Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Мосина, Алёна Геннадьевна

  • Мосина, Алёна Геннадьевна
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2013, МоскваМосква
  • Специальность ВАК РФ02.00.10
  • Количество страниц 120
Мосина, Алёна Геннадьевна. Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов: дис. кандидат химических наук: 02.00.10 - Биоорганическая химия. Москва. 2013. 120 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Мосина, Алёна Геннадьевна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1.Основные способы определения низкокопийных пептидов

1.1.1. Иммуно-ПЦР

1.1.2. ДНК-аптамеры

1.1.3. Полимеразная цепная реакция

1.1.3.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции

1.1.3.2. Компоненты реакции

1.1.3.3. Температурные режимы программы ПЦР

1.1.3.4. Оценка результатов реакции

1.1.3.5. Полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени

1.1.3.6. Факторы, влияющие на чувствительность и достоверность количественной ДНК-диагностики

1.1.3.7. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени»

1.1.3.8. Типы зондов в специфических системах детектирования

1.1.3.8.1. Праймеры-зонды («скорпионы»)

1.1.3.8.2. «Вытесняющие» зонды

1.1.3.8.3. Линейные зонды (TaqMan)

1.1.3.8.4. Зонды «молекулярные маячки» (Molecular beacons) . 3

1.1.3.8.5. Примыкающие пробы

1.1.3.8.6. Зонды типа «Perfect probe»

1.2.1. Исчерпывающий гидролиз биологически активных пептидов

1.2.2. Методы разделения и анализа аминокислот

1.2.3. Капиллярный электрофорез

1.2.4. Особенности капиллярного электрофореза аминокислот

1.2.5. Способы детектирования аминокислот

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Приборы и оборудование

2.3. Приготовление рабочих буферных растворов

2.4. Общая методология работы

2.4.1. Приготовление кислотных гидролизатов природных пептидов

51

52 56

2.4.2. Анализ смеси стандартных аминокислот и гидролизатов биологически активных пептидов

2.4.3. Синтез нуклеопротеиновых конъюгатов

2.4.4. Масс-спектрометрический анализ

2.4.5. Нуклеазный гидролиз

2.4.6. ПЦР в режиме реального времени конъюгата

2.4.7. Синтез олигонуклеотидов, содержащих гексахлорфлуоренильную метку

2.4.8. Очистка зондов методом вертикального гель-электрофореза

2.4.9. Выделение зондов из ПААГ

2.4.10. ВЭЖХ-очистка НЕХ-зондов

2.4.11. ПЦР в режиме реального времени на основе НЕХ-зондов . 61 2.5. Статистическая обработка результатов КЭ

2.5.1. Расчет селективности разделения

2.5.2. Оценка воспроизводимости

2.5.3. Оценка правильности

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопийных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала

3.2. Оптимизация флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК в режиме реального времени с использованием зондов, содержащих гексахлорфлуоренильную метку

3.3. Оптимизация анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного электрофореза

Приложение А

4. ВЫВОДЫ

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГХ - газовая хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

ИОХ - ионообменная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

КЗЭ - капиллярный зональный электрофорез

КЭ - капиллярный электрофорез

МС - масс-спектрометрия

ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

РНК - рибонуклеиновая кислота

СТВ - стрептавидин

Темед - N,N,N',N"- тетраметилэтилендиамин

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ЭОП - электроосмотический поток

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

ACR-акридин

BHQ2 - 4'-(4-нитро-фенилдиазо)-2'- метокси-5'-метокси-азобензол-4"-(М-этил)-М-этил-2-циапоэтил-(М,Ы-диизопропил)

BSP - фосфодиэстераза II из селезенки крупного Рогатого скота CMV -цитомегаловирус

Су5-1-(3-(4-монометокситри'1илокси)про11ил)-Г-(3-((2-цианоэтил)-(М,Н-

диизопропил)фосфорамидитил)пропил)-3,3,3',3'- тетраметилиндодикарбоциан

EI - ионизация электронным ударом

ESI - ионизация электрораспылением

FAM - б-флуоресцеинил-б-карбоксиамидогексил

HEX - гексахлорфлуоресцеин

HS V - вирус герпеса

MALDITOF MS (Малди) - ионизация с помощью лазерной десорбции из матрицы

Real Time ПЦР - ПЦР в режиме реального времени

ROX - карбокси-Х-родамин

Tris (Трис) - трис(гидроксиметил)аминометан

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Выявление пептидов и последующее изучение аминокислотного состава является важной задачей для контроля качества лекарственных препаратов и клинической диагностики социально-значимых заболеваний. В связи с этим возрастает необходимость разработки простых и недорогих чувствительных методов анализа пептидов, проявляющих биологическую активность. Также актуально на сегодняшний день развитие новых подходов в протеомном анализе для обнаружения низкокопийных пептидных биомаркеров. Это необходимо для определения особенностей индивидуального развития в области персонифицированной, спортивной медицины, геронтологии, а также для ранней диагностики заболеваний.

Перспективная задача клинической диагностики сегодня связана с идентификацией биомаркеров патологических состояний белковой природы, в качестве которых могут выступать низкокопийные пептиды. Большая часть имеющихся методов анализа не позволяют, к сожалению, в ходе одного эксперимента обнаружить присутствие низкокопийных пептидов. Поэтому для повышения предела чувствительности детекции маркерных пептидов необходимо использовать сочетание инструментальных микрометодов анализа (ВЭЖХ, MALDI TOF MS, электрофоретические и др.) и новых приемов аффинного обогащения пептидов [1,2].

Прогресс в области разработки и внедрения медицинских микроаналитических методов диагностики в значительной мере обусловлен использованием ДНК и ее фрагментов. Предпосылкой для этого служит способность полинуклеотидов высоко специфически ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями. Наиболее перспективный сегодня метод определения содержания в образцах сиквенс-специфичной ДНК (ПЦР, полимеразная цепная реакция) основан на использовании комплементарных взаимодействий олиго- и полинуклеотидов. Развитие методов ПЦР в реальном масштабе времени (Real Time ПЦР) позволяет

сегодня не только идентифицировать целевую последовательность ДНК в клиническом образце, но и достоверно оценить ее количество [3,4].

В настоящее время остается актуальной разработка и оптимизация методов аминокислотного анализа как синтетических, так и природных биологически активных пептидов. Это связано с тем, что некоторые пептиды могут иметь модификации в аминокислотном составе. Поэтому при контроле качества лекарственных препаратов необходимо подтверждение их подлинности, что особенно важно в связи с перспективами использования бактерицидных пептидов [5]. При классических условиях кислотного гидролиза происходит частичная потеря некоторых аминокислот, что не дает полной информации о составе исследуемого пептида. Для проведения анализа с помощью традиционных методов требуется сложное аппаратурное оформление и большой объем дорогостоящих токсичных реактивов для предколоночной или постколоночной дериватизации.

На основании всего выше изложенного становится очевидной необходимость разработки и оптимизации методов анализа для повышения чувствительности и надежности количественного определения низкокопийных пептидных биомаркеров и аминокислотного состава биологически активных пептидов в клинико-диагностических и фармакологических целях.

Представленная работа является частью научных исследований, проводимых в лаборатории искусственного антителогенеза Федерального государственного учреждения НИИ ФХМ ФМБА России в рамках проекта № 09-04-12133-офи_м «Нуклеопротеиновые конъюгаты для повышения эффективности протеомного анализа».

Цель работы заключается в разработке химических основ повышения чувствительности определения единичных молекул пептидных биомаркеров и оптимизации методов анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов.

Задачи исследования.

1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопийных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала, включающей стадии:

- аффинного связывания пептидов с модифицированными ДНК-аптамерами, снабженными реакционноспособной группой и маркерной нуклеотидной последовательностью;

- получение нуклеопротеиновых конъюгатов;

- исчерпывающее ферментативное расщепление исходного олигомера и частичное расщепление конъюгата;

анализ содержания целевого пептида в составе конъюгата с использованием приемов флуоресцентного анализа ПНР в режиме реального времени.

2. Оптимизация известных методов анализа:

- флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК с регистрацией сигнала в реальном масштабе времени с использованием олигонуклеотидных зондов, содержащих лабильную гексахлорфлуоренильную метку (HEX). Разработка усовершенствованных методов получения зондов и испытание полученных препаратов в ДНК-анализе клинических образцов.

- аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного зонального электрофореза. Для увеличения выхода мономеров в работе необходимо рассмотреть влияние условий пробоподготовки образцов на процессы химической деградации аминокислот; провести его верификацию на примерах анализа образцов препаратов пептидов;

Научная новизна.

1. Разработана новая схема высокочувствительного анализа низкокопийных пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с помощью амплификации сигнала методом ПТ IP в реальном масштабе времени.

2. Разработан новый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин олигонуклеотидов, препятствующий модификации метки

и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Оптимизированы условия очистки олигонуклеотидных зондов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

3. Оптимизирована методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации с помощью капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ-фотометрическим способом детектирования. Подобраны условия кислотного гидролиза пептидов, позволяющие увеличить выход образующихся аминокислот.

Практическая значимость.

Разработан и предложен способ повышения чувствительности определения пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов методом ПЦР в режиме реального времени. Для создания системы ПЦР-амплификации ДНК-фрагмента конъюгата была отработана методика синтеза и режимов анализа для модификаций и очистки олигонуклеотидных зондов. Предложенные подходы для оптимизации способов получения зондов успешно использовались при создании и в производстве новых наборов для определения широкого круга патогенов, таких как Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и dp (приложение А). Проведение подобных исследований особенно актуально в связи с постоянной потребностью в расширении арсенала диагностических методов с жесткими критериями надежности. Оптимизированный метод аминокислотного анализа биологически активных пептидов позволяет определять состав без их модификации. Это существенно при контроле качества лекарственных белковых препаратов, как брадикинин, инсулин, дарбэпоэтин.

На защиту выносятся:

- принципиальная схема обнаружения низкокопийных пептидов в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала;

- разработка нового способа деблокирования меченных олигонуклеотидов, которая приводит к уменьшению образования примеси и увеличению чувствительности ПЦР-анализа;

- оптимизированная методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без предварительной стадии химической дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007» (2007, Москва, Россия), 17-ой Менделеевской конференции молодых ученых (2007, Самара, Россия), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва, Россия), Life Sciences 2007 (2007, Глазго, Великобритания), 22ndInternational Symposium on MicroScale Bioseparations and Methods for Systems Biology, (2008, Берлин, Германия), 34th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (2009, Дрезден, Германия), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010» (2010, Москва, Россия), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия -новые методы и возможности» (2010, Москва, Россия), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар, Россия), 2-ой Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и продуктов» (2010, Москва, Россия), V Всероссийской конференции студентов и аспирантов с

международным участием «Химия в современном мире» (2011, Санкт-Петербург,

th • Россия), 36 International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations

and Related Techniques, HPLC 2011 (2011, Будапешт, Венгрия), VI Всероссийской

конференции студентов и аспирантов с международным участием «Менделеев-

2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), FEBS 2012 (2012, Севилья, Испания).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в научных рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение методики и 15 тезисов докладов на международных и федеральных конференциях.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1.0сновные способы определения низкокопийных пептидов

Одна из актуальных задач в протеомных исследованиях сегодня состоит в поиске новых биомаркеров различных, в том числе патологических, процессов, причем наиболее информативным оказывается анализ состава низкокопийных белков. Развитие инструментальных методов, в частности, высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и ПЦР-диагностикой, позволило значительно расширить пределы детекции низкокопийных белков, и провести инвентаризационные протеомные исследования различных биологических объектов [6]. Новые возможности увеличения чувствительности количественного протеомного анализа так же связаны с такими приемами, как аффинное обогащение с помощью искусственных антител нуклеотидной природы (ДНК-аптамеров)[7]. 1.1.1. Иммуно-ПЦР

Среди современных методов анализа низкокопийных биомаркеров особое значение имеет метод иммуно-ПЦР, который впервые позволил количественно определять фемтомолярные концентрации белков и пептидов в составе сложных смесей без их предварительного обогащения. Основное преимущество этого прогрессивного подхода состоит в использовании биоспецифических взаимодействий целевых молекул в сочетании с амплификацией сигнала с помощью приемов полимеразной цепной реакции. Метод иммуно-ПЦР основан на использовании антител или антител-связанных реагентов для определения компонентов образца [8]. Избирательная природа связывания антител позволяет им быть использованными для развития метода, который является высокоспецифичным и может быть направлен на анализ таких физиологических жидкостей, как кровь, плазма или моча. Для того, чтобы расширить масштаб полимеразной цепной реакции (ПЦР) до высокочувствительного определения пептидов, была изучена система иммуно-ПЦР, преимуществом которой является специфичные конъюгаты, включающие антитела и маркерную

олигонуклеотидную последовательность. Если объединить многосторонность иммуноферментного анализа (ИФА) с чувствительностью амплификации ПЦР-анализа, то иммуно-ПЦР основывается на конъюгатах специфических антител и молекул нуклеиновых кислот, которые затем используются как маркеры для амплификации сигнала с помощью ПЦР. Высокая эффективность амплификации обычно приводит к увеличению чувствительности в 100-10,000 раз [9,10]. Для визуализации результатов ПЦР- анализа используют горизонтальный электрофорез в агарозном геле или флуориметрический способ детекции. В добавление к этому свойству, иммуно-ПЦР предполагает возможность свободного выбора маркерной ДНК-последовательности [11]. Чувствительное определение таких маркеров считается одной из самых важных проблем в мониторинге многих социально-значимых заболеваний, таких как рак или аутоиммунная болезнь [12]. На рисунке 1 изображена принципиальная схема иммуно-ПЦР на примере обычного комплекса с первичным (иммобилизованным) и вторичным (идентифицирующим) антителами:

Ад

Первичное антитело

Рис. 1. Схема анализа иммуно-ПЦР с использованием первичного и

вторичного антител.

Есть различные варианты проведения иммуно-ПЦР, которые по литературным данным различаются видом иммуноферментной части метода. Как известно, ИФА возник из сочетания ферментативных кинетических и иммунологических методов анализа, в которых антитело выступает в качестве специфического детектора определяемого вещества, а фермент - в качестве метки иммунохимической реакции, с помощью которого визуализируется образование комплекса антиген-антитело (рис.2) [13].

Ад

Первичное антитело

Рис.2. Принципиальная схема иммуноферментного анализа.

В литературе [14] описан вариант иммуно-ПЦР, в котором как связывающую единицу используют рекомбинантный белок с прикрепленным стрептавидином (СТВ). Белок избирательно связывается с Бс-фрагментом иммуноглобулина в (^в), а стрептавидин в свою очередь аффинно связывается с маленькими молекулами биотина (витамин Н). Так комплекс белка со стрептавидином служит связующим звеном между антителом и биотинилированной ДНК-последовательностью. Однако, использование такого комплекса ограничивается только прямым форматом иммуно-ПЦР, в котором отсутствуют иммобилизованные антитела (антитела на твердой подложке для анализа антигенов методом захвата). Подбор системы белок- стрептавидин,

X

который бы аффинно связывался с идентифицирующим антителом, достаточно трудоемкий. На рисунке 3 показано схематическое изображение прямого иммуно-ПЦР. Очевидно, что комплекс белка со стрептавидином способен давать сильные сигналы в таких анализах, невзирая на концентрацию антигена. Этот вариант был использован в некоторых иммуно-ПЦР, применение которых основано на формате прямого анализа [15].

Биотин

ств- белок А Ад)

Рис. 3. Схема анализа иммуно-ПЦР с использованием комплекса белок-

стрептавидин.

Однако для двустороннего иммуноанализа конъюгаты со специфическим соединением между идентифицирующим антителом и маркерной олигонуклеотидной последовательностью должны избегать связывания с иммобилизованным антителом (рис. 1). Для образования альтернативной системы иммуно-ПЦР проводятся исследования такого двойного комплекса как биотин-стрептавидин. Его выбор связан с многосторонней и высоко-аффинной связью между двумя данными веществами (рис.4). В статье [16] описано использование конъюгатов биотинилированных ДНК- фрагментов, биотинилированных иммуноглобулинов и авидина. Авидин — гликопротеид, антагонист биотина, обладает способностью образовывать в организме биологически неактивный комплекс с биотином [17]. Хотя этот способ, как оказалось, не является оптимальным для воспроизводимости и качества анализа, собрание

сигналообразующих комплексов посредством следующих стадий инкубации открывают возможность создавать иммуно-ПЦР анализы без необходимости в громоздких синтезах и стадиях очистки конъюгатов антитело-ДНК [18].

биотин

ств ^

Ад

Рис. 4. Схема анализа иммуно-ПЦР с использованием комплекса биотин-стрептавидин (биотинилирование как идентифицирующего антитела, так и маркерной нуклеотидной последовательности).

Другая возможная принципиальная схема анализа иммуно-ПЦР с использованием комплекса стрептавидин-биотин показана на рисунке 5 [19]. На первом этапе концевые силанольные группы, которые находятся на стеклянной подложке, связываются с антигеном. Затем человеческое антитело образует конъюгат с антигеном. После этого в систему вводят биотинилированные козьи антитела против человечьих. Биотин имеет большое сродство к аффинному связыванию со стрептавидином, что позволяет с помощью него связать биотинилированные маркерную олигонуклеотидную последовательность и комплекс антител. Далее ставят ПЦР-анализ и полученные ампликоны детектируют посредством электрофореза в 1,5 % агарозном геле [19].

Несмотря на это, такие варианты имеют неотъемлемые недостатки, при которых термодинамические равновесие должно достигаться для каждого отдельного этапа количественного связывания компонентов. Тот факт, что время инкубации обычно составляет около часа в традиционном иммуноанализе, и что

оно может быть значительно дольше для уравновешивания гетерогенных систем, образование сигналообразующих комплексов является недостаточным. Такие сигналы слабее, чем сигналы, полученные посредством синтезированных конъюгатов.

Биотинилированная ДНК

<5

С^ Стрептавидин

Биотинилированные козьи антитела 1йА

Анти-ЕВЫА 1 ^А

Л

, Антиген EBNA 1

Стеклянная подложка

Рис. 5. Схема модельного процесса иммуно-ПЦР с использованием комплекса стрептавидин-биотин (использование двойного комплекса первичных

(идентифицирующих) антител).

Следовательно, осуществление анализа иммуно-ПЦР может быть значительно улучшено при использовании синтезированных конъюгатов антитело-ДНК, связанных ковалентно (рис.6). Однако, производство последних является затруднительным, потому что многие антитела являются слишком неустойчивыми при жестких условиях химического связывания и в особенности при хроматографической стадии очистки. Последняя стадия очистки обязательна, так как даже небольшие количества любых непрореагировавших ДНК-фрагментов или антител неизбежно ведут к уменьшению интенсивности сигнала в иммуно-ПЦР [20].

-г?

¥

Л \ Ковалентное

\ связывание

А V (Ад

Рис.6. Схема модельного процесса иммуно-ПЦР с использованием помимо аффинного, ковалентного связывания комплекса антитело-ДНК.

В добавление к увеличению чувствительности, иммуно-ПЦР обладает способностью свободно выбирать маркерную олигонуклеотидную последовательность, что открывает доступ к почти неограниченному ряду специфически меченых антител, которые позволяют проводить мультиплексное обнаружение различных антигенов [21]. Альтернативный способ заключается в использовании добавленной искусственной ДНК-последовательности как внутреннего стандарта, который конкурентно усиливается в течение ПЦР. Такой способ увеличивает как чувствительность, так и точность определения с помощью иммуно-ПЦР [22].

Таким образом, успехи в создании систем иммуно-ПЦР анализа в последние годы свидетельствует о перспективности и значительном потенциале такого подхода. В настоящее время во многих лабораториях мира ведется активный поиск в области разработки биохимических основ развития этого метода и создания специализированных диагностикумов.

1.1.2. ДНК-аптамеры

Кроме известных иммунологических подходов в качестве аффинных молекул (антител) используются специальные ДНК-аптамеры - олигонуклеотиды,

селектированные по сродству к объекту-мишени. Они могут рассматриваться как один из наиболее перспективных и технологически доступных классов искусственных аналогов антител.

Олигонуклеотиды—короткая нуклеотидная последовательность длиной до 20-30 нуклеотидных оснований. Нуклеотиды — звенья нуклеиновых кислот, каждый из которых состоит из азотистого основания, углеводного остатка и фосфатной группы. [23]. Гетероциклические основания, входящие в состав нуклеотидов, относятся к производным пурина или пиримидина. Пиримидиновые основания, как правило, представляют цитозин (С), тимин (Т) и урацил (II), а пуриновые - аденин (А) и гуанин (в). Следует отметить, что остаток урацила входит только в состав РНК, а тимин - только в состав ДНК. [24]

Аффинные молекулы являются фрагментами однонитевых ДНК, могут содержать разнообразные модификации, активные функциональные группы, флуоресцентные метки, вставки ненуклеотидной природы. [25-27].

Полученные биоспецифические молекулы используются, в конечном итоге, для выявления целевых биомаркерных молекул и позволяют создать методы их количественного определения. Несмотря на значительное число публикаций, посвященных поиску и изучению свойств ДНК-аптамеров, исследования в области их применения к задачам протеомного анализа только начаты. Причем, ДНК-аптамеры, исследованные в известных работах, не содержали активных групп, способных ковалентно связывать белковые мишени [28].

Естественное препятствие на пути повышения чувствительности выявления пептидных биомаркеров с помощью антител связано с обратимостью иммунных взаимодействий. Наиболее перспективным приемом для его преодоления может служить ковалентная сшивка компонентов комплекса. Использование синтетических антител нуклеотидной природы (ДНК- аптамеров), снабженных активными заместителями, создает возможность аффинного обогащения целевых молекул и их ковалентной фиксации. Кроме того, для количественного анализа содержания полученных конъюгатов могут быть применены, аналогично иммуно-ПЦР [29,30], такие высокочувствительные методы ДНК-анализа, как ПЦР, на

котором остановимся более подробно. Важно также отметить, что точность метода непосредственно зависит от надежности выбранной системы амплификации.

1.1.3. Полимеразная цепная реакция

1.1.3.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция- это циклическая температурозависимая ферментативная реакция, в ходе которой происходит экспоненциальное увеличение количества копий определенного участка молекулы исходной ДНК в неограниченных количествах (рис.7). Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое направление - ДНК-диагностику [31].

5-й цикл 32 копии

Рис.7. Принцип экспоненциальной амплификации ДНК в ходе ПЦР.

1.1.3.2. Компоненты реакции

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимы следующие компоненты (рис. 8):

1) Олигонуклеотидные затравки (праймеры) - пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 18 до 24

нуклеотида, комплементарные противоположным концам разных цепей соответствующим участкам ДНК-фрагмента;

2) Тац-полимераза - термостабильный фермент, сохраняющий активность после инкубации при высоких температурах и обладающий хорошо выраженной 5'-3' экзонуклеазной активностью;

3) Свободные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) - субстрат для ДНК-полимеразы, смешанные в равной пропорции дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ);

4) Буферный раствор - обеспечивающий оптимальные условия реакции и стабильное значение рН. Оптимальный рН реакционной смеси зависит от типа полимеразы и, как правило, находится в пределах от 8,0 до 9,0 при комнатной температуре. Необходимо учесть, что рН буферного раствора на основе трис существенно меняется при нагревании, поэтому работать фермент будет при более нейтральном значении рН;

5) Ионы магния- субстрат для ДНК-полимеразы, образуют растворимые комплексы с дНТФ.

6) ДНК-матрица - подготовленный образец, которой может содержать искомую ДНК-мишень. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

¥ А т Д-

дНТФ пи|/ фермент

ДНК-МО трицо

Taq-nonn^epasa , i

РП

олигонуклеогидмые затравки (лраймерь)

Рис.8. Компоненты, необходимые для проведения ПЦР.

1.1.3.3. Температурные режимы программы ПЦР

«Классическая» программа ПЦР включает в каждый цикл амплификации три температурных интервала (рис. 9):

1. Денатурация ДНК. Денатурацию ДНК, находящуюся в образце, обычно проводят при 90-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Чтобы полностью денатурировать ДНК, достаточно одной секунды инкубации при температуре 90 °С. Однако для уверенной денатурации ДНК рекомендуется 5-10 с. Слишком долгая инкубация на данном этапе ведет к ускоренному падению активности полимеразы. Однако допускаются и более низкие температуры, как например 85 °С при проведении низкотемпературного ПЦР [32].

2. Отжиг. Гибридизация праймеров или их отжиг на ДНК происходит в соответствии с правилом комплементарности. Важнейшим фактором в создании высокоспецифичной ПЦР-системы является подбор температуры отжига праймеров, которая может быть в интервале 40-75 °С. При завышенной температуре отжига эффективность реакции будет достаточно низкой, тогда как при заниженной температуре могут образовываться неспецифичные продукты амплификации.

3. Элонгация. Синтез комплементарных цепей ДНК путем удлинения праймеров происходит при температурном интервале 60-75 °С. Оптимальной температурой для работы Taq-пoлимepaзы считают 68-74 °С [33]. Однако фермент может работать и при более низких температурах. Поэтому если температура отжига праймеров в данном эксперименте выше 60 °С, нет необходимости добавлять отдельный температурный интервал для синтеза ДНК. Вполне достаточно увеличить время инкубации на этапе отжига праймеров [34].

1 этап

Денатурация

Похожие диссертационные работы по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Мосина, Алёна Геннадьевна

4.ВЫВОДЫ

1. Впервые предложена принципиальная схема анализа низкокопийных пептидов с использованием антител нуклеотидной природы, их ковалентной сшивки с мишенью и ПЦР- системы амплификации сигнала. Исследованы условия проведения ключевых стадий метода. Проведено достоверное определение содержания модельного пептида DRVYIHPF в составе конъюгата с чувствительностью 1,1 • 10"1бМ (66 копий в 1 мкл образца =11 • 10"21 mol).

2. Оптимизирован способ получения НЕХ-производных олигонуклеотидов, заключающийся в применении новых условий деблокирования олигонуклеотидов в процессе их синтеза. На примерах широкого круга патогенов (Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и др.) показано, что использование зондов, полученных в соответствии с новым методом, способствует повышению чувствительности ПЦР- анализа ДНК с регистрацией сигнала в реальном масштабе времени.

3. Оптимизирована методика определения аминокислотного состава пептидов без стадии модификации с помощью капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ- фотометрическим способом детектирования. Эффективность метода продемонстрирована на примерах определения аминокислотного состава ряда препаратов биологически активных пептидов (брадикинин, А- и В-цепи инсулина крупного рогатого скота, дарбэпоэтин).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Мосина, Алёна Геннадьевна, 2013 год

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sigdel Т.К., Sarwal М.М. Recent advances in biomarker discovery in solid organ transplant by proteomics // Expert Rev Proteomics. - 2011. - V. 8. -1. 6. - P. 705-715.

2. Sigdel T.K, Gao X., Sarwal M.M. Protein and peptide biomarkers in organ transplantation // Biomark Med. - 2012. - V. 6, -1.3. - P. 259-271.

3. Lee H.W., Cheng J., Kovbasnjuk O., Donowitz M., Guggino W.B. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) enhances the protein expression of CFTR // PLOS ONE. - 2013. - V. 8. -1.3.-P. 1-11.

4. Sommeregger W., Prewein В., Reinhart D., Mader A., Kunert R. Transgene copy number comparison in recombinant mammalian cell lines: critical reflection of quantitative realtime PCR evaluation // Cytotechnology. - 2013. [in press]

5. Мок W.W, Li Y. Therapeutic Peptides: New Arsenal Against Drug Resistant Pathogens // Curr Pharm Des. - 2013. [in press]

6. Franko F., Bambouskova M., Draber P. Rapid and sensitive detection of cytokines using functionalized gold nanoparticle-based immuno-PCR, comparison with immuno-PCR and ELISA // J Immunol Methods. - 2011. - V. 371. -1. 1-2. - P. 38-47.

7. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification // TRENDS in Biotechnology. - 2005. - V. 23. -1. 4.-P. 208-216.

8. Suzuki A., Itoh F., Hinoda Y., Imai K. Double determinant immuno-polymerase chain reaction: a sensitive method for detecting circulating antigens in human sera // Jpn J Cancer Res. - 1995. - V. 86. -1. 9. - P. 885-889.

9. Spengler M., Adler M., Jonas A., Niemeyer C.M. Immuno-PCR assays for immunogenicity testing // Biochem Biophys Res Commun. - 2009. - V. 387. - I. 2. - P. 278-282.

10. Adler M., Wacker R., Niemeyer C.M. Sensitivity by combination: immuno-PCR and related technologies // Analyst. - 2008. - V. 133. -1. 6. - P. 702-718.

11. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR // Nat Protoc. -2007. - V. 2. -1. 8.-P. 1918-1930.

12. Komatsu M., Kobayashi D., Saito K., Furuya D., Yagihashi A., Araake H., Tsuji N., Sakamaki S., Niitsu Y., Watanabe N. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR // Clin Chem. - 2001. - V. 47. -1. 7. - P.1297-1301.

13. Speeckaert M.M., Speeckaert R., Delanghe J.R. Human epididymis protein 4 in cancer diagnostics: a promising and reliable tumor marker // Adv Clin Chem. - 2013. - V. 59. -P.1-21.

14. Sano Т., Smith C.L., Cantor C.R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates // Science. - 1992. - V. 258. - I. 5079. - P. 120-122.

15. McElhinny A.S., Warner C.M. Detection of major histocompatibility complex class I antigens on the surface of a single murine blastocyst by immuno-PCR // Biotechniques. -1997.-V. 23.-P. 660-662.

16. Ke X., Warner C.M. Regulation of Ped gene expression by TAP protein // J Reprod Immunol. -2000. - V. 46.-I. l.-P. 1-15.

17. Byrne M.J., Warner C.M. MicroRNA expression in preimplantation mouse embryos from Ped gene positive compared to Ped gene negative mice // J Assist Reprod Genet. - 2008. -V. 25.-I. 5.-P. 205-214.

18. Ye Q., Zhuang H., Zhou C., Wang Q. Real-time fluorescent quantitative immuno-PCR method for determination of fluoranthene in water samples with a molecular beacon // J Environ Sci. - 2010. - V. 22. -1. 5. P. 796-800.

19. Wang T.-W., Lu H.-Y., Lou P.-J., Lin F.-H. Application of highly sensitive, modified glass substrate-based immuno-PCR on the early detection of nasopharyngeal carcinoma // Biomaterials. - 2008. - V. 29. - P. 4447-4454.

20. Burbulis I., Yamaguchi K., Gordon A., Carlson R., Brent R. Using protein-DNA chimeras to detect and count small numbers of molecules // Nat Methods. - 2005. - V. 2. -I. l.-P. 31-37.

21. Joerger R.D., Truby T.M., Hendrickson E.R., Young R.M., Ebersole R.C. Analyte detection with DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction // Clin Chem. -1995.-V. 41.-I. 9.-P. 1371-1377.

22. Diel P., Schiffer Т., Geisler S., Hertrampf Т., Mosler S., Schulz S., Wintgens K.F., Adler M. Analysis of the effects of androgens and training on myostatin propeptide and follistatin concentrations in blood and skeletal muscle using highly sensitive immuno PCR // Mol Cell Endocrinol. - 2010. - V. 330. -1. 1-2. - P. 1-9.

23. Martinez Т., Wright N., López-Fraga M., Jiménez A.I., Pañeda С. Silencing human genetic diseases with oligonucleotide-based therapies // Hum Genet. - 2013. - V. 132. -I. 5.-P. 481-493.

24. Щелкунов C.H. Генетическая инженерия - Учебно-справочное пособие. 2-е изд., испр. и доп. Сибирское университетское издательство. - 2004. - С. 496.

25. Cheng А.К., Sen D., Yu H.Z. Design and testing of aptamer-based electrochemical biosensors for proteins and small molecules // Bioelectrochemistry. - 2009. - V. 77. - I. l.-P. 1-12.

26. Li D., Song S., Fan C. Target-responsive structural switching for nucleic acid-based sensors //Acc Chem Res. - 2010. - V. 43. -1. 5. - P. 631-641.

27. Du Y., Li В., Wei H., Wang Y., Wang E. Multifunctional label-free electrochemical biosensor based on an integrated aptamer // Anal Chem. - 2008. - V. 80. — I. 13. - P. 5110-5117.

28. Graham J.C., Zarbl H. Use of cell-SELEX to generate DNA aptamers as molecular probes of HPV-associated cervical cancer cells // PLoS One. - 2012. - V. 7. -1. 4. - P. 19.

29. Zhang Y., Hu J., Zhang C.Y. Sensitive detection of transcription factors by isothermal exponential amplification-based colorimetric assay // Anal Chem. - 2012. - V. 84. - I. 21.-P. 9544-9549.

30. Zhang Z.Z., Zhang C.Y. Highly sensitive detection of protein with aptamer-based target-triggering two-stage amplification // Anal Chem. - 2012. - V. 84. -1. 3. - P. 1623-1629.

31. Kalendar R., Lee D., Schulman A.H. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis // Genomics. - 2011. - V. 98. - I. 2. - P. 137— 144.

32. Lee S.H., Ge S., Zhou S., Hong G. A novel low temperature PCR assured high-fidelity DNA amplification // Int J Mol Sci. - 2013. - V. 14. -1. 6. - P. 12853-12862.

33. Haider A., Jain M., Chaudhary I. Rapid detection of chromosome X, Y, 13, 18, and 21 aneuploidies by primed in situ labeling/synthesis technique // Indian J Hum Genet. -2013.-V. 19. -I. l.-P. 14-17.

34. Liu Y., Wu Т., Song J., Chen X., Zhang Y., Wan Y.. A mutant screening method by critical annealing temperature-PCR for site-directed mutagenesis // BMC Biotechnol. -2013.-V. 13.-1.21.-P. 1-8.

35. Wagner E.M. Monitoring gene expression: quantitative real-time rt-PCR // Methods in Molecular Biology.-2013.-V. 1027.-P. 19-45.

36. Dousti M., Abdi J., Bakhtiyari S., Mohebali M., Mirhendi Sh., Rokni M. Genotyping of Hydatid Cyst Isolated from Human and Domestic Animals in Ilam Province, Western Iran UsingPCR-RFLP // Iran J Parasitol. - 2013. - V. 8. -1. 1. P. 47-52.

37. Jonathan R. Brody and Scott E. Kern. History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis // Analytical Biochemistry. - 2004. - V. 333. - P. 1-13.

38. Silling S., Kreuter A., Hellmich M., Swoboda J., Pfister H., Wieland U. Human papillomavirus oncogene mRNA testing for the detection of anal dysplasia in HIVpositive men who have sex with men // J Clin Virol. -2012. -V. 53. -1. 4. - P. 325-331.

39. Combrinck C.E., Seedat R.Y., Burt F.J. FRET-based detection and genotyping of HPV-6 and HPV-11 causing recurrent respiratory papillomatosis // J Virol Methods. - 2013. - V. 189.-I. 2.-P. 271-276.

40. Mills A., Balasubramaniam R., Longacre T.A., Kong C.S., Pinsky B.A. Laboratory-developed LI sequencing and type-specific, real-time polymerase chain reaction for the detection and typing of human papillomaviruses in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues // Arch Pathol Lab Med. - V. 137. -1. 1. - P. 50-54.

41. Ding C., Cantor C.R. Quantitative Analysis of Nucleic Acids - the Last Few Years of Progress // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2004. - V. 37.1. 1. - P. 110.

42. De Cecco L., Dugo M., Canevari S., Daidone M.G., Callari M. Measuring microRNA expression levels in oncology: from samples to data analysis // Crit Rev Oncog. 2013. -V. 18.-I. 4.-P. 273-287.

43. Shuga J., Zeng Y., Novak R., Lan Q., Tang X., Rothman N., Vermeulen R., Li L., Hubbard A., Zhang L., Mathies R.A., Smith M.T. Single molecule quantitation and sequencing of rare translocations using microfluidic nested digital PCR // Nucleic Acids Research.-2013.-P. 1-11.

44. Treff N.R., Scott R.T. Four-hour quantitative real-time polymerase chain reaction-based comprehensive chromosome screening and accumulating evidence of accuracy, safety, predictive value, and clinical efficacy // Fertil Steril. - 2013. - V. 99. - I. 4. - P. 10491053.

45. Ребриков Д.В. Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». -М.:БИНОМ. Лаборатория знаний. - 2009. - 215с.

46. Klein D., Leutenegger С.М., Bahula С., Gold P., Hofmann-Lehmann R., Salmons В., Lutz H., Gunzburg W.H. Influence of preassay and sequence variations on viral load determination by a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction for feline immunodeficiency virus // J Acquir Immune Defic Syndr. - 2001. - V. 26. - I. l.-P. 8-20.

47. Tandon R., Cattori V., Willi B., Lutz H., Hofmann-Lehmann R. Quantification of endogenous and exogenous feline leukemia virus sequences by real-time PCR assays // Vet Immunol Immunopathol. - 2008. - V. 123. -1. 1-2. - P. 129-133.

48. Francino O., Altet L., Sánchez-Robert E., Rodriguez A., Solano-Gallego L., Alberola J., Ferrer L., Sánchez A., Roura X. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis // Veterinary Parasitology. - 2006. - V. 137. - P. 214-221.

49. Klatt M., Bauer P. Accurate Real-Time Reverse Transcription Quantitative PCR // Plant Signal Transduction. - 2009. - V. 479. - P. 61-77.

50. Chen Y. Gelfond J.A., McManus L.M., Shireman P.K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis // BMC Genomics. - 2009. - V. 10. - P. 407.

51. Bastien P., Procop G.W., Reischl U. Quantitative real-time PCR is not more sensitive than "conventional" PCR // J Clin Microbiol. - 2008. - V. 46. -1. 6. - P. 1897-1900.

52. Kutyavin I.V. New approach to real-time nucleic acids detection: folding polymerase chain reaction amplicons into a secondary structure to improve cleavage of Fo'rster resonance energy transfer probes in 50-nuclease assays // Nucleic Acids Research. -2010. -V. 38.-I. 5.-P. 1-12.

53. Salvatore A. E. Marras. Interactive Fluorophore and Quencher Pairs for Labeling Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes // Mol Biotechnol. - 2008. - V. 38. - P. 247-255.

54. Sjóback R., Nygren J., Kubista M. Characterization of fluorescein-oligonucleotide conjugates and measurement of local electrostatic potential // Biopolymers. - 1998. - V. 46.-I. 7.-P. 445-453.

55. Faulds K., Jarvis R., Smith W.E., Graham D., Goodacre R. Multiplexed detection of six labelled oligonucleotides using surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) // Analyst.-2008.-V. 133.-I. 11,-P. 1505-1512

56. Juskowiak B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential // Anal Bioanal Chem. - 2011. - V. 399. -1. 9. - P. 3157-3176.

57. Crisalli P., Hernández A.R., Kool E.T. Fluorescence quenchers for hydrazone and oxime orthogonal bioconjugation // Bioconjug Chem. - 2012. - V. 23. -1. 9. - P. 1969-1980.

58. Chevalier A., Massif C., Renard P.Y., Romieu A. Bioconjugatable azo-based dark-quencher dyes: synthesis and application to protease-activatable far-red fluorescent probes // Chemistry. - 2013. - V. 19. -1. 5. - P. 1686-1699.

59. Yang G.P., Erdman D.D., Tondella M.L., Fields B.S. Evaluation of tetramethylrhodamine and black hole quencher 1 labeled probes and five commercial amplification mixes in TaqMan real-time RT-PCR assays for respiratory pathogens // J Virol Methods. - 2009. - V. 162. -1. 1-2. - P. 288-290.

60. Marras S.A, Tyagi S., Kramer F.R. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes // Clin Chim Acta. - 2006. - V. 363.1. 1-2. -P. 48-60.

61. Whitcombe D., Theaker J., Guy S.P., Brown T., Little S. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence //Nat Biotechnol. - 1999. - V. 17. -1. 8. -P. 804-807.

62. Carters R, Ferguson J., Gaut R., Ravetto P., Thelwell N., Whitcombe D. Design and use of scorpions fluorescent signaling molecules // Methods Mol Biol. - 2008. - V. 429. - P. 99-115.

63. Zhu G., Yang K., Zhang C.Y. Sensitive detection of methylated DNA using the short linear quencher-fluorophore probe and two-stage isothermal amplification assay // Biosens Bioelectron. - 2013. - V. 49. - P. 170-175.

64. Wang Z., Zhang K., Wooley K.L., Taylor J.S. Imaging mRNA Expression in Live Cells via PNA DNA Strand Displacement-Activated Probes // Journal of Nucleic Acids. -2012. - V. 2012. - Article ID 962652. - Pp. 11.

65. Bassler H.A., Flood S.J., Livak K.J., Marmaro J., Knorr R., Batt C.A. Use of a fluorogenic probe in a PCR-based assay for the detection of Listeria monocytogenes // Appl Environ Microbiol. - 1995. - V. 61. -1. 10. - P. 3724-3728.

66. Daum L.T., Ye K., Chambers J.P., Santiago J., Hickman J.R., Barnes W.J., Kruzelock R.P., Atchley D.H. Comparison of TaqMan and Epoch Dark Quenchers during real-time reverse transcription PCR // Molecular and Cellular Probes. - 2004. - V. 18. - P. 207209.

67. Vaisman B.L. Genotyping of Transgenic Animals by Real-Time Quantitative PCR with TaqMan Probes // Methods Mol Biol. - 2013. - V. 1027. - P. 233-251.

68. Jones R., Baker M.B., Weber M., Harrison D.G., Bao G., Searles C.D. Molecular beacons can assess changes in expression and 3'-polyadenylation of human eNOS mRNA // Am J Physiol Cell Physiol. - 2009. - V. 296. -1. 3. - P. 498-504.

69. Pierce K.E., Rice J.E., Sanchez J.A., Wangh L.J. Detection of cystic fibrosis alleles from single cells using molecular beacons and a novel method of asymmetric real-time PCR // Mol Hum Reprod. - 2003. - V. 9. -1. 12. - P. 815-820.

70. Kara I.O., Duman B.B., Afsar C.U. The evaluation of minimal residual disease in multiple myeloma by fluorescent molecular beacons in real time PCR of IgH gene rearrangements and correlation with flow cytometry // J BUON. - 2013. - V. 18. — I. 2. — p. 442-447.

71. Yao Q., Zhang A.M., Ma H., Lin S, Wang X.X., Sun J.G., Chen Z.T. Novel molecular beacons to monitor microRNAs in non-small-cell lung cancer // Mol Cell Probes. - 2012. -V. 26.-I. 5.-P. 182-187.

72. Guo J., Ju J., Turro N.J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection // Anal Bioanal Chem. - 2012. - V. 402. -1. 10. - P. 3115-3125.

73. Massey M., Krull U.J. A fluorescent molecular switch for room temperature operation based on oligonucleotide hybridization without labeling of probes or targets // Anal Chim Acta.-2012.-V. 750.-P. 182-190.

74. Мосина А.Г., Чувилин A.H., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е., Травкин В.Ф. Анализ эффективности очистки НЕХ-олигонуклеотидов, полученных с использованием модифицированного метода деблокирования // Вестник МИТХТ. - 2012. -№ 4. -Т.7. - С.72-75.

75. Johansson L., GafVelin G., Arner E.S. Selenocysteine in proteins-properties and biotechnological use // Biochim. Biophys. Acta. - 2005. - V. 1726. -1. 1. - P. 1-13.

76. Kiyukov G.V., Castellano S., Novoselov S.V., Lobanov A.V., Zehtab O., Guigô R., Gladyshev V.N. Characterization of mammalian selenoproteomes // Science -2003. - V. 300. -I. 5624.-P. 1439-1443.

77. Srinivasan G., James C.M., Krzycki J.A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA // Science. -2002. -V. 296. -I. 5572. -P. 1459-1462.

78. Азимов A. Генетический код: от теории эволюции до расшифровки ДНК.- М.: Центрполиграф. - 2006. - 208 с.

79. Практическая химия белка: Пер. с англ./Под ред. Дарбре А. - М.: Мир. - 1989. - 623 с.

80. Adebiyi A., Jin D.-H., Ogawa T., Muramoto К. Acid hydrolysis of protein in a microcapillary tube of the recovery of tryptophan // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2005. - V. 69. - P. 255257.

81. Mirgorodskaya O., Korner R., Novikov A., Roepstorff P. Absolute Quantitation of Proteins by a Combination of Acid Hydrolysis and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem. - 2004. - V. 76. - P. 3569-3575.

82. Baek C., HanifZ., Cho S.W., Kim D.I., Um S.H. Shape control of cellulose nanocrystals via compositional acid hydrolysis // J Biomed Nanotechnol. - 2013. - V. 9. - I. 7. - P. 1293-1298.

83. Mucha A. Synthesis and modifications of phosphinic dipeptide analogues // Molecules. -2012. - V. 17. -I. 11.-P. 13530-13568.

84. Alterman M., Gogichayeva N., Kornilayev B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry-based amino acid analysis // Anal. Biochem. - 2004. -V. 335.-P. 184-191.

85. Yu H., Mou S.F. Effect of temperature on the retention of amino acids and carbohydrates in high-performance anion-exchange chromatography // J Chromatogr A. - 2006. - V. 1118. -I. l.-P. 118-124.

86. Yu H., Ding Y-.S., Mou S-.F., Jandik P., Cheng J. Simultaneous determination of amino acids and carbohydrates by anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection // J of Chromatogr A. -2002. - V. 966. - P. 89-97.

87. Lohrig K., Sickmann A., Lewandrowski U. Strong cation exchange chromatography for analysis of sialylated glycopeptides // Methods Mol Biol. - 2011. - V. 753. - P. 299-308.

88. Takano Y., Kashiyama Y., Ogawa N.O., Chikaraishi Y., Ohkouchi N. Isolation and desalting with cation-exchange chromatography for compound-specific nitrogen isotope analysis of amino acids: application to biogeochemical samples // Rapid Commun Mass Spectrom. - 2010. - V. 24. -1. 16. - P. 2317-2323.

89. Wang H., Duan J.A., Guo S., Qian D., Shang E. Development and validation of a hydrophilic interaction ultra-high-performance liquid chromatography with triple quadrupole MS/MS for the absolute and relative quantification of amino acids in Sophora alopecuroides L // J Sep Sci. - 2013. - V. 36. -1. 14. - P. 2244-2252.

90. Zhou G., Pang H., Tang Y, Yao X., Mo X., Zhu S„ Guo S„ Qian D., Qian Y. et al. Hydrophilic interaction ultra-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole tandem mass spectrometry for highly rapid and sensitive analysis of underivatized amino acids in functional foods // Amino Acids. - 2013. - V. 44. - I. 5. -P.1293-1305.

91. Bhushan R., Martens J. Separation of amino acids, their derivatives and enantiomers by impregnated TLC // Biomed Chromatogr. - 2001. - V. 15. -1. 3. - P. 155-165.

92. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Revelsky I.A. Simultaneous determination of fatty, dicarboxylic and amino acids based on derivatization with isobutyl chloroformate

followed by gas chromatography—positive ion chemical ionization mass spectrometry // J. of Chromatogr. B. - 2004. - V. 800. - P. 101-107.

93. Нидервайзер А., Патаки Г. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Пер. с англ.: - М.: Мир. - 1974. - 455 с.

94. Poinsot V., Сагрёпё М.А., Bouajila J., Gavard P., Feurer В., Couderc F. Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis // Electrophoresis. - 2012. - V. 33. -I. l.-P. 14-35.

95. Deng Y.H., Wang H., Zhang H.S. Determination of amino acid neurotransmitters in human cerebrospinal fluid and saliva by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection // J Sep Sci. - 2008. - V. 31. -1. 16-17. - P. 3088-3097.

96. Kaneta Т., Maeda H., Miyazaki M., Miyake R., Izaki H., Sakoda Y., Kinoshita S., Imasaka T. Determination of amino acids in urine by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection // J Chromatogr Sci. - 2008. - V. 46. -I. 8. - P. 712-716.

97. Linz Т.Н., Snyder C.M., Lunte S.M. Optimization of the separation of NDA-derivatized methylarginines by capillary and microchip electrophoresis // J Lab Autom. - 2012. - V. 17. -1. l.-P. 24-31.

98. Vasanits A., Molnar-Perl I. Temperature, eluent flow-rate and column effects on the retention and quantitation properties of phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids in reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. of Chromatogr. A. - 1999. - V. 832. -1. 1-2. - P. 109-122.

99. Hanczko R., Jambor A., Perl A., Molnar-Perl I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent // J Chromatogr A. - 2007. - V. 1163. -1. 1-2. - P. 25-42.

100. Shen Z., Sun Z., Wu L., Wu K., Sun S., Huang Z. Rapid method for the determination of amino acids in serum by capillary electrophoresis // J. of Chromatogr. A. - 2002. - V.979. - P. 227-232.

101. Энгельгардт X., Пер. с нем. Р. Ш. Вартапетян, Руководство по капиллярному электрофорезу, Москва. - 1996. - 229 с.

102. Kitagawa F., Otsuka К. Recent progress in capillary electrophoretic analysis of amino acid enantiomers // J Chromatogr B. - 2011. - V. 879. -1. 29. - P. 3078-3095.

103. Beckers J.L., Bocek P. The preparation of background electrolytes in capillary electrophoresis: Golden rules and pitfalls // Electrophoresis - 2003. - V. 24. - P. 518-535.

104. Ladarola P., Ferrari F., Fumagalli M., Viglio S. Determination of amino acids by micellar EKC: Recent advances in method development and novel applications to different matrices // Electrophoresis. - 2008. - V. 29. - P. 224-236.

105. Zuskova I., Novotna A., Vcelakova K., Gas B. Determination of limiting mobilities and dissociation constants of 21 amino acids by capillary zone electrophoresis // J. of Chromatogr. B. - 2006. - V. 841. - P. 129-134.

106. Liu K., Wang L. Enantioseparations of amino acids by capillary array electrophoresis with 532 nm laser induced fluorescence detection // J Chromatogr A. - 2013. - V. 1295. -P. 142-146.

107. Мосина А.Г., Мельников И.О., Назимов И.В., Глубоков Ю.М. Капиллярный электрофорез немодифицированных генетически кодируемых // Журнал Аналитическая Химия. - 2009. - Т. 64. - № 6. - С. 655-659.

108. Kang X., Xiao J., Huang X., Gu Z. Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples // Clinica Chimica Acta. - 2006. - V. 366. - P. 352-356.

109. Masuda A., Dohmae N. Amino acid analysis of sub-picomolar amounts of proteins by precolumn fluorescence derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate // Biosci Trends. - 2011. - V. 5. -1. 6. - P. 231-238.

110. Манаенков O.B., Сидоров А.И., Сульман Э.М. Экспресс-определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без их предварительной дериватизации // Ж. Анал. Химии. -2003. -Т. 58. -№10. -С. 1093-1096.

111. Lojkova L., Klejdus В., Formanek P., Kuban V. Supercritical Fluid Extraction of Bioavailable Amino Acids from Soils and Their Liquid Chromatographic Determination with Fluorometric Detection // J. Agric. Food Chem. - 2006,- V. 54. - P. 6310-6138.

112. Kutlan D., Molnar-Perl I. New aspects of the simultaneous analysis of amino acids and amines as their o-phthaldialdehyde derivatives by high- performance liquid chromatography analysis of wine, beer and vinegar // J. of Chromatogr. A. -2003.- V. 987. -P.311-322.

113. Zacharis C.K., Tempels F.W. A, Georgios A. Coupling of sequential injection analysis and capillary electrophoresis - Laser-induced fluorescence via a valve interface for online derivatization and analysis of amino acids and peptides // J. of Chromatogr. A. -2006.-V. 1132.-P. 297-303.

114. Shen D., Li Y., Zhang Z., Zhang P., Kang Q. Determination of amino acids by capillary electrophoresis with differential resonant contactless conductivity detector // Talanta. -2013.-V. 104.-P. 39-43.

115. Tuma P., Samcova E., Andelova K. Determination of free amino acids and related compounds in amniotic fluid by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection //J. of Chromatogr. B. - 2006. - V. 839. - P. 12-18.

116. Fonteh A.N., Harrington R.J., Quantification of free amino acids and dipeptides using isotope dilution liquid chromatography and electrospray ionization tandem mass spectrometry // Amino Acids - 2007. - V. 32. - P.203-212.

117. Johnson D.W. Free amino acid quantification by LC-MS/MS using derivatization generated isotope-labelled standards // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2011.-V. 879.-I. 17-18.-P. 1345-1352.

118. Pereira D.M., Valentao P., Teixeira N., Andrade P.B. Amino acids, fatty acids and sterols profile of some marine organisms from Portuguese waters // Food Chem. - 2013. - V. 141.-1.3.-P. 2412-2417.

119. Paiva M.J., Menezes H.C., Christo P.P., Resende R.R., Cardeal Zde L. An alternative derivatization method for the analysis of amino acids in cerebrospinal fluid by gas chromatography-mass spectrometry // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2013. -V. 931.-P. 97-102.

120. Moini M. High-throughput capillary electrophoresis-mass spectrometry: from analysis of amino acids to analysis of protein complexes // Methods Mol Biol. - 2013. - V. 984. - P. 79-119.

121. Ivanov A.R., Nazimov I.V., Lobazov A.P., Popkovich G.B. Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillary electrophoresis with refractometric detection // J of Chromatogr A.-2000. -V. 894. - P. 253-257.

122. Luk C., Compta Y., Magdalinou N., Marti M.J., Hondhamuni G., Zetterberg H., Blennow K., Constantinescu R. et al. Development and assessment of sensitive immuno-PCR assays for the quantification of cerebrospinal fluid three- and four-repeat tau isoforms in tauopathies // J Neurochem. - 2012. - V. 123. -1. 3. - P. 396-405.

123. Makam S.S., Majumder S., Kingston J.J., Urs R.M., Tuteja U., Sripathi M.H., Batra H.V. Immuno capture PCR for rapid and sensitive identification of pathogenic Bacillus anthracis // World J Microbiol Biotechnol. - 2013.

124. Радько С.П., Рахметова С.Ю., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53. - №. 1, - С. 5-24.

125. Косинова О.А., Малыгин А.А., Бабайлова С., Карпова Г.Г. Связывание рибосомного белка р40 человека и его укороченных форм с малой субчастицей рибосомы // Мол. Биол. - 2008. - Т. 42. - №. 6. - С. 1023-1029.

126. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко О.В., Бодоев Н.В., Иванов А.С., Арчаков А.И. Гетеродимерные фотоаптамерные конструкции как новый подход к повышению эффективности формирования фотосшивок с белком-мишенью // Биомедицинская химия. - 2010, - Т. 56. - №. 1. - С. 72-81.

127. Chuvilin A.N., Serebryakova M.V., Smirnov I.P., Pozmogova G.E. Byproduct with Altered Fluorescent Properties Is Formed during Standard Deprotection Step of Hexachlorofluorescein Labeled Oligonucleotides // Bioconjugate Chem. - 2009. - V. 20. -P. 1441-1443.

128. Ubhi B.K., Davenport P.W., Welch M., Riley J., Griffin J.L., Connor S.C. Analysis of chloroformate-derivatised amino acids, dipeptides and polyamines by LC-MS/MS // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2013. - V. 934. - P. 79-88.

129. Ilisz I., Aranyi A., Pataj Z., Péter A. Enantiomeric separation of nonproteinogenic amino acids by high-performance liquid chromatography // J Chromatogr A. - 2012. - V. 1269. -P. 94-121.

130. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Мосина А.Г., Назимов И.В. Способ разделения свободных генетически кодируемых аминокислот // Патент на изобретение № 2346931

131. Desiderio С., Iavarone F., Rossetti D.V., Messana I., Castagnola M. Capillary electrophoresis-mass spectrometry for the analysis of amino acids // J Sep Sci. - 2010. -V. 33.-I. 16.-P. 2385-2393.

132. Степанов B.M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. - 3-е изд. -М.: Изд-во Моск. ун-та: Наука. - 2005. - 336 с.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.