Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Баурина, Марина Михайловна

• Баурина, Марина Михайловна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Баурина, Марина Михайловна

Введение.

Список принятых в работе сокращений.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Нуклеиновые кислоты и их производные. Метаболизм рибонуклео-тидов. Характеристика, способы получения и применение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК.

1.2. Панкреатическая рибонуклеазы, характеристика, применение и способы выделения.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Методика проведения гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой.

2.4.2. Отделение моно- и олигорибонуклеотидов от высокомолекулярной фракции дрожжевой РНК ультрафильтрацией.

2.4.3. Методика проведения стерилизации раствора панкреатического гидролизата РНК.

2.4.4. Методика проведения опытов по экстракции рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС.

Глава 3. Основные экспериментальные данные и обсуждение результатов.

3.1. Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК.

3.1.1. Ферментативный гидролиз дрожжевой РНК. Количественные закономерности процесса.

3.1.2. Разделение ВМ и НМ фракций продуктов гидролиза ультрафильтрацией. Количественные закономерности процесса.

3.1.3. Осаждение смеси моно- и олигорибонуклеотидов из водноспиртовых растворов. Количественные закономерности процесса.

3.2. Разработка основ технологии получения панкреатической рибонук-леазы.

3.2.1. Исследование количественных закономерностей экстракции рибо-нуклеазы из поджелудочной железы КРС.

3.2.2. Количественные закономерности стадии ультрафильтрации.

3.2.3. Количественные закономерности стадии осаждения рибо-нуклеазы.

3.2.4. Очистка препарата технической рибонуклеазы.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК»

Актуальность работы. В настоящее время разработка недорогих эффективных лекарственных средств отечественного производства является одной из актуальных задач сохранения здоровья, продолжительности и качества жизни людей, решаемых современной российской фармацевтической промышленностью. Препараты нуклеиновой природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Отечественный фармакопейный препарат - панкреатический гидролизат РНК, известный под названием Энкад, представляет собой смесь олигонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-3'-фосфатов. Препарат регулирует обмен нуклеотидов в тканях, обладает имму-номодулирующими свойствами, способствует улучшению функций клеточных мембран, проведению импульса по двигательным нервам, уменьшению миодистрофических процессов и оптимизации биоэнергетики мышц. Препарат применяется для лечения наследственных тапеторетинальных абиотрофий - заболеваний, приводящих к слабовидению и слепоте. До настоящего времени не существует эффективных методов лечения этой группы болезней в мире. Препарат также разрешен к применению при болезни Шегрена, при дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы: наследственных формах миопатий (ранние стадии), врожденном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невральных абиотрофий, последствиях нейро-инфекций, спинальных амиотрофиях. Показана клиническая эффективность применения препарата Энкад при ряде других социально значимых заболеваниях (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, псориаз, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз).

Ранее сухая субстанция Энкада выпускалась на предприятии НПО «Био-лар» (г.Олайне, Латвия) при использовании в качестве сырья РНК дрожжей p.Torula, производства которых прекращены. Лекарственная форма препарата, выпускаемая в настоящее время на Харьковском предприятии по производству бактерийных препаратов (Украина), поставляется в Россию в ограниченных количествах, не удовлетворяющих потребности РФ. В связи с этим организация производства субстанции Энкад и его инъекционной формы на территории РФ является актуальной. Наиболее перспективным сырьем получения РНК в настоящее время для России являются хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые не требуют организации специального производства, так как выпускаются промышленностью в больших объемах и также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства.

Для получения панкреатического гидролизата РНК используется рибо-нуклеаза, выделяемая из бычьей поджелудочной железы - отхода мясоперерабатывающей промышленности. Известно, что себестоимость большинства биологически активных веществ, получаемых с использованием ферментов, в значительной степени зависит от стоимости последних. Существующие технологии получения рибонуклеазы многостадийны, длительны и характеризуются низким выходом фермента. В настоящее время накоплен огромный опыт переработки и выделения различных комплексов ферментов из поджелудочной железы. В связи с этим актуальным является совершенствование технологии получения ферментного препарата рибонуклеазы для создания эффективного и малоотходного производства. Рибонуклеаза помимо этого широко используется в медицине в качестве противовирусного средства и применяется в области молекулярной биологии.

Таким образом, современные потребности РФ в лекарственных препаратах отечественного производства настоятельно требуют разработок технологий на основе дешевого и доступного сырья в условиях комплексного производства.

Цель исследований. Разработать научные основы технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, а также ферментного препарата рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы, соответствующих требованиям фармакопеи.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1) Разработать технологический режим получения панкреатического гидро-лизата дрожжевой РНК как субстанции препарата Энкад, обеспечивающий повышение выхода целевого продукта:

- изучить возможность использования нового источника сырья натриевой соли низкомолекулярной РНК из хлебопекарных дрожжей для получения панкреатического гидролизата требуемого качества.

- разработать условия повышения стабильности состава панкреатического гидролизата.

2) Разработать режим основных технологических стадий извлечения рибо-нуклеазы из бычьей поджелудочной железы: экстракции, концентрирования, осаждения и очистки фермента с целью повышения выхода целевого продукта.

Научная новизна. Впервые разработана технология получения препарата панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей Saccharo-myces cerevisiae, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.

Впервые показана возможность применения миндальной кислоты на стадии ультрафильтрации в качестве ингибитора рибонуклеаз микроорганизмов, что позволило стабилизировать состав готового продукта с сохранением качества и увеличить его выход.

Проведено количественное изучение процессов гидролиза полирибонук-леотидов дрожжей, отделения от высокомолекулярных компонентов продуктов гидролиза и осаждения их из водно-спиртового раствора, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.

Проведено количественное изучение процессов извлечения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы водными растворами серной кислоты, ультраконцентрирования экстракта, осаждения фермента в изоэлектрической точке из водных растворов и спиртового осаждения, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.

Практическая значимость. Разработана технология получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты из хлебопекарных дрожжей с увеличением выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями. Показано, что применение ингибитора рибонуклеаз - миндальной кислоты на стадии ультраконцетрирования позволило повысить стабильность состава готового продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенно-сти.

Разработаны основные стадии технологического процесса получения ферментного препарата рибонуклеазы (из бычьей поджелудочной железы) и условия их проведения, обеспечивающие увеличение выхода продукта до 0,5% мае. от сухой железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующими технологиями.

Список принятых в работе сокращений:

РНК - дрожжевая рибонуклеиновая кислота - гетерогенный полирибонукле-отид;

ПГ РНК - панкреатический гидролизат дрожжевой РНК;

ПЖ - поджелудочная железа;

КРС - крупный рогатый скот;

ФП - ферментный препарат;

СВ - сухое вещество;

УФ - ультрафильтрация;

ФРПФ - 5-фосфо-рибозил-1-пирофосфат;

АТФ - аденозинтрифосфат;

ГТФ -гуанозинтрифосфат;

СТФ - цитидинтрифосфат;

УМФ - уридинмонофосфат;

ИМФ - инозинмонофосфат;

АДА - аденозиндезаминаза;

ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза;

МПА - мясопептонный агар;

СА - сусло-агар;

ФС - фармакопейная статья.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Баурина, Марина Михайловна

Выводы:

1 .Разработана технология получения панкреатического гидролизата натриевой соли рибонуклеиновой кислоты из нового источника нуклеината натрия РНК - хлебопекарных дрожжей, обеспечивающая получение фармакопейного препарата.

2.Исследовано влияние миндальной кислоты на подавление посторонней ферментативной активности в процессе ультрафильтрации и показано, что введение миндальной кислоты является условием повышения стабильности состава панкреатического гидролизата при сохранении его нетоксичности и апирогенности и повышения выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями.

3.Разработаны критерии контроля качества исходного сырья, полупродуктов и самого продукта по содержанию в них низкомолекулярных продуктов глубокого гидролиза РНК для получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.

4.Разработана технология получения ферментного препарата рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы с активностью 8500-14000 ед/мг препарата, в которой за счет введения ультраконцентрирования и осаждения рибонуклеазы в ИЭТ, обеспечивается выход продукта до 0,5 % мае. от поджелудочной железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующей технологией.

5.Проведены расчеты технико-экономических показателей производства панкреатического гидролизата дрожжевой РНК мощностью 100 кг/год и рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы - 2 кг/год. Показано, что применение разработанной технологии рибонуклеазы, обеспечивающей её себестоимость не более 2000 руб/г, приводит к снижению себестоимости панкреатического гидролизата на 30% по сравнению с препаратом, полученным с использованием импортного фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Баурина, Марина Михайловна, 2007 год

1. Ленинджер А. Основы биохимии. -М.:Мир. 1985.Т.-1-3. С1056

2. Элиот В. Биохимия и молекулярная биология. М.МАИК «Наука/Интерпериодика». - 2002. - С.446.

3. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. -Т.2. М. Мир,- 1993.-С. 415

4. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М. -Мир, -1986. -Т. 1-5.

5. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У .Я. Низкомолекулярная РНК получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне,- 1985,С. 191

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства М.: ООО «Изд-во Новая Волна», 2001.-С. 540

7. Авцын А.П., Фукс Б.Б., Шабанова М.Е., Терещенко О.Д. Наследственные дистрофии сетчатки у человека в связи с результатами их патегенетической терапии // Вестник Акад. Мед. наук СССР, 1971. Медицина, №7. - С. 63-69

8. ГОСТ 12.0.003 74 ССБТ. Опасные и вредные производственные факторы. Классификация.

9. Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Попова Л.М., Шнапер А.Л. Заместительный лечебный эффект рибонуклеотидов при некоторых болезнях. // Бюлл. эксп. биол. и медицины, 1969, - № 9. - С. 23-26

10. Young Richhard W. The renewal of photoreceptor cell outer segments J. Cell Biol. Apr 1967. v.33. (1) P.61-72

11. И. Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Левина Ф.Г. Шабанова М.Е. О специфическом лечебном эффекте рибонуклеотидов при тапеторетинальных дистрофиях //Вестник Акад. Мед. наук СССР, «Медицина» - Москва. - 1971. - № 7.- С. 63-68

12. Трутнева К.Б., Кацнельсон Н.А., Богословский Н.И., Фукс Б.Б., Милев-ская Т.И., Авербах В.М., Шабанова М.Е., Шамшинова A.M. Препараты РНКи рибонуклеотидов в лечении тапеторетинальных дистрофий. Вестник офтальмологии. - №2. - С. 68-77. - 1972

13. Шершевская С.Ф., Левина Ф.Г. Клинический опыт применения препаратов РНК при лечении тапето-ретинальных дистрофий. Вестник Акад. Мед. наук СССР. - «Медицина» - М., - 1978.-№10.-С 40-43.

14. Кацнельсон Л. И., Богословский Н. Е., Трутнева К. В. Результаты лечения препаратом Энкадом периферической пигментной абиотрофии сетчатки. Вестник АМН СССР. 1978, №10-С.36-40

15. Кацнельсон Л.И., Трутнева К.В., Богословский Н.Е. и др. Результаты длительного динамического наблюдения за применением препарата Энкад при пигментной тапеторетинальной абиотрофии // Вестник офтальмологии, 1982. -№ 2.-С. 28-29

16. Шабанова М.Е. Регенерация родопсина при наследственной дистрофии сетчатки. // Дисс. канд. биол. наук. -М., 1982 Рукопись.

17. Коновалова Н.В. Экспериментальное обоснование фонофореза препарата энкад и его клиническое использование при лечении больных пигментной дегенерации сетчатки. Канд. Дис. - Одесса 1988 С. 140

18. Багров С.Н., Шабанова М.Е. Механизм лечебного воздействия препарата энкад. - Нейроиммунология на пороге XXI века. - С-Петербург-1992 С. 120

19. Гринио Л.П., Агафонов Б.В. Миопатии. М. - Медицина, - 1997 - С. 213

20. Шабанова М.Е., Гринио Л.П., Корабельников Н.И., Фукс Б.Б. Лекарственный препаратдля лечения дегенеративных заболеваний нервно-мышечной системы. Материалы симпозиума М. ИБХ РАН - Изд-во РУДН. - 2005. С. 108

21. Пожарицкая М.М., Копьева Т.Н., Клиническая С.С. Цитологическая и иммунологическая характеристика действия препарата Энкад на слизистую оболочку полости рта при болезни Шенгрена Тер. архив.- 1988.- №4. -С. 7577

22. Бунина Т. Л., Хондкариан О. А., Коршунова Т. С. и др. Лечение бокового амиотрофического склероза рибонуклеотидами // Журнал Невропаталогии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 1976. t.LXXV1, С. 166-174

23. Гринио Л. П., Фукс Б. Б., Шабанова М. Е. и Корабельникова Н. И. Лекарственный препарат для лечения дегенеративных заболеваний нервно-мышечной системы,-А. с. 1703113, А 61 К 31/52, 35/72. Опубл. 24.06.1985

24. Макаров С.В., Липина Л.Н., Вологдина Н.Н., Шабанова М.Е. Применение препарата Энкад в терапии демиелинизирующего процесса. Нейроиммуноло-гия на пороге XXI в. С-Петербург-1992. - С.43-44.

25. Маркушева Л.И., Тихонов Ю.В., Тогузов Р.Т. Метаболический пул пуриновых соединений в эпидермисе и крови больных псориазом с применением препарата Энкад. Клиническая лабораторная диагностика. 1998 -№8. -С. 43.

26. Саруханова А. Г. Препарат дрожжевой РНК (Энкад) в терапии больных псориасом. // Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов. Тез. науч. раб. Науч. практ. конф. -Екатеринбург, 2002.-С. 183

27. Патент№ 2016579 РФ Рясина Т.В., Коршунова Т.С., Шабанова М.Е., Ко-шелев В.Б., Крушинский A.JL, Ларский Э.Г., Озереденко В.Г. Антигипокси-ческое средство для лечения ишемических нарушений мозгового кровообращения

28. Кольцов П.А., Шабанова М.Е. Энкад в лечении язвенной болезни 1-й Российский конгресс «Человек и лекарство». М. 1992. -С. 36

29. Серебряков С.Н. Опыт клинического применения препарата Энкад в лечении больных язвенной болезнью желудка и 12-типерстной кишки. Актуальные проблемы гастроэнтерологии и сочетанной патологии в геронтологии.-1995. С. 136-137

30. Vasiliyeva E.F., Kolyaskina G., Tsutsulovskaya M., Kaleda V., Shabanova М.Е. Effect of Encad on Lymphocytes in Schizophrenia. Abstracts of X World Congress of Psychiatry. Madrid. 1996 v.2. p.243

31. Васильева Е.Ф., КушнерС.Г., Каледа В.Г., Шабанова М.Е.Система естественной цитотоксичности и иммуномодулирующее действие Энкада при шизофрении. Материалы 10-ой научно-практической конференции неврологов «Нейроиммунология». С.-Петербург. 2001. С.38-40

32. Шабанова М.Е., Крылов И.А. Новые возможности медицинского применения отечественного препарата нуклеотидов Аллергология и иммунология в педиатрии 2006№ 2-3 (9) С 94

33. Рубенис О.С., Бринкманис Р.А., Ирген А. М., Лиепеня В.А., Тенисон Р.А. Прикладная биохимия и микробиология, 1976, т.ХН, вып. 3, с. 403 407

34. By Тхи Фыонг Ань Разработка основ технологии РНК из дрожжей // Дисс. канд. хим. наук. -М., 1997 Рукопись!

35. Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред. Белозерского А.Н. М. Мир. 1970.С.278

36. Пратикум по биохимии: Учебное пособие/ Под ред. С.Е., Соловьевой Г.А. М. Изд-во МГУ, 1989 С.509

37. Norimoto Y., Ohmura S., Enzymatic Hydrolysis of Ribonucleic Acid US Patent US 3,920,519 Nov. 18, 1975

38. Beljanski M. Polyribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. Пат. 4,190,649 (США), A61K 31/70. 0публ.26.02.1980

39. Beljanski M. Polyribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. Пат. 4,335,239 (США), A6IK 31/70. Опубл. 15.06.1982

40. Фукс Б.Б. Способ получения рибонуклеотидов Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1969 №9 С 23-26

41. Богословский А. И., Кацнельсон Л. А., Милявская Т. И., Трутнева К. В., Фукс Б. Б., Шабанова М. Е. и Шершевская С. Ф. Способ получения рибонуклеотидов. А.с. 663403 (СССР), А 61К 37/00. Опубл. 15.11.1976

42. Гайлума М. А., Ермолаев Е. Д., Замах В. П., Микстайс У. Я., Семтурис М. М. Фукс Б. Б. и Шабанова М. Е. Способ получения рибонуклеотидов. А.с. 948108 (СССР), С 07 Н 19/00. Опубл. 11.02.1981

43. Фукс Б. Б., Шабанова М. Е., Федоров С. Н., Краснопольский М. Ю., Микстайс У. Я., Ермолаев Е.Г. и Гаймула М.А. Способ получения рибонуклеотидов.-А.с. 1575359 (СССР), С 12 Р19/34. Опубл. 14.06.1988

44. Fux В.В., Shabanova М.Е., Fedorov S.N., Krasnopolsky J.M., Mixtais U.Y., Ermolaev E. D., Gaimula M.A. Method of Preparing a Mixture of Ribonucleotides. Patent US 5064758, С12Р19/ЗООпубл 12.11.1991 .

45. Тимиров IO.G., Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Способ получения рибонуклеотидов. Патент UA 66706А. А61К37/00, С12Р19/34.0публ.17.05.2004

46. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 1-3. М.: Мир, 1982. С. 1120

47. Dubos R. J. and Thompson R. H. S. The Decomposition of Yeast Nucleic Acid by a Heat-resistant Enzyme J. Biol.Chem 1938 124,(2) p 501-510

48. Шапот В. С. Нуклеазы. M., Медицина, 1968. С. 212

49. Aqvist, S. E. G. and Anfinsen, C.B. A Comparative Study of the Structures of Bovine and Ovine Pancreatic Ribonucleases // J. Biol. Chem., 234,1112 (1959)

50. С. H. Hirs, S. Moore, and W. Stein. A Chromatographic Investigation of Pancreatic Ribonuclease. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 200. pgs. 493506. Feb. 1953.

51. G. Taborsky. Chromatography of Ribonuclease on Carboxymethyl Cellulose Columns. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 234. pgs. 2652 2656. Oct. 1959.

52. Anfinsen CB, White FH Occurrence, Structure, and Properties The Enzymes P. Boyer Academic Press. NY 1961. v.5. p. 95-122

53. Кнорре Д. 3., Мызина С. Д. Биологическая химия М.: Высш. шк. 2002. -С. 469

54. Barnard Е A Biological Function of Pancreatic Ribonuclease. Nature. i969. v. 221. p. 340-344

55. A.S.E.G. Anfinsen The Isolation and Characterization of Ribonucleases from Sheep Pancreas. J. Biol. Chem. 1959. v. 234 p. 1112-1117

56. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты М. Мир. 1982 Т. 1-3 С.1118

57. Moore S., Stein W. Н. Chemical Structures of Pancreatic Ribonuclease and Deoxyribonuclease, Science, 180, 458-464 (1973)

58. Plumber Т.Н. Hir C.H.W. On the Structure of Bovine Pancreatic Ribonuclease

59. B. Isolation of a Glycopeptide. J. Biol. Chem 1964 239 p. 2530-2538

60. Richards F. M., Wyckoff H.W. Bovine Pancreatic Ribonuclease. The Enzymes. P. Boyer Academic Press. NY 1971. p. 647-806

61. Кнорре Д.Г. Биологическая химия. M., Высш. шк. 2002 С.479.

62. Филлипович Ю. Б. Основы биохимии. Изд. «Высшая школа», М., 1969,1. C. 574

63. Kunitz М. Crystalline Ribonuclease. J. General Physiology 1940. v.24, 15 p. 15-32

64. McDonald M. Proteolytic Contaminants of Crystalline Ribonuclease. J. General Physiology 1948. v.32 p. 33-37

65. Кривошеев Б. Н., Салганик Р. И., Лыкова С. Г. и др. Опыт применения рибонуклеазы в лечении псориаза. // Современные вопросы дерматологии и венерологии. Новосибирск, 1993. С. 30-35

66. Scheit К. Н., Reddy Е. R. and Murti Т. R. Seminal plasma ribonuclease and method for its recovery. US Pat. 4,331, 764 C12N 9/22 25.05.1982

67. Рогов И. А., ШапогинаА. M., Комолова Г. С., Ионова И. Н., Тихомирова Н.А. Способ очистки сырья молочной промышленности от избытка панкреатической рибонуклеазы. А.с. 02110066 (РФ). Опубл. 27.04.1998

68. Федосов Ю.В., Рассказов В.А. Способ получения рибонуклеазы А.с. SU813845A. А61К35/60. Опубл. 30.03.1986. Бюл №12

69. Козлов А. В., Ковалева Л. Б. и Мячин В. Ф. Способы очистки нуклеазы из проростков ячменя. А.с. 1703688 (СССР), C12N 9/22. Опубл. 07.01.1992

70. Банникова Г. Е., ВарламовВ. П. и Рогожин С. В. Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости Serratia marcescens. А.с. 1392902 (СССР), C12N 9/22 Опубл. 01.09.1986

71. McDonald М. A Method for Preparation of Protease-free Crystalline Ribonuclease J. General Physiology 1948. v.32 p. 39-42

72. McDonald M. R., Ribonucleases. Methods in enzymology. New York. Academic Press, 1955, v.2, p. 427

73. Crestfield A.M., Stein W.H., Moore S. On the Preparation of Pancreatic Ribonuclease A. J. Biol. Chem. 1963 238. p.618-621

74. Maxvell L.C. Thompson Prepapation of Pancreatic Enztmes Ribonuclease, Trypsinogen, chymotrypsin В and Alpha Chemotrypsin US Patent 2751329 C12N 9/22 Опубл. 19.06.1956

75. Хомов B.B., Сизов A.A., Масычева В.И. и Загребельный С.Н. Способ получения рибонуклеазы панкреатической. А.с. 0291195 (РФ), А61К 35/39. Опубл. 20.09.1997

76. Рышка Ф.Ю., Полонская Л.Б., Беленький Н.Г. и др., Способ очистки рибонуклеазы. А.с. 259790 (СССР), Кл. 6а, 22/07. Опубл. 27.12.1970

77. Куриненко Б.М., Калачева Н.В., Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы. А.с. 540873 (СССР), C12N 9/22, C12N 9/12. Опубл. 08.02.1987

78. Левицкий А.П., Барабаш Р.Д., Марченко А.И. и др., Способ получения рибонуклеазы. А.с. 561565 (СССР), C12N 9/22. Опубл. 22.07.1977

79. Голубенко И.А. и др., Рибонуклеаза Bacillus intermedins 7р. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного продукта. // «Биохимия», т.44, вып.4, М., 1979, с.640-647

80. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И.,, Паэгле Б.Я. и др. Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы Bacillus intermedins 7р. А.с. 1010125 (СССР), C12N 9/22, C12N 1/20 Опубл. 07.04.1983

81. Банникова Г.Е., Варламов В.П. и Рогожин С.В. Способ выделения и очистки буктериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости Serratia marcescens. А.с. 1392902 (СССР), C12N 9/22 Опубл. 01.09.1986

82. Хомов В.В., Сизов А.А., Масычева В.И. и Загребельный С.Н. Способ получения рибонуклеазы панкреатической. А.с. 0291195 (РФ), А61К 35/39. Опубл. 20.09.1997

83. Глазова Н.В., Быченкова О.В., Писарев О.А. и др. Способ очистки рибонуклеазы. А.с. 2152995 (РФ), C12N 9/22. Опубл. 20.07.2000

84. Практикум по биохимии. / Под ред. Северина С.Е., М.: МГУ, 1989, 509с.

85. Kunitz М. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity//J. Biol. Chem., 1946, V. 164, №161, P. 563-568

86. Kalnitsky G. and Rogers W. I. The activity of ribonuclease after digestion with carboxypeptidase // Biochimica et Biophysica Acta v. 20, 1956, p. 378-386

87. Kunitz M. Crystalline Desoxyribonuclease. Spectrophotometric Method for the Measurement of Desoxyribonuclease Activity. J. General Physiology 1950. v.33. p.349-377

88. Полыгина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева JI.B. Определение активности ферментов. Справочник. М.: ДеЛи принт, 2003. - С. 373

89. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии. Воронеж, Изд-во Воронежского ун-та, 1985. С. 254

90. Методы исследования нуклеиновых кислот. / Под редакцией Белозерского А.Н., М.: «Мир»,1970. С. 277

91. Крешков А. П. Основы аналитической химии. М., Изд-во «Химия». 1972,-С. 657

92. Худсон Д. Статистика для физиков. М., Изд-во «Мир», - 1970. - С. 270

93. Дытнерский Ю. И. Баромембранные процессы. Теория и расчет. М.: Химия, 1986.-С. 272

94. Дытнерский Ю.И. Процессы и аппараты химической технологии. Т.2. М. Химия.-2002.-С. 368

95. Березин М.А., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. - С. 320

96. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. В 2-х частях. 4.2. М.: Мир, 1989. - С. 590

97. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - С. 720

98. Zendzian E.N., Barnard Е.А. Disdributions of Pancreatic Ribonuclease, Chy-motrypsin, and Trypsin in Vertebrates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1967. v.122. p.699-713.

99. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин A.H., Дубина В.И., Бердутина А.В., Баканов Н.А. Способ активации комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы убойных животных. Патент РФ № 2112801. 1998. Б.И. № 16.

100. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Биологически активные соединения из природных объектов. Свойства и структурно-функциональные взаимосвязи. М.: МГУЛ, 2003.480 с.