки для ИФА с целью снижения фонового влияния компонентов сырого молока на чувствительность тест-системы.

Практическая значимость

На основании результатов исследований совместно с Шурдуба Н. А. и Сот-никовой В. М. разработаны «Методические рекомендации по разработке имму-ноферментной тест-системы для индикации и идентификации энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены: - 16-м Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2008 г.);

VI и VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008 гг.);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008 г.); расширенном заседании лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ (2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 5 научных статей, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Результаты, характеризующие уровень контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми и энтеротоксигенными стафилококками, типы энтеротоксинов;

• Материалы по разработке иммуноферментного метода обнаружения стафилококкового энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 стр. компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 163 источника (42 отечественных и 121 зарубежных авторов).

Похожие диссертационные работы по специальности «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», 06.02.05 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Нагорных, Алексей Михайлович

выводы

1. Из молока лактирующих коров, больных субклиническим маститом, было выделено 59,3% штаммов золотистого стафилококка, из секрета вымени коров с клинической формой мастита и сборного молока — 28,8% и 18,0% соответственно, тогда как из четвертей вымени клинически здоровых коров было выделено лишь 8,7% S. aureus.

2. Уровень контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров энтеротоксигеннымии штаммами золотистого стафилококка зависит от характера патологического процесса в вымени и составил 42,2% при субклиническом мастите, 36,4% — в сборном молоке, 33,3% при клинической форме мастита и 25,0% у здоровых коров.

3. Наиболее часто (53,8% от общего числа выделенных типов энтеротоксигенных штаммов S. aureus) в молоке и секрете вымени лактирующих коров обнаруживали золотистые стафилококки, продуцирующие только один энтеротоксин типа С. В 29,9% случаях у выделенных штаммов золотистого стафилококка обнаруживали способность одновременно вырабатывать 2-3 типа различных энтеротоксинов. Энтеротоксин типа С выявляли в 80,9% случаев среди выделенных энтеротоксигенных стафилококков, вырабатывающих данный токсин как отдельно, так и в комплексе с другими типами энтеротоксинов.

4. Подобрана наиболее оптимальная плотная питательная среда и способ культивирования на целлофане для накопления стафилококкового энтеротоксина типа С. Получен в виде гомогенного белка очищенный концентрат энтеротоксина типа С, проведена гипериммунизация кроликов по оптимальной схеме, получены гипериммунные диагностические антиэнтеротоксические сыворотки с титром 1:32 в реакции диффузной преципитации.

5. Предложена методика получения максимального выхода очищенных иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С при 45%-ном насыщении сульфатом аммония исходной гипериммунной сыворотки. На основе полученных антиэнтеротоксических иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С приготовлен конъюгат с коэффициентом чистоты 0,51.

6. Разработан доступный способ пробоподготовки сырого молока для ИФА, заключающийся в осаждении казеина в кислой среде и последующем центрифугировании образцов при 4 °С с целью удаления молочного жира и казеина.

7. Разработана специфичная иммуноферментная тест-система для обнаружения энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке с диагностической чувствительностью 97,2% по отношению к коммерческому диагностикуму. Чувствительность иммуноферментной тест-системы составила 8 нг/мл. предложения для практики

На основании проведенных исследований материалы по разработке иммуноферментной тест-системы для определения энтеротоксина типа С в сыром молоке включены в разделы 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 «Методических рекомендаций по разработке иммуноферментной тест-системы для индикации и идентификации энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)

Заключение

Методы обнаружения стафилококковых энтеротоксинов делятся на две категории: биологические и иммуносерологические. В настоящее время из биологических методов кроме теста кормления обезьян используют еще тест кормления котят и кожную пробу на сенсибилизированных энтеротоксином морских свинках. Однако биологические методы определения энтеротоксинов вытесняются серологическими, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле.

Все серологические методы, использованные для обнаружения стафилококковых энтеротоксинов, требуют специфической антисыворотки, от качества которой зависит и результативность того или иного метода. В свою очередь, высокоспецифичную сыворотку можно получить лишь после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов. Иммуносерологические методы, основанные на принципе гельдиффузии, включают технику простой или двойной диффузии в геле, которую проводят в пробирках или капиллярах, а также тест двойной гельдиффузии (микрометод) на стекле, встречный иммуноэлектрофорез и метод электроиммунодиффузии. Из этих методов чаще всего используют микрометод двойной гельдиффузии, как наиболее чувствительный и экономичный. Для быстрого обнаружения энтеротоксинов с успехом используется метод встречного иммуноэлектрофореза, а для количественного определения — электроиммунодиффузия.

Для выявления стафилококковых энтеротоксинов также разработаны методы пассивной гемагглютинации, агрегат-гемагглютинации, ингибирования гемагглютинации и латексагглютинации. Несмотря на то, что методы агглютинации обладают высокой чувствительностью, недостатком их является часто встречающаяся спонтанная агглютинация, что приводит к ложной интерпретации результатов.

В последнее десятилетие широкое распространение получили методы с использованием меченых антигенов или антител: радиоиммунологический и иммуноферментный методы.

Радиоиммунологический метод по-прежнему остается наиболее чувствительным и достоверным количественным методом определения антигенов и антител, что было доказано многочисленными сравнительными исследованиями. Однако нужно отметить следующие недостатки метода: ограниченный срок годности меченых реагентов, необходимость специальных условий для работы с радиоактивным материалом, высокая стоимость радиоизотопных манипуляций и счетного оборудования, необходимость разделения свободной и связанной метки.

Иммуноферментный анализ — один из наиболее перспективных и быстро развивающихся методов исследования биологически активных веществ. Ферментная метка, применяемая в иммуноферментном анализе, лишена недостатков, присущих радиоиммунологическому методу. Ее принципиальное преимущество в том, что меченные ферментом препараты могут длительно сохранять как иммунологическую, так и ферментативную активность. Стоимость реагентов, применяемых для анализа, невелика. Регистрацию результатов можно проводить визуально или при помощи спектрофотометра. По чувствительности иммуноферментный метод не уступает радиоиммунологическому.

Методы иммуноферментного анализа постоянно совершенствуются фирмами-производителями: повышается чувствительность и специфичность тест-систем, подбираются наиболее удобные условия для работы, сокращается число этапов проведения исследований, что способствует уменьшению возможности совершения ошибочных действий.

Своевременное обнаружение обсемененности продуктов энтеротоксигенными золотистыми стафилококками имеет важное значение в предупреждении пищевых отравлений, однако в ходе термической обработки продуктов они могут не обнаруживаться. В связи с этим необходим системный подход к исследованию продуктов на наличие энтеротоксинов золотистого стафилококка. собственные исследования

3.1 Материалы и методы исследований

Работа осуществлялась в период с 2006 по 2009 гг. в лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ в соответствии с ГНТП 08.05.02.10 «Разработать иммуноферментный метод индикации энтеротоксина золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах», а также на молочно-товарных фермах Московской, Вологодской и Смоленской областей, ветеринарным специалистам которых за предоставленную возможность работать в производственных условиях приносим глубокую благодарность. Было исследовано 442 пробы молока и секрета молочных желез от коров, выполнено более 1636 бактериологических, иммунологических, биохимических и микроскопических исследований.

Для выделения энтеротоксинобразующих штаммов S. aureus в хозяйствах отбирали пробы молока и секрета вымени от коров с различным состоянием молочной железы, а также сборное молоко из танков и фляг.

При диагностике субклинической формы мастита исследовали секрет молочной железы при помощи быстрого маститного теста, постановки пробы отстаивания и бактериологического исследования молока.

Быстрый маститный тест проводили с 2%-ным раствором мастидина в соответствии с «Рекомендациями по борьбе с маститом коров» (1983).

Для постановки пробы отстаивания использовали молоко, давшее положительную или сомнительную реакцию с мастидином. Из таких четвертей вымени в пробирки надаивали по 10 см3 молока, закрывали резиновой пробкой и оставляли в холодильнике. Реакцию учитывали через 16-18 ч. При наличии осадка высотой 0,1 см и выше реакцию считали положительной. Наряду с этим учитывали также изменение цвета молока и слой сливок.

Бактериологические исследования отобранных образцов проводили руководствуясь «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» (1983) и ГОСТом 30347-97 Молоко и молочные продукты. «Методы определения Staphylococcus aureus». В качестве питательных сред использовали солевой бульон, желточно-солевой агар или агар Байрд-Паркера.

Идентификацию золотистых стафилококков осуществляли на основе изучения способности коагулировать плазму крови кролика (ГОСТ 30347-97) и ДНК-азной активности (Lachica R.V et al., 1971). Для определения термостабильной ДНК-азной активности использовали готовый агар для теста на ДНК-азу с толуидиновым голубым (Himedia). Среду разливали в чашки Петри, подсушивали при 4 °С в течение 1 ч, вырезали лунки диаметром 3 мм, удаляли пипеткой агар и вносили в лунки пастеровской пипеткой культуры, затем инкубировали при 37 °С. Перед исследованием культур пробирки с суточным ростом стафилококков на сердечно-мозговом бульоне (BHI) прогревали в кипящей водяной бане 15 мин и вносили в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК агар и толуидин голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образовывались в результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНК-азой стафилококков. Появление через 1-4 ч после внесения розовоокрашенных зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНК-азы.

При постановке реакции плазмокоагуляции использовали сухую плазму крови кролика. Реакцию ставили в агглютинационных пробирках, куда вносили 0,5 мл разведенной плазмы и добавляли по 2 капли суточной бульонной культуры испытуемых стафилококков. Одновременно ставили контроль реакции (в одну пробирку вносили заведомо известный штамм плазмокоагулирующего стафилококка, в другую — только плазму). Учитывали результат реакции при инкубации в термостате через 1, 2, 3, 18 и 24 ч по образованию желеобразного сгустка.

С целью подтверждения принадлежности характерных для золотистого стафилококка культур к виду S. aureus также проводили определение их способности ферментировать маннит в анаэробных условиях. Для этого в пробирку с регенерированным кипячением и остуженным полужидким пептонным агаром с 0,5% маннита с хромогенным индикатором вносили уколом петлей исследуемую культуру и заливали стерильным вазелиновым маслом на высоту 2 см. Засеянные пробирки инкубировали 5 сут при 37 °С. Изменение окраски индикатора свидетельствовало о ферментации маннита. В качестве контрольных использовали пробирки со средой, но без посева исследуемой культуры.

Также дополнительным тестом, подтверждающим отношение исследуемых культур к стафилококкам является тест на каталазу. Для этого с суточной агаровой культуры снимали петлей бактериальную массу и на стерильном предметном стекле смешивали с 3%-ной перекисью водорода. Образование пузырьков газа свидетельствовало о том, что культура образует каталазу.

Таким образом, если культура обладала плазмокоагулирующей и термонуклеазной способностью, ферментировала маннит в анаэробных условиях, обладала каталазой, а также по морфологическим и культуральным характеристикам типична для золотистого стафилококка, то такой штамм относили к виду S. aureus.

В качестве референтной тест-системы использован иммуноферментный диагностикум RIDASCREEN®SET A,B,C,D,E (R-Biopharm, Германия). Анализ выделенных штаммов золотистого стафилококка на энтеротоксины проводили в соответствии с МУ 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах». В рамку планшета вставляли стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

Лунки А-Е и Н покрыты антителами к энтеротоксинам стафилококка, соответственно А, В, С, D, Е, а лунки F и G с адсорбированными антителами от неиммунизированных животных служат для отрицательного контроля. При добавлении по 100 мкл исследуемых растворов в лунки A-G, и положительного контроля в лунку Н во время инкубации в течение часа при комнатной температуре энтеротоксины связывались на поверхности лунки специфическими антителами. Затем после 4-кратной отмывки стрипа 250 мкл моющего буфера из лунок удалялись все несвязанные компоненты исследуемых растворов, после чего добавляли 100 мкл конъюгата антител к энтеротоксинам с пероксидазой. При инкубации (1 ч) конъюгат иммуносорбировался на поверхности лунок энтеротоксинами. После следующей промывки планшета в лунки добавляли 50 мкл раствора субстрата (пероксид карбамида) и 50 мкл хромогена (тетраметилбензидин) и оставляли на 3 мин в темноте. В результате химического взаимодействия субстрата с хромогеном образовывались окрашенные продукты реакции, свидетельствующие о наличии энтеротоксинов в исследуемых пробах. По истечении срока добавляли по 100 мкл стоп-реагента и в течение 60 мин измеряли оптическую плотность при 450 нм. Для каждой пробы отдельно вычисляли среднее значение оптической плотности отрицательного контроля. Оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, должна быть равна или больше 0,5. Средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль) должна быть равна или меньше 0,3.

Для получения токсинсодержащего материала культивирование отобранных штаммов S. aureus проводили на плотных питательных средах: 1. Среда Casman Е. Р. (1958), содержащая (г/л): гидролизата казеина 40,0; дрожжевого экстракта 10,0; агар-агара 1,5; гидрофосфата калия 1,0; тиамина гидрохлорида 0,0004; никотиновой кислоты 0,0012; кальция пантотената 0,005; дистиллированной воды до 1 л; рН 7,2-7,4. Витамины стерилизовали через мембранные фильтры № 2 (отдельно), остальные компоненты автоклавировали; 2. Мясо-пептонный агар, содержащий (г/л): питательного агара 35,0; NaCl 75,0; дрожжевого экстракта 50,0; воды дистиллированной до 1 л.

Токсигенную культуру выращивали с применением целлофана (Major R. F., 1978). Культивирование стафилококков проводили следующим образом: 30 стерильных чашек Петри заливали 15 мл расплавленной среды, после затвердевания агара на его поверхность помещали стерильный целлофан диаметром, большим диаметра чашки на 0,5 см. Посевной материал готовили путем смыва микробной культуры со скошенного питательного агара стерильным забуференным (рН 6,8-6,9) физраствором в объеме 2,0 мл. Взвесь стафилококков, смытых со скошенного питательного агара, наносили на поверхность целлофана и культивировали 48 ч при 37 °С. После инкубации культуры стафилококков смывали стерильным забуференным (рН 6,8-6,9) физраствором и центрифугировали при 3 500 g в течение 15 мин.

Очистку и концентрацию энтеротоксина проводили путем высаливания сульфатом аммония (Hebert G. A. et al., 1973), диализа в дистиллированной воде и концентрирования в полиэтиленгликоле (20 000 Д). Надосадочную жидкость, содержащую энтеротоксин, насыщали при комнатной температуре сухим сульфатом аммония. Сульфат аммония добавляли малыми порциями при тщательном перемешивании до полного растворения. После добавления сульфата аммония смесь помещали в холодильник (при 4 °С) на ночь. Образовавшийся за это время осадок отделяли центрифугированием при 3 500 g в течение 20 мин и перерастворяли его в дистиллированной воде в 1/10 части от исходного объема. Полученный раствор разливали в целлофановые мешочки и диализовали против дистиллированной воды до отрицательной реакции на сульфат ионы (контроль 10% раствором ВаСЬ). После этого диализат центрифугировали при 3500 g в течение 20 мин с целью удаления нерастворимых примесей.

Дальнейшая окончательная очистка энтеротоксина была проведена в химико-токсикологическом отделе Городской ветеринарной лаборатории ГУ «Московское объединение ветеринарии», сотрудникам которой приносим большую благодарность за помощь в проведении экспериментальных исследований. Полученный концентрат энтеротоксина обрабатывали ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,005 М Трис-HCl буфером рН 7,2. К одной части диализата добавляли одну часть влажной целлюлозы и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при медленном перемешивании. Затем смесь переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 7 880 g в течение 20 мин. С целью удаления оставшихся в растворе примесей использовали колонку размером 1,5x90 см, наполненную Сефадексом-С75. Сефадекс уравновешивали 0,05 М фосфатным буфером, содержащим 1 М NaCl рН 6,8. Сконцентрированный энтеротоксисодержащий материал осторожно наслаивали на поверхность Сефадекса G-75. Элюцию токсина проводили фосфатным буфером со скоростью 0,3-0,5 мл/мин. Сбор фракций проводили при помощи коллектора фракций.

Для последующей концентрации энтеротоксина применяли полиэтиленгликоль с молекулярной массой 20 000 Д. Для этого диализный мешок погружали в 50%-ный ПЭГ при 5 °С и выдерживали до тех пор, пока объем не снизится до 15-20 мл или меньше. Затем удаляли мешок из ПЭГ и тщательно промывали снаружи холодной водопроводной водой, замачивали в дистиллированной воде на 1-2 мин и в 0,2 М NaCl на 2-3 мин.

Концентрацию энтеротоксина и иммуноглобулинов определяли с помощью красителя кумасси бриллиантового синего G-250 по методу Sendmack Р., Grossberg М. С., 1977 на спектрофотометре СФ-26 (JIOMO, г. Санкт-Петербург). Метод основан на способности красителя в кислой среде вступать в комплекс с пептидами с молекулярной массой выше 10 000 Д. Об образовании комплекса судили по поглощению света при 595 нм на спектрофотометре.

Антиэнтеротоксические сыворотки получали путем иммунизации кроликов породы шиншилла весом 2,5-3 кг по трем схемам (изложены в собственных исследованиях).

При изучении титра антител антитоксических сывороток, полученных после иммунизации, использовали метод двойной радиальной иммунодиффузии в 1,5% агаровом геле Difco, USA (Ouchterlony О., 1958). 1,5 г агара Difco суспендировали в 100 мл 0,85% раствора NaCl и расплавляли на водяной бане. Горячий агарозный гель разливали слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляли их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делали лунки в геле, не допуская трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. Диаметр каждой лунки составлял 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносили автоматическими пипетками со сменными наконечниками, не допуская переливания. После заполнения чашки Петри закрывали крышками и инкубировали во влажной камере при температуре 25 °С. Реакцию учитывали не ранее чем через 48 ч. Чашки просматривали на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°.

Иммуноглобулины антиэнтеротоксических сывороток получали методом высаливания при комнатной температуре и постоянном перемешивании на магнитной мешалке насыщенным раствором сульфата аммония, забуференным до рН 7,3. Образующийся осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин, затем растворяли в дистиллированной воде и вторично осаждали сульфатом аммония при том же насыщении. Переосаждение повторяли еще один раз, затем осадок растворяли в физрастворе и удаляли избыток солей путем диализа против физраствора до отрицательной пробы с хлористым барием. Очищенный раствор иммуноглобулинов концентрировали в диализном мешочке против 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом

20 ООО Д. Препараты иммуноглобулинов хранили в замороженном состоянии при минус 20 °С.

Для получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена использовали метод перйодатного окисления (Nakane Р. К. and Kawaoi А., 1974). Была использована пероксидаза хрена тип IV с коэффициентом чистоты (RZ) 3,0 («Sigma», США).

Отработку оптимальных концентраций антител, антигенов и оптимального разведения конъюгата проводили в 5-кратной повторности.

Полистироловые планшеты с положительным контролем инактивировали путем погружения в кюветы, заполненные 3%-ным раствором хлорамина Б.

Определение пероксидазы в сыром молоке проводили по ГОСТ 3623-73 Молоко и молочные продукты «Методы определения пастеризации».

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с компьютерной программой Exel.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Нагорных, Алексей Михайлович, 2010 год

1. Азбелев В. Н. Приоритет профессора П. Н. Лащенкова в установлении этиологической роли стафилококка при пищевых токсикоинфекциях // Врачебное дело. 1951. - № 4. - С. 371-374.

2. Акатов А. К., Зуева В. С. Стафилококки. М.: Медицина, 1983. - 210 с.

3. Акатов А. К., Самсонова Т. М., Хатеневер М. Л. Классификация и биологическая характеристика коагулазоположительных стафилококков, выделенных от животных // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1983. - № 1. - С. 29-33.

4. Артемов А. А., Ванханен В. В. Идентификация источников загрязнения пищевых продуктов стафилококками // Рациональное питание. Киев, 1983. -вып. 18.-С. 101-103.

5. Архангельский И. И. Источники микробного загрязнения молока. В кн.: санитария производства молока. М.: Колос, 1970. - С. 9-13.

6. Бейлбаева М. Л., Тугамбаев Т. И. Методы иммунизации и их эффективность // Известия АН Казахе. ССР. 1983. - № 4. - С. 71-72.

7. Бугрова В. И. Стафилококковые энтеротоксины. Обзор // Вопр. питания. -1983.-№4. -С. 11-15.

8. Васенко С. В. Методы получения и очистки стафилококкового энтеротоксина // Актуальные вопр. инфекц. и инваз. болезней ж-х. М., 1995.-С. 88-91.

9. Гасанов Н. Г. Изучение гемолитической, коагулазной и ДНК-азной активности стафилококков / Рукопись. — М. — 1988. — 11 с.

10. Генералова А. Г., Бержц В. М. Идентификация Stahylococcus aureus путем определения нуклеазной активности и методом многомерного статистического анализа // Журн. микробиол. 1998. — № 3. — С. 6-10.

11. Демидова JT. Д., Юрков В. М., Миляновский А. Г. Актуальные проблемы санитарии производства молока // Проблемы вет. санитарии и экологии: Сб. науч. тр. ВННИВСГЭ. М., 1995. - Т. 98. - С. 103-113.

12. Доморадская Т. Н. Современные методы обнаружения энтеротоксигенных стафилококков в продуктах питания // Вопр. питания. — 1991.-№ 1. С.7-12.

13. Дорофеева И. К., Москаленко' Ю. С. Опыт изучения пищевой токсикоинфекции стафилококковой этиологии // Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии. — Ростов/Дон, 1981. — С.53.

14. Карташова В. М., Гинзбург А. А. Разработка ускоренного метода индикации патогенных стафилококков в молоке коров с помощью РДПА // Дезинфекция в промышленном животноводстве. М., 1980. — С. 14-17.

15. Керопиан Е. А., Коротаев А. И.' РНК-азная активность как косвенный показатель энтеротоксигенности стафилококков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1979. № 7. - С. 112-113.

16. Куваева Н. Б., Кармеканова Н. Р., Лукина JI. Б. Обнаружение энтеротоксигенных стафилококков в молоке и сыре // Вопр. питания. 1994. - № 4. - С. 29-31.

17. Кулиева Э. М., Шуман М. С. О вспышке стафилококковой пищевой интоксикации // Актуальные вопросы мед. паразитологии и тропической медицины. Баку, 1981.-С. 116-117.

18. Красницкая Е. С. К вопросу о стафилококковых интоксикациях в РСФСР // Гигиена и санитария. -1960. № 1. - С.74-76.

19. Куридзе Д. Г. Получение очищенного стафилококкового С2-энтеротоксина и антисыворотки к нему // Сб. научн. тр. Моск. вет. академии. -1985.-С. 53-55.

20. Методические указания 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах» // Утв. фед. службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008 г.

21. Молоко и молочные продукты. «Методы определения Staphylococcus aureus», ГОСТ 30347-97, «Методы определения пастеризации», ГОСТ 3623

22. Методические указания по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров // Утв. ГУВ МСХ СССР, 1983.

23. Нагорных А. М. Иммуноферментный метод определения стафилококкового энтеротоксина типа С в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока здоровых и больных маститом коров // «Ветеринарная патология». — Москва, 2009. № 4. - С. 23-27.

24. Оксамитный Н.К. О некоторых патогенных свойствах стафилококков // Труды ВНИИВС. 1970. -№ 36. - С.101.

25. Осташевский А. Г., Образцов В. П., Котенко И. И. Применение реакции преципитации для определения энтеротоксигенности стафилококков // Материалы научно-производств. конф. по ветеринарной гигиене продуктов животноводства. Минск, 1968. - С. 4.

26. Павлова Ж. П., Дедюхина В. П., Ляхова И. С. Обсемененность сырого молока токсигенным стафилококком и его устойчивость при пастеризации // Вопр. питания. 1989. - № 1. - С. 67-68.

27. Петрас П., Машкова Л. Выявление стафилококковой энтеротоксигенности // Журн. гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Прага, 1984. - Т.28. - № 3. - С. 305-314.

28. Рекомендации по борьбе с маститом коров // Утв. ГУВ МСХ СССР. 1983.

29. Седова Н. Н., Попова Т. Я. Обнаружение стафилококковой термостабильной ДНК-азы в бульонных культурах и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1982. - № 4. - С. 67-69.

30. Стаканчикова И. М. Определение типов энтеротоксинов золотистого стафилококка в продуктах молочного происхождения // Мат. междунар. научно-практич. конф. «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». Ульяновск, 2008. — С. 118.

31. Флуер Ф. С. Быстрый метод коагглютинации для типирования стафилококковых энтеротоксинов типов А и В с использованием сенсибилизированных антиэнтеротоксическими антителами стафилококков, содержащих белок А // Иммунология. 1985. - № 2. - С. 711-72.

32. Флуер Ф. С. Определение стафилококковых энтеротоксинов типа А, В, С2 методом агрегат-гемагглютинации // Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. — 1982. — С. 81-82.

33. Флуер Ф. С. Определение стафилококковых токсинов А и В в пищевых продуктах иммуноферментным методом // Вопр. питания. -1991.-№3.-С. 56-59.

34. Флуер Ф. С. Бактериальные энтеротоксины и проблемы их дальнейшего изучения // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, 2002. -Т.1.-С. 267-268.

35. Хоулт Дж. и др. Определитель бактерий Берджи, 9 изд. М., Мир, 1980.

36. Шурдуба Н. А., Сотникова В. М., Нагорных А. М. Определение энтеротоксигенности S. aureus, выделенного из молока и молочных продуктов // В сборнике научных трудов ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». № 1. — 2009. - С. 20-23.

37. Abbar F. М., Mohammed М. Т. Selected biological properties of enterotoxigenic staphylococci isolated from milk // J. of Food Propertion. 1986. -Vol. 49. — № 11. — P. 871-873.

38. Adekeye D. Enterotoxin production by strains of S. aureus isolated from animals and man in Nigeria // Vet. Microb. 1980. - № 5. - P. 143-150.

39. Adesiym A. A., Usman B. Isolation of enterotoxigenic strains of staphylococci from dogs // Vet. Micr. 1983. - Vol. 8. - № 5. - P. 459-469.

40. Adesiyun A. P. Characteristics of S. aureus strains isolated from bovinemastitis milk; bacteriophage and antimicrobial agent susceptibility and enterotoxigenicity // J. Veter. Med. Sc. B. 1995. - Vol. 42. - № 3. - P. 129-139.

41. Aldridge et al., Comparison of Rapid Identification Assays for Staphylococcus // Clin. Microbiol. 1984. - Vol.19 (5). - P. 703-704.

42. Ashour M. M., Omar M. M. Production of enterotoxin D by S. aureus in milk and some milk products // Zeitschrift fur die Gesamte Hygiene and ihre Grenzgebiete. 1984. - Vol. 30. - № 3. - P. 159-160.

43. Avena R. and Bergdoll M. Purification and Some Physicochemical Properties of Enterotoxin C, Staphylococcus aureus Strain 361 // Biochem. -1967.-Vol. 6.-P. 1474.

44. Baker et al., Evaluation of Various Rapid Agglutination Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 21(5). -P. 726-729.

45. Balint J., et al. Detection and Characterization of Staphylococcal Enterotoxin В in Protein A Preparations Purified by Immunoglobulin G Affinity Chromatography // Immun. Meth. 1989. - P. 116-127.

46. Becker H. et al. Nachweis von Staphylococccus-aureus-Enterotoxinen in Lebensmitteln mit kommerziellen Enzymimmuntests // Archiv fur Lebensmittelhygiene. 1994. - Vol. 45. - P.25-48.

47. Becker H., Gang-Stiller K. Characterization of staphylococcus aureus strains isolated from raw milk with special reference to the clumping factor // Netherl. Milk Dairy J. 1989. - Vol.43. - № 3. - P. 355-366.

48. Berdal B. P., Olavik O. et al. A sandwich ELISA method for detection of S. aureus enterotoxins // Acta patologica et microbiologica Scandinavica. 1981.

49. Vol. 89. № 6. - P. 411-417.

50. Bennett R. W. et al. Visual screening with enzyme immunoassay for stahylococcal enterotoxins in foods // J. of the AOAC International, 1994. Vol. 77. - P. 27-32.

51. Bergdoll et al. A New Staphylococcus Enterotoxin. Enterotoxin F. Associated with the Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus // Lancet 2. -1981.-№9.-P. 1017-1021.

52. Bergdoll M. et al. Identification of a New Enterotoxin as Enterotoxin С // Bacteriol. 1965. - P. 90.

53. Bergdoll M. et al. Identification of Enterotoxin E // Immun. 1971. - P. 593.60.' Blomster-Hautarnaa D. et al. Preparation of Toxic Shock Syndrome Toxin-1 // Methods in Enzymology. 1988. - P. 165-172.

54. Bolstrielge M. C., Roth G. Enterotoxigenicity of strain of S. aureus isolated from milk and milk products // Suid Afrikaance Tydoknifvir Sauvelkinde. 1985. -V. 17. - № 3. - P. 91-95.

55. Burdova O. Determination of St. enterotoxins in milk products by three methods // Arch. Veter. Pol. 1994. - Vol. 34. - Fasc. Уг. - P. 69-74.

56. Berke et al. Evaluation of Rapid Coagulase Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1986. -. 23 (5). - P. 916-919.

57. Brooks J. Sensitive Enzyme-Amplified Electrical Immunoassay for Protein A-Bearing Staphylococcus aureus in Foods // App. and Envir. Microbiol. 1990. - P. 3278-3284.

58. Brown W. J. Comparison of a Yellow Latex Reagent with Other Agglutination Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1986. - Vol/23. - P. 640-642.

59. Buning-Pfane H. et al. Einfache methode fur den nachweis von staphylokolken enterotoxin В in vanillepudding mittels ELISA-test // Zbl.1.bensm. Uters. Forsch. 1981. - № 173. - P. 351-355.

60. Bystron J., Molenda J. et al. Occurrence of enterotoxigenic strains of St. aureus in raw poultry meat // Pol. J. veter. Sc. 2005. - Vol. 8. - № 1. - P. 3740.

61. Bystron J., Molenda J. Staphylococcal enterotoxins // Advances in Agricultural Sc. 2004. - № 9. - P. 19-22.

62. Casman E. P., Bennett R. W. et al. The microslide gel doubie diffusion test for the detection and assay of staphylococcal enterotoxins // Health Lab. Sci. -1969.-№6.-P. 186-198.

63. Chang H. C. and Bergdoll M. Purification and Some Physicochemical Properties of Staphylococcal Enterotoxin D // Biochem. 1979. - P. 18-24.

64. Chu F.S., Thadhani K. Purification and characterization of staphylococcal enterotoxin A// Biochemistry. 1966. - Vol.5. - P. 3281-3289.

65. Das A. K., Panda S. N. Studies on staphylococcus aureus of bovine origin including phage typing // Anim. Health. 1990. - Vol. 29. - № 1. - P. 17-22.

66. Davison N., Dack G. M. Some chemical and physical studies of staphylococcus enterotoxin // Infection Dis. 1939. - № 64. - P. 302-306.

67. Deverise L. A. Identification of pathogenic staphylococci isolated from animals derived from animals // Appl. Bacter. 1980. - Vol. 49. - P. 1-11.

68. Dickie N., Konowalchuk J. Rapid solid-phase radioassay for staphylococcal protein A // Canad. J. Microbiol. 1977. - Vol. 23. - P. 832-834.

69. Dickie N., Akhtar S. Improved radioimmunoassay of staphelococcal enterotoxin A // Asmoc. Off. Anal. Chem. 1982. - № 65. - P. 180-184.

70. Doern G. V. Evaluation of a commercial latex agglutination test for identification of S. aureus // Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19. - P. 191-193.

71. Donelly С. В., Leslie J. E. Serological identification of enterotoxigenic staphylococci from cheese // Appl. Micr. 1967. - № 15. - P. 1382-1387.

72. Essers et al. Rapid and Reliable Identification of Staphylococcus aureus bya Latex Agglutination Test // Clin. Microbiol. 1980. - Vol.l2(5). - P.641-643.

73. Evans J. В., Ananaba C. A. Enterotoxin production by atypical S.aureus from poultry // The J. of Appl. Bacter. 1983. - Vol. 54. - № 2. - P. 257-263.

74. Evenson M. L. et al. Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk // Int. J. Food Microbiol. 1988. - Vol. 7. - P. 311-316.

75. Fast D. et al. Toxic Shock Syndrome-Associated Staphylococcal and Pyrogenic Toxins Are Potent Inducers of Tumor Necrosis Factor Production // Infect. Immun. -1989. P. 291-293.

76. Fey H., Pfister H. Comparative evaluation of different enzyme-Linked immunosorbent assay systems for the detection of staphylococcal enterotoxin A, В and С // Clin. Micr. 1984. - № 19. - P. 34-38.

77. Freed В. C., Bvanasin M. J. Enzyme-ldenked Immunosorbent Assay for detection of staphyloccal Enterotoxins in Foods // Appl. Emvir. Microb. 1982. -44.-P. 1349-1355.

78. Fung D. Y., Steinberg D.H. Thermal activation of staphylococcal enterotoxin В и С // 1981. P. 321-324.

79. Fung D. Y., Wagner S. Cappilary tube assay for staphylococcal enterotoxin А, В and С // Appl. Microbiol. 1974. - № 21. - P. 559-591.

80. Freer J. and Arbuthnott J. Toxins of Staphylococcus aureus // Pharmac. Ther. -1983.-P. 55.

81. Garcia M. L., Garcia M. C., Otero A. et al. Biotypes of coagulase-positive staphylococci associated with bovine mastitis // Proc. Appendix. Stockholm. -1989. P. 24.

82. Garcia M. L. et al. Characterization of Staphylococci Isolated From Mastitic Cows in Spain // 39 Applied Environ. Microbiol. 1980. - P. 548-554.

83. Goldstein J. Microtube coagulase tests for detection of coagulase-positive staphylococci // Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 15. - P. 848-851.

84. Gunn В. A. et al. Comparison of Methods for Identifying Staphylococcus and Micrococcus spp // Clinical Microbiol. 1981. - P. 195-201.

85. Guzman et al. Novel Immunoenzvrnatic Assay for Identification of Coagulase and Protein A-Negative Staphylococcus aureus Strains // Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30 (5). - P. 1194-1197.

86. Hahn I. F., Pickenhahn P. An avidin-biotin ELISA for the detection of staphylococcal enerotoxins A and В // Immunol. Methods. 1986. - Vol. 92. - № 1,-P. 25-29.

87. Hebert G. A. et al. Determination of the optimal ammonium sulfate concentration for the fractionation of rabbit, sheep, horse and goat antisera. // Appl. Microbiol. 1970. - № 25. - P. 26-36.

88. Hcrooka E. Y. Enterotoxina estafilococica: avancos metodologicos na deteccao em alimentos // Semina. 1993. - Vol. 14. - № 1. - P. 32-35.

89. Hilker J. S., Heilman W. S. Heat inactivation of enterotoxin A from S. aureus in veronal buffer //Appl. Micr. 1968. - № 16. - P. 308-310.

90. Hogan J. S., Cornetta A. Comparison of four test procedures to identify Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infections // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47. - № 9. - P. 2017-2019.

91. Holeckova B. Production of enterotoxins by St. aureus isolated from sheep milk // Bull. Veter. Inst, in Pulawy. 2004. - Vol. 48. - № 1. - P. 41-45.

92. Huang I. and Bergdoll M. The Primary Structure of Staphylococcal Enterotoxin В // J. Biol. Chem. 1970. - P. 245.

93. Humber J. K., Denny С. B. Influence of pH an the heat inactivation of staphylococcal enterotoxin A as determined by monkey feeding and serological assay //Appl. Microb. 1975. - № 30. - P. 755-758.

94. Iandolo J. Genetic Analysis of Extracellular Toxins of Staphylococcus aureus //Ann. Rev. Microbiol. 1989. - P. 343-375.

95. Kato E., Kumo T. Enterotoxigenicity of bovine Staphylococci isolated from California Mastitis test-positive milk // Jpn. Vet. Res. 1980. - № 28. - P. 75-85.

96. Kauffman P. E. Ensyme immunoassay for staphylococcal enteroloxin A // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1980. - № 63. - P. 1138-1143.

97. Korpysa W. et al. Osek J. Enterotoksyny gronkowcowe oraz ich wykrywanie w mleku, przetworach mlecznych // Med. Weter. 2005. - Vol. 61. -6.-P. 633-636.

98. Kuroishi Т., Komine K., Itigaki M. Cases of clinical staphylococcal mastitis accompanied by increased staphylococcal enterotoxin-C in mammary-gland secretion // Japan Veter. Med. ASSN. 2002. - Vol. 56. - № 3. - P. 147-151.

99. Lachica R.V. Simplified theromonuclease test for rapid identification of Staphylococcus aureus recovered on agar media // Appl. Environm. Microbiol. -1976. Vol. 32. - P. 633-634.

100. Lairscey et al. Performance of Four Slide Agglutination Methods for Identification of Staphylococcus aureus When Testing Methicillin-Resistant Staphylococci // Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25. - № 1. - P. 181-182.

101. Lakner M., Schneider E., Usleber E. et al. Development and application of immunochromatografic tests for the detection of staphylococcal enterotoxin E //

102. Food agr. Immunol. 1998. - Vol.10. - № 3. - P. 249-257.

103. Lamaita H. C., Cerqueira M. M., Carmol S. Staphylococcus sp. counting and detection of Staph, enterotoxins and toxic shock toxin syndrome from cooled raw milk // Agr. Brasil. Med. Veter. Zootech. 2005. - Vol. 57. - № 5. - P. 702709.

104. Lim Y. S., Jegathesan M. Relationship of some biochemical characteristics of S. aureus to enterotoxin production // Transaction of the royal society of tropical medicine and hygiene. 1986. - Vol. 80. - № 6. - P. 972-975.

105. Lens W., Thelen R. Detection of Enterotoxin in cultures of S.aureus by ELISA and the Microslide Immunodiffusion // Zbl. fur Bacter. Microbiol, und Hyg. 1983. - Vol. 253. - № 4. - P. 466-476.

106. Lim Y.S. Serological detection of enterotoxin from strains of S. aureus isolated in Malaysia // Singap. Med. J. 1995. - Vol. 26. - № 3. - P. 304-306.

107. Major P. Quantitative determination of staphylococcal B-type enterotoxin with Leeriest electicimurne diffusion method // Aeta Microb. Acad. Sci. 1979. — № 26. - P. 333-336.

108. Mayer R. F. Palmieri N. Y. Single radiani immunodiffusion method for screening staphylocoocal isolated for enterotoxin // Appl. Environ. Microbiol. -1980. № 40. - P. 1080-1085.

109. Morse S. A., Mah R. A. Microtiter hemagglutination-inhibition assaystaphylococcal enterotoxin В // Appl. Microbiol. 1967. - № 15. - P. 58-61.

110. Niskanen S.N. et al. Evaluation of Three Slide Agglutination Tests for Rapid Identification of S. aureus // Acta vet scand. 199 J. - Vol. 32. - P. 543-549.

111. Nacane P. K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjgation // Histochem. Cytochem. 1974. - Vol. 22. - P. 1084-1091.

112. Olsvik Q., Berdal B. A sensitive ELISA method for protein A detection // Acta pathol. Microbial. Scand. 1981. - Vol. 89. - P. 289-290.

113. Olsvik Q., Foseum K. Staphylococcal enterotoxin A, B. arid С produced by coagulase-negative strains within the family Micrococcacese // Acta Patol. Microb. et lmmun. Scand. 1982. - Volt-90. 6. - P. 441 -445.

114. Otenhajmer I., Mitis S. C. Correlation between the production of enterotoxin A and В and' some biochemical characteriction of S. aureus strains isolated from milk and dairy products // Acta Veterinaria. 1974. - Vol. 24. - № 6. - P. 255259. • •' ■ '

115. Ouchterlony- O.^ Diffusion-in-gel methods for immunological analysis // Prog.-allergy. 1958. - Vol. 5. - P. 1-77.

116. Park С.'E.'et al. Evaluation of a-commercial enzyme immunoassay kit (RIDASGREENR) for detiction of staphylococcus enterotoxins А, В, C, D and E in foods // Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60. - P. 677-681.

117. Reiser R. F., Robbins R. N. Purification and Some Physicochemical Properties of Toxic-Shock Toxin // Biochemistry. 1983. - Vol. 22. - P. 39073912.

118. Reiser R. F., Conaway D. Detection of staphylococcal enterotoxin in foods // Appl. Microbiol. 1974. - Vol. 27. - P. 83-85.

119. Reiser R. F., Robbins R. N. Identification, purification and some Physicochemical properties of staphylococcal Enterotoxin C3 // Infec. Immun. -1984. № 45. - P. 625-630.

120. Reyes L. Determination of enterotoxigenicity of strain of S. aureus isolated from sheese // Revista Latinoamer. Microb. 1984. - Vol. 26. - № 26. - P. 277283.

121. Robern H., Cluson T. The use of polyethylene glycol in radioimmunoassay of staphylococcal enterotoxins // Can. J. microbial. 1978. - № 24. - P. 765-766.

122. Salomon L. L., Tew R. W. Assery of staphylococcal enterotoxin В by latex agglutination // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - № 129. - P. 539-542.

123. Sanders G. G., Bartlett M. L. Double antibody solid phase enzyme immunoassay for detection staphylococcal enterotoxin A // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - № 34. - P. 518-522.

124. Shibata J., Morita M., Amano J. The passive hemagglutination inhibition test for detection of staphylococcal enterotoxin В with sensitized and lyophilized red blood cells // Micr. Immun. 1977. - № 21. - P. 45-48.

125. Schocken-Iturrino R. P., Furlanetto S. M. Enterotoxigenic S. aureus in milk saples from mastitis cows //Ars. Veterin. 1986. - Vol. 2. - № 1. - P. 69-74.

126. Sendmack P., Grossberg M.C. A rapid, sensitive and versalite assay for protein using Comassie brilliant blue G-250 //Ann.Biochem. 1977. - Vol. 93. -P. 499-529.

127. Shinagawa K., Tanabayashi K., Kogure Y. Incidence and population of enterotoxigenic staphyloccus aureus in raw milk from milking to milk plant //

128. Veter. Sc. 1988. - Vol. 50. - № 5. - P. 1060-1064.

129. Shitandi A., Gathoni K. Toxin production by St. aureus from cases of bovine mastitis in Kenya //Agr. Trop. Subtrop. Praghe, 2003. - Vol. 36. - P. 46-51.

130. Silwarman G. J. Entertotoxin secretion during Extended Growth of S. aureus on Agar Surfaces // Bact. Prot. Toxin. 1984. - № 24. - P. 119-121.

131. Smith J. L. et al. Enterotoxin A synthesis in S. aureus: Ingibition by Glycerol and Maltose // Cen. Microb. 1986. - Vol. 132. - P. 3375-3381.

132. Soo H. M., Tatini S. R., Bennett R. V. Thermal enactivation of staphylococcal enterotoxin A and D in certain foods // Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Micr. 1974. - № 74. - P. 14.

133. Spero L., Griffin B. Effect of single and double peptide bond Scission by trypsin on the structure and activity of staphylococcal enterotoxin С // Biol. Chem. 1976. - Vol. 251. - P. 5580-5588.

134. Stelma G. N. Inactivation of Staphylococcal enterotoxin A by Chemical Modification // Biochem. Biophysic. 1982. - Vol. 105. - № 1. - P. 121-127.

135. Stiffer-Rosenberg G., Fey H. Simple assay for staphylococcal enterotoxin A, В and C:modification of enzyme-linked immunosorbent assay // Clin. Microbiol. -1978.-№8.-P. 473-479.

136. Su C.Y., Wong A. C. Current perspectives on detection of staphilococcal entertotoxin // Food Protect. 1997. - Vol 60. - P. 195-202.

137. Sugiyama H., Bergdoll M. S., Dack G. M. Early development of a temporary resistance to the emetic action of staphylococcus enterotoxin // Infect. Dis. 1962. - Vol. 3. - № 3. - P. 233-238.

138. Sommerfeld P., Terplan G. Methoden sum Nachweis von Staphylokokken enterotoxinen //Arch. Lebensmit. 1975. - № 26. - P. 128-137.

139. Takeshige K., Watanabe K., Igarashi H. Detection of S. aureus in Bovine Mastitis and Some Characteristics with Special Reference to Enterotoxin Producibility and Coagulase Types of Isolates // Jpn. J. Vet. Sci. 1983. - Vol. 45.-№3.- Р. 355-362.

140. Tranter H.S. Production purification and identefication of the staph, enterotoxin I I J. of App. Bacter. Symposium Supp. 1990. - Vol. 69. - P. 123-145.

141. Velan B. Chemiluminescence immunoassay: a new sensitive method for determination of antigens // Immunochemistry. 1978. - № 15. - P. 331-333.

142. Wairather F. J., Lewis E. E. Rapid quantitative serological assay of staphylococcal enterotoxin В //Appl. Microb. 1966. -№ 14. - P. 284-291.

143. Wanger S. et al. Latex Agglutination-Negative Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Recovered from Neonates: Epidemiologic Features and Comparison of Typing Methods // Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 10. -P: 2583-2588. ■

144. Watts J. L., Pankey J. W. Evaluation of the Staph-Ident and STAPHase systems for identification of staphylococci from bovine inlramammaiy infections // Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20. - P. 448-452.

145. Weiss R. et al. Zum Nachweis der Protein-A-Bilding von Staphylokokken mittels der ELISA-Technik // Zbl. Vet. Med. 1984. - Vol. 31. - P. 424-434.

146. Windemann H., • Baumgarther P. S. Application of Ensyme-Linkcd Immunosorbents Assay (ELISA) with Labeled Antegen for Detection of Staphylococcal enterotoxins А, В and С in foods // Zbl. Bacter. microb. Hyg. -1985. Vol. 181. - № 3-5. - P. 345-364.

147. Yamada S., Igarashi H. Improved reversed passive hemagglutination foi simple and rapid detection of staphylococcal enterotoxins A-E in food // Micr. Immun. 1977. - № 21'. - P. 675-682.

148. Yolken R. ' H., Leister F. ' J. ' Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates versatile tools for enzyme immunoassays // J. ol Immunological Methods. 1981. - Vol. 43. - P. 209-218.

149. Zarsour J.!, Bailie E. Evoluation of Three test procedures for Identefication of S. aureus from Clinical Sources // Clin: Microbiol. 1978. - № 8. - P. 133-136.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.