Разработка липосомальных лекарственных форм для увеличения доставки химиопрепаратов и возможности преодоления множественной лекарственной резистентности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Шоуа, Илона Беслановна

• Шоуа, Илона Беслановна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шоуа, Илона Беслановна

Список сокращений.

Введение.

Часть I. Обзор литературы.ю

Часть II. Собственные исследования.

Глава 1. Материалы и методы исследования.

1.1. Материалы и реактивы.

1.1.1. Среды и сыворотки.

1.1.2. Реактивы.

1.1.3. Препараты.

1.1.4. Моноклональные антитела.

1.1.5. Клеточные линии.

1.1.6. Экспериментальная модель опухолевого роста.

1.1.7. Режимы введения и дозы циклоплатама in vivo.

1.1.8. Оценка результатов.

1.2. Методы исследования.

1.2.1. Метод получения больших многослойных липосом доксорубицина и циклоплатама.

1.2.2. Получение малых однослойных липосом.

1.2.3. Метод количественного определения доксорубицина и циклоплатама в липосомах.

1.2.4. Измерение размера липосом с доксорубицином и циклоплатамом.

1.2.5. Прямая реакция иммунофлюоресценции.

1.2.6. Определение функциональной активности P-gp.

1.2.7. Определение клеточной гибели.

1.2.7.1. Проточно-цитофлюориметрический анализ.

1.2.7.2. Определение гибели клеток с помощью Annexin V.

1.2.7.3. Исследование цитотоксической активности in vitro с помощью МТТ-теста.

1.2.8. Электронно-микроскопическое исследование.

Глава 2. Создание липосомального доксорубицина и изучение его цитотоксической активности

2.1. Получение больших многослойных липосом с доксорубицином.

2.1.1. Методика получения больших многослойных липосом с доксорубицином.

2.2. Получение малых однослойных липосом с доксорубицином.

2.2.1. Методика получения малых однослойных липосом с доксорубицином.

2.3. Стандартизация малых однослойных липосом с доксорубицином.

2.3.1. Измерение размера липосом.

2.3.2. Количественное определение доксорубицина в липосомах.

2.4. Элекронно-микроскопическое исследование.

2.5. Исследование включения доксорубицина внутри липосом.

2.6. Изучение цитотоксической активности липосом с доксорубицином in vitro.

2.7. Сравнение липосомального и свободного доксорубицина по накоплению в клетках.

Глава 3. Создание липосомального циклоплатама и изучение его цитотоксической активности 3.1. Получение больших многослойных липосом с циклоплатамом.

3.1.1. Методика получения больших многослойных липосом с циклоплатамом.

3.2. Получение малых однослойных липосом с циклоплатамом.

3.2.1. Методика получения малых однослойных липосом с циклоплатамом.

3.3. Стандартизация малых однослойных липосом с циклоплатамом.

3.3.1. Измерение размера липосом.

3.3.2. Количественное определение доксорубицина в липосомах.

3.4. Изучение цитотоксической активности липосомального циклоплатама in vitro.

3.5. Изучение противоопухолевой активности липосомального циклоплатама in vivo.

Обсуздение и выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка липосомальных лекарственных форм для увеличения доставки химиопрепаратов и возможности преодоления множественной лекарственной резистентности»

Актуальность темы

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Однако большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится отсутствие избирательности действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. На сегодняшний день описано много механизмов, приводящих к множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является актуальной задачей.

Существует ряд подходов к увеличению эффективности лекарственных препаратов, среди которых использование новых фармацевтических технологий для создания систем транспорта известных противоопухолевых препаратов. Одним из наиболее оптимальных вариантов для повышения доставки препаратов к опухолевым клеткам является использование носителей, таких как липосомы.

Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, внутри липосом находится водное пространство. В водное пространство липосом могут быть включены водорастворимые препараты, а в липидный бислой - гидрофобные. Липосомы способны транспортировать лекарственное средство, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами лекарств.

В настоящем исследовании при создании липосомальных лекарственных форм в качестве модельных препаратов использовали доксорубицин и циклоплатам.

Доксорубицин - антрациклиновый гликозид, широко применяемый противоопухолевый антибиотик, представляющий собой S-фазовоспецифичный * препарат. Точный механизм его противоопухолевого действия неизвестен, но оно может быть обусловлено связыванием с ДНК путем встраивания между парами оснований и ингибированием синтеза ДНК и РНК. Доксорубицин входит в круг препаратов МЛУ и является субстратом для Pgp 170, который является членом суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов, вследствие усиленного выброса лекарства из клетки.

Циклоплатам - оригинальное по структуре комплексное соединение платины второго поколения синтезировано П. А. Чельцовым с сотрудниками в 1982 году в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН. Механизм действия циклоплатама во многом совпадает с механизмом действия цисплатина и других производных платины. Циклоплатам ковалентно связывается с ДНК с образованием аддуктов в положении N-7 гуанина и аденина, которые в отсутствии процессов репарации способны реагировать с нуклеофильными центрами пуриновых оснований или белка с образованием сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок. Известно, что механизм развития резистентности опухолевых клеток к препаратам платины обусловлен повышенной репаративной способностью ДНК. Однако, тот факт, что клетки, резистентные к циклоплатаму, чувствительны к другим производным платины, свидетельствует о наличии, как сходных, так и различающихся механизмов, ответственных за резистентность к этому препарату.

I «

Цели исследования

Разработать липосомальную лекарственную форму доксорубицина и циклоплатама, с целью преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

Задачи исследования

1. Разработать состав и технологию получения липосомальных форм доксорубицина и циклоплатама.

2. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного доксорубицина in vitro на клеточных линиях: Jurkat, К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

3. Сравнить цитотоксическую активность липосомального и свободного циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562.

4. Сравнить противоопухолевый эффект липосомального и свободного циклоплатама in vivo на экспериментальной мышиной модели солидной опухоли меланоме В-16.

Научная новизна

Получены липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама.

Показано более высокое накопление доксорубицина в клетках, по сравнению со свободным препаратом. Продемонстрировано преимущество действия липосомальной лекарственной формы доксорубицина, как на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170, так и на клеточной линии Jurkat, по сравнению со свободным препаратом.

Впервые показана большая эффективность действия липосомального циклоплатама in vitro на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и in vivo на меланоме В-16 по сравнению с его свободной формой.

Практическая значимость работы

Созданы липосомальные лекарственные формы доксорубицина и циклоплатама, которые обладают большей цитотоксической активностью по сравнению со свободными препаратами. Показана возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости, опосредованной действием Pgp 170, с помощью липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Продемонстрирована более выраженная цитотоксическая активность липосомального циклоплатама по сравнению со свободной формой препарата на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 in vitro и большая эффективность липосомальной формы циклоплатама, чем свободного препарата при лечении меланомы В-16 in vivo.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) это термин, * описывающий феномен резистентности опухолевых клеток одновременно к широкому ряду структурно и функционально отличающихся химиопрепаратов г

9]. При МЛУ опухолевые клетки приобретают устойчивость к различным классам токсических агентов. Было описано много механизмов, объясняющих явление множественной лекарственной резистентности. Они условно классифицированы на не клеточный и клеточный механизмы резистентности [110].

Не клеточные механизмы резистентности

Не клеточная лекарственная резистентность может появиться как результат опухолевого роста in vivo. Этот феномен связывают с солидными опухолями, которые проявляют уникальные свойства по сравнению с лейкозами. В частности, разветвленная структура сосудов в опухолевой ткани сильно v отличается от нормальной ткани сосудистыми шунтами и отростками [61, 62, > 118]. Внеклеточное окружение, связанное с солидными опухолями, характеризуется увеличенным давлением интерстициальной жидкости по сравнению с нормальными тканями. Это является следствием двух факторов, а именно, высокой проницаемости сосудов и отсутствием функциональной лимфатической системы. Следовательно, плохая опухолевая васкуляризация может приводить к уменьшению доступа лекарства в зоны солидных опухолей и, таким образом, защищать опухолевые клетки от цитотоксического действия препаратов [110]. Свойства солидных опухолей также приводят к тому, что некоторые области опухоли испытывают дефицит в питательных веществах и кислороде. Такие свойства могут индуцировать механизмы резистентности, которые возникают в результате внеклеточного влияния.

Клеточные механизмы резистентности

Клеточные механизмы классифицируют на основе изменений в биохимических процессах опухолевых клеток. Такие механизмы могут быть классифицированы на две группы: 1) не классический фенотип МЛУ и 2) классический фенотип МЛУ.

1. Не классический фенотип МЛУ с

Термин не классический фенотип МЛУ используют для описания не транспортного механизма, который затрагивает многочисленные классы лекарств. Этот тип резистентности может быть следствием изменения активности ферментных систем, таких как: глутатион S-трансфераза, глутатион и топоизомеразы, которые могут уменьшать цитотоксическую активность лекарств. Изменения соотношения белков, контролирующих апоптоз, также может приводить к резистентности ко многим противоопухолевым препаратам, которые проявляют цитотоксический эффект путем апоптоза.

Глутатион S-трансфераза (GST)

Глутатион S-трансфераза (GST) это ферментативная система, вовлеченная в клеточную детоксикацию. Глутатион (GSH) - небелковый тиол, взаимодействие сульфгидрильной группы которого с реактивной группой лекарственного препарата, определяет образование конъюгатов препарата с глутамином. Эти конъюгаты менее активны, растворимы и выбрасываются из клетки с помощью белков транспортеров GS-X, в том числе MRP [9]. Химические взаимодействия между глутатионом и алкилирующими соединениями катализируются группой ферментов GST, разные изоформы которых взаимодействуют с разными препаратами, повышая степень детоксикации лекарств [122].

GST вовлечен в метаболическую биотрансформацию многих противоопухолевых лекарств, он также защищает клетки от разрушения вследствие действия свободных радикалов. Существует несколько клеточных У линий с гиперэкспрессией GST. GST-тс изофермент, который гиперэкспрессирован в клетках рака молочной железы, устойчивых к адриамицину MCF7/ADR, эти клетки также экспрессируют P-gp. Увеличение уровня GST-ti также наблюдается в разных клеточных линиях с МЛУ. Другие GST изоформы в 8 раз увеличивают резистентность к лекарствам, таким как хлорамбуцил. Такие агенты, как этакриновая кислота и простагландин являются блокаторами GST активности. Они могут быть использованы для увеличения чувствительности к хлорамбуцилу или мелфалану [90].

GST является клеточным регулятором тиол трипептида. Глутатион также играет ключевую роль в детоксификации и клеточной репарации после разрушающего эффекта доксорубицина и алкилирующих агентов [110]. Увеличение уровня GSH наблюдается во многих клеточных линиях, резистентных к алкилирующим агентам. Уменьшение уровня GSH приводит к повышению чувствительности клеток с лекарственной резистентностью. Использование таких агентов, как бутатионин сульфоксамин (BSO) снижает GSH-опосредованную лекарственную резистентность, путем уменьшения GSH уровней [19].

Активность топоизомераз

Два типа топоизомераз присутствуют в эукариотических клетках (топоизомераза I и топоизомераза II) [96, 129]. Оба типа ферментов вовлечены в процесс ДНК репликации. Некоторые противоопухолевые препараты являются ингибиторами топоизомераз. Топоизомераза II является мишенью для доксорубицина и этопозида, тогда как топоизомераза I является мишенью для кампотецина. Эти препараты стабилизируют комплекс между ДНК и топоизомеразой, который в нормальных условиях быстро распадается. К препаратам, которые взаимодействуют с топоизомеразами, относятся доксорубицин, рубомицин, этопозид и др. Подобного рода резистентность может существовать параллельно с резистентностью, опосредованной действием P-gp, поскольку эти препараты являются субстратами для P-gp. Компенсаторное повышение уровня топоизомеразы I наблюдается в клетках, резистентных к ингибиторам топоизомеразы II, в которых наблюдается сниженный уровень этого фермента.

Изменение регуляции апоптоза.

Противоопухолевые препараты индуцируют программированную клеточную гибель (апоптоз). При апоптозе характерны агрегация хроматина, конденсация ядра, сморщивание клетки, уменьшение ее размеров и образование апоптотических телец. Решение будет ли клетка продолжать клеточный цикл или подвергнется апоптозу зависит от комплексного взаимодействия группы генов и белков. Опухолевый ген супрессор р53 играет роль не только в аресте клеточного цикла в Gi фазе, и апоптозе после повреждающего действия противоопухолевых лекарств на ДНК, но также регулирует экспрессию белка bcl-2 и Ьах [79]. Мутации гена р53 часто наблюдаются в опухолях, что обусловливает нарушение нормального функционирования белка и способности клеток индуцировать апоптоз или останавливать клеточный цикл после повреждения. Нарушение нормальных функций р53 может приводить к изменению чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам.

PTEN (также известен как ММАС-1 или ТЕР-1) - один из опухолевых г супрессоров. PTEN функционирует, как липидная фосфатаза и регулирует пути сигнальной трансдукции, ключевой мишенью которой является фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат [9]. Он проявляет слабую тирозин фосфатазную активность. С функционированием PTEN связывают многие нормальные процессы клетки, включающие рост, адгезию, миграцию, инвазию и апоптоз. Он также необходим для эмбрионального развития. PTEN препятствует действию фосфаинозитид 3-киназы (PI3-kinase) дефосфорилируя фосфотидилинозитол (3,4,5)-трифосфат. PTEN негативно влияет на выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, его активация может повысить чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам, а его инактивация вызывает лекарственную резистентность.

Вс1-2 - протоонкоген, повышенный уровень которого может наблюдаться в опухолях, подавляет апоптоз. Вс1-2 является членом семейства генов, продукты которых обладают, как антиапоптотическим (bcl-2, Bax-XL) так и проапоптотическим действием (Вах, Bad, Bic и др.) Способность клеток подвергаться апоптозу связана с образованием гетеро- и гомодимеров, f опосредованных через bcl-2 - Ьах взаимодействие [120]. Для примера, bax - bcl

2 гетеродимер, а также Ьах гомодимер способствуют апоптозу, тогда как апотоз к* ингибируется bcl-2 гомодимерами. Резистентнось может быть обусловлена мутациями генов, индуцирующих апоптоз (р53) или гиперэкспрессией генов, блокирующих клеточную гибель. Bcl-2 является геном, который играет ключевую роль в регуляции путей клеточной гибели.

Bcl-2 защищает клетки от стимулов, вызывающих гибель, таких как ультрафиолетовое или гамма облучение, фактор некроза опухолей или лекарства. Bcl-2 также может вызывать клеточную резистентность к цитостатическому действию ряда противоопухолевых препаратов, таких как доксорубицин, этопозид, таксол, камтотецин, митоксантрон и цисплатин. В отличие от МЛУ, опосредованной P-gp, гиперэкспрессия bcl-2 не предотвращает выброс лекарства из опухолевой клетки. Гиперэкспрессия bcl-2 t приводит к резистентным механизмам, при которых противоопухолевые лекарства способствуют аресту клеточного цикла, однако их эффект скорее цитостатический, чем цитотоксический [66].

CD95 является мембранным гликопротеином и членом семейства TNF рецепторов. При олигомеризации CD95 антителами или тримеризации CD95 лигандом, он передает апоптотические сигналы. CD95L - мембранный протеин, который принадлежит к семейству TNF цитокинов. Подобно другим членам этого семейства CD95L может находиться мембрано-связанным и в растворенной форме. Система лиганд-рецептор CD95L/CD95 играет важную роль в апоптозе некоторых типов клеток, есть данные, что эта система может иметь отношение к гибели опухолевых клеток при действии химиопрепаратов, л а нарушение в функционировании этой системы может приводить к ' лекарственной устойчивости [9].

2. Классический фенотип МЛУ Множественная лекарственная устойчивость, опосредованная транспортными белками

К транспортным белкам относится семейство АТФ-зависимых транспортеров. Эти белки также были обнаружены в бактериях и дрожжах [127]. Такие транспортеры обычно состоят из четырех структурных доменов, два из которых пронизывают мембрану (каждая состоит из нескольких трансмембранных сегментов) и два находятся в цитоплазме. Два последних звена являются нуклеотид-связанными доменами, они участвуют в расщеплении АТФ, извлекая энергию, необходимую для транспорта питательных веществ, аминокислот и низкомолекулярных пептидов через мембрану.

В число мембранных транспортеров, опосредующих МЛУ, входят MRP (белок, ассоциированный с МЛУ, или multidrug resistance associated protein),

LRP (lung-resistance-related-protein), P-gp, гиперэкспрессия которых может наблюдаться в опухолевых клетках и обуславливать выброс противоопухолевых лекарств из клетки, в результате чего происходит уменьшение уровня лекарства в клетке, необходимого для успешной терапии. Такие транспортеры объединяет общая доменная организация - наличие трансмембранных и АТФ-связывающих участков, которые также называются АВС-доменами.

MRP - белок, ассоциированный с МЛУ

MRP член семейства ABC транспортеров. MRP был обнаружен на клеточной линии мелкоклеточного рака легких резистентной к доксорубицину, которая не экспрессировала P-gp, и распознан, как трансмембранный гликопротеин. Он представляет собой несимметричную молекулу с восемью субъединицами и четырьмя мембранно-связанными доменами. Экспрессия MRP обнаруживается во многих опухолях, включая рак легких, острый лимфобластный лейкоз, хронический миелолейкоз [18, 30, 72].

В класс противоопухолевых препаратов, которые являются субстратами для MRP, входят антрациклины, такие как доксорубицин, винка-алкалоиды и этопозид. Проявлением МЛУ является выброс MRP препаратов из опухолевой клетки, вследствие чего уменьшается внутриклеточная аккумуляция лекарств. Хотя субстраты MRP и P-gp схожи, все же наблюдается только 15% гомологии по аминокислотам между ними. Известно несколько изоформ MRP, это MRP1, MRP2 или сМОАТ и MRP3-6. MRP1 и 2, идентифицированные как транспортеры органических анионов, также играют физиологическую роль в АТФ-зависимом однонаправленном транспорте конъюгатов глутатиона, таких как лейкотриен С4 и 8-(2,4-динитрофенил) глутатион. MRP2 может транспортировать винбластин.

Белок MRP определяет устойчивость клеток практически к тем же веществам, что и P-gp, однако с несколько другим спектром перекрестной резистентности. MRP также экспрессируется в нормальных тканях, таких как мышцы, легкие, селезенка, надпочечники, желчный пузырь. В клетках этих тканей MRP транспортирует конъюгаты глутатиона, которые играют важную роль в нормальной жизнедеятельности клеток.

Белок LRP (lung resistance protein)

LRP (major vault protein/lung resistance protein) был впервые обнаружен на клетках клеточной линии немелкоклеточного рака легких, в которых отсутствовал P-gp. Недавно было выявлено, что LRP присутствует во многих человеческих опухолевых клеточных линиях, которые ранее не были обработаны лекарствами. В этих клеточных линиях экспрессия LRP коррелирует с резистентностью к доксорубицину, винкристину и компонентам платины. Информация о клинической значимости LRP ограничена [80]. Он является специфическим белком клеточных органелл - рибонуклеопротеиновых частиц « vault», функция которых связана с ядерно-цитоплазматическим транспортом и везикулярным транспортом веществ, в том числе цитостатических лекарств, хотя прямые доказательства этого отсутствуют. Он экспрессируется при карциноме яичников, меланоме, немелкоклеточной карциноме легких, остром и хроническом миелолейкозе [17]. Экспрессию LRP связывают с плохим ответом на химиотерапию при карциноме яичников и остром миелолейкозе.

Транспортный белок Pgp 170

Pgp 170 - член суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков, является белком плазматической мембраны [9, 110]. Состоит из 1280 аминокислот, условно разделен на две половины, каждая из которых имеет 6 трансмембранных участков и цитоплазматический сайт связывания АТФ (рис.1). Было показано, что выброс субстратов P-gp из клетки это АТФ-зависимый процесс. Его субстратами являются антрациклины, винка-алкалоиды, подофиллотоксины и таксаны.

Pgp человека кодируется геном MDR1, который локализован на хромосоме 7. Семейство MDR включает два гена человека MDR1 и MDR2 и три гена грызунов (MDR1, 2, 3). Один ген человека (MDR1) и два грызунов имеют отношение к лекарственной резистентности.

В нормальных тканях Pgp 170 часто представлен на апикальных частях различных секреторных эпителиоцитов [11, 32]. Его физиологической ролью в организме является защита от экзогенных и эндогенных токсинов, транспорте АТФ, стероидов, полипептидов. Pgp также участвует в работе таких биологических барьеров как, плацента, гемато-тестикулярный, гемато-энцефалический барьеры. Он локализуется в таких тканях, как печень, почки, толстая кишка, ободочная кишка, кора надпочечников, поджелудочная железа, плацента, матка, клетки эндотелия сосудов и яичек [52, 116, 117]. клеточная 'А мембрана межклеточное пространство

О/? ОпС7 цитоплазма

CD0H

Рис.1 Вторичная структура P-gp

1-12 - гидрофобные трансмембранные участки А - сайты гликозилирования В - сайт связывания АТФ

Анализ уровня Р-гликопротеина на поверхности опухолевых клеток у онкологических больных показал, что экспрессия Pgp 170 наблюдается приблизительно в 50% случаев [27, 47, 76]. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов, вследствие усиленного выброса лекарства из клетки. В ряде случаев экспрессия P-gp на опухолевых клетках может служить плохим прогностическим признаком, даже если P-gp не всегда определяет резистентность больных к проводимой химиотерапии.

Выдвигаются несколько механизмов, объясняющих транспортные функции P-gp. Согласно модели Ниггесмана и Готтесмана (1992) P-gp, сталкиваясь с ксенобиотиками на внутренней стороне плазматической мембраны, переносит агенты к внешней стороне, где они диффундируют во внеклеточную среду (рис 2). Также предполагают, что P-gp повышает внеклеточный уровень рН, деполяризуя электрический потенциал плазматической мембраны клетки, действуя, как протонный насос или как хлоридный канал, таким образом, уменьшая аккумуляцию слабых оснований или уменьшая рН-зависимое связывание агентов к их внутриклеточным мишеням [115].

Рис.2 из клетки)

Сайт связывания лекарства лекарство 0

Мембрана ингибитор МЛУ О

Сай г связывания нн гнбитора внутрь клетки)

Рис.2 Схема функционирования P-gp Модель иллюстрирует белок, который использует энергию АТФ для выбрасывания лекарс твенных субстратов через плазматическую мембрану. Ингибитор МЛУ может взаимодействовать с местом связывания лекарства или с местом связывания ингибитора.

Согласно модели Готтесмана и Постана (1993), P-gp прямо взаимодействует с субстратами в плазматической мембране и выбрасывает их из клетки. Доказательства конкурентного связывания лекарства на P-gp молекуле было показано с радиоактивно меченными фотоаффинными зондами, такими как Nр-азидо-[3-1251]-салицил)- N -Р-амино виндезин и [3 Н] азидопин. Эта технология основана на передаче энергии от хромофорных субстратов P-gp к > фотоактивным радиомеченным зондам. Фотоактивный аналог винбластина, Nрг I р-азидо-[3- I]- салицил)- N -Р-амино виндезин использовали как зонд, который присутствовал на винбластин связывающих сайтах на молекуле P-gp, который находился на мембранах везикул, полученных из клеток легких китайского хомячка и клетках человеческой карциномы с МЛУ. Эта метка ингибировала связывание винкристина и даунорубицина, что свидетельствует о том, что связывание было конкурентным [33].

В связи с клинической значимостью P-gp ведутся поиски путей преодоления его активности. Было показано в эксперименте, что множество веществ ингибируют выброс лекарства из клетки, опосредованный P-gp и, следовательно, предотвращают резистентность [25, 28]. Для повышения чувствительности клеток к химиотерапии используют ингибиторы P-gp в комбинации с противоопухолевыми лекарствами. Такие комбинации позволяют > усилить внутриклеточную аккумуляцию лекарств, путем ослабления транспортной функции P-gp, и, вследствие этого, частичного преодоления клеточной резистентности.

К ингибиторам P-gp принадлежит ряд препаратов, таких как блокаторы кальциевых каналов, коронарные вазодиляторы, индол алколоиды, гормоны, циклоспорины и многие другие гидрофобные препараты [48]. Клинические испытания показали, что для большинства ингибиторов МЛУ, опосредованной P-gp, не удается получить в крови больных концентрации, необходимой для преодоления лекарственной устойчивости, поскольку высокие дозы этих препаратов дают тяжелые осложнения. В настоящее время разрабатываются менее токсичные и более эффективные модуляторы P-gp. Tsuruo и соавторы впервые продемонстрировали способность блокатора кальциевых каналов верапамила, преодолевать МЛУ [124, 125]. Верапамил усиливал внутриклеточную аккумуляцию многих противоопухолевых лекарств, включая доксорубицин во многих клеточных линиях [46, 55, 58]. Также было продемонстрировано, что антагонисты кальция преодолевали МЛУ in vitro, к > ним относятся: фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, бепридил и дилтиазем. Эти агенты ингибировали МЛУ при очень высоких концентрациях от 5 до 50 мкМ. Такие высокие концентрации приводили к цитотоксическому действию не только в резистентных, но и в нормальных клетках [73, 74]. Индол алколоиды, и антималярийный хинин также предотвращали МЛУ in vitro на клеточных линиях в комбинации с доксорубицином. Циклоспорин А, который применяется как иммуносуппрессант при трансплантации органов, является одним из эффективных модуляторов МЛУ. В комбинации с некоторыми противоопухолевыми лекарствами он эффективно преодолевал МЛУ во многих клеточных линиях, таких как Р388, СНО, К562, СЕМ и С26.

Большинство ингибиторов первого поколения преодолевали МЛУ при очень высоких концентрациях. Поиски не токсичных ингибиторов привели к г открытию новых соединений относящихся ко второму поколению, являющихся аналогами первых, но более сильных и менее токсичных.

Структурные аналоги верапамила: дексверапамил, емопамил, галлопамил и Ro 11-2933 преодолевали МЛУ in vitro аналогично верапамилу, но с незначительной токсичностью на многих экспериментальных моделях животных [92]. Некоторые из этих агентов показали сильное ингибирующее действие, такие как тиапамил аналог Rol 1-2933, который эффективен в концентрации 1-2 мкМ по сравнению с верапамилом 5-10 мкМ. Не иммуносуппрессивный аналог циклоспорина A, PSC 833, вызывал эффективное ингибирование МЛУ во многих экспериментах in vitro на клеточных линиях. PSC 833 преодолевал МЛУ в комбинации с даунорубицином, доксорубицином, винкристином, винбластином, таксолом и митоксантроном в клетках МЛУ клеточной линии Р388 in vitro в концентрации 0,5-2 мкМ [23, 67].

Недавно были созданы ингибиторы МЛУ путем использования структурно-активационных взаимоотношений и комбинаторных химических подходов против специфических механизмов МЛУ. Эти агенты эффективно преодолевали МЛУ в наномолярных концентрациях (20-100 нМ). К ним относятся специфические блокаторы P-gp, такие как циклопропилдибензосуберан LY 335979, акридонекарбоксамин GF 120918, дикетопиперазин XR9051, диарилимидазол ОС 144-093, также биспецифичные (и P-gp и MRP) блокаторы, такие как VX-710 и VX-853. Циклопропилдибензосуберан LY 335979 оказывает в 10-раз более сильное по сравнению с циклоспорином А ингибирующее действие, блокируя механизмы, специфичные для P-gp [39]. Акридонекарбоксамин GF 120918 сходен по характеристикам с LY 335979, которые заключаются в селективном блокировании механизма P-gp. Хотя все эти агенты показали эффективность в комбинации с противоопухолевыми препаратами, такими как доксорубицин, все еще исследуется в какой степени эти соединения могут преодолевать резистентность в более устойчивых моделях солидных опухолей и в клинике при лечении резистентных опухолей.

Первое поколение ингибиторов, таких как верапамил и циклоспорин А, обладали фармакологической активностью, что было показано и в предклинических и в клинических исследованиях, при этом требовались высокие дозы для получения терапевтических концентраций, достаточных для преодоления МЛУ in vivo [100]. Эти дозы оказывали тяжелое токсическое действие. Поэтому первое поколение ингибиторов нуждалось в развитии или создании новых соединений ингибиторов МЛУ с низкой токсичностью. Созданные ингибиторы второго поколения были менее токсичны и в целом преодолевали МЛУ более эффективно, чем первые. Не смотря на то, что эти агенты преодолевали МЛУ, опосредованной P-gp, при комбинированном введении с противоопухолевыми лекарствами они оказывали влияние на фармакокинетические свойства этих препаратов. Возможно, это было следствием блокирования P-gp в нормальных тканях, таких как печень и почки, которые обладают секреторной функцией. Например, такое фармакокинетическое взаимодействие в 8 раз увеличивало концентрацию в плазме даунорубицина, когда противоопухолевый препарат комбинировали с Р> gp ингибитором верапамилом у крыс, что приводило к усилению токсичности и, как следствие этого, требовалось уменьшение дозы противоопухолевого лекарства [94]. Многими исследованиями было подтверждено, что высокие дозы верапамила приводили к 8 кратному увеличению захвата винкристина в таких тканях, как печень, почки, кишечник, что потребовало 8-кратного уменьшения дозы препарата. Недавно было показано, что VX-853, сильный ингибитор МЛУ третьего поколения, в 3 раза уменьшал клиренс в плазме паклитоксела, при котором тоже требовалось уменьшение дозы лекарства.

По-видимому, как следствие этих осложнений, оказалась неудачной II фаза клинических испытаний у больных раком легкого, яичников, молочной железы, кишечника, почки, миеломой и лейкемии. Из-за отсутствия селективной экспрессии P-gp на опухолевой ткани не понятно в какой степени изменения в г фармакокинетике, вызванные ингибитором, могут отрицательно сказываться на терапии [107].

Механизмы МЛУ не ограничиваются основными положениями, которые были изложены выше. Однако ясно, что они многочисленны. Открытие новых механизмов, обусловливающих резистентность опухолевых клеток, продолжается.

Липосомы - новый подход для лекарственной доставки

Альтернативным подходом для преодоления лекарственной резистентности является новая система лекарственной доставки на основе липосомальных форм химиопрепаратов, которая способствует селективному накоплению препаратов в опухолевой ткани. Липосомальные носители в клинической онкологии стали распространенными при лечении солидных опухолей и по $ существу, являются моделью системы доставки, которые могут усиливать действие противоопухолевых лекарств [5, 56, 109]. Например, длительно циркулирующие липосомы и другие макромолекулярные носители могут увеличивать депонирование лекарств в солидных опухолях [38, 41, 98].

Липосомы представляют собой микросферы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что определяет их многие привлекательные качества. Гидрофильные полярные головки липидов находятся в контакте с водной фазой и защищают от воды гидрофобные углеводородные цепи. Они нетоксичны, биодеградируемы, при определенных условиях могут поглощаться клетками или сливаться с клеточной мембраной. Внутри липосомы находится водное пространство (рис. 3). Водорастворимые лекарства могут включаться в водное пространство липосом, а жирорастворимые в липидный бислой [1,7].

Рис.3 Модель липосомы

При включении лекарства в липосомы объем его распространения в организме значительно уменьшается, при этом увеличивается концентрация лекарства в опухоли, что приводит к снижению неспецифической токсичности препарата [49]. При оптимальных условиях, лекарство находится внутри водного пространства липосом, тогда как после попадании в клетку лекарство становится биодоступным. Липосомы защищают лекарство от метаболизма и инактивации в плазме. Транспорт липосом через нормальный эндотелий ограничен, вследствие чего уменьшается накопление лекарства в здоровых тканях. Эндотелий сосудов опухолевых тканей фенистрирован это приводит к тому, что небольшие носители могут проникать через образовавшиеся поры, в опухолевую ткань [57]. Все эти факторы вносят вклад в повышение терапевтического эффекта, которое наблюдается при применении липосомальных форм некоторых противоопухолевых препаратов. Большинство г липосомальных препаратов, которые используются в клинике при лечении опухолей, являются маленькими однослойными везикулами, состоящими из одной фосфолипидной бислойной мембраны с внутренним водным пространством для инкапсуляции лекарств. Многослойные и другие структуры, также используются для доставки гидрофобных лекарств, которые включаются в липосомальную мембрану. Фармакокинетика липосом зависит от свойств, таких как размер липосом, поверхностный заряд, композиции липидов, из которых состоит мембрана липосом. Липосомальные лекарства, которые в настоящее время используются в клинической онкологии, являются стандартизованными и предусмотрены для длительной циркуляции.

Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами лекарств, включая возможность преодоления лекарственной резистентности [5, 6, 134]. Липосомальные системы доставки препаратов могут преодолевать активность транспортных белков МЛУ даже в высоко резистентных опухолях.

В настоящее время в клинике используют липосомальные формы антрациклинов, а также другие липосомальные препараты, такие как липосомальная форма паклитаксела, различные камптотецины и винкристин. Также создаются новые конструкции липосом для лечения опухолей с лекарственной резистентностью. Например, анионные липосомы, поскольку анионные липиды могут ингибировать P-gp; термолипосомы, из которых вытекает лекарство в условиях гипертермии; липосомы, которые могут увеличивать и оптимизировать выход лекарства в ткани мишени в зависимости от рН окружающей среды. Также липосомальные химиопрепараты могут быть эффективнее, чем свободные лекарства в комбинации с ингибиторами МЛУ. Липосомы позволяют доставлять плохо растворимые лекарства, которые не являются субстратами для P-gp. Также липосомы используют для доставки антисмысловых олигонуклеотидов к опухолевым клеткам для преодоления лекарственной резистентности.

В настоящее время два липосомальных антрациклина используют для лечения опухолей: пегилированный липосомальный доксорубицин (PLD, Doxil, ALZA Pharmaceuticals, Palo Alto, CA; также известный как Caelyx) и липосомальный даунорубицин (DaunoXome, Gilead Sciences, Foster City, CA). PLD представляет собой маленькие униламеллярные везикулы (100 нм), состоящие из нейтральных липидов, окруженных полиэтиленгликолем (ПЭГ), который защищает от не специфических взаимодействий. Пегелированные липосомы называют стерически стабилизированными липосомами. При этом доксорубицин включается внутрь липосом очень эффективно, наблюдается хорошая упаковка или даже кристаллизация в водном пространстве липосом [20]. Липосомальный даунорубицин также представляет собой маленькие униламеллярные везикулы, которые состоят исключительно из нейтральных липидов дистеароилфосфатидилхолина и холестерина, и, таким образом, тоже характеризуется нейтральным зарядом и жесткими мембранами с очень маленьким размером липосом (< 40нм) [49].

Доксорубицин относится к антрациклиновым гликозидам, он является противоопухолевым антибиотиком. Доксорубицин представляет собой S-фазовоспецифичный препарат. Точный механизм его противоопухолевого действия неизвестен, но оно может быть обусловлено связыванием с ДНК путем встраивания между парами оснований и ингибированием синтеза ДНК и РНК в результате нарушения матрицы и изменения пространственной структуры. Другие возможные механизмы противоопухолевой активности включают связывание с липидами мембран клеток и, как следствие, изменение различных клеточных функций, взаимодействие с топоизомеразой II и образование расщепленных комплексов ДНК [6].

Через гематоэнцефалический барьер доксорубицин не проходит. Быстрая биотрансформация (в течение 1ч), происходит в печени, при этом образуется активный метаболит доксорубицинол. Ферментативное восстановление доксорубицина под действием оксидаз, редуктаз и дегидрогеназ приводит к образованию свободных радикалов, что может способствовать кардиотоксическому действию препарата. Фаза распределения примерно 5 мин. Фаза выведения 20-48 ч для доксорубицина и доксорубицинола. Препарат выводится с желчью 40% в неизмененном виде в течение 5 дней, почками 512% доксорубицина и его метаболитов, нахождение препарата в моче определяется в течение 5 дней [3].

Доксорубицин применяют главным образом в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами при лимфо- и ретикулосаркомах, лимфогранулематозе, острых лейкозах, раке молочной железы, раке легкого, злокачественных опухолях яичка, саркомах мягких тканей и некоторых костных саркомах, нейрабластоме и опухоли Вильмса у детей, а также у некоторых больных раком щитовидной железы и переходноклеточным раком мочевого пузыря.

Возможными отдаленными эффектами многих противоопухолевых препаратов являются вторичные злокачественные опухоли, хотя не ясно, связано ли их развитие с мутагенным или иммунодепрессивным действием этих средств. Влияние дозы и продолжительности лечения также не известно, но вероятно, риск повышается при длительном применении. Хотя информация ограничена, имеющиеся данные позволяют предположить, что риск канцерогенного действия наиболее высок при использовании алкилирующих препаратов. Доксорубицин оказывает канцерогенное действие у животных и является потенциальным канцерогенным препаратом для человека. Вызывает побочные эффекты, такие как гематологические осложнения, выпадения волос, осложнения со стороны сердца и вторичный рак [10].

Побочными эффектами при использовании доксорубицина могут быть: лейкопения, тромбоцитопения, инфекция, стоматит, кардиотоксическое действие, образование экстравазата, целлюлит, некроз ткани, изъязвление в желудочно-кишечном тракте, гиперурикемия, нефропатия, связанная с повышенным образованием мочевой кислоты, местная реакция, флебофиброз, рецедив лучевой эритемы, аллергическая реакция и анафилаксия [4, 6].

Оба липосомальных антрациклина (доксорубицин и даунорубицин) были впервые использованы для лечения саркомы Капоши, которая развивалась при СПИДе. Прямых доказательств того, что липосомальный доксорубицин способен преодолевать клеточную резистентность нет. В исследованиях, проведенных Northfelt, у 53 пациентов с саркомой Капоши, развившейся на фоне СПИДа, применяли PLD во второй линии после слабо эффективной предшествующей химиотерапии [95]. Из 28 пациентов, которые были с прогрессированием заболевания после лечения, включавшим стандартную лекарственную форму доксорубицина, на терапию PLD объективно ответ наблюдали у 32% пациентов. Эти результаты указывают на то, что PLD может вызывать клинический ответ у пациентов, рефрактерных к предшествующей терапии, которая включала в себя лиофилизированную форму доксорубицина.

PLD не вызвал эффекта у больных по поводу рака молочной железы, которые были антрациклин-резистентными [113]. Эта II фаза исследования включала 11 пациентов с метастазирующим раком молочной железы, которые или прогрессировали и получали стандартное лечение, включающее антрациклины или это были больные, у которых развивались метастазы через 6 месяцев после терапии, включавшей антрациклины. Никакого объективно ответа у этой резистентной по антрациклину группы получено не было. В этом исследовании PLD не показал перекрестной-резистентности к доксорубицину, как при саркоме Капоши. Это может быть следствием меньшей аккумуляции PLD в клетках опухоли при раке молочной железы, в отличие от высоко васкуляризированной саркомы Капоши, также это может быть за счет различий в механизмах резистентности между двумя типами опухолей или обусловлено другими причинами. Однако, PLD вызвал эффект при раке молочной железы, когда его использовали как в монотерапии, так и в комбинации с другими липосомальными антрациклинами, что сопровождалось уменьшением токсического эффекта [103].

В настоящее время липосомальные препараты можно комбинировать с другими терапевтическими подходами лечения. В частности, гипертермия может быть использована для ингибирования биораспространения липосомальных лекарств. В животных моделях применение гипертермии подкожных опухолей, после внутривенного введения длительно циркулирующих липосом, приводила к значительному увеличению захвата липосом в опухолевой ткани [85]. Это является следствием вызванных гипертермией изменений в динамике микроциркуляции и сосудистой проницаемости, которая облегчает проникновение липосом из опухолевых сосудов.

Липосомальные антрациклины были исследованы и при других нозологиях. Например, при III фазе рандомизированных клинических исследований терапии рака яичников PLD был эффективен во второй линии терапии, после первой, включавшей платину. Также хорошие результаты получены при лечении множественной миеломы и неХоджкинской лимфомы.

Таким образом, длительно циркулирующий липосомальный даунорубицин, как и пегилированный липосомальный доксорубицин, созданный и одобренный в Европе (MyocetTM, Elan Pharma, Munich, Germany) значительно изменяют биораспространение, уменьшают токсичность включенных в них лекарств [20].

Липосомы, способные ингибировать P-gp

Многими исследованиями было показано, что липосомы используют при лекарственной резистентности опухолей путем включения в состав липосом анионных фосфолипидов, таких как кардиолипин и фосфотидилсерин [99]. Эффектом такой доставки было увеличение клеточного накопления и цитотоксичности липосомальных агентов. Механизм действия для таких липосом включает прямое взаимодействие между анионными липидами и P-gp [99]. Было показано, что анионные липосомы интернализуются клетками определенного вида, в отличие от минимального взаимодействия, которое наблюдается при действии стабилизированных нейтральных липосом [75]. При интернализации анионных липосом наблюдался выход лекарства во внутриклеточную среду, обходя P-gp или другие мембранные транспортеры. Однако, несмотря на преодоление механизмов МЛУ в экспериментальных моделях, анионные липосомы не достаточно стабильны in vivo, время циркуляции для таких липосом невелико, все эти причины ограничивают их использование в клинике [43].

Нейтральные фосфолипиды, такие как фосфотидилхолин и фосфатидилэтаноламин, входящие в состав многих липосомальных мембран, являются субстратами P-gp, которые могут конкурировать с лекарством за связывание с P-gp [126]. Например липосомы, содержащие фосфотидилхолин или фосфатидилэтаноламин, вызывают увеличение захвата лекарства и усиление цитотоксичности в клеточных линиях с МЛУ. Это наблюдается не только с липосомальными формами лекарств, но также с пустыми липосомами, с которыми были предварительно проинкубированы клетки перед добавлением свободного препарата, что указывает на прямое взаимодействие между липосомами и клетками [101]. Michieli и соавторы 1999 наблюдали, что в клетках линии с МЛУ, которая гиперэкспрессировала P-gp, липосомальный даунорубицин, мембрана которого состояла из фосфотидилхолин/холестерина, вызывал значительную внутриклеточную аккумуляцию препарата по сравнению со свободным препаратом, что приводило к 4-5 кратному увеличению цитотоксического эффекта [88]. Однако, механизм этого эффекта неясен. Нейтральные липосомы не обнаруживают способности к хорошему слиянию с клетками и не интернализуются в большинстве опухолевых клеточных типах.

Липосомы, способные к триггерному выходу лекарства: Термо и рНчуствительные липосомы

Стабилизированные липосомы проникают из сосудов в опухолевые ткани, где в конечном итоге происходит выход лекарства и проникновение его в опухолевые клетки. Процессы, действующие как стимуляторы выхода препарата из липосом, могут включать захват липосом рэтикулоэндотелиальной системой, а также дестабилизацию тканевыми липазами, окисляющими агентами или другими тканевыми компонентами [44]. Новые подходы в создании липосомальных препаратов включают конструирование липосом, способных к триггерному выходу препарата: такие липосомы могут подвергаться структурным изменениям в ответ на физико-химические стимулы, таким образом можно контролировать выход препарата из липосом. Примером таких липосом являются: термочувствительные липосомы, из которых при гипертермии наблюдается выход лекарства, и рН-чуствительные липосомы, триггером которых является кислая среда.

Гипертермия может усиливать накопление в опухоли стабильных и длительно циркулирующих липосом, при этом гипертермия используется и как дестабилизатор термочувствительных липосом, таким образом, обеспечивая выход лекарства в гипертермированный регион. Термолипосомы должны состоять из липидов температурная фаза перехода которых выше 37°С. Таким образом, гипертермия индуцирует структурные изменения, приводящие к быстрому выходу инкапсулированного в липосомы препарата. Например, термочувствительные липосомы с доксорубицином были тестированы in vitro на клетках сублинии MCF-7 с МЛУ. При действии на них липосомального доксорубицина и гипертермии клеточный рост был ингибирован на таком же уровне, как и на клетках без МЛУ [87]. При этом наблюдался быстрый выход доксорубицина при 39-40°С.

Комбинация липосом и ингибиторов мембранных транспортеров Многие агенты способны ингибировать мембранные транспортеры, такие как P-gp, хотя до сих пор нет четких доказательств преимущества этих ингибиторов в клинике. Трудностями в развитии ингибиторов P-gp являются фармакологические ограничения, как самих ингибиторов, так и в комбинации с химиотерапией. Например, PSC 833 (валосподар) аналог циклоспорина и мощный ингибитор P-gp. Хотя этот агент сам вызывает токсичность при использовании его в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, такими как даунорубицин, доксорубицин и паклетаксел, наблюдается значительное изменение в клиренсе и фармакокинетике химиотерапевтических лекарств, приводящее к усилению токсичности [12]. В предклинических исследованиях комбинация PSC 833 с липосомальным доксорубицином была предпочтительнее, чем со свободным препаратом, поскольку он предотвращал нежелательное взаимодействие между лекарствами, пегилированный липосомальный доксорубицин был не затронут PSC 833. Липосомальная доставка может уменьшать определенные фармакологические сложности, связанные с сопутствующей антирезистентной терапией, путем включения антирезистентных агентов в липосомы. В ранних исследованиях в липосомы упаковывали ингибитор P-gp валиномуцин, который сам обуславливал значительную токсичность. Липосомальный валиномуцин давал меньшую токсичность без уменьшения ингбиторной активности для P-gp в экспериментальных моделях [40].

Доставка аналогов гидрофобных лекарств

Липосомы могут также использоваться для доставки аналогов гидрофобных лекарств, предназначенных для предотвращения резистентности, опосредованной мембранными транспортерами. Например, антрациклин -аннамицин и липофильное производные платины [105]. Эти соединения предназначены для того, чтобы сделать клеточный захват относительно независимым от P-gp и/или других выбрасывающих лекарства насосов. Хотя липосомальный аннамицин, проявил активность в предклинических исследованиях на моделях с лекарственной резистентностью, во II фазе клинических исследований липосомальный аннамицин никаких ясных доказательств эффективности у пациентов с • раком молочной железы, резистентных по доксорубицину не показал [24].

Иммунолипосомы

Для того чтобы оказать непосредственное действие лекарственных носителей на опухолевые клетки, были разработаны липосомы, связанные с антителами - иммунолипосомы [102]. Иммунолипосомы были созданы для специфического распознавания соответствующих антигенов. В принципе, терапевтический эффект может быть увеличен при применении иммунолипосом, поскольку их содержимое попадает прямо в опухолевые клетки вслед за рецептор опосредованным эндоцитозом. Исходя из сказанного, можно сделать вывод, что использование иммунолипосом может быть более эффективно при резистентных опухолях.

HER2 (ErbB2, Neu) является онкогеном рецептор-тирозин киназ (RTK), который может быть мишенью при терапии на основе моноклональных антител, таких как герцептин. Иммунолипосомы к HER2 были сконструированы для взаимодействия и интернализации с HER2гиперэкспрессирующими опухолевыми клетками, и приводили к селективной внутриклеточной лекарственной доставке [68, 100]. Иммунолипосомы, содержащие или Fab или scFv фрагменты против HER2, были использованы для доставки доксорубицина, в результате это привело к сильной и селективной противоопухолевой активности в ряде опухолевых моделей. При этом наблюдался больший эффект, чем при использовании свободного доксорубицина, обычного липосомального доксорубицина и липосомального доксорубицина плюс свободные анти- HER2 антитела [68, 100].

Иммунолипосомы против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR/HERl/ErbBl) представляют другой пример, основанный на иммунолипосомальной лекарственной доставке [81]. Иммунолипосомы к EGFR-мишеням, в клеточных культурах, как было показано, интенсивно интернализовались в цитоплазму EGFR-гиперэкспрессирующих клеток, тогда как в неэкспрессирующих клетках не наблюдалась интернализация. При этом отмечалась заметная цитотоксичность, когда включали в иммунолипосомы любые из нескольких химиотерапевтических агентов (доксорубицин, винорелбин и метотрексат).

Иммунолипосомы, захватываемые клеткой, обеспечивают точную внутриклеточную доставку лекарства, путем пенитрации плазматической мембраны, обеспечивают выход лекарства внутрь цитоплазмы, обходя мембран-связанные тарнспортные механизмы. В in vivo исследованиях на резистентных моделях мышиной карциномы легких была показана большая эффективность иммунолипосомального доксорубицина по сравнению со свободным препаратом и обычным липосомальным доксорубицином [53]. Рецептор трансферина также может являться мишенью для иммунолипосом. Антитрансфериновые иммунолипосомы использовали для доставки доксорубицина в резистентные по этому препарату клетки сублинии К562 (K562/ADR) [121]. При этом наблюдали минимальный выброс лекарства из клетки и уровень доксорубицина был приблизительно эквивалентен в резистентных K562/ADR клетках и родительской линии, тогда как свободный препарат был выброшен из клетки. В проведенных исследованиях антитрасфериновые иммунолипосомы, конъюгированные с антителами ОХ26, были использованы для доставки радиоактивномеченного дигоксина в иммортолизованных RBE4 крысиных капиллярных эндотелиальных клетках мозга. Клеточный захват дигоксина был в 25-раз выше при использовании иммунолипосом.

Другие иммунолипосомы, созданные для преодоления лекарственной резистентности, включают иммунолипосомы, конъюгированные с моноклональными антителами к P-gp, которые вызывали увеличение цитотоксичности инкапсулированного винорилбина в резистентных К562 клетках [84].

Использование липосомальных векторов в генной терапии

Существуют различные подходы генной терапии для ингибирования, преодоления или использования механизмов резистентности. Прогресс в этой области и в генной терапии опухолей в настоящее время ограничен недостаточным развитием генно-векторной технологии для доставки нуклеиновых кислот. Для вирусных векторов характерны: канцерогенность, токсичность, иммуногенность, не специфичность, низкая экспрессия вирусных рецепторов на опухолевых клетках, а также сложная процедура создания. Использование липосомальной системы доставки более дешево. Однако эти системы опираются в основном на катионные липиды/липосомы для упаковки нуклеиновых кислот, которые являются более стабильными, чем нейтральные липосомы, созданные для эффективной длительной циркуляции. Конструкции, содержащей ген, необходима стабильность для проведения успешной генной терапии, более того, добавление фрагментов антител или других лигандов к конструкции может позволить сделать генную доставку более специфичной и эффективной.

Генная терапия на основе липосом включает подходы, при которых возможно прямое воздействие на механизмы лекарственной резистентности [71, 104]. Например, использование катионных липосом для доставки антисмысловых олигонуклеотидов или рибозимов против сиквенсов MDR1 гена, а также использование технологии генной терапии для гиперэкспрессии генов лекарственной резистентности в нормальных тканях, для защиты тканей от токсического действия химиотерапии [123, 15, 83]. Например, ген MDR1 трансфецированный посредством липосомальных векторов в гематопоэтические предшественники в костном мозге [14].

Олигонуклеотиды сконструированы для того, чтобы смодулировать передачу генетической информации, но механизмы, с помощью которых олигонуклеотиды могут индуцировать биологический эффект, сложны. Для того чтобы антисмысловые олигонуклеотиды снижали экспрессию гена, он должен проникнуть в клетки мишени. Данные о точных механизмах, вовлеченных в этот процесс не ясны. Захват происходит через активный транспорт, который в свою очередь зависит от температуры, структуры и концентрации олигонуклеотидов и линии клеток [78, 128, 135]. Многочисленными работами было продемонстрировано, что олигонуклеотиды плохо интернализуются в клетках вне зависимости от того отрицательно они заряжены или нет, а также обязательным условием для действия антисмысловых олигонуклеотидов является, по-видимому, их ядерная локализация [54, 22]. Для того чтобы улучшить клеточный захват и активность антисмысловых олигонуклеотидов используют транспортеры, такие как липосомы. Использование этих транспортеров позволяет увеличить стабильность олигонуклеотидов от разрушения нуклеазами и позволяет использовать их меньшие концентрации .

Нуклеиновые кислоты могут легко инкапсулироваться в липосомы, которые содержат водное пространство, либо могут быть связанными с липосомальной поверхностью электростатическими взаимодействиями. Эти векторы, из-за их положительного заряда, имеют высокую аффинность к мембранам клеток, которые отрицательно заряжены при физиологических условиях [119].

Bcl-2 - важный антиапоптотический белок, который определяется в различных человеческих опухолевых клетках. Его ингибирование может теоретически вызывать чувствительность клеток к цитотоксической химиотерапии, что было показано в ряде последних исследований на тканевых культурах и экспериментальных моделях, которые привели к началу клинических испытаний [59].

Гиперэкспрессия Bcl-2 наблюдается при многих видах новообразований. Bcl-2 повышен приблизительно в 35% опухолей у больных раком предстательной железы [86, 21]. При гиперэкспрессии белка bcl-2 в опухолевых клетках простаты LNCaP увеличивался их in vivo туморогенный потенциал и появлялась резистентность к апоптозу [108]. Экспрессия Bcl-2 в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы является низкой или отсутствует.

Первоначально, антисмысловые фосфодиестер и фосфоротиоат олигонуклеотиды к мРНК bcl-2, использовались для ингибирования роста клеток в культуре 697 человеческой лейкемии [112]. Мишенью олигонуклеотидов является сайт инициации трансляции человеческого мРНК bcl-2. Оба класса олигомеров уменьшают клеточную пролиферацию: фосфоротиоаты более сильные ингибиторы, эксперименты с фосфодиестером в настоящее время потеряли свою значимость. Предполагалось, что фосфоротиоат bcl-2 антисмысловые олигонуклеотиды индуцируют клеточную гибель через взаимодействие со специфическими участками [26, 45].

Препарат G3139, представляющий собой фосфодиестер и фосфоротиоат антисмысловые олигонуклеотиды, направленные против первых шести кодонов Bcl-2 мРНК (G3139, Genta, Inc., Lexington, Mass.), был успешно использован на клетках Неходжскинской лимфомы. Молекулярная масса G3139 - 579,99. Он нестабилен в растворах со значением рН менее 3 или выше 7. Предполагаемое специфическое уменьшение уровня Bcl-2 мРНК через один день после обработки было продемонстрировано Kitada и соав. в клетках SU-DHL-4 [69]. Соизмеримое уменьшение в уровне белка Bcl-2, наблюдалось только после трех дней, по-видимому, из-за длительного периода жизни белка Bcl-2, что было связано с сильным снижением клеточной жизнеспособности. Обработка клеток лимфомы RS11846 препаратом G3139 приводила к уменьшению экспрессии Bcl-2 и увеличени. чувствительности этих клеток к АгаС и метотрексату [70]. При этом использовалась чрезвычайно высокая концентрация олигонуклеотидов.

Обработка опухолевых клеток LNCaP и опухоли Шионоги in vitro G3139 ингибировала экспрессию Bcl-2, что зависело от дозы и специфичности последовательностей [50, 89]. Авторы использовали катионный липид липофектина для доставки и измеряли уровни bcl-2 белка и мРНК. Однако они использовали только одиночный контроль олигонуклеотида, который уменьшает достоверность эксперимента. В других экспериментах, антисмысловые олигонуклеотиды существенно усиливали чувствительность к паклитакселу и доцетакселу, причем усиление действия препаратов зависело от их дозы. Характерные апоптотические изменения были обнаружены только после комбинированного лечения, а не после использования одного Bcl-2 олигомера [37, 51].

В настоящее время фосфоротиоат олигонуклеотиды (G3139) изучаются при введении внутривенно или интроперитонеально у пациентов, которые принимают участие в клинических испытаниях [13, 60]. Эти олигонуклеотиды стабильны в течение 48 часов, к этому времени их уровни все еще могут определяться в тканях. После внутривенного введения G3139 в дозе приблизительно 5 мкг/кг, элиминация в плазме составляет 22ч [34, 35, 111, 133].

Данные клинических исследований дают основания для дальнейшего клинического развития G3139, как монотерапии, так и в комбинации с другими цитотоксическими препаратами [29, 36, 64, 65, 91, 130, 131]. G3139 в настоящее время проходит I/II фазы испытаний у пациентов с андроген-независимым раком предстательной железы, которым назначают G3139 в комбинации с доцетакселом. Клинические испытания других нозологий опухолей планируются [29, 91]. Эффективность этого препарата в клинике в настоящее время обнадеживает, так как его токсичность относительно низкая, состоит, главным образом, в утомлении и тромбоцитопении.

Поиск подходов для доставки лекарств к мишени, включающий клеточный или субклеточные сайты и увеличения биодоступности активного лекарства, играет важную роль. Липосомальная система доставки активно развивается и становится более усовершенствованной. Одним из перспективных подходов является использование иммунолипосом или других лиганд-связанных липосом, которые характеризуются интеграцией с молекулярной мишенью и лекарственной доставкой. Эти агенты могут вызывать лиганд-опосредованную интернализацию и внутриклеточную доставку лекарства, таким образом, добиваясь значительной селекции и эффективности доставки к опухолевой клетке, включая резистентные опухоли. В настоящее время липосомальные антрациклины в ряде случаев могут значительно уменьшать механизмы резистентности, основанной, в основном, на изменении фармакокинетики, биодоступности и токсичности, по сравнению со свободным лекарством. Разрабатывается ряд других липосомальных лекарств. Стратегия, основанная на использовании липосом, включает попытку прямого воздействия на выброс лекарства, таким образом, преодолевая некоторые механизмы резистентности. Приведенные данные позволяют надеяться на реальную возможность использования липосомальных форм цитостатиков для лечения злокачественных опухолей. На сегодняшний день специалисты многих стран мира работают над созданием липосомальных форм химиопрепаратов. Применение цитостатиков, инкапсулированных в липосомы, значительно расширяет возможности химиотерапии опухолей и повышает ее эффективность даже в высоко резистентных опухолях.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Шоуа, Илона Беслановна

Выводы:

1. Разработана липосомальная форма доксорубицина. Полученны липосомы со средним диаметром 116±3 нм.

2. Разработана липосомальная форма циклоплатама. Средний размер полученных липосом составляет 142,3±4 нм.

3. Липосомальный доксорубицин накапливается в клетках in vitro в большем количестве по сравнению со свободным препаратом.

4. Липосомальная лекарственная форма доксорубицина была более эффективной на линий К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 по сравнению со свободным препаратом.

5. Показана высокая цитотоксическая активность липосомального циклоплатама на клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Pgp 170 и родительской линии К562 по сравнению с лиофилизированной формой циклоплатама.

6. При использовании липосомальной лекарственной формы циклоплатама меняется биодоступность препарата, в связи, с чем диапазон его оптимальных терапевтических доз снижается по сравнению с величинами доз препарата в лиофилизированной форме и составляет 30, 40 мг/кг и 40, 50 мг/кг, соответственно.

7. По торможению роста опухоли и длительности противоопухолевого эффекта липосомальный циклоплатам более эффективен при лечении меланомы В-16, по сравнению со свободной формой циклоплатама.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шоуа, Илона Беслановна, 2005 год

1. Барсуков Л.И. Липосомы. Соросовский образовательный журнал // 1998, №10.

2. Кановалова А.Л. Противоопухолевая активность нового противоопухолевого препарата циклоплатам. // Тематический сборник «Циклоплатам», издательство РОНЦ РАМН, Москва выпуск 1993, с. 3-15.

3. Клюева М. А. Лекарственные средства 4000 наименований лекарственных препаратов и их форм (свойства, применение, взаимодействие, противопоказания). Справочник. АО «Книжный дом Локус». 1996, с. 568.

4. Машковский М.Д. Информация о лекарственных средствах для специалистов здавоохранения. Лекарственные средства, применяемые в онкологии. // Вып. 5. М. РЦ. Фармед инфо, 1999, с. 284.

5. Оборотова Н.А., Лопатин П.В. Методы управления доставкой противоопухолевых препаратов и их использование при создании современных лекарств. // В. Сб. «Химиотерапия опухолей», М. 1990, выпуск 55, с. 4 11.

6. Оборотова Н.А. Липосомальные лекарственные формы цитостатиков для повышения селективности химиотерапии опухолей. // Тез. докл. Международной конференции «Фармация в веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург 1999, с. 65.

7. Оборотова Н.А, Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии. // Успехи современной биологии. 2001, Т.1, №5, с. 464-475.

8. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. // (СССР) М-1980, с. 296

9. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. // Биохимия, 2000, том 65, вып. 1, с. 112-126.

10. Чернова В. А. Лекарственные и диагностические средства, применяемые в онкологической практике. // Медицина, 1982, 3-е изд. с. 216.

11. Abraham, E., Prat, A. G., Gerweck, L., Seneveratne, Т., Areci, R. J., Kramer, R., Guidotti, G., and Cantiello, H. F. // The multidrug resistance (mdrl) gene product functions as an ATP channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 312-316.

12. Advani, R., Fisher, G.A., Lum, B.L., Hausdorff, J., Halsey, J., Litchman, M., Sikic, B.I. // A phase I trial of doxorubicin, paclitaxel, and valspodar (PSC 833), a' modulator of multidrug resistance. Clin. Cancer Res. 2001, 7, 1221-1229.

13. Agrawal S, Temsamani J, Tang JY. // Pharmacokinetics, biodistribution, and stability of oligodeoxynucleotide phosphorothioates in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88:7595-99.

14. Ali-Osman F., Berger M. S., Rajagopal S. // Cancer res. 1993, № 53. P. 56635668.

15. Barrand, M.A., Heppell-Parton, A.C., Wright, K.A., Rabbits, Twentyman, P.R. // A 190-kilodalton protein overexpressed non-P-glycoprotein-containing multidrug-resistant cells and its relationship to the MRP gene. J. Natl. Cancer Inst. 1994, 86, 110-117.

16. Batist, G., Tulpule, A., Sinha, B.K., Katki, A.G., Myers, C.E., Cowan, K.H. // Overexpression of a novel anionic glutathione transferase in multidrug-resistant human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 1986, 33, 15544-15549.

17. Batist, G., Barton, J., Chaikin, P., Swenson, C., Welles, L. // Myocet (liposome-encapsulated doxorubicin citrate): a new approach in breast cancer therapy. Expert Opin. Pharmacother. 2002, 12, 1739-1751.

18. Bennett, C. F., Chiang, M. Y., Chan, H., Shoemaker, J. E., and Mirabelli, C. K. // Cationic lipids enhance cellular uptake and activity phosphorothioate antisense oligonucleotides. Mol. Pharmacol. 1992,41: 1023 1033.

19. Boesch, D., Gaveriaux, C., Jachez, В., Pourtier-Manzanedo, A., Bollinger, P., Loor, F. // In vivo circumvention of P-glycoprotein mediated multidrug resistance of tumor cells with PSC 833. Cancer Res. 1991a., 51, 4226-4233.

20. Booser, D.J., Esteva, F.J., Rivera, E., Valero, V., Esparza-Guerra, Priebe, W., Hortobagyi, G.N. // Phase II study of liposomal annamycin in the treatment of doxorubicin-resistant breast cancer. Cancer Chemother. Pharmacol. 2002, 50, 6-8.

21. Campos L, Sabido O, Rouault JP, Guyotat D. // Effects of BCL-2 antisense oligodeoxynucleotides on in vitroproliferation and survival of normal marrow progenitors and leukemic cells. Blood 84: 1994, 595-600.

22. Chan, H. S., Grogan, Т. M., DeBoer, G., Haddad, G., Gallie, B. L., and Ling, V. // Diagnosis and reversal of multidrugresistance in paediatric cancers. Eur. J. Cancer 6,1996, 1051-1061.

23. Charuk, J. H., Grey, A. A., and Reithmeier, R. A. // Identification of the synthetic surfactant nonylphenol ethoxy-late: a P-glycoprotein substrate in human urine. Am. J. Physiol. 1998, 274, F1127-F1139.

24. Chen HX, Marshall JL, Trocky N, Ling Y, Baidas S, et al. // A phase I study ofBCL-2 antisense G3139 (GENTA) and weekly docetaxel in patients with advanced breast cancer and other solid tumors. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2000, 19:692 (Abstr.).

25. Collette N, Auwera P, Mevinier F, Lambert C, Sculier I, Coune A. // Tissue distribution and bioactivity of amphotercin В administered in liposomes to cancer patients. J of Antimicrobial Chemotherapy, 1991; 27: 535-548. (130)

26. Cordon-Carlo, C., O'Brien, J. P., Boccia, J., Casals, D., Bertino, J., and Melamed, M. R. // Expression of the multidrug resistance gene product (p-glycoprotein) in human normal and tumor tissues. J. Histochem. Cytochem. 1990, 38: 1277-1287.

27. Cotter FE, Johnson P, Hall P, Pocock C, al Mahdi N, et al. // Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma growth in a SCID-hu mouse model. Oncogene, 1994, 9:3049-55.

28. Cotter FE, Corbo M, Raynaud F, Orr RM, Pocock C, et al. // Bcl-2-antisense therapy in lymphoma: in vitro and in vivo mechanisms, efficacy, pharmacokinetics and toxicity studies. Ann. Oncol. 1996, 7:32.

29. Cotter FE,Waters J, Cunningham D. // Human Bcl-2 antisense therapy for lymphomas. Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1489:97- 106.

30. Cotter FE. // Antisense therapy of hematologic malignancies. Semin. Hematol. 1999, 36:9-14.

31. D.G. Fatouros, K. Hatzidimitriou, S.G. Antimisiaris. // Liposomes encapsulating prednisolone and prednisolone-cyclodextrin complexes: comparison of membrane integrity and drug release. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2001, 13,287-296.

32. Daoud, S.S., Juliano, R.L. // Reduced toxicity and enhanced antitumor effects in mice of the ionophoric drug valinomycin when incorporated in liposomes. Cancer Res. 1986,46, 5518-5523.

33. Daryl C. Drummond, Olivier Meyer, Keelung Hong, Dmitri B. Kirpotin, and Demetrios Papahadjopoulos. // Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacological reviews 1999, Vol. 51, No.4.

34. Dass CR, Walker TL, Burton MA, Decruz EE. // Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes. J Pharm. Pharmacol, 1997; 49 (10): 972-975.

35. Drummond, D.C., Meyer, O., Hong, K., Kirpotin, D.B., Papahadjopoulos, D. // Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacol. Rev. 1999, 51, 691-743.

36. Drummond, D.C., Zignani, M., Leroux, J. // Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery. Prog. Lipid Res. 2000, 39, 409-460.

37. Durrieu F, Belaud-Rotureau MA, Lacombe F, Dumain P, Reiffers J, et al. // Synthesis of Bcl-2 in response to anthracycline treatment may contribute to an apoptosis-resistant phenotype in leukemic cell lines. Cytometry. 1999, 36:140-49.

38. Feng, M.R., Liebert, M.,Wedemeyer, G., Grossman, H.B., Mancini,W.R., Williams, M., Wagner, J.G. // Effects of verapamil on the uptake and efflux of etoposide (VP 16) in both sensitive and resistant cancer cells. Selective Cancer Ther. 1992,7,75.

39. Fisher, G. A., Lum, B. L., Hausdorff, J., and Sikic, В. I. // Pharmacological considerations in the modulation of multidrugresistance. Eur. J. Cancer 6, 1996, 10821088.

40. Ford, J.M., Hait, W.N., // Pharmacologic circumvention of multidrug resistance. Cytotechnology 1993, 1-3, 171-212.

41. Forssen, E.A., Coulter, D.M., Proffitt, R.T. // Selective in vivo localization of daunorubicin small unilamellar vesicles in solid tumors. Cancer Res. 1992, 52, 32553261.

42. Gleave ME, Miyake H, Goldie J, Nelson C, Tolcher A. // Targeting bcl- 2 gene to delay androgen-independent progression and enhance chemosensitivity in prostate cancer using antisense bcl- 2 oligodeoxynucleotides. Urology, 1999, 54:3646.

43. Goldstein, L. J. // MDR1 gene expression in solid tumours. Eur. J. Cancer 6, 1996, 1039-1050.

44. Goren, D., Horowitz, A.T., Tzemach, D., Tarshish, M., Zalipsky, Gabizon, A. // Nuclear delivery of doxorubicin via folate-targeted liposomes with bypass of multidrug-resistance efflux pump. Clin. Cancer Res. 2000, 6, 1949-1957.

45. Harrington K. J., Lewanski C. R., Stewart S. W. // Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer/. Part.2: Clinical development. Clinical Oncology. 2000, Vol. 12.P.16-24.

46. Huang, S.K., Lee, K.D., Hong, K., Friend, D.S., Papahadjopoulos, D. // Microscopic localization of sterically stabilized liposomes in colon carcinoma-bearing mice. Cancer Res. 1992, 52, 5135-5143.

47. Inaba, M., Kobayashi, H., Sakurai, Y., Johnson, R.R. // Active efflux of daunorubicin and adriamycin in sensitive and resistant sublines of P388 leukemia. Cancer Res. 1979, 39, 2200-2203.

48. Irina Lebedeva and CA Stein // ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: Promise and Reality. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001, 41:403-19. (95)

49. Iversen P. // In vivo studies with phosphorothioate oligonucleotides: pharmacokinetics prologue. Anticancer Drug, 1991, Des. 6:531-38.

50. Jain, R.K. // Transport of molecules in the tumour interstitium: a review. Cancer Res. 1987, 47, 3039-3051.

51. Jain, R.K. // Determinants of tumor blood flow: a review. Cancer Res. 1988, 48,2641-2658.

52. Jain RK. Vascular and interstitial barriers to delivery of therapeutic agents in tumors. Cancer Metastasis Rev. 1990; 9: 253-266.

53. Jansen B, Schlagbauer-Wadl H, Brown BD, Bryan RN, van Elsas A, et al. // bcl-2 antisense therapy chemosensitizes human melanoma in SCID mice. Nat. Med. 1998, 4:232-34.

54. Jerry M. Adams and Suzanne Cory. // The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival SCIENCE 1998, 28 AUGUST VOL 281.

55. Jonsson, В., Nilsson, K., Nygren, P., Larsson, R. // SDZ PSC 833 a novel potent in vitro chemosensitizer in multiple myeloma. Anticancer Drugs, 1992, 3, 641-646.

56. Kirpotin, D.B., Park, J.W., Hong, K., Zalipsky, S., Li, W.L., Carter, P., Benz, C.C., Papahadjopoulos, D. // Sterically stabilized anti-HER2 immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cells in vitro. Biochemistry 1997, 36, 66-75.

57. Kitada S, Miyashita T, Tanaka S, Reed JC. // Investigations of antisense oligonucleotides targeted against bcl-2 RNAs. Antisense Res. 1993, Dev. 3:157-69.

58. Kitada S, Takayama S, De Riel K, Tanaka S, Reed JC. // Reversal of chemoresistance of lymphoma cells by antisense-mediated reduction of bcl-2 gene expression. Antisense Res. 1994, Dev. 4:71- 79

59. Kobayashi, H., Takemura, Y., Miyachi, H. // Novel approaches to reversing anti-cancer drug resistance using gene-specific therapeutics. Hum. Cell 2001, 14, 172-184.

60. Krishnamachary, N., Center, M.S. // The MRP gene associated with a non-P-glycoprotein multidrug resistance encodes a 190-kDa membrane bound glycoprotein. Cancer Res. 1993, 53, 3658-3661.

61. Lampidis, T.J., Krishan, A., Planas, L., Tapiero, H. // Reversal of intrinsic resistance to adriamycin in normal cells by verapamil. Cancer Drug Deliv. 1986, 3, 251-259.

62. Lampidis, T.J., Kolonias, D., Tapiero, H., Savaraj, N., Cahn, J. // In vitro cardiac potencies of multidrug resistance modulators. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1990,31,373.

63. Lee, K.D., Hong, K., Papahadjopoulos, D. // Recognition of liposomes by cells: in vitro binding and endocytosis mediated by specific lipid headgroups and surface charge density. Biochim. Biophys. Acta 1992, 1103, 185-197. (65)

64. Lehnert, M. // Clinical multidrug resistance in cancer: a multifactorial problem. Eur. J. Cancer 6, 1996, 912-920.

65. Lo, Y.L. // Phospholipids as multidrug resistance modulators of the transport of epirubicin in human intestinal epithelial Caco-2 cell layers and everted gut sacs of rats. Biochem. Pharmacol. 2000, 60, 1381-1390.

66. Loke, S. L., Stein, C. A., Zhang, X. H., Mori, K., Nakanishi, M., Subasinghe, C., Cohen, J. S., and Neckers, L. M. // Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 3474-3478.

67. Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osborne, B.A., Jacks, T. // p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 1993, 362, 847-849.

68. Massing, U., Fuxius, S. // Liposomal formulations of anticancer drugs: selectivity and effectiveness. Drug Resist. 2000, Update 3, 171-177.

69. Masuda, Y., Kobayashi, H., Holland, J.F., Ohnuma, T. // Reversal of multidrug resistance by a liposome-MDRl ribozyme complex. Cancer Chemother. Pharmacol. 1998,42, 9-16.

70. Matteucci, M.L., Anyarambhatla, G., Rosner, G., Azuma, C., Fisher, P.E., Dewhirst, M.W., Needham, D., Thrall, D.E. // Hyperthermia increases accumulation of technetium-99m-labeled liposomes in feline sarcomas. Clin. Cancer Res. 2000, 6, 3748-3755.

71. McDonnell TJ, Navone NM, Troncoso P, Pisters LL, Conti C, et al. // Expression of bcl-2 oncoprotein and p53 protein accumulation in bone marrow metastases of androgen independent prostate cancer. J. Urol. 1997, 157:569-74

72. Michieli, M., Damiani, D., Ermacora, A., et al. // Liposome encapsulated daunorubicin for PGP-related multidrug resistance. Br. J. Haematol. 1999, 106, 9299.

73. Miyake H, Tolcher A, Gleave ME. // Antisense Bcl-2 oligodeoxynucleotides inhibit progression to androgen-independence after castration in the Shionogi tumor model. Cancer Res. 1999, 59:4030-34.

74. Morgenstern, R., DePierre, J.W., Jornvall, H. // Microsomal glutathione transferase. Primary structure. J. Biol. Chem. 1985, 260, 13976-13983.

75. Nawrath, H., Raschack, M. // Effects of (2)-desmethoxyverapamil on heart and vascular smooth muscle. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987, 42, 1090-1097.

76. Nomura T, Koreeda N, Yamashita F, Takakura Y, Hashida M. // Effect of particle size and charge on the disposition of lipid carriers after intratumoral insection into tissue-isolated tumors. Pharm Res. 1998; 15 (1): 128-132. (132)

77. Nooter, K., Oostrum, R., Deurloo, J. // Effects of verapamil on the pharmacokinetics of daunomycin in the rat. Cancer Chemother. Pharmacol. 1987, 20, 176-178.

78. Northfelt, D.W., Dezube, B.J., Thommes, J.A., et al. // Efficacy of pegylated-liposomal doxorubicin in the treatment of AIDS-related Kaposi's sarcoma after failure of standard chemotherapy. J. Clin. Oncol. 1997, 15, 653-659.

79. Osheroff, N. // Biochemical basis for the interactions of type I and II topoisomerases with DNA. Pharmacol. Ther. 1989, 41, 223-241.

80. Oswald C., Hall J. // Anticancer Res. 1989, № 9, P-915-922.

81. Oudard S, Thierry A, Jorgensen TJ, Rahman A. // Sensitization of multidrug-resistant colon cancer cells to doxorubicin encapsulated in liposomes. Cancer Chemother Pharmacol. 1991; 28(4):259-65.

82. Poste, G., Papahadjopoulos, D. // Drug-containing lipid vesicles render drug-resistant cell sensitive to actinomycin D. Nature 1976; 261, 699-701.

83. Ozols, R.F., Cunnion, R.E., Klecker, R.W., Hamilton, T.C., Ostchega, Y., Parrillo, J.E., Young, R.C. // Verapamil and adriamycin in the treatment of drug-resistant ovarian cancer patients. J. Clin. Oncol. 1987, 5, 641-647.

84. Park, J.W., Hong, K., Carter, P., et al. // Development of antipl85HER2 immunoliposomes for cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 1327— 1331.

85. Park, J.W., Hong, K., Kirpotin, D.B., Papahadjopoulos, D., Benz, C.C. // Immunoliposomes for cancer treatment. Adv. Pharmacol. 1997, 40, 399-435.

86. Park, J.W., Hong, К., Kirpotin, D.B., et al. // Anti-HER2 immunoliposomes: enhanced efficacy attributable to targeted delivery. Clin. Cancer Res. 2002, 8, 11721181.

87. Pedroso de Lima, M.C., Neves, S., Filipe, A., Duzgunes, N., Simoes, S. // Cationic liposomes for gene delivery: from biophysics to biological applications. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 1221-1231.

88. Perez-Soler R. // Liposomes as carriers of antitumor agents: toward a clinical reality. Cancer Treatment Reviewes. 1989; 16: 67-82. (133)

89. Presant, C.A., Kennedy, P.S., Wiseman, C., Gala, a K., Bouzaglou, A., Wyres, M., Naessig, V. // Verapamil reversal of clinical doxorubicin resistance in human cancer. Am. J. Clin. Oncol. 1986, 9, 355-357.

90. Raffo AJ, Perlman H, ChenMW, Day ML, Streitman JS, et al. // Overexpression of bcl-2 protects prostate cancer cells from apoptosis in vitro and confers resistance to androgen depletion in vivo. Cancer Res. 1995, 55:4438-45.

91. Rahman A, Husain SR, Siddiqui J, Verma M, Agresti M, Center M, Safa AR, Glazer RI. // Liposome-mediated modulation of multidrug resistance in human HL-60 leukemia cells. J Natl Cancer Inst. 1992, Dec 16; 84(24): 1909-15.

92. Rivera, E., Valero, V., Esteva, F.J., et al. // Lack of activity of stealth liposomal doxorubicin in the treatment of patients with anthracycline-resistant breast cancer. Cancer Chemother. Pharmacol. 2002, 49, 299-302.

93. Roberts J. J., Tompson A. J. // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1979, №22. P. 71-133.

94. Roepe, P.D. // Analysis of the steady-state and initial rate doxorubicin efflux from a series of multidrug-resistant cells expressing different levels of P-glycoprotein. Biochemistry 1992, 31, 12555-12564.

95. Schuetz, E. G., Schinkel, A. H., Relling, M. V., and Schuetz, J. D. // P-glycoprotein: a major determinant of rifampicin-inducibleexpression of cytochrome P4503A in mice and humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 4001-4005.

96. Sevick, E.M., Jain, R.K. // Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Res. 1989, 49, 3506-512.

97. Stewart, A. J., Pichon, C., Meunier, L., Midoux, P., Monsigny, M., and Roche, A. C. // Enhanced biological activity of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly-L-lysine. Mol. Pharmacol. 1996, 50: 1487 1494.

98. Suzanne Cory and Jerry M. Adams. //THE BCL2 FAMILY: Regulators of the cellular life-or-death switch. NATURE REVIEWS 2002, Vol Sept.

99. Suzuki, S., Inoue, K., Hongoh, A., Hashimoto, Y., Yamazoe, Y. // Modulation of doxorubicin resistance in a doxorubicin-resistant human leukaemia cell by an immunoliposome targeting transferring receptor. Br. J. Cancer 1997, 76, 83-89.

100. Tew, K.D., Bomber, A.M., Hoffman, S.J. // Ethacrynic acid and piriprost asenhancers of cytotoxicity in drug resistant and sensitive cell lines. Cancer Res. 1988,48,3622-3625.

101. Thierry, A.R., Rahman, A., Dritschilo, A. // Overcoming multidrug resistance in human tumor cells using free and liposomally encapsulated antisense oligodeoxynucleotides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993a, 190, 952-960.

102. Tsuruo, Т., Iida, H., Tsukagoshi, S., Sakurai, Y. // Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil. Cancer Res. 1981, 41, 1967-1972.

103. Tsuruo, Т., Iida, H., Tsukagoshi, S., Sakurai, Y. // Increased accumulation of vincristine and adriamycin in drug resistant P388 tumor cells following incubation with calcium antagonists and calmodulin inhibitors. Cancer Res. 1982a, 42, 47304733.

104. Van Veen, H.W., Konings, W.N. // The ABC family of multidrug transporters in microorganisms. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1365, 31-36.

105. Vlassov, V. V., Balakireva, L. A., and Yakubov, L. A. // Transport oligonucleotides across natural and model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1994,1197:95-108.

106. Wang, J.C. // DNA topoisomerases. Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 665697.

107. Waters JS,Webb A, Cunningham D, Clarke PA, Raynaud F, et al. // Phase I clinical and pharmacokinetic study of bcl-2 antisense oligonucleotide therapy in patients with non-Hodgkin's lymphoma. J. Clin. Oncol. 2000, 18:1812-23.

108. Webb A, Cunningham D, Cotter F, Clarke PA, di Stefano F, et al. // BCL-2 antisense therapy in patients with non- Hodgkin lymphoma. Lancet, 1997, 349:113741.

109. Woodle M, Losic DD. // Sterically stabilized liposomes. Biochim Biophys Acta, 1992; 1113: 171-199.

110. Wooldridge JE, Ballas Z, Krieg AM, Weiner GJ. // Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing CpG motifs enhance the efficacy of monoclonal antibody therapy of lymphoma. Blood, 1997, 89:2994-98.

111. Working, P.K., Dayan, A.D. // Pharmacological-toxicological expert report. Caelyx (stealth liposomal doxorubicin HC1). Hum. Exp. Toxicol. 1996, 15, 751-785.

112. Yakubov, L. A., Deeva, E. A., Zarytova, V. F., Ivanova, E. M., Ryte, A. S., Yurchenko, L. V., and Vlassov, V. V. // Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 64546458.

113. Yuan F, Leunig M, Huang SK, Berk DA, Papahadjopoulos D, Jain RK. // Micro-vascular and interstitial penetration of sterically stabilized (Stealth) liposomes in a human tumor xenograft. Cancer Res. 1994; 54: 3352-3356.