Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Гаева, Анна Вячеславовна

• Гаева, Анна Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гаева, Анна Вячеславовна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Методы генотипирования бактерий

1 ^.Идентификация и генотипирование патогенных иерсиний

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 .Бактериальные штаммы 3

2.2.Питательные среды, препараты и реактивы

2.3.Методы исследований

2.3.1. Бактериологические методы

2.3.2. Генетические методы

2.3.3. Методы статистической обработки материала 59 ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ 61 ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ ПО ПРИЗНАКАМ, СВЯЗАННЫМ С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ

ГЛАВА 4. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ 72 ВЫЧИТАЮЩЕГО РЕСТРИКЦИОННОГО ФИНГЕРПРИНТИНГА

4.1. Выбор потенциальных пар эндонуклеаз рестрикции для 73 вычитающего рестрикционного фингерпринтинга патогенных иерсиний

4.2. Изучение дискриминирующих возможностей метода вычитающего 75 рестрикционного фингерпринтинга при использовании EcoRI - Paul

пары эндонуклеаз рестрикции

4.3. Паспортизация штаммов чумного микроба различного 78 происхождения на основе вычитающих рестрикционных фингерпринтов

4.4. Компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного 82 фингерпринтинга штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов ГЛАВА 5. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ НА ОСНОВЕ

ЧЕТЫРЕХ VNTR ЛОКУСОВ

5.1. Поиск новых вариабельных областей генома чумного микроба

5.2. ПЦР - VNTR анализ штаммов чумного микроба разного 90 происхождения и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба

5.2.1. Изучение вариабельности I VNTR области у штаммов чумного и 91 псевдотуберкулезного микробов

5.2.2. Изучение вариабельности II VNTR области у штаммов чумного и 96 псевдотуберкулезного микробов

5.2.3. Изучение вариабельности III VNTR области у штаммов чумного и 97 псевдотуберкулезного микробов

5.3. Определение сиквенс типов вариабельных областей штаммов 99 чумного микроба разного происхождения

5.4. Сиквенс типы вариабельных областей вирулентных штаммов 116 псевдотуберкулезного микроба

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИДЕНТИФИКАЦИИ И

ВНУТРИВИДОВОГО VNTR ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА

6.1. Условия проведения ПЦР с праймерами TAN I-TAN 2 и подбор 124 гелей для разделения продуктов амплификации

6.2. Создание маркеров на основе фрагментов ДНК, полученных с ДНК 125 референтных штаммов чумного микроба разного происхождения

6.3. Учет и интерпретация результатов ПЦР анализа 128 ГЛАВА 7. СРАВНЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И ГЕНОТИПИЧЕСКИХ 131 СХЕМ КЛАССИФИКАЦИИ ЧУМНОГО МИКРОБА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВРФ - вычитающий рестрикционный фингерпринтинг

кДа - килодальтон

КОЕ - колониеобразующая единица

Мда - мегадальтон

м.к. - микробная клетка

н.о. - не определялось

ПЦР - полимеразная ¡цепная реакция

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na

BLAST - Basic Local Alignment Searching Tool

dNTP- дезоксинуклеотидтрифосфат (deoxynucleotidtriphosphate)

Hms - признак пигментации (hemin storage)

hms - оперон, отвечающий за сорбцию гемина

MLST- мультилокусное секвенирование (multilocus sequence typing)

MLVA - мультилокусный VNTR анализ (multilocus VNTR analysis)

MST - мультиспейсерное сиквенс типирование (multispacer sequence typing)

pgm - область пигментации хромосомы (pigmentation locus)

A pgm - делеция области пигментации

PFGE - электрофорез в пульсирующем поле (pulsed-field gel electrophoresis)

Psn - чувствительность штамма к действию пестицина (pesticin sensitivity)

Pst - признак продукции пестицина (pesticin production)

pst — структурный ген, кодирующий синтез пестицина

IVN - аллель I VNTR области

IIVN - аллель II VNTR области

IIIVN - аллель III VNTR области

VNTR - область с вариабельным числом тандемных повторов (various number tandemrepeat)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба»

ВВЕДЕНИЕ

Чума - одна из наиболее опасных инфекционных болезней человека. Документальные подтверждения о массовых поражениях людей во многих странах мира датируются с V века до нашей эры. И в настоящее время чума представляет реальную угрозу, так как является природно-очаговым заболеванием и периодически вызывает эпизоотии в 42 природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, а также в других странах мира [29]. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев заболеваний человека чумой [158].

Возбудитель чумы обладает высокой фенотипической и генетической изменчивостью, отмеченной рядом исследователей, как для штаммов из разных природных очагов, так и для штаммов, циркулирующих в одном природном очаге [58].

Зарубежные исследователи для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба используют классификацию, предложенную R. Devignat (1951). Классификация основана на биохимических различиях (способности к ферментации глицерина, редукции нитратов и окислению аммиака) и историко-географическом происхождении штаммов, разделяя их на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Эта классификация не учитывает разнообразие штаммов, выделяемых на территориях Центральной Азии, Кавказа, Западной Сибири, Африки. Об этом свидетельствуют опубликованные в последние годы сведения о рамнозопозитивных слабовирулентных штаммах из природных очагов полевочьего типа Китая, которые D. Zhou et al. (2004) выделили в новый биовар microtus, а также ряд публикаций отечественных ученых, описывающих разные подвиды чумного микроба из природных очагов на территории России и ближнего зарубежья [9, 17, 28, 43].

Классификация, принятая в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, основана на фенотипических свойствах,

вирулентности по отношению к лабораторным животным и ландшафтно-географической приуроченности. Согласно этой классификации все штаммы Yersinia pestis подразделяют на пять подвидов - основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улэгейский). Штаммы основного подвида с большим эпидемическим потенциалом высоковирулентны как для диких, так и для лабораторных животных. Фенотипические характеристики штаммов основного подвида, выделяемых в разных природных очагах, различаются и соответствуют характеристикам какого-либо из биоваров: antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны для лабораторных животных, их эпидемическая значимость ниже, чем у штаммов основного подвида.

До сих пор широко используются методы индикации, идентификации, типирования чумного микроба, основанные на определении различных фенотипических свойств. Нестабильность фенотипа затрудняет интерпретацию результатов, что может привести к ошибочным выводам. Бурное развитие молекулярной генетики в последнее время привело к разработке приемов детекции, идентификации и типирования микроорганизмов, основанных на анализе структуры генома. Использование более стабильной генетической основы позволит повысить точность идентификации и типирования штаммов чумного микроба и усовершенствовать фенотипические схемы классификации.

В то же время, каждый молекулярно-генетический подход обладает разной информативностью и еще не описан единственный метод, позволяющий эффективно проводить типирование и служить основой для совершенствования таксономии чумного микроба. Поэтому возникает необходимость в комплексном подходе к решению данной проблемы.

Для повышения эффективности генетического типирования бактерий важен правильный выбор ДНК - мишеней, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. На основе анализа литературных сведений по эффективности отдельных методов генотипирования можно говорить о

перспективности сочетания таких высокодискриминирующих методов как метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ) и метод мультилокусного VNTR анализа (ПЦР - VNTR, сиквенс-VNTR). ВРФ еще не применялся для типирования штаммов чумного микроба, а варианты VNTR анализа, апробированные на штаммах чумного микроба, обладают либо излишней (по-штаммовой), либо недостаточной (объединяющей штаммы разных подвидов в одну группу) дискриминирующей способностью [38, 39, 109,112, ИЗ, 127].

Поэтому выбор ДНК мишени с тандемными повторами, определяющими подвидовую и очаговую принадлежность штаммов весьма актуален. Сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволит наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, выявлять их эволюционные связи, проводить паспортизацию штаммов.

Цель работы - разработка методических подходов для генетического типирования штаммов чумного микроба на основе VNTR анализа и метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга. Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах стран СНГ и Монголии, по наличию основных детерминант вирулентности и изучить их фенотипическое проявление. Подобрать штаммы, полноценные по составу детерминант вирулентности, на которых будет изучаться эффективность методов генетического типирования.

2. Выбрать потенциальные пары ферментов для проведения вычитающего рестрикционного анализа штаммов чумного микроба и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба. Проверить эффективность выбранных пар рестриктаз на референтных штаммах.

3. Получить фингерприиты вычитающей рестрикции репрезентативной выборки штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Провести компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и оценить эффективность дифференциации штаммов чумного микроба из разных очагов и вирулентных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.

4. Выявить новые вариабельные тандемные нуклеотидные повторы в геноме Y. pestis. Подобрать праймеры к обнаруженным областям с тандемными повторами и оптимизировать параметры амплификации этих областей.

5. Изучить вариабельность выявленных VNTR областей генома штаммов Y. pestis разного происхождения и вирулентных штаммов Y. pseudotuberculosis. Определить нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, содержащих вариабельные тандемные повторы.

6. Разработать способ VNTR-ПЦР дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременным внутривидовым типированием штаммов чумного микроба. Разработать методический подход к мультиспейсерному сиквенс типированию для идентификации и генотипирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

7. Оценить эффективность использования метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга, разработанных мультиспейсерного сиквенс типирования и VNTR-ПЦР для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов, генетического типирования, усовершенствования схем классификации чумного микроба и эпидемиологического анализа штаммов чумного микроба разного географического происхождения.

Научная новизна работы

Получена характеристика штаммов Y. pestis из природных очагов стран СНГ и Монголии по особенностям фенотипа и распространенности детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды

кальцийзависимости. Показано, что в некоторых природных очагах (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной и Волго-Уральский песчаный) циркулируют штаммы с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности как хромосомной, так и плазмидной локализации.

Впервые получены молекулярные портреты штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с помощью метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и показана корреляция фингерпринтов штаммов чумного микроба с их подвидовой принадлежностью, а в ряде случаев - с очаговой принадлежностью.

Впервые на основе УШИ областей межгенных пространств /шЮ-УР01967, УР01967-агиЕ, УР01961-УР01960 разработан способ мультиспейсерного сиквенс типирования штаммов чумного микроба, позволяющий проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов и определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

Показано, что разработанный способ мультиспейсерного сиквенс типирования эффективен при генетическом типировании штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что усовершенствование классификационных систем, основанных на фенотипических характеристиках, не всегда позволяющих четко определить принадлежность штаммов чумного микроба к очагу и мезоочагу, возможно на основе комплексного использования методов мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.

Удачный выбор ДНК-мишеней и молекулярно-генетических методик, основанных на мультиспейсерном сиквенс типировании и вычитающем рестрикционном фингерпринтинге, позволили охарактеризовать особенности генетической структуры таласских штаммов чумного микроба. Определено, что генотипы таласских штаммов имеют уникальную генетическую формулу по

строению вариабельных участков /zwiG-YP01967 и YP01961-YP01960. В ходе кластерного анализа методом попарного невзвешенного группирования с арифметическим усреднением (UPGMA) определена наибольшая близость штаммов таласской группы к штаммам неосновных подвидов.

По результатам работы получен патент на изобретение, зарегистрированное в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» № 2332464. Практическая значимость работы

Разработана VNTR-ПЦР, использующая в качестве ДНК-мишени hutG -YP01967 область, для дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов и одновременного внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Очевидно, что использование данного метода в практической работе учреждений Роспотребнадзора имеет экономическое преимущество. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов» (протокол № 2 от 17. 04. 2007 г.), «Способ межвидовой и внутривидовой дифференциации патогенных иерсиний (Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis) с определением их потенциальной вирулентности» (протокол № 7 от 12. 12. 2008 г.), одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб». Положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки эффективности методов генетического типирования создана референс-панель штаммов чумного микроба, отобранных из различных ландшафтно-географических областей, с полным набором детерминант вирулентности.

и

2. Метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга эффективен для внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Подобранная комбинация эндонуклеаз рестрикции EcoRI - Paul позволяет получать молекулярные портреты штаммов чумного микроба, отражающие их подвидовую и очаговую принадлежность.

3. Мультиспейсерное сиквенс типирование на основе трех VNTR областей хромосомы: /zwíG-YP01967, УР01967-ягиЕ, YP01961-YP01960 позволяет дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

4. VNTR - ПЦР с праймерами TAN 1 - TAN 2 дифференцирует штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов, а также штаммы чумного микроба, принадлежащие к разным подвидам и циркулирующие в разных природных очагах.

5. Кластеры генотипов, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, полностью коррелируют с существующей подвидовой классификацией чумного микроба и показывают неоднородность большинства подвидов в соответствии с очаговой принадлежностью.

6. Генотипы штаммов чумного микроба таласской группы, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, имеют существенные отличия от генотипов штаммов известных подвидов, что позволяет выделить их в отдельный внутривидовой таксон.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов,

микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Генодиагностика инфекционных заболеваний - 2007» («Молекулярная диагностика - 2007» Москва, 2007), Международная школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика, Москва -Пущино, 2008), XII Всероссийская медико - биологическая научная конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009). Так же результаты исследования были представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых ^ опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях. Структура и объем диссертации

Диссертация представлена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель содержит 163 источника, из них 51 отечественный и 112 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гаева, Анна Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1. Предложенная референс-панель штаммов чумного микроба из природных очагов стран СНГ позволяет оценивать эффективность методов генетического типирования.

2. Впервые проведен анализ штаммов чумного микроба с использованием метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга. Полученные фингерпринты распределяют штаммы на группы, соответствующие подвидам по фенотипической классификации, и очаговой принадлежности. Показаны высокие дискриминирующие способности метода в определении очаговой принадлежности штаммов основного подвида.

3. Разработан методический подход мультиспейсерного сиквенс типирования, позволяющий проводить идентификацию, определение подвида, очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов чумного микроба и внутривидовое типирование штаммов псевдотуберкулезного микроба. Оптимальные дискриминирующие свойства установлены для штаммов неосновных подвидов и штаммов основного подвида из природных очагов Западной Сибири и Тянь-Шаня.

4. Разработана монолокусная УШИ - ПЦР, которая позволяет одновременно дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую и очаговую принадлежность штаммов чумного микроба.

5. Применение вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования позволяет эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов. Каждому подвиду и таласской группе штаммов соответствуют строго определенные генотипы.

6. С помощью мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикциониого фиигерпринтинга получены генетические доказательства обособленности штаммов таласской группы от штаммов известных подвидов и возможности выделения этой группы в отдельный внутривидовой таксон.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие молекулярной микробиологии создает основу для нового уровня таксономических исследований и открывает большие перспективы для усовершенствования внутривидового типирования возбудителя чумы, а также для практического использования молекулярно-генетических методов при установлении источника происхождения штаммов, вызвавших вспышку или использованных при террористическом акте.

Разработка методических подходов к идентификации и внутривидовому типированию штаммов чумного микроба (как и любого другого микроорганизма) включает несколько этапов. На первом - осуществляется подбор коллекции полноценных по вирулентности штаммов, включающей штаммы из разных природных очагов. На втором этапе на основе литературных данных и (или) проведенных подработок выбираются наиболее перспективные методы типирования. На третьем - подбираются подходящие ДНК - мишени, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. В случае методов, основанных на изучении полиморфизма рестрикционных фрагментов, выбираются рестриктазы с оптимальным количеством сайтов рестрикции. Четвертый этап включает сам процесс типирования и оценку его эффективности.

Нами проведен комплексный фенотипический анализ и плазмидный скрининг 214 штаммов чумного микроба из 39 природных очагов, расположенных на территории стран СНГ, и 4 аймаков Монголии. В этом наборе присутствуют штаммы всех подвидов и таласской группы из природных очагов пустынной, степной, равнинно-предгорной, горной, высокогорной ландшафтных зон. Это означает, что коллекция включает практически все разнообразие штаммов чумного микроба, встречающихся на обозначенных территориях, а потому может быть использована при определении эффективности методов молекулярного типирования. Так как MST система, предложенная нами, включает два локуса тандемных повторов из области пигментации, необходимо было проводить тестирование системы на штаммах, содержащих область пигментации. Известно, что эта область стабильно сохраняется у штаммов неосновных подвидов, но утрачивается с частотой 10"5 у большинства штаммов основных подвидов. Поэтому все штаммы были проверены по признакам пигментации и чувствительности к пестицину, детерминируемым этой областью. Необходимость определения плазмидного состава и фенотипа, соответствующего наличию плазмидных репликонов вызвана тем, что предполагается в дальнейшем дополнить систему внутривидового типирования ДНК мишенями из плазмидных генов вирулентности.

Фенотипический анализ и плазмидный скрининг штаммов чумного микроба из разных природных очагов подтвердил высокую стабильность признаков, детерминируемых областью пигментации - пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов неосновных подвидов. Популяции большинства штаммов основного подвида состояли из пигментированных и непигментированных колоний. Соотношение пигментированных и непигментированных колоний варьировало в популяциях штаммов из разных природных очагов. Все штаммы из Дагестанского равнинно-предгорного очага утратили признак пигментации в результате делеции области пигментации. Низкая стабильность этого признака отмечена для штаммов из Волго-Уральского песчаного очага. Большинство исследованных штаммов из этого очага не содержали клеток, дающих пигментированные колонии. Отсутствие признака пигментации и небольшой процент НтБ+ клеток был характерен также для штаммов из Прикаспийского Северо-Западного, Волго-Уральского степного, Зауральского степного, Сарыджазского и Верхненарынского высокогорных, Устюртского, Муюнкумского, Копетдагского, Северо-Приаральского, Приаральско-Каракумского, Каракумского пустынных и Прикаспийского песчаного очагов. Причину различной стабильности сохранения признака пигментации у штаммов основных подвидов мы не изучали. Плазмидиым скринингом показно, что утрата одной или двух плазмид не характерна для штаммов неосновных подвидов, но с разной частотой встречается у штаммов основного подвида (наиболее часто у штаммов из Волго - Уральского песчаного очага).

Для проверки эффективности ВРФ и MST методов использовались штаммы с полным набором генов вирулентности.

Вычитающий рестрикционный фингерпринтинг выбран нами из группы методов генетического типирования, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, как наиболее удобный для оценки внутривидового геномного полиморфизма штаммов (высокая разрешающая способность, воспроизводимость, относительно низкая стоимость). Существенным моментом в данном методе генетического типирования является подбор комбинации эндонуклеаз рестрикции, которая позволит получить оптимальную картину распределения фрагментов ДНК и обеспечит высокий уровень дискриминации между штаммами. При тестировании комбинаций рестриктаз EcoRI - CfrlOI, EcoRI - Paul, EcoRI - Muí, EcoRI -Eco52I, EcoRI - Kpn2I на референтных штаммах чумного микроба оказалось, что наиболее удачные варианты фингерпринтов получались при использовании пары «детекции - вычитания» EcoRI - Paul. Для выяснения гетерогенности ВРФ профилей у штаммов, относящихся к одному подвиду, но выделенных в разных природных очагах, нами проведен анализ 101 штамма чумного микроба. Сравнение полиморфизма фингерпринтов чумного и псевдотуберкулезного микроба проведено с привлечением 27 штаммов псевдотуберкулезного микроба. В результате проведенной работы были получены молекулярные портреты ВРФ типов штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. У штаммов основного подвида, выделенных из различных природных очагов (Джейранчельский равнинно-предгорный, Ленинаканский, Присеванский, Тувинский (горные), Сарыджазский, Муюнкумский пустынный, Прикаспийский песчаный), выявлены различные геноварианты, соответствующие отдельному природному очагу, кроме штаммов Верхненарынского, Аксайского и Алайского высокогорных очагов, у которых обнаружены идентичные ВРФ профили. При генотипировании 6 штаммов из Терско-Сунженского низкогорного очага нами выявлено два геноварианта - один характерен для штаммов, относящихся к основному подвиду, а другой - штаммов кавказского подвида. Также различия в ВРФ профилях обнаружено у штаммов из Северо-Приаральского, Мангышлакского (по 2 геноварианта) и Приаральско-Каракумского (3 геноварианта) пустынных очагов. Для штаммов алтайского подвида выявлены два типа ВРФ профилей: один геновариант включал штаммы из Алтайского горного очага, второй геновариант определен для штамма из Монголии. У штаммов улэгейского подвида также определено два геноварианта, которые коррелировали с природными очагами (аймаками). Штаммы гиссарского подвида принадлежали к одному геноварианту, также как и группа таласских штаммов. ВРФ профили штаммов псевдотуберкулезного микроба при использовании пары рестриктаз EcoRI - Paul отличались по распределению фрагментов от ВРФ профилей штаммов чумного микроба. Коэффициент подобия между штаммами псевдотуберкулезного микроба (от 60%) оказался ниже, чем между штаммами чумного микроба (от 78%).

Таким образом, проведенный анализ штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения показал возможность внутривидовой дифференциации штаммов этих микроорганизмов методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга при эпидемиологическом анализе вспышек и завозных случаев инфекции.

Полученные результаты коррелируют с фенотипической классификацией штаммов чумного микроба, разделяющей их на подвиды, а также определяют специфические ВРФ профили у штаммов чумного микроба разных подвидов из различных природных очагов.

В настоящее время для исследования вида Y. pestis активно используется метод, основанный на анализе нескольких хромосомных и (или) плазмидных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR локусов), называемый MLVA [38, 102, 109, 112, 113, 127, 161]. Klevytska А. с соавт. (2001) выявили в геноме чумного микроба 43 VNTR локуса с различным уровнем полиморфизма. Учитывая цели проводимых анализов штаммов чумного микроба, рядом исследователей подобраны различные комбинации VNTR - локусов для генетического типирования и филогенетического анализа. Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генетического типирования, существует проблема дифференциации штаммов с одинаковым MLVA генотипом, но отличающихся нуклеотидным составом. В связи с этим мы считаем целесообразным дополнение MLVA секвенированием полученных аллелей. Ранее в нашей лаборатории при сравнительном ПТ1Р-скрининге hutG-YP01950 региона области пигментации хромосомы чумного и псевдотуберкулезного микробов выявлены два вариабельных участка, содержащих VNTR последовательности [37]: /m¿G-YP01967 (I VNTR), расположенный перед областью пигментации и YP01961-YP01960 (III VNTR), расположенный в области пигментации. К данным участкам нами добавлен участок YP01967-arwE и комбинация из них была проверена в качестве ДНК -мишеней для мультиспейсерного сиквенс типирования. Данный метод генетического типирования определяет вариабельность межгенных пространств. Нами рассчитаны праймеры TAN 1 - TAN 2, максимально приближенные к hutG-YP01967 региону, состоящему из двух вариабельных локусов, и подобран режим амплификации. Праймеры HSI 69 - HSI 70 и HSI 37 - HSI 38 на вариабельные участки УР01967-

При изучении области 7шЮ-УР01967 нами выявлено 20 аллелей во взятой выборке штаммов чумного микроба и 5 аллелей дополнительно при исследовании известных нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank штаммов биоваров antiqua, medievalis, orientalis, microtus. На основе секвенирования аллелей у исследованных нами штаммов удалось провести дифференциацию на разных уровнях. Первый уровень - это четкая дифференциация между видами Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Штаммы псевдотуберкулезного микроба отличаются от штаммов чумного микроба не только по количеству повторов первого и второго VNTR локусов I VNTR области и единичным нуклеотидным заменам в тандемных повторах, но и наличием уникальной вставки 363 п.н. между первым и вторым VNTR локусами этой области. Второй уровень дифференциации - подвидовой. Для каждого подвида характерен свой набор аллелей. Штаммы основного подвида содержат только полные тандемные повторы. У штаммов основного подвида в первом локусе количество повторов варьировало от 4 до 9, во втором локусе всегда содержалось 3 повтора. Для данной группы штаммов чумного микроба определены аллели IVN 1 - IVN 6. Аллели всех штаммов неосновных подвидов отличаются от аллелей штаммов основных подвидов наличием разного количества неполных повторов. В зависимости от количества полных и неполных повторов у штаммов неосновных подвидов определены разные аллели. Для штаммов алтайского подвида характерны аллели IVN 9, IVN 10, IVN 11, для штаммов удэгейского подвида - аллели IVN 7, IVN 8, IVN 12. Штаммы гиссарского подвида несут аллели IVN 14 и IVN 15. У штаммов таласской группы определен характерный аллель IVN 13. Особенность аллелей штаммов, относящихся к кавказскому подвиду, состоит в присутствии IS 285 элемента во втором локусе у всех штаммов, кроме выделенных в Восточно-Кавказском высокогорном очаге. Для штаммов данного подвида установлены аллели IVN 16, IVN 17, IVN 18, IVN 19, IVN 20.

Третий уровень дифференциации обеспечивает определение очаговой и мезоочаговой принадлежности. Выше нами было показано, что каждому подвиду соответствует несколько аллелей I VNTR области. Нами обнаружена четкая корреляция VNTR аллелей с очаговой и мезоочаговой принадлежностью штаммов. Это касается в первую очередь штаммов неосновных подвидов, но несколько в меньшей степени и штаммов основных подвидов.

В литературе не описаны VNTR области с подобными типирующими возможностями. Важно, что I VNTR область расположена вне области пигментации, поэтому ее можно определить у всех выделяемых штаммов, в том числе и Hms" мутантов чумного микроба.

На основе I VNTR области нами разработан способ дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов и внутривидового типирования штаммов чумного микроба методом ПЦР. Для интерпретации результатов нами предложен набор маркеров из фрагментов ДНК референтных штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Вариабельную область I VNTR в MST системе удачно дополняет II VNTR область (YPO1961-агиЕ). Нами выявлены 6 аллелей этой области у штаммов чумного микроба, циркулирующих на территории стран СНГ и Монголии. Наиболее распространенным оказался IIVN 1 аллель. Введение этой области в MST систему усилило дифференцирующие возможности системы относительно штаммов основного подвида из Аксайского высокогорного очага, штаммов алтайского и кавказского подвида, а также позволило различать штаммы кавказского подвида из Ленинаканского и Терско-Сунженского очагов.

Область III VNTR (YPO 1960-YPO1961) обладает достаточно высоким уровнем вариабельности для штаммов чумного микроба (выявлено 12 аллелей).

С помощью этой области можно проводить подвидовую дифференциацию, но не такую четкую, как при использовании I VNTR области. В тоже время, аллели штаммов улэгейского подвида отличаются не только от аллелей штаммов других подвидов, но также выявлены отличия аллелей штаммов улэгейского подвида, выделенных в разных очагах. Отдельные аллели обнаружены нами для штаммов таласской группы и штаммов основного подвида из Таукумского пустынного очага. Необходимость включения этой области в MST систему вызвана как ее дополнительными возможностями для дифференциации штаммов из разных очагов, так и для усиления дифференцирующих свойств системы на мезоочаговом уровне.

Проведенный нами анализ показал, что в качестве ДНК - мишени максимальными дифференцирующими свойствами обладает /zwiG-YP01967 вариабельная область. Использование двух других областей повышает разрешающую способность метода, увеличивая количество аллелей, соответствующих очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов. Только сочетание трех VNTR областей в системе MST дает оптимальные результаты типирования. Индекс дискриминационной силы системы типирования штаммов чумного микроба методом MST с применением трех исследованных вариабельных областей оказался достаточно высоким и составил 0,83.

При использовании метода MST типирования определены характерные генотипы для штаммов чумного микроба, которые позволяют проводить внутривидовую дифференциацию вида Y. pestis, устанавливать подвиды, а также проводить генетическое типирование штаммов из отдельных природных очагов и, в ряде случаев, мезоочагов, позволяя с высокой степенью достоверности определять источник происхождения изолята. Подготовлены последовательности ДНК штаммов чумного микроба разного происхождения для создания компьютерной базы данных. Различия в составе данных участков у штаммов, относящихся к разным подвидам и выделенных из разных природных очагов, обеспечивают внутривидовую классификацию штаммов чумного микроба на генетическом уровне и возможность быстрой идентификации свежевыделенных штаммов в чрезвычайных ситуациях.

Изучение распространения аллелей изученных областей у штаммов псевдотуберкулезного микроба выявило некоторые особенности. Так, у штаммов ОЗ серотипа отсутствует II VNTR область, поскольку у всех этих штаммов делегированы гены порина и агиЕ аргининового оперона, что является их специфической меткой. По сравнению со штаммами чумного микроба наибольшая вариабельность аллелей у штаммов псевдотуберкулезного микроба отмечена не для первой, а для третьей VNTR области, индекс полиморфизма которой составил 0,84. Оптимальной разрешающей способностью, как и для штаммов чумного микроба, обладает MST типирование с привлечением всех трех областей. Среди 67 штаммов псевдотуберкулезного микроба нами определено 19 MST типов, в то время как среди 170 штаммов чумного микроба - 31 MST тип. Распространение MST типов штаммов псевдотуберкулезного микроба коррелировало с географическим происхождением и серотипом штаммов. MST типирование может быть использовано для проведения эпидемиологического расследования вспышек псевдотуберкулезной инфекций, анализа штаммов псевдотуберкулезного микроба, выделяемых как при обследовании больных, так и из объектов окружающей среды, поскольку для данного вида исследования наиболее информативно использование простых повторов с высоким уровнем мутаций [ 127].

В статье G. Morelli с соавт. (2010), посвященной эволюции и путям распространения чумного микроба по континентам, авторы методом мультилокусного секвенирования исследовали аллели для 933 SNP в коллекции из 286 штаммов. Как и в наших исследованиях, ими определена четкая корреляция генотипов и географических регионов, в которых выделены изоляты. По мнению исследователей, единичные нуклеотидные замены, как в кодирующей части генома, так и в межгенных пространствах отражают этапы адаптации отдельных линий Y. pestis при распространении их по материкам и странам. Предложенный нами метод MST типирования также отводит важную роль единичным нуклеотидным заменам при определении региона, в котором выделен штамм. С практической стороны, использование SNP типирования (933 локуса) и MST типирования (три локуса) наиболее адекватно отражают геноварианты популяций чумного микроба. Более того, среди выявленных локусов генома Y. pestis с SNP можно отобрать те, которые будут удачно дополнять MST систему и не будет необходимости в проведении большого количества сиквенсов для определения генотипа изолята.

Подводя итоги выше сказанному, можно утверждать, что сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволяет наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба. В эпидемиологических исследованиях применение данного сочетания позволит проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов. Предложенная MST система предполагает дополнение другими ДНК-мишенями, увеличивающими ее типирующие свойства в отношении очаговой принадлежности штаммов из очагов сусликового и песчаночьего типа и мезоочаговой принадлежности из зарубежных очагов, а также определения наличия факторов вирулентности у исследуемых штаммов, а значит и степени их опасности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гаева, Анна Вячеславовна, 2012 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ажикина Т. Л. Гибридизационные подходы в широкомасштабных исследованиях геномов: Автореф. дис... док. биол. наук, - Москва. - 2009. - 35с.

2. Андросова С.В., Бондаренко Н.М., Нежнева В.Н. Характеристика культур чумного микроба, выделенных на территории деятельности астраханской противочумной станции в 1987 - 1990 годах [Текст] // Тез. обл. науч.-практ. конф. «Профилакт. особо опасных инф. в Сев. Прикаспии». - Астрахань, 1991. - С. 26 - 27.

3. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. -Иркутск [Текст] / Изд - во Иркут. ун - та, 1989. - 90 с.

4. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов Центрально-Азиатской зоны природной очаговости чумы. [Текст] // Мол. генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 4. - С.39-42.

5. Бессонова А. А. О двух разновидностях pestis, обнаруживаемых при росте на глицериновых средах. [Текст] // Вестн. Микробиол., эпидемиол. И паразитол. -1928. - Т. 7, вып. 3. - С. 250 - 253.

6. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов А.С. Систематика бактерий (с основами геносистематики). Монография. [Текст] / Н. Новгород: изд-во Нижегородского ун-та, 1992. - 171 с.

7. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий и ее природное значение. [Текст] // Успехи микробиологии. - М.: Наука, 1990. - Т. 24. - С. 3 -25.

8. Бобров А.Г., Филиппов А.А. Распространенность IS 285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis. [Текст] // Мол. генет., микробиол., вирусол. - 1997. - № 2. - С. 36 - 40.

9. Вершинина Т.И. О популяционной изменчивости возбудителя чумы из природных очагов Горного Алтая и Северо-Западной Монголии [Текст] / Автореф. дис.... канд. мед. наук. - Саратов, 1986. - 16 с.

10. Гаранина С.Б., Самойлова Л.В., Подсвиров A.B., Санджиев В.Б.-Х., Величко Л.Н., Топорков В.П., Куличенко А.Н. Выявление некультивируемых форм возбудителя Y.pestis в полевом материале, собранном в Прикаспийском СевероЗападном степном природном очаге чумы, с использованием ПЦР-анализа [Текст] // Природно-очаговые особо опасные инф. на юге России, их профилакт. и лаб. диагност.: Сб. науч. тр., поев. 100-летию Астраханской противочумной станции. - Астрахань: ГУП "Издательско-полиграфический комплекс "Волга", 2001. - С. 324-327.

11. Гольдфарб Л. М., Седина С. Г., Святая Т. В., Сидорова Н. К., Кочетов А. X., Алиев Л. И. К серологической характеристике культур, выделенных на холмогорье Бадхыз в 1976 г. [Текст] // Пробл. особо опасных инф. - 1978. - № 4 (62) - С. 5 - 7.

12. Горшков О.В. Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis. [Текст]: Дис.... канд. биол. наук. - Саратов, 2000. - 137 с.

13. Елкин Ю.М., Михайлова P.C., Розанова Г.Н., Тарасова В.Е., Лалазарова И.Г., Грамотина Л.И., Осипова С.П., Быкова З.А., Калмыкова Л.И. Возбудитель чумы очага Центрального Кавказа [Текст] // Пробл. особо опасных инф. - 1977. -Вып. 3(55).-С. 9-12.

14. Иванов П.Л. Геномная дактилоскопия: гипервариабельные локусы и генетическое маркирование. [Текст] // Молекулярная биология. - 1989. - Т. 23, вып. 2.-С. 341 -348.

15. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. [Текст] / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.:ОАО «Издательство «Медицина», 2009. - 472 с.

16. Леви М.И. Классификация разновидностей возбудителя чумы. [Текст] // Тез. докл. науч. конф. по природн. очаговости и профилактике чумы и туляремии.(30 октября-2 ноября 1962 г.) - Ростов-на-Дону, 1962. - С. 72-74.

17. Логачев Л.И. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае [Текст]: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. -Саратов, 1979. - 17 с.

18. Логачев Л.И, Ивженко Н.И. Характеристика штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае в 1972 году [Текст] // Докл. Иркут. противочумн. ин-та. - Чита, 1974. - Вып. 10. - С. 113 - 115.

19. Логачев Л.И., Михайлов Е.П. К характеристике вирулентности штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае [Текст] // Современ. аспекты профилакт. зоонозных инф. - Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 50.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. [Текст] - М.: Мир, 1984. - 479 с.

21. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. [Текст] - М.: Медицина, 1969. - 295 с.

22. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А Л. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. [Текст] - Нукус: Каракалпакастан, 1990. - 152 с.

23. Методы общей бактериологии: пер. с англ. [Текст] / Под ред. Ф. Герхардта и др. - М.: Мир, 1984. - 264 е., ил.

24. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР: МУ 3.5.5. - 1034 - 01. - Москва: Минздрав России, 2001.-С. 5.

25. Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Манохина О.В., Пучкова Л.И., Калмыкова Г.В., Михайлова В.М., Репин В.Е., Ильичев A.A. Идентификация и паспортизация штаммов Bacillus thuringiensis методом геномной дактилоскопии с использованием биотинилированной ДНК фага M 13. [Текст] // Генетика. -1999. - Т. 35, № 6. - С. 751 - 755.

26. Орешкова С.Ф., Манохина О.В., Пучкова Л.И., Репин В.Е., Ильичев A.A. Идентификация и паспортизация штаммов микроорганизмов методом геномной

дактилоскопии с использованием биотинилированной ДНК фага М 13. [Текст] // Генетика. - 1996. - Т. 32, № 6. - С. 740 - 743.

27. Осадчая Л.М., Мисалева О.С., Алексеева O.E., Егорова Р.П., Чернова В.А. К характеристике возбудителя чумы из Северного Приаралья [Текст] // Матер. VII науч. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1971. - С. 39 - 40.

28. Пак Г.Ю., Айкимбаев А.М., Степанов В.М., Казакбаева P.A., Темиралиева Г.А., Соорбеков О.С. К вопросу об уреазной активности штаммов чумного микроба, выделенных от красных сурков в Западном Тянь-Шане. [Текст] // Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инфекций. -Саратов, 1983. - С. 30 - 33.

29. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. [Текст] / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - ОАО «Издательство «Медицина», 2004. - 192 е.: ил.

30. Попов Ю.А., Ерошенко Г.А., Булгакова Е.Г., Смирнова Н.И. Разработка комплексного алгоритма генотипирования и методов оценки генетического разнообразия природных штаммов возбудителей чумы и холеры. [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - вып. 4 - С. 5-10.

31. Руководство по профилактике чумы. [Текст] / Под редакцией A.B. Наумова и JI.B. Самойловой. - Саратов, 1992. - 275 с.

32. Сагимбеков У.А., Рапопорт Л.П., Ветров Ф.Е., Пошевина Г.О., Самсонова Л.Г., Кузьменко В.И., Джексембеков С.К., Красникова Л.В., Цой Д.Ч. О выделении возбудителя чумы в Таласском Алатау (Западный Тянь-Шань) [Текст] // Профилакт. особо опасных инф. - Сарат. ун-т, 1980. - С. 11 -15.

33. Санитарно - эпидемиологические правила СП 1.3. 1285-03. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). [Текст] // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - 103 с.

34. Санитарно - эпидемиологические правила СП 1.3. 2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и

возбудителями паразитарных болезней. [Текст] // Госсанэпиднадзор России. -М., 2008.-101 с.

35. Слудский А.А. Природные очаги чумы полевочьего типа (структура и функционирование). [Текст]: Автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. - Саратов, 1998. -43 с.

36. Соорбеков О.С., Тюлембаев М.А., Мартиневский И.Л., Классовский Л.Н., Атчабаров Б.Б. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1979-1980 гг. в Таласском Алатау [Текст] // Микробиол., генетика и иммунол. чумы и холеры. - Саратов, 1983. - С. 8 - 11.

37. Сухоносов И.Ю. Структурно - функциональные различия hms областей геномов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis. [Текст]: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2009. - 201 с.

38. Сучков И.Ю., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Шишияну М.В., Мишанькин Б.Н. Мультилокусный VNTR - анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природных очагах. [Текст] // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. - 2004. - N 4. - С. 19 - 28.

39. Сучков И.Ю., Мишанькин Б.Н., Водопьянов С.О., Смоликова Л.М., Шишияну М.В. Генотипирование Yersinia pestis: вариабельность локуса (СААА)п у природных штаммов, выделенных на территории бывшего СССР. [Текст] // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. - 2002. - N 4. - С. 18-21.

40. Тимофеева Л.А. О таксономии чумного микроба. [Текст] // Пробл. особо опасных инф. - 1972. - Вып. 1 (23). - С. 15 - 22.

41. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1961 - 1966 г.г. в чумных очагах Сибири и Монголии [Текст] // Пробл. особо опасн. инф. -1969. - №4 . - С. 13 - 18.

42. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П., Головачева В.Я., Миронова Л.П., Логачев А.И. Особенности культур чумного микроба, выделенных в горном Алтае [Текст] // Особо опасные инф. в Сибири и на Д. Востоке. Докл. Иркут. противочумн. ин-та - Кызыл, 1966. - Вып. 7. - С. 112 - 115.

43. Тимофеева JI.А., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран Мандалин. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 - 1971 гг. [Текст] // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

44. Туманский В.М. Микробиология чумы (Микробиологические основы диагностики чумы). [Текст] - М., 1968. - 268 с.

45. Тюлембаев М. А., Соорбеков О. С., Якунин Б. М. О выявлении эпизоотии чумы среди мышевидных грызунов в Таласском автономном очаге. [Текст] // Вопр. природ, очагов, зоонозов. - Саратов, 1982. - С. 40 - 41.

46. Филиппов A.A. Мобильные генетические элементы патогенных иерсиний [Текст]: Дис.... докт. мед. наук. - Саратов, 2001.-370 с.

47. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко O.A. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов [Текст] // ЖМЭИ. - 1992. - №3 - С. 10 - 13.

48. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко O.A. Содержание плазмид в штаммах возбудителя чумы - представителях разных природных очагов [Текст] // Эпидемиол., микробиол. и иммунол. бакт. и вирусных инф.: Тез. докл. обл. науч. конфер. молодых ученых, 17-20 окт. 1989 г. - Ростов н/Д., 1989. - С. 158 - 159.

49. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле [Текст] // Профилакт. природноочаговых инф. - Ставрополь, 1983. - С. 326 - 327.

50. Цыганкова Е.А. Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба. [Текст]: Дис. ... канд. биол. наук. - Ставрополь, 2007. - 181 с.

51. Ятченко Н.Л. О роли мышевидных грызунов в природной очаговости и эпидемиологии чумы в Кыргызстане. [Текст] // Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профил.: Матер, межгосуд. науч.-практ. конф. - Алма-Ата, 1992.-С. 293-295.

52. Aanensen D.M., Spratt B.G. The multilocus sequence typing network: mlst.net [Text] // Nucleic Acids Research. Web Server issue - 2005. - V. 33. - W. 728-733.

53. Achtman M., Morelli G., Zhu P., Wirth T., Diehl I. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis. [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. - 2004. -V. 101, №51.-P. 17837-17842.

54. Achtman M., Zurth K., Morelli G. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. - 1999. - V. 96, № 24. - P. 14043-14048.

55. Adair D., Worsham P., Hill K. Klevytska A. M., Jackson P. J., Friedlander A. M., Keim P. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis. [Text] // J. Clin. Microbiol.- 2000.-V. 38.-P.1516-1519.

56. Akopyants N.S., Fradkov A., Diatchenko L., Hill J.E., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Sverdlov E.D., Berg D.E. PCR - based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori. [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1998.- V. 95.-P. 13108-13113.

57. Alito A., Morcillo N., Scipioni S., Dolmann A., Romano M., Cataldi A., van Soolingen D. The IS 6110 restriction fragment length polymorphism in particular multidrug - resistant Mycobacterium tuberculosis strains may evolve too fast for reliable use in outbreak investigation. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1999. - V. 37. -P. 788-791.

58. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. [Text] // J. Clin. Microbiol. Rew. - 2004. - V. 17, № 2. - P. 434 - 464.

59. Bagley M., Anderson S., May B. Choice of methodology for assessing genetic impacts of environmental stressors: polymorphism and reproducibility of RAPD and AFLP fingerprints. [Text] // J. Ecotoxicology. - 2001. - № 10. - P. 239 - 244.

60. Basu A., Garg P., Datta S. Vibrio cholerae 0139 in Calcutta, 1992 - 1998: incidence, antibiograms and genotypes. [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2000. - V. 6. -P. 139 - 147.

61. Beddek A., Li M.-S., Kroll J. S., Jordan T. W., Martin D. Evidence for capsule switching between carried and disease-causing Neisseria meningitidis strains [Text] // Infect, and Immun. - 2009. - V. 77, № 7. - P. 2989-2994.

62. Beyer W., Mukendi F.M., Kimmig P. and Büohm R. Suitability of repetitive-DNA-sequence-based PCR fingerprinting for characterization of epidemic isolates of Salmonella enterica serovar Saintpaul. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V. 36. -P. 1549-1554.

63. Boniotti M., Goria M., Loda D., Garrone A., Benedetto A., Mondo A., Tisato E., Zanoni M, Zoppi S., Dondo A., Tagliabue S., Bonora S., Zanardi G., Pacciarini M. L. Molecular typing of Mycobacterium bovis strains isolated in Italy from 2000 to 2006 and evaluation of Variable-Number Tandem Repeats for geographically optimized genotyping. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, № 3. - P. 636644.

64. Brudey K., Driscoll J.R., Rigouts L., Prodinger W.M., Gori A. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. [Text] // BMC Microbiol. - 2006. - V. 6. - P. 23.

65. Buchrieser C., Rusniok C., Frangeul L., Couve E., Billault A., Kunst F., Carniel E., Glaser P. The 102-kilobase pgm locus of Yersinia pestis: sequence analysis and comparison of selected regions among different Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis strains [Text] // Infect. Immun. - 1999. - V. 67, N 9. - P. 48514861.

66. Chain P.S.G., Carniel E., Larimer F.W. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis. [Text] // Proc.Natl. Acad. Sei. USA.-2004.-V. 101, №38.-P. 13826-13831.

67. Chmielewski R., Wieliczko A., Kuczkowski M., Mazurkiewicz M., Ugorski M. Comparison of 1ST profiling, REP and ERIC-PCR of Salmonella enteritidis isolates from Poland. [Text] // J. Vet. Med. - 2002. - V. 49. - P. 163-168.

68. Chowchury Sh., Arias C., Nallapareddy S., Reyes J., Willems R., Murray B. Trilocus sequence typing scheme for hospital epidemiology and subspecies differentiation of an important nosocomial pathogen, Enterococcus faecalis. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - V. 47, № 9. - P. 2713 - 2719.

69. Chu M.C., Yockey B.M., Bracher J.E., Moss K.A., Close D.W., Berrada Z.L., Bratcher H.B., Carter L.G. Application of molecular methods to characterize Yersinia pestis isolates. [Text] // Chin. J. Contr. Endem. Dis. - 1999. - V. 14. - P. 219.

70. Cui Y., Li Y., Gorge O., Platonov M., Yan Y., Guo Zh., Pourcel C., Dentovskaya S., Balakhonov S., Wang X., Song Y., Anisimov A., Vergnaud G., Yang R. Insight into microevolution of Yersinia pestis by clustered regularly interspaced short palindromic repeats. [Text] // PloS ONE. - 2008. - V. 3, № 7. - e 2652.

71. Daffonchio D., Raddadi N., Merabishvili M., Chérit A., Carmagnola L., Brusetti L., Rizzi A., Chanishvili N., Visca P., Sharp R., Borin S. Strategy for identification of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains closely related to Bacillus anthracis. [Text] // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - V. 72, № 2. -P. 1295-1301.

72. Desai M., Logan J.M., Stanley J. Genome sequence - based fluorescent amplified fragment length polymorphism of Campilobacter jejuni, its relationship to serotyping and its implications for epidemiological analysis. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39, № 11.-P. 3823-3829.

73. Devignat R. Varietes de l'espece Pasturella pestis. Nouvelle hypohthese [Text] // Bull. OMS. - 1951. - V. 4, № 2. - P. 247 - 263.

74. Diatchenko L., Lau Y.F.C., Campbell A.P., Chenchik A., Moqadam F., Huang B., Lukyanov S., Lukyanov K., Gurskaya N., Sverdlov E.D., Siebert P.D. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1996. - V. 93. - P. 6025 - 6030.

75. Drancourt M., Roux V., Dang L.V., Tran-Hung L., Castex D., Chenal-Francisque V., Ogata H., Fournier P.-E., Crubézy E., Raoult D. Genotyping, Orientalis-like

Yersinia pestis, and plague pandemics. [Text] // Emerging Infectious Diseases. -2004. - V. 10, № 9. - P. 1585-1592.

76. Eppinger M., Worsham P.L., Nicolich M.P., Riley D.R., Sebastian Y., Mou S., Achtman M., Lindler L., Ravel J. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolution and pangenome of the plague bacterium. [Text] // J. Bacteriol. - 2010. - V. 192, № 6. - P. 1685 - 1699.

77. Erwin A., Sandstedt A., Bonthuis P., Geelhood J., Nelson K., Unrath W., Diggle M., Theodore M., Pleatman C., Mothershed E., Sacchi C., Mayer L., Gilsdorf J., Smith A. Analysis of genetic relatedness of Haemophilus influenzae isolates by Multilocus Sequence Typing. [Text] // J. Bacteriol. - 2008. - V.190, № 4. - P. 14731483.

78. Faruque S.M., Saha M.N., Asadulghani, Bag P.K., Bhadra R.K., Bhattacharya S.K., Sack R.B., Takeda Y., Nair G.B. Genomic diversity among Vibrio cholerae 0139 strains isolated in Bangladesh and India between 1992 and 1998. [Text] // FEMS Microbiol Lett. - 2000. - V. 184. - P. 279 - 284.

79. Fawley W.N., Freeman J., Smith C., Harmanus C., van den Berg R.J., Kuijper E.J., Wilcox M.H. Use of highly discriminatory fingerprinting to analyze clusters of Clostridium difficile infection cases due to epidemic ribotype 027 strains [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V. 46, № 3. - P. 954-960.

80. Fredericq P. Collicins [Text] //Ann. Rev. Microbiol. - 1957. - V 11. - P. 7-22.

81. Ghosh R., Balakrish Nair G., Li Tang, Morris J.G., Sharma N.C., Ballal M., Garg P., Ramamurthy Th., Stine O.C. Epidemiological study of Vibrio cholerae using variable number of tandem repeats. [Text] // FEMS Microbiol. Lett. - 2008. - V. 188. -P. 196-201.

82. Godoy D., Rändle G., Simpson A., Aanensen D., Pitt T., Kinoshita R., Sprattl B. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2003. - V. 41, № 5. - P. 2068 - 2079.

83. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. The CRISPR db database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. [Text] // BMC Bioinform. - 2007. - V. 8. - P. 172 - 174.

84. Grundmann H., Satoshi H., Tanner G. Determining confidence intervals when measuring genetic diversity and the discriminatory abilities of typing methods for microorganisms. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2001. -V. 39, № 11. -P. 4190-4192.

85. Guiyoule A., Grimont F., Iteman I., Grimont P. A., Lefevre M., Carniel E. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains. [Text] // J. Clin Microbiol. - 1994. - V. 32. - P. 634 - 641.

86. Guiyoule A., Rasoamanana B., Buchrieser C., Michel P., Chanteau S., Carniel E. Recent emergence of new variants of Yersinia pestis in Madagascar. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1997. - V. 35. - P. 2826 - 2833.

87. Harbottle H., White D.G., McDermott P.F., Walker R.D, Zhao S. Comparison of multilocus sequence typing, pulsed-field gel electrophoresis, and antimicrobial susceptibility typing for characterization of Salmonella enterica erotype Newport isolates. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - V. 44, № 7. - P. 2449 - 2457.

88. Hermans P., Sluigter M., Hoogenboezem T., Heersma H., van Belkum A., Croot R. Comparative study of five different DNA fingerprint techniques for molecular typing of Streptococcus pneumoniae strains. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1995. - V. 33, №6.-P. 1606-1612.

89. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and phisiology of Pasteurella pestis. VI. A different plating medium for estimation of the mutation rate to aviru-lence [Text] // Ibid. - 1961. - V. 81. -P. 605-608.

90. Huang X-Z., Chu M., Engelthaler D., Lindler L. Genotyping of a homogeneous group of Yersinia pestis strains isolated in the United States. [Text] // J. Clin. Micobiol. - 2002. - V. 40, № 4. - P. 1164 - 1173.

91. Hunter P., Gaston M. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpsin s index of diversity. [Text] // J. Clin. Microbiol. -1988. - V. 26, № 11. - P. 2465 - 2466.

92. Inagaki T., Nishimori K., Yagi T., Ichikawa K., Moriyama M., Nakagawa T., Shibayama T., Uchiya K., Nikai T., Ogawa K. Comparison of a variable-number tandem-repeat (VNTR) method for typing Mycobacterium avium with mycobacterial interspersed repetitive-unit-VNTR and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - V.47, № 7. - p. 21562164.

93. Iwobi A.N., Rakin A., Garcia E. Heesemann J. Subtractive hybridization uncovers novel pathogenicity-associated loci in Yersinia enterocolitica. [Text] // The genus Yersinia. / Edited by Skurnik et al. - New York, 2003. - Ch.4. - P.25-29.

94. Joans D., Meyer H.G., Matthes P., Härtung D., Jahn B, Daschver F., Jansen B. Comparative evaluation of three different genotyping methods for investigation of nosocomial outbreaks of legionnaires diseae in hospitals. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2000. - V. 38, № 6. - P. 2284 - 2291.

95. Jones S.W., Dobson M.E., Franchesconi S.C. DNA assays for detection, identification and individualization of select agent microorganisms. [Text] // J. Croat. Med. - 2005. - V. 46, № 4. - P. 522 - 529.

96. Kado C., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small Plasmids [Text] // J. Bacteriol. - 1981. - V. 145, №3. - P. 1365 - 1373.

97. Kattar M., Jaafar R., Araj G., Le Fle^che P., Matar G., Rached R., Khalife S., Vergnaud G. Evaluation of a multilocus variable-number tandem-repeat analysis scheme for typing human Brucella isolates in a region of brucellosis endemicity. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V. 46, № 12. - P. 3935-3940.

98. Kenefic L.J., Beaudry J., Trim C., Daly R., Parmar R., Zanecki S., Hynh L., van Ert M.N., Wagner D.M., Craham T., Keim P. High resolution genotyping of Bacillus anthracis outbreak strains using four highly mutable single nucleotide repeat markers. [Text] // Letters in Applied Microbiology. - 2008. - V. 46. - P. 60-603.

99. Keto-Timonen R.O., Autio T.J., Korkeala H. An improved amplified fragment length polymorphism (AFLP) protocol for discrimination of Listeria isolates. [Text] // Syst. Appl. Microbiol. - 2003. - V. 26, № 2. - P. 236 - 244.

100. Killigore G., Thompson A., Johnson S., Brazier J., Kuijper E., Pepin J., Frost E., Savelkoul P., Nicholson S., van den Berg R., Kato H., Sambol S., Zukowski W., Woods Ch., Limbago B., Gerding D., Mc. Donald L. Comparison of seven techniques for typing international epidemic strains of Clostridium difficile: restriction endonuclease analysis, pulsed - field gel electrophoresis, PCR-ribotyping, multilocus variable-number tandem-repeat analysis, amplified fragment length polymorphism and surface layer protein A gene sequence typing. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V. 46, № 2. - P. 431 - 437.

101. Kim W., Song M-O., Song W., Kim K-J., Chung S-I., Choi C-S., Park Y-H. Comparison of 16S rDNA analysis and REP-PCR genomic fingerprinting for molecular identification of Yersinia pseudotuberculosis [Text] // Antonie van Leeuwenhoek. - 2003. - V. 83. - P. 125-133.

102. Kingston J., Tuteja U., Kapil M., Murali H.S., Batra H.V. Genotyping of Indian Yersinia pestis strains by MLVA and repetitive DNA sequence based PCRs. [Text] // Antonie van Leeuwenhoek. - 2009. - DOI 10.1007/s 10482-009-9347-2.

103. Klevytska A., Price L., Schupp J., Worsham P., Wong J., Keim P. Identification and characterization of variable - number tandem repeats in the Yersinia pestis genome. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39, № 9. - P. 3179 - 3185.

104. Koeleman J.G., Stoof J., Biesmans D.J., Salenkoul P.H., Vanderbroucke-Grauls C.M. Comparison of amplified ribosomal DNA restriction analysis, random amplified polymorphic DNA analysis and amplified fragment length polymorphism fingerprinting for identification of Acinetobacter genomic species and typing of Acinetobacter baumannii. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1999. - V. 37, № 10. - P. 3428 - 3429.

105. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G., Morris J., Sulakvelidze A., Stine O. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43, № 6. - P. 2674 - 2684.

106. Kuijper E.J., van den Berg R.J., BrazierJ.S. Comparison of molecular typing methods applied to Clostridium difficile [Text] / D. A. Caugant (ed.). Molecular

epidemiology of microorganisms. Methods in molecular biology. 2009. - V. 551. - P. 159-171.

107. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L., Prieur A., Denoeud F., Ramisse V., Sylvestre P., Benson G., Ramisse F., Vergnaud G. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. [Text] // BMC Microbiol. - 2001. - V. 1. - P. 2.

108. Li W.H. Simple method for constructing phylogenetic trees from distance matrices. [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1981. - V. 78. - P. 1085 - 1090.

109. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M., Dai E., Song Y., Guo Zh, Pourcel C., Dentovskaya S., Anisimov A., Yang R., Vergnaud G. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by ML VA: insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci. [Text] // PloS ONE. - 2009. - V. 4, №6.-e 6000.

110. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M., Zhou D, Guo Zh., Dai X., Cui B., Qi Zh., Wang Z, Wang H., Dong X., Song Zh., Zhai J., Song Y., Yang R. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. [Text] // PLoS ONE. - 2008. - V. 3, № 5. - e 2166.

111. Lin A.W., Usera M.A., Barrett T.J., Goldsby R.A. Application of random amplified polymorphic DNA analysis to differentiate strains of Salmonella enteritidis. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1996. - V. 34. - P. 870-876.

112. Lowell J., Zhansarina A.,Yockey B., Meka-Mechenko T., Stybayeva G., Atshabar B., Nekrassova L., Tashmetov R., Kenghebaeva K., Chu M., Kosoy M., Antolin F., Gage K. Phenotypic and molecular characterizations of Yersinia pestis isolates from Kazakhstan and adjacent regions. [Text] // Microbiology. - 2007. - V. 153. P. 169-177.

113. Lowell J.L., Wagner D.M., Atshabar B., Antolin M.F., Vogler A.J., Keim P., Chu M.C., Gage K.L. Identifying sources of human exposure to plague. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43. - P. 650 - 656.

114. Lucier T.S., Brubaker R.R. Determination of genome size, macrorestriction pattern polymorphism and nonpigmentation specific deletion in Yersinia pestis by

pulsed-field gel electrophoresis. [Text] // J. Bacteriol. - 1992. - V. 174, № 7. - P. 2078 - 2086.

115. Michael G.B., Cardoso M., Rabsch W, Schwarz S. Phenotypic and genotypic differentiation of porcine Salmonella enterica subsp. enterica serovar Derby isolates. [Text] // Vet. Microbiol. - 2006. - V. 118. P. 312-318.

116. Michael G.B., Cardoso M., Schwarz S. Molecular analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona isolated from slaughter pigs. [Text] // Vet. Microbiol. - 2006. - V. 112. - P. 43-52.

117. Mills-Robertson F., Crupper S.S., Addy M.E., Mensah P. Antibiotic resistance and genotyping of clinical group B Salmonella isolated in Accra, Ghana. [Text] // J. Appl. Microbiol. - 2003. - V. 94. - P. 289 - 294.

118. Mokrousov I., Limeschenko E., Vyazovaya A., Narvskaya O. Corynebacterium diphtheriae spoligotyping based on combined use of two CRISPR loci. [Text] // J. Biotechnol. - 2007. - V. 2. - P. 901 - 906.

119. Morelli G., Song Y., Mazzoni C. J., Eppinger M., Roumagnac Ph., Wagner D. M., Feldkamp M., Kusecek B., Vogler A. J., Li Y., Cui Y., Thomson N. R., Jombart T., Leblois R., Lichtner P., Rahalison L., Petersen J. M., Balloux F., Keim P., Wirth Th., Rave J., Yang R., Carniel E., Achtman M. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity [Text] // Nature Genetics. - 2010. -October.-P. 1-6.

120. Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., TakedaY., Nair G.B., Berg D.E. Characterization of VPI patogenicity island and CTXphi prophage in environmental strains of Vibrio cholerae. [Text] // J. Bacteriol. - 2001. - V. 183. - P. 4737 - 4746.

121. Nallapareddy S., Duh R., Singh K., Murray B. Molecular typing of selected Enterococcus faecalis isolates: pilot study using multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - V. 40. - P. 868 - 876.

122. Niemann S., Rüsch-Gerdes S., Richter E., Thielen H., Heykes-Unden H., Diel R. Stability of IS 6110 restriction fragment length polymorphism patterns of

Mycobacterium tuberculosis strains in actual chains of transmission. [Text] //J. Clin. Microbiol. - 2000. - V. 38, № 7. - P. 2563 - 2567.

123. Octavia S., Lan R. Multiple locus variable number of tandem repeat analysis of Salmonella enterica serovar Typhi. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - V. 47, № 8. -P. 2369-2376.

124. Olive D. Michael, Bean P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1999. - V. 37, № 6.-P. 1661 - 1669.

125. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis - etiologic agent of plaque. [Text] // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - P. 186 - 189.

126. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis. [Text] // J. Bacteriol. - 1981. - V. 148. P. 877 -883.

127. Pourcel C., Andre-Mazeaud F., Neubauer H., Ramisse F., Vergnaud G. Tandem repeats analysis for the high resolution phylogenetic analysis of Yersinia pestis. [Text] // BMC Microbiol. - 2004. - V. 4. - P. 22.

128. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA and provide additional tools for evolutionary studies. [Text] // Microbiology. - 2005. - V. 151. -P. 653-663.

129. Power E. RAPD typing in microbiology: a technical review. [Text] // J. Hosp. Infect. - 1996. - V. 34. - P. 247-265.

130. Prescott L.M. Microbiology. [Text] - 2002. - 1150 p.

131. Radnedge L., Agron P.G., Worsham P.L., Andersen G. Genom plasticity in Yersinia pestis. [Text] // Microbiology. - 2002. - V.148. - P.1687-1698.

132. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P., Worsham P., Andersen G. Identification of nucleotide sequences for the specific and rapid detection of Yersinia pestis. [Text] //Appl. Environment. Microbiol.- 2001.- V. 67, № 8. - P. 3759 -3762.

133. Revazishvili T., Rajanna C., Bacanidze L., Tsertsvadze N., Imnadze P., 0A Connell K., Kreger A., Stine O., Morris J., Sulakvelidze A. Characterization of

Yersinia pestis isolates from natural foci of plague in the Republic of Georgia and their relationship to Y. pestis isolates from other countries. [Text] // J. Clin. Microbiol. Infect. - 2008. - V. 14, № 5. - P. 429 - 436.

134. Ruiz-Garbajosa P., Bonten M., Robinson D., Top J., Nallapareddy S., Torres C., Coque T., Canton R., Baquero F., Murray B., del Campo R., Willems R. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecalis reveals hospital-adapted genetic complexes in a background of high rates of recombination. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - V. 44. - P. 2220 - 2228.

135. Salim A., Lan R., Reeves P.R. Vibrio cholerae pathogenic clones. [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2005. - V. 11. - P. 1758 - 1760.

136. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. [Text] // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. - 1977. - Vol.74. - P. 5463 - 5467.

137. Sander A., Ruess M., Bereswill S., Schuppler M., Steinbrueckner B. Comparision of different DNA fingerprinting techniques for molecular typing of Bartonella henselae isolates. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V. 36, № 10. - P. 2973-2981.

138. San Millan R, Garaizar J, Bikandi J. In silico simulation of fingerprinting techniques based on double endonuclease digestion of genomic DNA. [Text] // In Silico Biol. - 2005. - V. 5, № 3. - P. 341-346.

139. Saxena M.K., Singh V.P., Lakhcharua B.D., Taj G., Sharma B. Strain differentiation of Indian isolates of Salmonella by ERIC-PCR. [Text] // Res. Vet. Sei. - 2002. - V. 73. P. 313-314.

140. Schouls L., van der Ende A., Damen M., van de Poll I. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis of Neisseria meningitidis yields groupings similar to those obtained by multilocus sequence typing [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2006. -V. 44, №4.-P. 1509-1518.

141. Seiander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J., Gilmour M.N., Whittam T. S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. [Text] // J. Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - V. 51. - P. 873-884.

142. Souza R.A., Falcao D.P, Falcao J.P. Emended description of the species Yersinia massiliensis. [Text] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2010. - DOI 10.1099/ijs.0.021840-0.

143. Souza R., Pitondo-Silva A., Falcao D.P., Falcao J.P. Evaluation of four molecular typing methodologies as tools for determining taxonomy relations and for identifying species among Yersinia isolates. [Text] // J. Microbiol. Methods. - 2010. -V. 82, №2.-P. 141-150.

144. Stumpt A., Roggenkamp A., Hoffmann H. Specificity of enterobacterial repetitive intergenic consensus and repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction for the detection of clonality within the Enterobacter cloacae complex. [Text] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2005. - V. 53, № 1. - P. 9 - 16.

145. Szczuka E., Kaznowski A. Typing of clinical and environmental Aeromonas sp. strains by random amplified polymorphic DNA PCR, repetitive extragenic palindromic PCR and enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2004. - V. 42, № 1. - P. 220 - 228.

146. Terletski V., Michael G.B., Schwarz S. Subtracted restriction fingerprinting - a new typing technique using magnetic capture of tagged restriction fragments. [Text] // FEMS Immun. Med. Microbiol. - 2004. - V. 41. - P. 1- 8.

147. Terletski V.P., Schwarz S., Carnwath J., Niemann H. Subtracted restriction fingerprinting - a tool for bacterial genome typing. [Text] // BioTechniques. - 2003. -V. 34.-P. 304-313.

148. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratoiy strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF). [Text] // Microbiol. Res. - 2003. - V. 158. - P. 135-142.

149. Torrea G., Chenal-Francisque V., Leclercq A., Carniel E. Efficient tracing of global isolates of Yersinia pestis by restriction fragment length polymorphism analysis using three insertion sequences as probes. [Text] // J. Clin. Microbiol. -2006. - V. 44, № 6. - P. 2084 - 2092.

150. Tyler K.D., Wang G., Tyler S.D., Johnson W.M. Factors affecting reliability and reproducibility of amplificationbased DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. [Text] // J.Clin. Microbiol. - 1997. - V. 35. - P. 339-346.

151. Van Belkum A. DNA fingerprinting of medically important microorganisms by use of PCR. [Text] // J. Clin. Microbiol. Rev. - 1994. - V. 7. P. 174-184.

152. Van Belkum A., Kluitmans J., van Leeuwen W., Bax R., Quint W., Peters E., Fluit A., Vandenbroucke - Grauls C., van den Brule A., Koeleman H. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR for typing of Staphylococcus aureus strains. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1995. - V. 33. - P. 1537 - 1547.

153. Van Belkum A., Struelens M., Visser A., Verbrugh H., Tibayrenc M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics, and microbial epidemiology. [Text] // Clinical Microbiology Reviews. - 2001. - V. 14, №3. _ p. 547.560.

154. Voskressenskaya E, Leclercq A., Tseneva G., Carniel E. Evaluation of ribotyping as a tool for molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis strains of worldwide origin. [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43, № 12. - P. 6155-6160.

155. Wang Y.-W., Watanabe H., Phung D.C., Tung S.K., Lee Y-S., Terajima J., Liang S-Y., Chiou C-S. Multilocus variable-number tandem repeat analysis for molecular typing and phylogenetic analysis of Shigella flexneri. [Text] // BMC Microbiol. - 2009. - V. 9. - P.278 - 288.

156. Wei J.C., Yu D.Z., Hai R. The geographical distribution of ribotypes of Yersinia pestis in China. [Text] // Zhonghua. Liu. Xing. Bing. Xue. Za. Zhi. - 2003. - V. 24, N 11.-P. 1027-1030.

157. Weigel R.M., Qiao B, Barber D.A., Teferedegne B., Kocherginskaya S, White B.A., Isaacson R.E. Identification of patterns of transmission of Salmonella within swine production systems using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and repetitive sequence polymerase chain reaction (REP-PCR): a quantitative analysis. [Text] // Berl. Muunch. Tieruarztl. Wochenschr. - 2001. - V. 114. - P. 397-400.

158. WHO. Plague. Available from: http: //www.who.int/mediacentre/. - 2009. -April. - Fact sheets 267.

159. Yeh R.W, Ponce de Leon A., Agasino C.B., Hahn J., Daley C.L., Hopewell P.C., Small P.M. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes. [Text] // J. Infect. Dis.- 1998.-V. 177.-P. 1107-1111.

160. Yu D.Z., Hai R., Dong X.Q., Li M., Xia L.X., Shi X.M., Wei J.C., Cui B.Z., Wang P., Sun L.Z., Zhang Z.K., Hu Y., Zhang E.M. Genetic analysis of Yersinia pestis strains isolated in China [Text] // Zhonghua. Liu. Xing. Bing. Xue. Za. Zhi. -2003. - V. 24, N 11. - P. 1005-1009.

161. Zhang X., Hai R., Wei J., Cui Z., Zhang E., Song Z., Yu D. MLVA distribution characteristics of Yersinia pestis in China and the correlation analysis. [Text] // BMC Microbiology. - 2009. - V. 9. - P. 205-213.

162. Zhao S., Mitchell S.E., Meng J., Kresovich S., Doyle M.P., Dean R.E., Casa A.M., Weller J.W. Genomic typing of Escherichia coli 0157:H7 by semi-automated fluorescent AFLP analysis. [Text] // Microbes Infect. - 2000. - V. 2, № 2. - P. 107 -113.

163. Zhou D, Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X., Zhai J., Li M., Cui B., Qi Z., Jin L., Dai R., Du Z., Wang J., Guo Z., Wang J., Huang P., Yang R. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus [Text] // J. Bacteriol. - 2004. - V. 186, №15. - P. 5147-5152.