Разработка молекулярно-генетических методов ранней диагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum и осложнений тропической малярии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Арюков Артем Русланович

• Арюков Артем Русланович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Арюков Артем Русланович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клеточные и молекулярно-генетические особенности биологии Plasmodium falciparum

1.2. Патогенез и особенности клинического течения тропической малярии

1.3. Противомалярийные препараты и механизмы их действия

1.4. Гены, ассоциированные с лекарственной резистентностью Plasmodium falciparum

1.5. Механизмы формирования лекарственной резистентности Plasmodium falciparum

1.6. Молекулярно-генетические маркеры лекарственной резистентности Plasmodium falciparum

1.7. Методы оценки чувствительности Plasmodium falciparum к действию противомалярийных препаратов

1.8. Методы выявления однонуклеотидных полиморфизмов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика обследованного материала

2.2. Паразитологические методы

2.3. Молекулярно-генетические методы

2.4. Методы статистической обработки данных

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ МАРКЕРОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ PLASMODIUM FALCIPARUM

3.1. Исследуемый материал

3.2. Пробоподготовка и выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты

3.3. Идентификация маркерных однонуклеотидных полиморфизмов методом анализа длин рестрикционных фрагментов

3.4. Идентификация маркерных однонуклеотидных полиморфизмов с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с альтернативными праймерами

3.5. Выбор режимов и оптимизация физико-химических параметров

3.6. Выявление маркеров лекарственной резистентности Plasmodium falciparum в пробах крови больных тропической малярией

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ PLASMODIUM FALCIPARUM

4.1. Сбор и хранение венозной крови

4.2. Подбор флуоресцентных зондов и праймеров

4.3. Оптимизация температуры отжига

4.4. Подбор проб положительного и отрицательного контроля для тест-систем выявления маркеров лекарственной устойчивости Plasmodium falciparum

4.5. Учет и интерпретация результатов исследования

4.6. Оценка чувствительности и специфичности разработанной мультиплексной системы полимеразной цепной реакции в реальном времени

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ МАРКЕРОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ PLASMODIUM FALCIPARUM - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАВОЗНЫХ СЛУЧАЕВ ТРОПИЧЕСКОЙ МАЛЯРИИ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

5.1. Генетическая структура микропопуляций возбудителей завозной тропической малярии по локусам геновз ассоциированных с лекарственной резистентностью

5.2. Структура заболеваемости завозной тропической малярией по признаку лекарственной чувствительности возбудителей

5.3. Изучение эффективности противомалярийных препаратов на основании анализа генетических маркеров лекарственной резистентности возбудителей

5.4. Оценка эффективности лечебно-профилактических мероприятий в системе эпидемиологического надзора в отношении малярийной инфекции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

98

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка молекулярно-генетических методов ранней диагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum и осложнений тропической малярии»

Актуальность темы

Малярия - широко распространенная инфекция, вызываемая простейшими рода Plasmodium (E. Marchiafava & A. Celli, 1885), переносчиками которых служат комары рода Anopheles (J. W. Meigen, 1818). Несмотря на реализуемую Всемирной организацией здравоохранения Глобальную техническую стратегию борьбы с малярией на 2016-2030 годы, ожидаемого снижения заболеваемости и смертности от малярии в мире в настоящее время не отмечается [130]. В 2022 году в 85 странах, расположенных в эндемичных по этой инфекции регионах, было зарегистрировано в общей сложности 249 миллионов случаев малярии, из них 608000 закончились летально [130]. Наибольшее количество случаев, а именно 233 миллиона, было зарегистрировано в Африке и Юго-Восточной Азии [121].

Для России сохраняется угроза возврата этой инфекции и восстановления естественного механизма передачи возбудителей. Это обусловлено широким распространением на территории нашей страны эффективных переносчиков малярийных плазмодиев - комаров комплекса Anopheles maculipennis s.l. (An. maculipennis, An. messeae, An. beklemishevi) и Anopheles claviger, а также регулярным завозом возбудителей малярии лицами, посещающими тропические регионы [3, 14]. Особую группу риска составляют контингенты военнослужащих, выполняющих задачи на территории, эндемичной по этой инфекции [12]. По данным Роспотребнадзора, в 2021 году в Российской Федерации было зарегистрировано 94 случая малярии (0,06 на 100 тыс.), в 2022 году - 113 случаев (00,8 на 100 тыс.), завезенных из стран Африки, Юго-Восточной Азии, Южной Америки [16]. Однако, по мнению экспертов, реальные показатели завоза малярии в нашу страну значительно выше, что связано с особенностями выявления и регистрации случаев заболевания [1]. Самолечение и связанный с отсутствием государственной регистрации дефицит современных противомалярийных

препаратов служат предпосылками для тяжелого течения малярийной инфекции с летальным исходом [13].

Смертность при малярии в основном связана с тропической формой заболевания, вызываемой Plasmodium falciparum (W. H Welch, 1897). Для тропической малярии при несвоевременно начатом адекватном этиотропном лечении характерно злокачественное течение и тяжелые осложнения [125]. К осложнениям тропической малярии относится малярийная кома, малярийный алгид, возникающий на фоне нарушения гемодинамики, инфекционно -токсических шок, сопровождающийся прогрессивным падением давления до 80/40 мм^ и ниже, гемоглобинурийная лихорадка и, наконец, острая почечная недостаточность, нередко приводящие к гибели неиммунных лиц, которые заразились возбудителем тропической малярии при посещении эндемичных регионов [6].

Одним из основных препятствий к снижению заболеваемости и летальности является широкое распространение P. falciparum, устойчивого к действию противомалярийных лекарственных препаратов [89]. Практически во всех регионах, эндемичных по тропической малярии, регулярно регистрируются штаммы возбудителя, резистентные к наиболее часто используемым противомалярийным препаратам: хинину, хлорохину, сульфадоксину-пириметамину и мефлохину [18]. В последние годы появились данные о формировании резистентности P. falciparum к артемизинину и его производным, а также о снижении эффективности комбинированной терапии на основе этого препарата. Вначале об этой проблеме сообщили в субрегионе Большого Меконга, затем в Папуа-Новой Гвинее, Гайане и странах Африки к югу от Сахары [21, 57, 110].

Сложность морфологической идентификации резистентных паразитов на фоне приема недостаточно эффективных лекарственных препаратов часто приводит к быстрому осложнению заболевания [1]. В связи с этим ранняя диагностика лекарственной резистентности P. falciparum рассматривается в

качестве одного из основных направлений предупреждения злокачественного течения тропической малярии [13].

Длительное время лекарственная чувствительность P. falciparum оценивалась по эффективности специфической этиотропной терапии на основании прямого микроскопического обнаружения малярийных паразитов и их элиминации из крови на фоне приема противомалярийных препаратов [126]. Нередко данный метод требует продолжительного клинического наблюдения, не учитывает влияния специфического иммунитета, индивидуальных особенностей фармакокинетики и метаболизма лекарственных препаратов. Эти недостатки, а также ограниченная чувствительность микроскопии, исключают возможность оперативного подбора наиболее эффективной схемы специфической терапии.

Перспективным методом оценки эффективности лекарственных препаратов служит выявление молекулярно-генетических маркеров лекарственной устойчивости инфекционных агентов. Для выявления однонуклеотидных полиморфизмов P. falciparum широкое распространение получила технология полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ее модификация - ПЦР в реальном времени обладает рядом преимуществ и позволяет получать результаты в течение нескольких часов. Однако на отечественном фармацевтическом рынке отсутствуют тест-системы на основе ПЦР для диагностики малярии. В связи с этим разработка надежных лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентности P. falciparum рассматривается в качестве актуального направления повышения эффективности специфической этиотропной терапии и предупреждения осложнений тропической малярии.

Цель исследования

Совершенствование ранней диагностики лекарственно -устойчивой тропической малярии на основе разработки метода выявления генетических маркеров лекарственной резистентности P. falciparum с использованием технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Задачи исследования

1. На основании литературных данных определить гены P. falciparum, ассоциированные с лекарственной устойчивостью паразитов, выявить наиболее перспективные для диагностической оценки однонуклеотидные полиморфизмы и оценить их связь с устойчивостью плазмодиев к основным этиотропным лекарственным препаратам.

2. Оценить информативность различных маркеров лекарственной резистентности P. falciparum на материале от жителей регионов, эндемичных по тропической малярии.

3. На основе ПЦР в реальном времени разработать мультиплексные тест-системы для ранней диагностики лекарственно-устойчивой тропической малярии, оптимизировать условия проведения реакций, оценить чувствительность и специфичность разработанных методов, определить критерии интерпретации полученных результатов.

4. Провести анализ эффективности применения разработанных тест-систем для оценки лекарственной резистентности P. falciparum в клиническом материале, оценить распространение лекарственной устойчивости к основным противомалярийным препаратам в случаях завозной тропической малярии.

Научная новизна

1. Впервые на основе технологии ПЦР с использованием альтернативных праймеров и рестрикционного анализа разработаны методики выявления наиболее распространенных маркеров лекарственной устойчивости P. falciparum.

2. Впервые в Российской Федерации разработаны варианты мультиплексной ПЦР в реальном времени для диагностики лекарственно устойчивой тропической малярии.

3. С помощью разработанных вариантов ПЦР в реальном времени проведена оценка устойчивости P. falciparum к действию основных противомалярийных препаратов.

4. Выдвинуто и обосновано положение о том, что лекарственная устойчивость малярийных плазмодиев служит одним из ведущих факторов, приводящих к развитию осложнений тропической малярии.

Практическое значение работы

1. Доказана информативность результатов и целесообразность практического использования разработанных вариантов ПЦР в реальном времени для выявления генетических маркеров лекарственной резистентности P. falciparum в оценке эффективности специфической этиотропной терапии завозной тропической малярии.

2. Обоснована методика начала лечения завозных случаев тропической малярии сразу с применения наиболее эффективных комбинированных препаратов, включающих лекарственные средства с различными механизмами фармакологического действия; проведение монотерапии по возможности должно быть ограничено.

Реализация результатов работы

Материалы диссертации вошли в проект методических рекомендаций «Малярия: диагностика, лечение и профилактика в Вооруженных Силах Российской Федерации», представленных на утверждение в ГВМУ МО РФ. Предложенные методики выявления генетических маркеров лекарственной резистентности P. falciparum использованы при выполнении НИР №VMA-01.03.-2426/0030 «Изучение фазовых (сезонных) генетических преобразований вирулентности и лекарственной резистентности Plasmodium falciparum в организме переносчиков комаров рода Anopheles» (Шифр «Эколан- М 1.1»), утвержденной Начальником ГВМУ МО РФ 6.10.2023 г.

Разработанные тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени по определению лекарственной устойчивости Plasmodium falciparum к препаратам хинолинового ряда, производным артемизинина и

пириметамина внедрены в работу Южного отделения Совместного Российско-Вьетнамского Тропического научно-исследовательского и технологического центра (Тропический центр, Хошимин, Вьетнам) (Акт внедрения от 6.11.2024 г.)

Методические рекомендации по лабораторной диагностике лекарственно -устойчивой тропической малярии внедрены в учебный процесс работы кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний), кафедры общей и военной эпидемиологии, а также на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих научных форумах: LXXXIV научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины-2023» (Санкт-Петербург, 2023); 96-я Всероссийская научно-практическая конференция студенческого научного общества с международным участием «Мечниковские чтения-2023» (Санкт-Петербург: Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова 26-27 апреля 2023 года); Х Всероссийская междисциплинарная научно-практическая конференция с международным участием «Социально значимые и особо опасные инфекционные заболевания» (Сочи, 07-10 ноября 2023 года); VII международная конференция молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов в рамках площадки открытых коммуникаций 0репВю-2020 (Наукоград Кольцово, 2020 год); XLVШ межвузовская студенческая конференция, посвященная 137-летию со дня рождения академика Е.Н. Павловского «Актуальные проблемы биологии и медицинской паразитологии» (Санкт-Петербург, 16 марта 2021 года); Всероссийская ежегодная научно-практическая конференция «Нерешенные вопросы этиотропной терапии актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 05-06

декабря 2022 года; Санкт-Петербург, 07-08 декабря 2023 года; Санкт-Петербург, 12-13 декабря 2024 года).

Положения, выносимые на защиту

1. Для возбудителей тропической малярии характерно разнообразие молекулярно-генетических механизмов формирования лекарственной резистентности; генетические маркеры устойчивости к одним и тем же лекарственным препаратам отличаются у штаммов P. falciparum, распространенных в разных географических регионах.

2. Разработанные варианты ПЦР в реальном времени характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью и могут быть использованы с целью выявления генетических маркеров лекарственной устойчивости P. falciparum у больных завозной тропической малярией.

3. Структура завозной тропической малярии характеризуются высокой частотой встречаемости возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью к основным противомалярийным препаратам (хлорохин, мефлохин, пириметамин, артемизинин).

Степень достоверности результатов исследования

Достоверность результатов исследования подтверждается результатами статистической обработки полученных данных с использованием адекватных методов и принципов статистического анализа.

Методология и методы исследования

Методология исследования включала в себя оценку эффективности разработанных тест-систем на основе технологии ПЦР для ранней диагностики лекарственно-устойчивой тропической малярии и мониторинга противомалярийного лечения. Исследование выполнено с соблюдением

принципов доказательной медицины (отбор пациентов и групп сравнения, статистическая обработка результатов). Работа выполнена в дизайне контролируемого исследования с использованием молекулярно-генетических, инструментальных, лабораторных и статистических методов исследования.

Личный вклад автора

Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора. Автором лично проведен анализ литературы по теме диссертационного исследования, глубина выборки составила 15 лет, разработан дизайн исследования, подобраны и изучены маркеры лекарственной устойчивости P. falciparum. Автором лично выполнен дизайн праймеров и зондов для различных методик ПЦР, исследованы пробы, обработаны и обобщены полученные результаты, проведен их статистический анализ, разработаны критерии интерпретации полученных данных, сформулированы выводы, разработаны и обоснованы практические рекомендации.

Соответствие диссертации паспорту специальности

Научные положения и результаты диссертации соответствуют формуле и области исследований научной специальности 3.3.8. Клиническая лабораторная диагностика (а именно пунктам 3, 10 и 11 паспорта научной специальности).

Публикации

По результатам работы опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, подана заявка на изобретение: №2641060.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2010») и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные данные, обсуждение, выводы. Диссертация иллюстрирована 6 рисунками, включает 23 таблицы, 11 приложений. Список литературы включает 132 источника, в том числе 17 отечественных и 115 зарубежных.

Степень разработанности

К настоящему времени накопилось достаточно исследований, посвященных молекулярной диагностике малярии [75, 51]. Однако встречаются лишь единичные работы по ранней диагностике лекарственно-устойчивой тропической малярии и оценке эффективности специфической этиотропной терапии лечения [58, 67]. При этом не существуют отечественных тест-систем для выявления молекулярно-генетических маркеров лекарственной устойчивости P. falciparum, пригодных для оценки эффективности противомалярийного лечения.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клеточные и молекулярно-генетические особенности биологии

Plasmodium falciparum

Plasmodium falciparum - вид простейших паразитов из рода Plasmodium, возбудитель тропической малярии, опасного и широко распространённого паразитарного заболевания. Плазмодии обладают множеством жизненных форм, размеры которых варьируют от 1,5 мкм (мерозоит) до 80 мкм (оокинета), и претерпевают непрерывные изменения на протяжении всего жизненного цикла [72].

Помимо структур, характерных для других одноклеточных паразитов, в строении эритроцитарных форм P. falciparum выделяются специфические образования. Мембранный органоид апикопласт (видоизмененная двумембранная пластида) участвует в синтезе липидов, предшественников изопреноидного ряда — изопентенилпирофосфата и диметилаллилпирофосфата [66, 131]. Кроме того, описаны расщелины Маурера, представляющие собой структуры, секретирующие белки и ферменты, которые обеспечивают усвоение необходимых питательных веществ паразитарной клеткой и уклонения от факторов клеточного и гуморального иммунитета хозяина [68].

Развитие P. falciparum происходит со сменой хозяев и сопровождается чередованием бесполых и половых стадий развития. Окончательным хозяином плазмодиев служат 70 из более 460 видов комаров рода Anopheles [83]. В желудке самки комара, поглощающей паразитов с кровью больного человека, происходит половое размножение плазмодиев. В организме человека паразиты размножаются бесполым путем [80, 83].

Спорозоиты P. falciparum, скапливающиеся в слюнных железах зараженной самки комара, проникают в организм человека в процессе кровососания [76]. С током крови паразиты попадают в печень, где в течение 1-2 недель развиваются, размножаясь посредством множественного деления. После завершения тканевой

шизогонии из печени в кровь выделяются тысячи мерозоитов [55]. Вновь появившиеся бесполые формы P. falciparum размножаются, проходя стадии мерозоита, трофозоита, шизонта и повторяя циклы эритроцитарной шизогонии каждые 48 часов. По мере увеличения численности паразитарной популяции в крови, часть плазмодиев перестает делиться и переходит на этапы гаметогонии, трансформируясь в половые формы. Микро- и макрогаметоциты (незрелые мужские и женские половые клетки) в результате трансмиссии попадают в желудок самки комара, где происходит половое размножение паразитов. Микрогаметоциты в течение 15 мин в результате эксфлагелляции каждого из них формируют по 8 мелких снабженных жгутиками подвижных клеток (бичей). Макрогаматоциты увеличивают размеры, приобретая способность к половому процессу. Созревшие половые клетки копулируют между собой, образуя диплоидную зиготу [104]. При этом возможна копуляция между собой мужских и женских половых клеток как одной генерации паразитов, так с плазмодиями других штаммов, попавших в организм самки в процессе предыдущих кровососаний на других прокормителях. Тем самым обеспечивается обмен генетической информацией и объединение генофонда паразитарной популяции. Образующаяся в результате копуляции зигота трансформируется в подвижную оокинету, которая, проникнув под наружную оболочку стенки желудка комара, теряет подвижность и превращается в ооцисту. После 10-11 циклов деления ооциста формирует синцитиальную клетку (споробласт), внутри которого посредством мейоза с последующей спорогонией образуется около 3000 гаплоидных спорозоитов [95]. Разрывая оболочку спороцисты, спорозоиты разносятся гемолимфой, скапливаются в слюнных железах насекомого, где, дозревая, приобретают инвазионную способность [54].

Сложный жизненный цикл паразитов и их непрерывная изменчивость обеспечивается последовательным скоординированным функционированием сложноорганизованного наследственного материала. Геном P. falciparum, объемом около 24 Мб, до 80% которого представлено АТ н.п., организован в 14 хромосом и включает более 5300 генов, объединенных в семейства (комплексы). В настоящее время изучены наиболее вариабельные, расположенные в субтеломерных областях

хромосом три семейства генов, обеспечивающие высокую антигенную изменчивость паразитов. Среди них комплекс var, объединяющий 59 генов, а также rif и stevor, включающие 149 и 28 генов соответственно. Установлено, что около 10% ядерного генома P. falciparum кодируют структуру более 550 полипептидов, участвующих в формировании белков апикопласта. Около 4,7% протеома паразита кодируются митохондриальным геномом [51].

В организме человека персистируют только гаплоидные (n) стадии цикла развития P. falciparum. Диплоидной (2n) становится зигота плазмодия, образующаяся в желудке комара после слияния гамет. Зигота подвергается еще одному раунду репликации хромосом, образуя оокинету (4 n), трансформирующуюся в ооцисту, внутри которой в результате мейоза с последующей спорогонией формируются гаплоидные (n) спорозоиты [56].

1.2. Патогенез и особенности клинического течения тропической малярии

Ведущие патогенетические механизмы при тропической малярии обусловлены изменением свойств пораженных эритроцитов, что приводит к их массивному гемолизу, а также с возникновением токсико-аллергических реакций в ответ на поступление в плазму крови продуктов метаболизма P. falciparum. Наиболее распространенными клиническими симптомами falciparum-малярии являются лихорадка (>92% случаев), озноб (79%), головные боли (70%) и потливость (64%). Помимо этого, отмечается головокружение, недомогание, мышечная боль, боль в животе, тошнота, рвота, легкая диарея и сухой кашель. Также диагностируется высокая частота сердечных сокращений, желтуха, бледность, ортостатическая гипотензия, увеличение печени и селезенки [114].

Нерастворимые кристаллы в-гематина, гемозоин, образующиеся в результате переваривания паразитами гемоглобина, являются основным агентом, оказывающим токсическое воздействие на организм. Инфицированные эритроциты, содержащие гемозоин, остаются недоступными для факторов клеточного и гуморального иммунитета [33]. Фагоциты могут поглощать только

свободные гранулы гемозоина, высвобождающиеся после разрыва эритроцитов, инициируя тем самым воспалительные реакции, которые приводят к повышению температуры [34, 119]. Гемозоин откладывается в тканях селезенки, печени, почек и легких, вызывая их увеличение и изменение цвета [39, 84].

В отличие от других форм заболевания, несмотря на 48-часовой цикл эритроцитарной шизогонии, тропическая малярия обычно проявляется нерегулярными приступами лихорадки. Это различие обусловлено способностью мерозоитов P. falciparum проникать в большое количество эритроцитов последовательно, без скоординированных интервалов, что нехарактерно для других патогенных видов плазмодиев.

Тропическая малярия отличается злокачественным течением, сопровождающимся развитием осложнений, приводящих к летальному исходу. Осложненная малярия чаще встречается у детей в возрасте до 5 лет, у беременных женщин, а также у неиммунных лиц, впервые инфицированных P. falciparum [81].

К особенностям патогенеза тяжелых форм тропической малярии относятся процессы розеттинга, то есть, формирования конгломератов пораженных плазмодием эритроцитов с интактными, а также адгезии инфицированных эритроцитов на поверхности эндотелия капилляров [9, 113]. Указанные процессы вызывают тромбоз мелких сосудов и приводят секвестрации тканей жизненно важных органов, чаще головного мозга [41]. Патогенез тропической малярии включает молекулярно-генетические механизмы, связанные с выделением P. falciparum различных белков, к которым, в частности, относятся KAHRP, HSP40, MAHRP1, MAHRP2, REX3 и т.д. Наиболее важный экспортируемый белок PfEMP1 (эритроцитарный мембранный протеин) служащий главным фактором вирулентности P. falciparum, локализован на поверхности мембран пораженных малярийным плазмодием эритроцитов. Он характеризуется повышенным сродством к основным клеточным рецепторам, в частности, к ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), CD36, CR и др. [11, 15, 45, 129]. Связываясь со специфическими клеточными рецепторами, белок PfEMP1 формирует патологические контакты пораженных плазмодием эритроцитов со здоровыми

клетками, в результате чего развивается розеттинг, адгезия и секвестрация [128]. Транспорт белков малярийного плазмодия из эритроцита обеспечивается выпячиваниями мембраны паразитофорной вакуоли - так называемыми расщелинами Маурера [2, 7]. Будучи высокомобильными структурами, они быстро перемещаются на ранних этапах развития паразитов, обеспечивая транспортировку PfEMP1 в мембрану эритроцита.

В связи с вышеописанными особенностями патогенеза, продолжительность заболевания у жителей эндемичных регионов, не проходящих этиотропную терапию, может достигать 1,5 лет, в то время как у неиммунных лиц тропическая малярия, как правило, завершается летально в короткие сроки.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ для лечения неосложненной тропической малярии применяются пероральные препараты, действующие на эритроцитарные стадии развития плазмодиев. При тяжелом течении проводится парентеральное введение наиболее эффективных лекарственных средств с различными механизмами фармакологического действия. В случаях лекарственной устойчивости паразитов используются схемы лечения тяжелых форм заболевания [45, 124].

1.3. Противомалярийные препараты и механизмы их действия

В настоящее время используются противомалярийные препараты, относящиеся к различным фармакологическим группам, которые отличаются избирательным действием на основные метаболические пути P. falciparum. Данные препараты оказывают воздействие на различные стадии жизненного цикла плазмодия, вызывая либо гибель, либо прекращение его дальнейшего развития.

Хинин, кинимакс и мефлохин, так же, как и хлорохин (производное 4-аминохинолина), связывают метаболиты гематина, в результате чего инактивируются глутатионтрансфераза малярийного плазмодия, что приводит к блокировке ключевых ферментов, которые обеспечивают превращение гематина в гемозоин. Вследствие этого прерывается процесс расщепления гемоглобина в

пищеварительной вакуоли P. falciparum. Диаминопиримидины (пириметамин, сульфадоксин) участвуют в блокировке ферменты фолатного пути синтеза нуклеиновых кислот в цитоплазме малярийного плазмодия, поскольку они связывают и конкурентно замещают дигидроптероатсинтазу и дигидрофолатредуктазу малярийного плазмодия [45]. Механизм действия атоваквона и других антибиотиков связан с разобщением биологического окисления с фосфорилированием в митохондриях паразита. Они ингибируют НАДН-дегидрогенау II типа и блокируют цитохромоксидазный комплекс во внутренней мембране митохондрий в результате конкурентного замещения цитохрома b [77]. Антибиотики тетрациклинового ряда (доксициклин) и группы линкозамидов (клиндамицин) конкурентно замещают и ингибируют синтазы жирных кислот II типа [36, 69]. Таким образом, они нарушают метаболизм жирных кислот, которые используются для синтеза мембран апикопласта возбудителя малярии. Производные артемизинина (артемизинин, артесунат, артеметер) отличаются множественным механизмом фармакологического действия. Механизм образования свободных радикалов, повреждающих АТФ-азный Ca2+-насос в мембранах эндоплазматического ретикулума, блокирует фолдинг белков P. falciparum, в связи с чем ингибируется транспортная система белка экспортера -PfEXPl. В результате происходит нарушение транспорта вирулентных пептидов возбудителя малярии в клеточные структуры пораженного им эритроцита [52]. Также следует отметить нарушение мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов по причине блокировки фосфатидилинозитол-3-киназы [64]. В конечном итоге, происходит нарушение энергетического обмена P. falciparum, что приводит к его гибели.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Арюков Артем Русланович, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексина Д. Д., Иванова Л. В. ТРУДНОСТИ ДИАГНОСТИКИ МАЛЯРИИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ //Медико-биологические, клинические и социальные вопросы здоровья и патологии человека. - 2022. - С. 102-105.

2. Баранова А. М., Гузеева Т. М., Морозова Л. Ф. СЛУЧАИ СМЕРТЕЛЬНЫХ ИСХОДОВ ОТ ТРОПИЧЕСКОЙ МАЛЯРИИ В РОССИИ (20092012 ГГ.) //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2013. - №. 3. -С. 50-52.

3. Горностаева Р. М., Данилов А. В. Об ареалах малярийных комаров (Diptera, Culicidae: Anopheles) комплекса maculipennis на территории России //Паразитология. - 2002. - Т. 36. - №. 1. - С. 33-47.

4. Гржибовский А. М. Анализ номинальных данных (независимые наблюдения) //Экология человека. - 2008. - №. 6. - С. 58-68.

5. Достижения в области химиотерапии малярии / Докл. науч. группы ВОЗ: Сер. техн. докл. (ВОЗ, 711). - М.: Медицина, 1986. - 212 с

6. Инфекционные болезни: национальное руководство / под ред. Н. Д. Ющука, Ю. Я. Венгерова - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2023. - 1104 с. (Серия "Национальные руководства) - ISBN 978-5-9704-4912-7

7. Коваленко А. Н. и др. Сложности терапии P. falciparum-малярии в Российской Федерации //Терапевтический архив. - 2019. - Т. 91. - №. 11. - С. 7580.

8. Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов: Методические указания. —М.: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора,— 43 с

9. Лысенко А.Я., Кондрашин А.В., Ежов М.Н. Маляриология. 2-е изд. Копенгаген: Всемирная организация здравоохранения. Европейское региональное бюро; 2003. 510 с.

10. Методические рекомендации по профилактике, диагностике и лечению малярии в Вооруженных Силах Российской Федерации. - М: ГВМУ. - 2019. - 92 с.

11. Сергиев В.П. и др. Проблемы клинической диагностики и лечения P. falciparum-малярии в Российской Федерации //Терапевтический Архив - 2018. - Т. 90. - №. 11. - С. 4-8.

12. Соловьев А. И. и др. Противоэпидемическая защита военнослужащих от малярии в условиях Юго-Восточной Азии (к 15-летию гуманитарной операции по ликвидации последствий цунами на территории Индонезии) //Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2020. - №. 2. - С. 157-163.

13. Токмалаев А. К. и др. Лечение осложнённой малярии (возбудитель Plasmodium falciparum) у взрослых: обзор национальных руководств и их соответствие рекомендациям Всемирной организации здравоохранения //Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2023. - Т. 28. - №. 4. - С. 230.

14. Токмалаев А. К., Баранова А. М., Малеев В. В. Эпидемиологические и клинические аспекты диагностики, лечения и профилактики завозных случаев малярии в Российской Федерации //Терапевтический архив. - 2020. - Т. 92. - №. 11. - С. 77-81.

15. Усков А. Н. И др. Молекулярно-генетические механизмы вирулентности plasmodium falciparum и патогенеза тропической малярии //Журнал инфектологии. - 2018. - Т. 10. - №. 3. - С. 23-29.

16. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: офиц. сайт. Москва. Обновляется в течение суток. URL: https ://82.rospotrebnadzor.ru/directions/sanoxrana/149911/ print/?ysclid=m63f4odd3p152734148 (дата обращения: 19.01.2025).

17. Химиотерапия малярии и устойчивость к противомалярийным препаратам: Докл.науч.группы ВОЗ / Сер.техн.докл. (ВОЗ; 529). - М.: Медицина, 1975. - 145 с

18. Achan J. et al. Quinine, an old anti-malarial drug in a modern world: role in the treatment of malaria //Malaria journal. - 2011. - Vol. 10. - P. 1-12.

19. Apte A., Daniel S. PCR primer design //Cold Spring Harbor Protocols. -2009. - Vol. 2009, N 3. - P. pdb. ip65.

20. Arnou B. et al. The Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase PFATP6: insensitive to artemisinin, but a potential drug target. - 2011.

21. Balikagala B. et al. Evidence of artemisinin-resistant malaria in Africa //New England Journal of Medicine. - 2021. - Vol. 385, N 13. - C. 1163-1171.

22. Ballabio A. et al. Screening for steroid sulfatase (STS) gene deletions by multiplex DNA amplification //Human genetics. - 1990. - Vol. 84. - P. 571-573.

23. Bereczky S. et al. Rapid DNA extraction from archive blood spots on filter paper for genotyping of Plasmodium falciparum //American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. - 2005. - T. 72, N 3 - P. 249-251.

24. Bereczky S. et al. Rapid DNA extraction from archive blood spots on filter paper for genotyping of Plasmodium falciparum //American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. - 2005. - T. 72, N 3. - C. 249-251..

25. Bertaux L. et al. New Pf ATP6 mutations found in Plasmodium falciparum isolates from Vietnam //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2009. - T. 53, N 10. - P. 4570-4571.

26. Berzosa P. et al. Profile of molecular mutations in pfdhfr, pfdhps, PfMDR1, and PfCRT genes of Plasmodium falciparum related to resistance to different antimalarial drugs in the Bata District (Equatorial Guinea) //Malaria Journal. - 2017. - Vol. 16. - P. 1-10.

27. Broccanello C. et al. Comparison of three PCR-based assays for SNP genotyping in plants //Plant methods. - 2018. - Vol. 14. - P. 1-8.

28. Bwire G. M., Mikomangwa W. P., Kilonzi M. Occurrence of septuple and elevated Pfdhfr-Pfdhps quintuple mutations in a general population threatens the use of sulfadoxine-pyrimethamine for malaria prevention during pregnancy in eastern-coast of Tanzania //BMC Infectious Diseases. - 2020. - Vol. 20. - P. 1-5.

29. Chamberlain J. S. et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification //Nucleic acids research. - 1988. - Vol. 16, N 23. - P. 11141-11156.

30. Cheng Y. H. Estimation of teaching-learning-based optimization primer design using regression analysis for different melting temperature calculations //IEEE transactions on nanobioscience. - 2014. - Vol. 14, N 1. - P. 3-12.

31. Chitnumsub P. et al. The structure of Plasmodium falciparum hydroxymethyldihydropterin pyrophosphokinase-dihydropteroate synthase reveals the basis of sulfa resistance //The FEBS Journal. - 2020. - Vol. 287, N 15. - P. 3273-3297.

32. Chou A. C., Chevli R., Fitch C. D. Ferriprotoporphyrin IX fulfills the criteria for identification as the chloroquine receptor of malaria parasites //Biochemistry. - 1980.

- Vol. 19, N 8. - P. 1543-1549.

33. Corbett Y. et al. Phagocytosis and activation of bone marrow-derived macrophages by Plasmodium falciparum gametocytes //Malaria Journal. - 2021. - Vol. 20. - P. 1-10.

34. Coronado L. M., Nadovich C. T., Spadafora C. Malarial hemozoin: from target to tool //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 2014. - Vol. 1840, N 6. - P. 2032-2041.

35. Cowman A. F. et al. Amino acid changes linked to pyrimethamine resistance in the dihydrofolate reductase-thymidylate synthase gene of Plasmodium falciparum //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1988. - Vol. 85, N 23. - P. 91099113.

36. Dahl E. L. et al. Tetracyclines specifically target the apicoplast of the malaria parasite Plasmodium falciparum //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2006. - Vol. 50, N 9. - P. 3124-3131.

37. Dahm R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA //Developmental biology. - 2005. - Vol. 278, N 2. - P. 274-288.

38. Daniels R. et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking //Malaria journal. - 2008. - Vol. 7. - P. 1-11.

39. Deroost K. et al. Improved methods for haemozoin quantification in tissues yield organ-and parasite-specific information in malaria-infected mice //Malaria journal.

- 2012. - Vol. 11. - P. 1-11.

40. Devyatkin V. A. et al. Allele-specific PCR with fluorescently labeled probes: criteria for selecting primers for genotyping //Vavilov Journal of Genetics and Breeding. - 2024. - Vol. 28, N 3. - P. 351.

41. Dondorp A. M., Pongponratn E., White N. J. Reduced microcirculatory flow in severe falciparum malaria: pathophysiology and electron-microscopic pathology //Acta tropica. - 2004. - Vol. 89, N 3. - P. 309-317.

42. Dooley J. J. et al. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays //Meat science. - 2004. - Vol. 68, N 3. - P. 431-438.

43. Ecker A. et al. PfCRT and its role in antimalarial drug resistance //Trends in parasitology. - 2012. - Vol. 28, N 11. - P. 504-514.

44. Elnifro E. M. et al. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology //Clinical microbiology reviews. - 2000. - Vol. 13, N 4. - P. 559570.

45. Fairhurst R. M., Wellems T. E. Malaria (plasmodium species) //Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. - WB Saunders, 2015. - P. 3070-3090. e9.

46. Färnert A. et al. Sampling and storage of blood and the detection of malaria parasites by polymerase chain reaction //Transactions of the royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. - 1999. - Vol. 93, N 1. - P. 50-53.

47. Ferdig M. T. et al. Dissecting the loci of low-level quinine resistance in malaria parasites //Molecular microbiology. - 2004. - Vol. 52, N 4. - P. 985-997.

48. Ferreira P. E. et al. PfMDR1: mechanisms of transport modulation by functional polymorphisms //PLoS One. - 2011. - Vol. 6, N 9. - P. e23875.

49. Fidock D. A. et al. Mutations in the P.falciparum digestive vacuole transmembrane protein PfCRT and evidence for their role in chloroquine resistance //Molecular cell. - 2000. - Vol. 6, N 4. - P. 861-871.

50. Fisher N. et al. Cytochrome b mutation Y268S conferring atovaquone resistance phenotype in malaria parasite results in reduced parasite bc1 catalytic turnover and protein expression //Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 287, N 13. - P. 9731-9741.

51. Fitri L. E. et al. Malaria diagnostic update: From conventional to advanced method //Journal of Clinical Laboratory Analysis. - 2022. - Vol. 36, N 4. - P. e24314..

52. Gardner M. J. et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum //Nature. - 2002. - Vol. 419, N 6906. - P. 498-511.

53. Daniyan M. O., Przyborski J. M., Shonhai A. Partners in mischief: functional networks of heat shock proteins of Plasmodium falciparum and their influence on parasite virulence //Biomolecules. - 2019. - Vol. 9, N 7. - P. 295.

54. Gaudet M. et al. Allele-specific PCR in SNP genotyping //Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. - 2009. - P. 415-424.

55. Gerald N., Mahajan B., Kumar S. Mitosis in the human malaria parasite Plasmodium falciparum //Eukaryotic cell. - 2011. - Vol. 10, N 4. - P. 474-482.

56. Guttery D. S. et al. Meiosis in Plasmodium: how does it work? //Trends in parasitology. - 2023.

57. Hamilton W. L. et al. Evolution and expansion of multidrug-resistant malaria in southeast Asia: a genomic epidemiology study //The Lancet Infectious Diseases. -2019. - Vol. 19, N 9. - P. 943-951.

58. Hanboonkunupakarn B., White N. J. Advances and roadblocks in the treatment of malaria //British journal of clinical pharmacology. - 2022. - Vol. 88, N 2. -P. 374-382.

59. Hayden M. J. et al. Multiplex-ready PCR: a new method for multiplexed SSR and SNP genotyping //BMC genomics. - 2008. - Vol. 9. - P. 1-12.

60. Holmes F. L. Meselson, Stahl, and the replication of DNA: a history of" The most beautiful experiment in biology". - Yale University Press, 2008.

61. Howell W. M. et al. Dynamic allele-specific hybridization //Nature biotechnology. - 1999. - Vol. 17, N 1. - P. 87-88.

62. Juma D. W. Molecular monitoring of PfATPase6 single nucleotide polymorphism (SNPs) in relation to artemisinin resistance in Western Kenya : gnc. -2013.

63. Kalendar R. et al. Designing allele-specific competitive-extension PCR-based assays for high-throughput genotyping and gene characterization //Frontiers in molecular biosciences. - 2022. - Vol. 9. - P. 773956.

64. Ke H. et al. Mitochondrial type II NADH dehydrogenase of Plasmodium falciparum (PfNDH2) is dispensable in the asexual blood stages //PLoS One. - 2019. -Vol. 14, N. 4. - P. e0214023.

65. Kim S., Misra A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications //Annu. Rev. Biomed. Eng. - 2007. - Vol. 9, N 1. - P. 289-320.

66. Kuske C. R. et al. Small-scale DNA sample preparation method for field PCR detection of microbial cells and spores in soil //Applied and Environmental Microbiology. - 1998. - Vol. 64, N 7. - P. 2463-2472.

67. Landier J. et al. The role of early detection and treatment in malaria elimination //Malaria Journal. - 2016. - Vol. 15. - P. 1-8.

68. Lanzer M. et al. Maurer's clefts: a novel multi-functional organelle in the cytoplasm of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes //International journal for parasitology. - 2006. - Vol. 36, N 1. - P. 23-36.

69. Lim L., McFadden G. I. The evolution, metabolism and functions of the apicoplast //Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. -2010. - Vol. 365, N 1541. - P. 749-763.

70. Lisewski A. M. et al. Potential role of Plasmodium falciparum exported protein 1 in the chloroquine mode of action //International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. - 2018. - Vol. 8, N 1. - P. 31-35.

71. Lisewski A. M. et al. Supergenomic network compression and the discovery of EXP1 as a glutathione transferase inhibited by artesunate //Cell. - 2014. - Vol. 158, N 4. - P. 916-928.

72. Lucius R., Loos-Frank B., Lane R.P., Poulin R., Roberts C., Grencis R.K. Biology of parasitic Protozoa [Текст] / Lucius R., Loos-Frank B., Lane R.P., Poulin R., Roberts C., Grencis R.K. — 2-издание. — Weinheim: John Wiley & Sons, 2017 — 472 c.

73. M. W. et al. Genome structure and gene content in protist mitochondrial DNAs //Nucleic acids research. - 1998. - Vol. 26, N 4. - P. 865-878.

74. MacPherson J. M. et al. Variability of the random amplified polymorphic DNA assay among thermal cyclers, and effects of primer and DNA concentration //Molecular and Cellular Probes. - 1993. - Vol. 7, N 4. - P. 293-299.

75. Mbanefo A., Kumar N. Evaluation of malaria diagnostic methods as a key for successful control and elimination programs //Tropical medicine and infectious disease. - 2020. - Vol. 5, N 2. - P. 102.

76. Menard R. et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity //Nature Reviews Microbiology. - 2013. - Vol. 11, N 10. - P. 701-712.

77. Menemedengue V. et al. Molecular epidemiology of malaria in Cameroon. XXX. sequence analysis of Plasmodium falciparum ATPase 6, dihydrofolate reductase, and dihydropteroate synthase resistance markers in clinical isolates from children treated with an artesunate-sulfadoxine-pyrimethamine combination //The American journal of tropical medicine and hygiene. - 2011. - Vol. 85, N 1. - P. 22.

78. Meudt H. M., Clarke A. C. Almost forgotten or latest practice? AFLP applications, analyses and advances //Trends in plant science. - 2007. - Vol. 12, N 3. -P. 106-117.

79. Miotto O. et al. Genetic architecture of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum //Nature genetics. - 2015. - Vol. 47, N 3. - P. 226-234.

80. Molina-Cruz A. et al. Mosquito vectors and the globalization of Plasmodium falciparum malaria //Annual review of genetics. - 2016. - Vol. 50, N 1. - P. 447-465.

81. Moya-Alvarez V., Abellana R., Cot M. Pregnancy-associated malaria and malaria in infants: an old problem with present consequences //Malaria journal. - 2014. - Vol. 13. - P. 1-10.

82. Mu J. et al. Multiple transporters associated with malaria parasite responses to chloroquine and quinine //Molecular microbiology. - 2003. - Vol. 49, N 4. - P 977989.

83. Njokah M. J. et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum Pfcrt and Pfmdr1 variants by artemisinin //Malaria Journal. - 2016. - Vol. 15. - P. 1-9.

84. Pek R. H. et al. Hemozoin produced by mammals confers heme tolerance //Elife. - 2019. - Vol. 8. - P. e49503.

85. Perchetti G. A. et al. Multiplexing primer/probe sets for detection of SARS-CoV-2 by qRT-PCR //Journal of Clinical Virology. - 2020. - Vol. 129. - P. 104499.

86. Peterson D. S., Walliker D., Wellems T. E. Evidence that a point mutation in dihydrofolate reductase-thymidylate synthase confers resistance to pyrimethamine in falciparum malaria //Proceedings of the National Academy of sciences. - 1988. - Vol. 85, N 23. - P. 9114-9118.

87. Pickard A. L. et al. Resistance to antimalarials in Southeast Asia and genetic polymorphisms in pfmdr1 //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2003. - Vol. 47, N 8. - P. 2418-2423.

88. Price R. N. et al. Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number //The Lancet. - 2004. - Vol. 364, N 9432. - P. 438447.

89. Qiu D. et al. A G358S mutation in the Plasmodium falciparum Na+ pump PfATP4 confers clinically-relevant resistance to cipargamin //Nature communications. -2022. - Vol. 13, N 1. - P. 5746.

90. Ralph S. A., D'Ombrain M. C., McFadden G. I. The apicoplast as an antimalarial drug target //Drug Resistance Updates. - 2001. - Vol. 4, N 3. - P. 145-151.

91. Rastelli G. et al. Docking and database screening reveal new classes of Plasmodium f alciparum dihydrofolate reductase inhibitors //Journal of Medicinal Chemistry. - 2003. - Vol. 46, N 14. - P. 2834-2845.

92. Raymond C. K. et al. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs //Rna. - 2005. - Vol. 11, N 11. - P. 1737-1744.

93. Reed M. B. et al. Pgh1 modulates sensitivity and resistance to multiple antimalarials in Plasmodium falciparum //Nature. - 2000. - Vol. 403, N 6772. - P. 906909.

94. Riley L. K. et al. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses //Journal of Clinical Microbiology. - 1996. - Vol. 34, N 4. -P. 942-946.

95. Rosenberg R., Rungsiwongse J. The number of sporozoites produced by individual malaria oocysts //The American journal of tropical medicine and hygiene. -1991. - Vol. 45, N 5. - P. 574-577.

96. Saha P. et al. Comparative efficacies of artemisinin combination therapies in Plasmodium falciparum malaria and polymorphism of pfATPase6, PfCRT, pfdhfr, and pfdhps genes in tea gardens of Jalpaiguri District, India //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2012. - Vol. 56, N 5. - P. 2511-2517.

97. Sambrook J., Russell D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform //Cold Spring Harbor Protocols. - 2006. - Vol. 2006, N 1. - P. pdb. prot4455.

98. Sanchez C. P. et al. Transporters as mediators of drug resistance in Plasmodium falciparum //International journal for parasitology. - 2010. - Vol. 40, N 10. - P. 1109-1118.

99. Schmalzing D. et al. Microchip electrophoresis: a method for high-speed SNP detection //Nucleic acids research. - 2000. - Vol. 28, N 9. - P. e43-e43.

100. Schwöbel B. et al. Different mutation patterns of atovaquone resistance to Plasmodium falciparum in vitro and in vivo: rapid detection of codon 268 polymorphisms in the cytochrome b as potential in vivo resistance marker //Malaria journal. - 2003. -Vol. 2. - P. 1-7.

101. Semagn K. et al. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement //Molecular breeding. - 2014. - Vol. 33. - P. 1-14

102. Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future //Nature. -2017. - Vol. 550, N 7676. - P. 345-353.

103. Si K. et al. The structure of Plasmodium falciparum multidrug resistance protein 1 reveals an N-terminal regulatory domain //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2023. - Vol. 120, N 32. - P. e2219905120.

104. Sinden R. E. et al. Gametocyte and gamete development in Plasmodium falciparum //Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. - 1978. - Vol. 201, N 1145. - P. 375-399.

105. Singh B. et al. A genus-and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. - 1999.

106. Singh G. P., Goel P., Sharma A. Structural mapping of Kelch13 mutations associated with artemisinin resistance in malaria //Journal of structural and functional genomics. - 2016. - Vol. 17. - P. 51-56.

107. Srivastava I. K., Rottenberg H., Vaidya A. B. Atovaquone, a broad spectrum antiparasitic drug, collapses mitochondrial membrane potential in a malarial parasite //Journal of Biological Chemistry. - 1997. - Vol. 272, N 7. - P. 3961-3966.

108. Srivastava I. K. et al. Resistance mutations reveal the atovaquone-binding domain of cytochrome b in malaria parasites //Molecular microbiology. - 1999. - Vol. 33, N 4. - P. 704-711.

109. Srivastava I. K., Vaidya A. B. A mechanism for the synergistic antimalarial action of atovaquone and proguanil //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1999. -Vol. 43, N 6. - P. 1334-1339.

110. Stokes B. H., Ward K. E., Fidock D. A. Evidence of artemisinin-resistant malaria in Africa //The New England journal of medicine. - 2022. - Vol. 386, N 14. - P. 1385.

111. Talundzic E. et al. Molecular epidemiology of Plasmodium falciparum kelch13 mutations in Senegal determined by using targeted amplicon deep sequencing //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2017. - Vol. 61, N 3. - P. 10.1128/aac. 02116-16.

112. Tan S. C., Yiap B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present //BioMed Research International. - 2009. - Vol. 2009, N 1. - P. 574398.

113. Tembo D. L. et al. Differential PfEMP1 expression is associated with cerebral malaria pathology //PLoS pathogens. - 2014. - Vol. 10, N 12. - P. e1004537.

114. Trampuz A. et al. Clinical review: Severe malaria //Critical care. - 2003. -Vol. 7. - P. 1-9.

115. Tran T. M. et al. A nested real-time PCR assay for the quantification of Plasmodium falciparum DNA extracted from dried blood spots //Malaria journal. - 2014.

- Vol. 13. - P. 1-8.

116. Triglia T. et al. Mutations in dihydropteroate synthase are responsible for sulfone and sulfonamide resistance in Plasmodium falciparum //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1997. - Vol. 94, N 25. - P. 13944-13949.

117. Turkiewicz A. et al. Genetic diversity of the Plasmodium falciparum GTP-cyclohydrolase 1, dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes reveals new insights into sulfadoxine-pyrimethamine antimalarial drug resistance //PLoS Genetics. - 2020. - Vol. 16, N 12. - P. e1009268.

118. Tyagi S., Kramer F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization //Nature biotechnology. - 1996. - Vol. 14, N 3. - P. 303-308.

119. Tyberghein A. et al. Immunopathological effects of malaria pigment or hemozoin and other crystals //Biofactors. - 2014. - Vol. 40, N 1. - P. 59-78.

120. Veiga M. I. et al. Globally prevalent PfMDR1 mutations modulate Plasmodium falciparum susceptibility to artemisinin-based combination therapies //Nature communications. - 2016. - Vol. 7, N 1. - P. 11553.

121. Venkatesan P. The 2023 WHO World malaria report //The Lancet Microbe.

- 2024. - Vol. 5, N 3. - P. e214.

122. Verdier F. et al. Chloroquine uptake by Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes during in vitro culture and its relationship to chloroquine resistance //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1985. - Vol. 27, N 4. - P. 561-564..

123. Vos P. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting //Nucleic acids research. - 1995. - Vol. 23, N 21. - P. 4407-4414.

124. Wang P. et al. Sulfadoxine resistance in the human malaria parasite Plasmodium falciparum is determined by mutations in dihydropteroate synthetase and an additional factor associated with folate utilization //Molecular microbiology. - 1997. -Vol. 23, N 5. - P. 979-986.

125. White N. J., Chotivanich K. Artemisinin-resistant malaria //Clinical Microbiology Reviews. - 2024. - Vol. 37, N 4. - P. e00109-24.

126. WHO Expert Committee on Malaria et al. WHO Expert Committee on Malaria [meeting held in Geneva from 9 to 17 September 1985]: eighteenth report. -World Health Organization, 1986.

127. Wicht K. J., Mok S., Fidock D. A. Molecular mechanisms of drug resistance in Plasmodium falciparum malaria //Annual review of microbiology. - 2020. - Vol. 74, N 1. - P. 431-454.

128. World Health Organization. Guidelines for the treatment of malaria, 2015. https://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241549127/en

129. World Health Organization. World malaria report 2018. https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2018/report/en/

130. World Health Organization. World malaria report 2023. - World Health Organization, 2023.

131. Yeh E., DeRisi J. L. Chemical rescue of malaria parasites lacking an apicoplast defines organelle function in blood-stage Plasmodium falciparum //PLoS biology. - 2011. - Vol. 9, N 8. - P. e1001138.

132. Zhang J. et al. A multiple-capillary electrophoresis system for smallscale DNA sequencing and analysis //Nucleic Acids Research. - 1999. - Vol. 27, N. 24. - P. e36-e42.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А

Праймеры и ампликоны для рестрикционного анализа

Пряймеы

Название Нуклсотилвой послсдовасслыгос ть Размер (ПН.) Длина ампл икона (п.и.)

рк: кт кт«т

у-тотогтсатотстттааастт -у 21 145

К76Т11 5' СААА^СТАТАСТТАССААТТТТС-3' 23

гшвга мал

ТШУР У- ЛиДСТАССОСТОДАТТАТТТАО -3' 22 417

шбуд Г. ССТОЛАСТСЛСТГСТТСГАЛАТ зг 22

ПЛГОШ N1(1420

N10420? 5'- ОСТС'ГТТСГаОТТАОСАТОСТТ .у 22 404

И1042Б 5'- АОБАТССАААССААГАСОСАА-У 21

Р£МБЕ1 Б1246 V

5'-CTACAGC.AATCGITGGAGA.AA -3: 21 509

Ш346Т к 5'-САОААТДЦСТАТДОСТАОАОС -3' 21

РГОНГК вНИК

ЗК^Р 5' - АТС АТСС; ААС ААСГСТСС С АС -3' 21 507

5'- ААСААСООААССТССТАТААТАА=1АСАТТ -3' 29

РШШ>!$ К5401

К540Е Е 5:-ТСГТАААТСТСАТОССАААССАА-3' 23 34Е

К540Е К 5'- ТОАТСАТОТТТСТТСОС.ДААТСС -3: 23

РШШ'Е!А5735

#786 Р 5'- АТА АОС С АТАГСС А.ААТТОТТС С С -У 14 227

АЗ 783 Я 5'- ТСООООАТАГСАТСаСТСТГС -3' 21

А)

ТОКСТСл КТО ти1ОТАГГШЛМСЛЫТТМООА1АА1ЛТТШАШЛТЛГт™>й1АтШАШ

Б) В)

«■.^етла^&иттСАЛАЛЛТЛЛЛГ.ААГбАйАЛЛЛШСЛГП'ТТТ V. UTt.Tr 1лЛ(Г^.1Г,ТТТГТ^>.ГПЫХТТ( АЛЛОлтЛААГОТ ПАС СОТПЛААТС! ТТТА ССТОСЛС ЛАС ЛТЛйЛАЛЛЛЛПЛГТТЛГл! САТТТ О IТЛЛЛОЛПЛЛЛЦПТТТТЛЛ1ЛС Ы&ЛМХ ЛТТТТА1ААГЛТ ОС ГЛТЛТОГГСГТЛПЛТГАкЮАОС.ЛАСШАСС ГЦ Г! НАГАКТОТОТПООЮ ТШЖЛААШШйАЗМШ(№Л!йЛ1лПЛЛТССМЛЛТлт1СЛ1 ТАИ ГАТ1 ГЛТ«Х.ТТТ «ПАС ААГПАГАТ1Л1 < АА1ЬАТМСАЛОГАТТ&ТЛТ ООЛГвТААПАС АКЛЛЛААГлПАААЛАППААЛОС Г ОЛЛТЛПТАЛ&ЛА ОТОГГТтлТСАЛОАгааАГАлтГАТОЛГЛлГАлГС£Т(ЮАП-ГллАТ1АЛ

ыгаытми лттш/си слмзг&илтсо-у

АГЛГЛЛТТ ЧТ1 ^ЛТТЛГСЛГТТАЛЛАС* АТТЛТТТСТГ»ТААТТТС> Л1ЛиЛЛЛЛЛК"1Л|"Н1Л] шллллмлллс»лслллл\лилл

ОЛАТТАТТЛТАААТГ.Г ЛОГ ТТТАТЛЙЙЙ АТТГ ЛГгТГ АААОГПС Т

с ■ кггтат« [ Т4 а! лип пост «гюогптшиш ггси

V.! ЛЛЛЛСл:.':.л; 1Л1Л! [ЛиИОЛЮЛИ ПЛЮЛЛЛК-С АШАСТШАТАТТ™ Т(Ю1ЛС1ГТАТС 1С7 т\»АЛТ11 ТА АТ17Г Ш Ь ШКЛ^СИГ ¡ С.1С11 )

Г)

1 '^ЛЛСЛСХ.ШСЬТКШОЛЛМ. ЛСКУ ДО1ШАААА1 С А ЛС-ПТТЛЮЛАТС ТСТГЛПЛЛОЛТПТЛГОЛС ТТЦЛЛАЛЛ ТОМ САСАТТА ГЛПЛЛАЛАЛТОЛТЛ! ОЛСЛЛЛПТТСЛЛО ЛП АТС ЛАЛЛ1АА1ЛАТЛЛ1ЛАП1ЛПСЮ] ТТ [ЛЛАЛЛАТ ОТААЛТОААГГТТСАААССААТГГОС.АТГГОГЛСААОА'П лисштлттТЛЛГЛЛ1АЛТСЛЛ(1ЛЛЛ1ЛПЛ] иолтлтл ТТААТАТЛТЦ ГОА7 ЫТААС Т1АЛС1Л1Ц.ЦАИ ПАОАААСТ ТАТГПСЛАГлитоТСЛЛОЛЛС-КГАТОГТЛШЛАТЛГО ГССЛТЛ"|ЛГОАААЛТЛТСЛЛЛТПООАЛОЛС)ЛА(ЗЛГ«:ЛЛ

сап оолл<»лт<тлллс<т плоилотоскл! дг

АОЛГ< .ЛЛТТТА1П ¡ЛАК ЛПЛ("( АЛАТЛЛАТЛТС |Л1 Л1АЛ ЛТОПООАС С лШОС! ГАЛЛАМ ПЛТСЛООТСАШАЛЛА ЛСЛШСШ ГлаСТЛТ.40СТ.<САС<ГУ

А) ^.ТТаГГЛЛЛТаТОЛТвСХШАССАМГГАТ^АО^А Пй АТАС ААТТААС ТАТААТ Сг ГПТТАААОАЛГОТ ОТТСгАТЛАТОАГПЛОГТОАТАТАГТАЛАТалТАТ ТАОТОСТГО ТАС ЛААТААТСС АОАЛАТТЛТЛАА А ГГАГГААААЛЛАААААЛСАЛЛТТСТЛТАОТйТла ТТС'ТААТОС АТАЛААОАОО АЛАТС САСАТАС ААГ СЮ,«ЛА]ААСТААСАААГТАТОАТААТС-ТАО Г ГГ АТО АТАГАААААА1ТЛ1ТТА(^ ЛАС АААОАГГААА ТТТТС ТТО ТАТТАААТОН А АТЛССТСОТТАТАСЮ А тас ТАПгалТАТТоо аттассы гттосаи ас« СлТСлТСЛ-У

И мяилк-к с.иояпл с^гтсо.тггшоеслшй шшогтйшййпйшйс .мига «кклшшш ао

ммААтшгшо:адоААССпл^шАО.«олпттоАГйААОА10тпАИ1САПААСА^№та«СА1аш(тплс тйаллАтшлтплшл кгттггжослмпсы яоги

Ж) 5'- геСССИ И ТОА ГССС ГС7ТСГАТТАТ АККАД ТОТ АСААйСАТАТОАТ САТОТ АТШАССАТ ОйСГ АйН ОСТСССАССПТСМТ АССССТ А«ТС А1СА(аШАТСТ6Т6ТТ6СТГГГ(МГААТААААтАТ5ТСАТГСЯТСС ААСТААТШ йАСАОАТТАМПСТАПОААйШ АТ йААСДАМАЛТйЛАТ ,Ш ГСССАЙСАЙ ГПССА И ТССС ГТА Т-3

Ампликоны: А) Р/СЯТ К76Т; Б) Р/МОЯ1 N86Y; В) Р/МОЯ1 N1042D; Г) Р/МБЯ! D1246Y; Д); РЮИРБ К540Е; Е) PfDHFR S108N; Ж) Р1К13 А578Б. Курсивом выделены праймеры, жирным шрифтом и подчеркиванием - полиморфные нуклеотиды и сайты рестрикции.

Эндонуклеазы для рестрикционного анализа

Эндонуклеады рестрикции

51МР Эндонуклеаза/ число сайтов на амплнконе Сайт н точка рестрикции Рестрикцнонные фрагменты (п.н.)

для дикого штамма для мутантного штамма

К.76Т Ла1/1 5' ЩААТТУЗ1 3' ШЩЕ 5" - 95,47

иабУ Лс&1 /1 5'К|ААТТУЗ| 3' УТТАА^К 5' 239, 179 -

N10420 Лье! ¡Ъ 5' АТ1.ТААТ 3' 31 ТААТТГА 5' 132, 116, 99, 25 248, 116, 99

01246У 1 5' А|ОАТСТ 3' 3' ТСТАС|А5' 300, 209 -

БШК ВьеНИ УАСЧГофгЗ' 3' ТСАС.; СМ 5' - 329, 178

К540Е ВаС'ГП 5' З1 З1 ССТАС|№Г 5' 210, 138

А578Й АМН 5'-АОТСТ -3: 3'-ТС|ОАо: 123, 104

А) 5'...АТСААТАА:ЬЙАТТТТТССТАА...3'

4

1

Б) З'-СтЛЛСАТС.мШУТТЛОСП'ОАЮ-З'

В) 5'.,.ТТАТ.КТА4ГАСИТ... 3'

Г) 5\,.ААСМ^ШИТА...31

Д) 5'...ААбААСАА01С3222.!.АААвС АТТСС.„У

Е) 5'-ААТвОАТШЛ. А .СТА-3*

Ж) б'-САТСШетАЮТ-З1

ЯшЛГ-

Участки генов с БОТ, точками и сайтами рестрикции: А) PfCRT К76Т; Б) PfMDR1 N86Y; В) PfMDR1 N1042D; Г) PfMDR1 D1246Y; Д) PfDHFR S108N; Е) РЮИРБ К540Е; Ж) РЖ13 А578Б. 1 - полиморфный кодон; 2 - полиморфный нуклеотид; 3 -точка рестрикции; 4 - сайт рестрикции.

Схемы и примеры электрофоретического разведения рестрикционных фрагментов

А) PfCRT К76Т; Б) PfMDR1 N86Y; В) PfMDR1 N1042D; Г) PfMDR1 D1246Y; Д) PfDHFR S108N; Е) РЮИРБ К540Е; Ж) РЖ13 А578Б.

Приложение Г

Праймеры и амплифицируемые фрагменты для аллель-специфичной ПЦР с

альтернативными праймерами

Праймеры для аллель-специфичной П ЦР

Название Нуклеотидная последовательность Размер (п-н.) Длина ампликона

Р£Ш>И1 81034С

51034С Р1 5:- ТОСАОСТТТАТОСОСАГТСА -3' 20 263 п.н.

51034С ¥2 5'- ТССАОСТТТАТСОООАТТСТ -3' 20

81034С Я 5'- ТССАССАГСАТСТСТТАСАТСАА -3; 23

Р£АТР6 \569K

№69К Р 54 ТОГЮТТОССТОАОСТОТАОТ -3! 21 190 п.н.

N56951Ю 5'- ОССАССАОААТАГСАААААААТ -3' 22

Ш69К112 5'- СССАОСАОААТАТСАААААААА -3' 22

И569К Ю 5'- ОССАОСАОААТАГОАААААААО -3 22

Р£АТРб АбЗОБ

АбЗОБ 5'- ОСААСААСАААТООАТАТОААО -3! 22 960 п.н.

АбЗОБ ¥2 5'- ОСААСААСАААТООАТАЮААТ -3' 22

АбЗОБ Я 5'- ТОСТТСТТТАОСТАССТССО -3' 20

до -ГССЛССШ^СбССЛТТС/А^^САМССССТСААТТАШАПМТАСТТГТСССТА ЛтОСШОСАТССПСПААГТААААСАССТАСТАТАПАСПОАТСАСТТТАТСАААТССТ ТАШАСТПТАТАТТТАСТОСТАОПАТОСТСЮААААПААТОТССПААААООАСАПСА СААААТ0СААААПАТСАШ0АСАААТАПАТССАТТААТСАТТА0ААААТСАААТА7Та^

тотололтлтотхюл-з •

С) ГОГТСТТОГСГа^СГСГАОТАТААТТАОААТООТТАОСАТТСТТТАААТТСТТАТС АТ ' ТТТС АТТС МТ0ТАСТ00ТМТАТ0АСТ0ИАТСАТТТТТТ0ААСТАА.Л0М1ТТ0П0 АТАССССИООТОАТТТАТССИСТТАТТТОАТСАИОТАСАООТОТТОКГГ/.^ ТТГТТТТСЛ ТА ПСТОСТвСС

У 0<Ч<ОиСШГ«;л7.т;л<(£ХХ1АТАСЮАОААМТАСАтОЛГС^ п\ ААТААААТАААТАС САСАТСААСАСАТААТААТААТААСААСААТААТААТААТАОТААТАОТОПССААОТОААТ ОТАГ1К"! 1СГТОО Ц I АОАААТОААТОТАААСАААТАААААТТАПОААПС А(ТАОАОАААООАААГПАТОАОТОПАПОПОАА.иГАА.\ААААААОАААТ ААТАПОТАПОТАААООТОСАСаОАОААТАТААТААААААГТОТАААТАПАТТТААСОАААААГОАТАТАСОГССАПАААТаАААС ТТТААААМТОАМТТСАТМТМОАТТСААМТАТОШАААААОАОСАПМОААСАСТГАОСТТТОСТТАТААААААТТААОТАОТ АМОА тАААТАПМОМТАС АОАТОАттТАААПАОААСМ(МШМтАША<ЮТ(К1АТТАО<»ТА ТТАПОАТССАС" САСЮТАМТАТОТАСЮААОАСК'ААПАОАТТАТОССАТАТООСТООТАТАСОТОТАТТТАТОАТТАСАООТОАТААТАГТААТАСО ОСС'АОАОСТАТАОС'ТАААОАААТТААТАТАТТАААТАААААТОААООАОАТОАТОААААСЮАТААТТАТАС'АААТААТАААААТАСА САМТАТОПОПАТМТСЮААОАОМШОААОАТТШСАПАОААМО<АААААСАТАТШААААААТАСАС(МОААПОТТТТС ТОТАОААООАА(('ТАМ(А1АААААА('АМПОТААААОТАПААААОАСТТАООАОАААСАОТТОСТАТОАСАООТОАТООТОТ АМТОАТОС'АС СА<Х АПОАААТС АСКГ10АСАТАСЮМТА«1А ТОСЮТАПААТООААССС^ООГ^Са.ШйиСС! • 1'

Амнликоны: А) Р/МБЮ 810340; Б) РРЛТРб Ш69К; В) РРЛТРб А630Б. Курсивом выделены праймеры, жирным шрифтом и подчеркиванием - полиморфные нуклеотиды и включающие их кодоны.

Приложение Д

Схемы и примеры электрофоретического разведения ампликонов для ПЦР с

альтернативными праймерами

а 100 ър ь

■ ■ — — ЮОЬр - — и

к»ы «ЮЬр

т0

Й

И П 1 2 3 4 5 6 7

12349678

¡¡5Ш- И И XI И XI Ю XI И XI 83

1 '■¡•и® "Л! ¡1 " \)Г" 11 V

Ш |Мй) и С*

1 2233 44 55 66 Р1 Р2 Р1 ¥2 Р1 Р2 Р1 Р2 Р1 Р2

яг (ИОв! 1)1 (ММ) «2 (М<«|

А) Р/МБЯ! Б1034С; Б) РГЛТРб Ш69К; В) РГЛТРб А630Б.

Результаты анализа сиквенсов маркерных участков генома P. falciparum .

Отмечены SNP мутантных и диких генотипов

Совместный Российско-Вьетнамский Тропический научно-

исследовательский и технологический центр ( Тропический центр)

ЮЖНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

в работу научно-исследовательской группы по реализации проекта «Изучение фазовых (сезонных) генетических преобразований вирулентности и лекарственной резистентности Plasmodium falciparum в организме переносчиков комаров рода Anopheles» тест-систем на основе полимеразной ценной реакции в реальном времени по определению лекарственной устойчивости Plasmodium falciparum к препаратам хинолиного ряда, производным ар)емезинина и перимитамина

Комиссия в составе: председателя - заведующая лабораторией, кандидат биологических наук Лыонг Тхи Мо и членов комиссии: Чан Ван Чыонг. Нгуен Ван Хиеп подтверждает, что указанные тест-системы используются при обследование биологических проб переносчиком - комаров рода Anopheles. Обследовано 54 образца (24 имаго. 30 личиночных стадий) собранных в различных регионах республики Вьетнам. Применение в научной работе мултиплексных тест-систем на основе PCR-RT существенно ускоряет выполнение лабораторных исследований, способствует оптимизации работы и выводит научный поиск на новый технологический уровень, расширяя возможности применение современных молекулярно-генетичсских методов для эпидемиологического мониторинга одной из широко распространенных трансмиссивных инвазий.

Председатель комиссии

Заведующая лаборатории тропической медицины.

УТВЕРЖДАЮ Содиректор (Российская часть) С

[.етнамская часть)

Палько И.В.

АКТ ВНЕДРЕНИЯ

кандидат химических наук: Члены комисиии:

Чан Ван Чыонг

Xäc dinh kha näng khäng thuöc nhöm Quinolon. dän xuät artemesinin vä perimitamine cua ki sinh tning sot ret Plasmodium falciparum bang ky thuät realtime RT-PCR thuöc de täi "Nghien cüu su bien döi gen dpc lyc vä kha näng khäng thuöc theo müa cua ky sinh trung söt ret Plasmodium falciparum trong vector truyen benh loäi Anopheles ". To Thäin dinh göm:

Tö truöng: TS. Luong Thj Mo, Truöng phöng Y sinh Nhigt döi Thänh vien: ITiS. Trän Vän Truöng ThS. Nguyen Vän lliep Quy irinh thir nghit?m vöi 54 mau vec-to iruyen benh loäi Anopheles (24 mau muöi trutwig thänh, 30 mäu bo gäy) thu thäp tai cäc diem nghien cuu khäc nhau tai Viet Nam, Tö thäm djnh xäc nhan quy trinh xet nghi?m cö giä tri düng de xäc dinh kha näng khäng thuöc cua ki sinh trüng söt ret bang ky thu^t realtime RT-PCR da möi. rut ngän theri gian vä dam bäo tinh chinh xäc trong thi nghiem, mö röng kha näng i'mg dung cua cäc phuong phäp di truyen phän tu trong giäm sät dich te möl trong sö nhüng benh phö bien truyen qua trung gian.

Tö trircmg.

Truöng phöng Y sinh Nhi?t döi: Thänh vien:

УТВЬРЖДАЮ Заместитель начальника академии

АКТ ВНКДРЕНИЯ

в учебный процесс кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики федерального государственного бюджетного военного обраювагсльти о учреждения высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации ре{V . н.татов научном работы по магеришшм кандидатской диссертации Арюкова Артема Руслановича (преподавателя кафедры биологии) на тему: «Разработка лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum и осложнений тропической малярии»

Комиссия в составе: председателя заведующего кафедрой

клинической биохимии и лабораторной диагностики, член-корреспондента РАН. д.м.н.. Иванова A.M. и членов комиссии: шведующето учебной частью кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, к.м.н., )лькнна I .И., допета кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, к.м.н.. Крнворучко Л.Б. подтверждает, что результаты лиссертационното исследования на ie\n: «Разработка лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum н осложнении тропической малярии» аспирант при кафедре (биологин) Арюкова Артема Руслановича внедрены в образовательный процесс на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики:

1. Результаты диссертационного исследования использованы при подготовке методических материалов для проведения лекции №12 «Генетика человека. Молекулярная диагностика. Метод полимера той ценной реакции.» для курсантов, студенте и слушателей Военно-медицинской академии, по дисциплине «Клиническая лабораторная диагностика».

2. Результаты диссертационного исследования использованы при подготовке методических материалов для проведения практического занятия Ля9 «Лабораторная диагностика инфекционных болезней» для курсантов.

студентов и слушателей Военно-медицинской академии, по дисциплине «Клиническая лабораторная диагностика».

Использование резулыагов диссертации Арюкова Артема Руслановича способствует повышению качества подготовки курсантов, студентов и слушателей по учебным дисциплинам, реализуемым на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики.

Председатель комиссии: заведующий кафелрон член-корреспондент РАН доктор медицинских наук, профессор

Члены комиссии:

доцен г кафедры

кандидат медицинских наук

доцент кафедры кандидат медицинских наук

Иванов А.М.

Элькин Г.И.

Криворучкп А.К

УТВЕРЖДАЮ Заместитель начальника академии

по учебной .работе aevToji мсдицйнским паук, доцент

1акиев Р.Г.

--t . * .. ^

АКТ ВНЕДРЕНИЯ

н учебный процесс кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и фонических заболеваний) федеральною государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации результатов научной работы по материалам кандидатской диссертации на тему: «Разработка лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum и осложнений тропической малярии» аспиранта при кафедре (биологии) Арюкова Артема Руслановича

Комиссия в составе: председателя начальника кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитолог ии и тропических заболеваний), главного инфекциониста МО РФ д.м.н., профессора Козлова К.И. и членов комиссии: заместителя начальника кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний), доцента, к.м.н., Мальцен О.В.. доцента кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний), к.м.н.. Гудкова Р.П. подтверждает, что результаты диссертационного исследования на тему: «Разработка лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентности Plasmodium falciparum и осложнений тропической малярии» аспиранта при кафедре (биологии) Лрюкова Артема Руслановича внедрены в образовательный процесс на кафелре инфекционных болезней (с курсом медицинской паразит ологии и тропических заболеваний):

I Результаты диссертационного исследования использованы при подготовке методических материалов для проведения практического занятая №1 «Малярия: этиология, лабораторная диагностика, профилактика.» для курсантов, студентов и слушателей Военно-медицинской академии по дисциплине «Инфекционные болезни» (специальность - 31.05.01 Лечебное дело).

2. Использование результатов диссертации способствует повышению качества образования на кафедре инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний), так как в работе содержатся материалы о способах ныяазепия однонуклеотидных полиморфизмов, являющихся генетическими маркерами лекарственной устойчивости штаммов Plasmodiuni falciparum - возбудителя тропической малярии. Это пс только позволяет повысить качество лабораторной диагностики малярии, но и jaei возможность подобрать эффективные препараты для ттиотропной терапии тропической малярии, вызванной лекаршкенно устойчивыми штаммами, завезенными из эндемичных peí ионов.

Таким образом, внедрение результатов диссертационно!о исследования Арюкова A.I'. в учебный процесс кафедры (инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболевании) является актуальным и своевременным.

11редседатель комиссии: начальник кафедры Главный инфекционист МО РФ доктор медицинских наук, профессор полковник медицинской службы

Члены комиссии:

заместитель начальника кафедры, доцент, кандидат медицинских наук

доцент кафедры канди дат медицинских наук

■ду/

подпись

•лппсу

Козлов К.В.

Мхтьцсв О.В.

Гудков Р.В.

УТВЫ'ЖДЛЮ Заместитель начальника Военно-медицинекой академии

ЛК1 ВНЕДРЕНИЯ

в учебный процесс кафедры (общей и военной эпидемиологии) федеральною государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации результатов научной работы по материалам кандидатской диссертации на тему: «Разраб01ка лабораторных методов ранней генодиагностики лекарственной резистентное 1н Р1ампоЛшп Гакзрагшл и осложнений тропической малярии» аспиранта при кафедре (биологии) Лрюкова Артема Руслановича

Мы. нижеподписавшиеся, комиссия в составе: председателя -начальника кафелры (обшей и военной эпидемиологии), главного нештатного эпидемиолога МО РФ. гм.н.. профессора Кузина АЛ. и членов комиссии: ир<х1>ессора кафелры (обшей и военной яшдемиологии), д.м.и.. профессора Жоголева С.Д., преподавателя кафедры (общей и военной эпидемиологии), кмн. Карпущенко В.Г. подтверждает, что результаты диссертационного исследования на тему: «Разработка лабораторных методов ранней генодиа! иостики гскарствснной резистентности Р1ачто<1шт Гакзратт и осложнений тропической малярии» аспиранта при кафедре (биологии) Лрюкоза Артема Руслановича внедрены в образовательный процесс на кафедре (общей и военной эпидемиологии):

1. Результаты диссертационного исследования использованы при подготовке методических материалов для проведения практического занятия № 16 «Антропонозы с трансмиссивным механизмом передачи)' для курсантов, студентов и слушателей Военно-медицинской академии по учебной дисциплине «Эпидемиология» (специальность — 31.05.01 Лечебное дело).

2. Результаты диссертационного исследования использованы при подготовке методических материалов для проведения практического занятия

№ 11 «Эпидемиология и профилактика трансмиссивных зоонозов» зля слушателей ординатуры Военно-медицинской академии по учебной дисциплине «Эпидемиология» (специальность - 32.08. !2 Эпидемиология).

Использование результатов диссертации способствует повышению качества учебного процесса на кафедре (общей и военной эпидемиологии), позволяют раскрыть механизмы формирования лекарственной устойчивости Plasmodium falciparum - возбудителя одной из наиболее значимых антропонозных трансмиссивных инвазий. Внедрение результатов диссертационного исследования Арюкова Л.Р. в учебный процесс кафедры (общей и военной эпидемиологии) язляется своевременным и актуальным.

Председатель комиссии:

Начальник кафедры

(обшей и васиной эпидемиологии)

главный нештатный эпидемиолог МО РФ

доктор медицинских наук, профессор

Члены комиссии:

Профессор кафедры

(обшей и военной эпидемиологии)

доктор медицинских наук, профессор

Преподаватель кафедры (общей и военной эпидемиологии) кандидат медицинских наук

Кузин A.A.

ЖоголевС.Д

Карпущенко В.Г.