Разработка подхода к генотерапии опухолей с помощью гена цитохрома человека CYP450 2В6 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Коломейчук, Сергей Николаевич

• Коломейчук, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коломейчук, Сергей Николаевич

Содержание

Список сокращений

Введение 6 1. Обзор литературы: «Генная терапия онкологических заболеваний»

1.1. Что такое генная терапия ?

1.2 Направления генной терапии

1.3.Векторы для генной терапии 13 1.3.1. Невирусные системы доставки 15 1.3.1.1 Микроинъекция ДНК

1.3.1.2. Трансфекция «голой ДНК»

1.3.1.3. Катионные липосомы

1.3.1.4. Катионные полимеры 21 1.3.2 Вирусные системы доставки 23 1.3.2.1 .Аденовирусные векторы

1.3.2.2.Ретровирусные векторы

1.3.2.3. Аденоассоциированные вирусы

1.4. Выбор систем доставки ДНК для генотерапии опухолей

1.5. Улучшение эффективности векторов

1.6. Генная терапия ненаследственных заболеваний

1.6.1. Рибозимы

1.6.2. Антисмысловые олигонуклеотиды

1.6.3. «Опухолевые» вакцины

1.6.4. Введение генов-супрессоров опухолевого роста

1.6.5. Введение генов «суицида»

1.6.6.Усиление цитотоксического эффекта генов «суицида»

1.7. Последние достижения генной терапии в клинике и будущие перспективы

2. Материалы и методы

2.1. Квалификация реактивов

2.2 Среды и антибиотики

2.3 Генотип использованных штаммов Е. coli

2.4 Методики клонирования

2.5 Индукция экспрессии CYP 2В6 в клетках E.coli.

2.6 Исследование СО-восстановленных спектров CYP 450 2В6 и определение содержания CYP2B6 в мембранной фракции клеток E.coli.

2.7 Характеристика комплексов ДНК-катионные липосомы методом атомно-силовой микроскопии.

2.8 Определение токсичности катионных липидов

2.9 Определение токсичности катионных липосом in vitro.

2.10 Трансфекция эукариотических клеток репортерными генами и оценка эффективности трансфекции.

2.11 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции.

2.12 Трансфекция эукариотических клеток комплексами катионные липосомы - ДНК цитохрома CYP 450 2В6.

2.13 Исследование чувствительности клеток к циклофосфамиду.

3 Результаты исследований

3.1 Получение генетической конструкции, экспрессирующей ген цитохрома CYP2B6.

3.1.1 Получение кДНК цитохрома Р450 2В6 из рекомбинантной плазмиды

3.1.2.Получение промежуточной конструкции риС9/Д£та1 СУР 2В

3.1. Неполное расщепление плазмиды р11С9/А5,т<я

3 СУР 2В6 рестриктазой ЕсоК\ с последующим гидролизом полученного продукта по сайту Бта!

3.1.4. Клонирование гена цитохрома СУР2В6 в экспрессионном эукариотическом векторе рсБМА 3.1. (+).

3.1.5. Экспрессия цитохрома СУР2В6 в бактериальных клетках.

3.2 Тестирование катионных липидов на цитотоксичность

3.3 Получение катионных липосом и оценка их цитотоксичности.

3.4 Характеристика комплексов ДНК-липосомы

3.5 Трансфекция клеток 293 геном цитохрома человека СУР 2В6.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подхода к генотерапии опухолей с помощью гена цитохрома человека CYP450 2В6»

Актуальность проблемы.

Проблема лечения онкологических заболеваний является одной из важнейших, стоящих перед теоретической и практической медициной [1]. Как правило, традиционные методы лечения онкологических больных направлены на устранение последствий возникновения опухолей, а не причин, вызывающих их [2]. Существенным недостатком онкотерапии является ее низкая избирательность, сопряженная с многочисленными побочными эффектами. Все это, наряду с возрастающей смертностью населения развитых стран от онкологических заболеваний, создало предпосылки для возникновения альтернативных, "биологических" стратегий терапии и лечения злокачественных опухолей [3]. Такой стратегией является генная терапия, главным инструментом которой является нуклеотидная последовательность или ген, выступающие в качестве средства для лечения моногенных заболеваний, опухолей и инфекций. Во-первых, применение нуклеиновых кислот специфично: антисмысловые нуклеотиды узнают отличие даже в один нуклеотид в ДНК-мишени опухоли. Во-вторых, используя суицидные гены, можно локально в опухоли создать такие высокие концентрации действующего агента, которые невозможно достичь методами стандартной терапии. В-третьих, например, при неоперируемых опухолях поджелудочной железы, генотерапия оказывает эффект в тех случаях, когда традиционная медицина бессильна.

Появление генной терапии вызвало волну энтузиазма, однако такие настроения сменились более осторожными, когда начались клинические испытания. Стало очевидно, что низкая эффективность переноса нуклеиновых кислот в клетки-мишени ш vivo и недостаточная адресная доставка - основные препятствия для успешного применения данной стратегии в клинике [2]. Часто говорят, что до сих пор генотерапия не вылечила ни одного пациента, не принимая во внимание то, что на сегодняшний день было завершено лишь несколько генотерапевтических протоколов. Стоит отметить,что в I и II фазах клинических испытаний находится много протоколов, в которых скорость излечения гораздо выше, чем при лечении традиционными методами.

Ряд событий, произошедших за последние три года, открыл серьезные побочные эффекты, связанные с генотерапевтическим вмешательством. Молодой пациент, страдающий наследственным заболеванием - недостаточностью фермента орнитин-транскарбамоилазы, умер после введения высокой дозы аденовирусного вектора [4]. У мышей с опухолями ЦНС, подвергавшихся терапии геном HSV-ífc в составе аденовирусного вектора, была обнаружена демиелинизация нервов, прилегающих к месту введения. Серьезная проблема безопасности, связанная с применением вирусных векторов, может быть преодолена применением невирусных систем доставки, например липосом, поликатионов и др. Низкая эффективность трансфекции, характерная для невирусных систем доставки, может быть преодолена применением стратегии «суицидных» генов, когда даже 10%-ная эффективность трансфекции достаточна для гибели 75-80% клеток опухоли [5].

В нашем институте под руководством академика РАМН А.И. Арчакова давно занимаются изучением свойств и структуры цитохрома Р450. В 1998 году А.И. Арчаковым была высказана идея о применении накопленных знаний в данной области для оценки возможности применения одной из изоформ цитохрома Р450-СУР450 2В6 для генотерапии опухолей человека. Эта диссертационная работа представляет собой материал по исследованию влияния реомбинантного цитохрома Р450 2В6 на изменение чувствительности клеток эукариот к противоопухолевому препарату циклофосфамиду.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлась оценка возможности терапии опухолей человека с помощью гена цитохрома CYP450 2В6 и циклофосфамида in vitro. Для достижения этого мы поставили перед собой ряд задач:

• Создание генетической конструкции, способной эффективно экспрессировать ген цитохрома в клетках эукариот

• Скрининг катионных липидов на цитотоксичность и выбор наиболее подходящих образцов.

• Приготовление катионных липосом и их характеристика.

• Получение и характеристика комплексов катионных липосом и ДНК.

• Осуществление трансфекции ДНК с помощью липосом в клетки эукариот in vitro.

• Достижение цитотоксического эффекта на опухолевых клетках при помощи комбинированной терапии.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработан оригинальный подход к созданию генотерапевтического протокола, сочетающего молекулярнобиологический (создание генетической конструкции, несущей функциональный ген, и последующее ее введение в клетки эукариот) и медицинский аспекты (применение цитостатика, активируемого в опухоли). Впервые в России опробована схема оценки цитотоксического действия ЦФА на опухолевых клетках, трансфицированных геном цитохрома Р450, in vitro. Создана генетическая конструкция, экспрессирующая цитохром Р450 2В6 как в клетках эукариот, так и в E.coli. В результате скрининга на клеточных линиях были отобраны новые синтетические катионные липиды, оказавшиеся наименее токсичными для клеток млекопитающих. Оптимизирована технология получения катионных липосом и контроля препаратов липосом и ДНК методом атомно-силовой микроскопии.

Результаты работы могут найти применение в экспериментальной и клинической онкологии, молекулярной биологии и медицине.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав обзора литературы и "Материалы и методы исследования", 4-х глав раздела "Результаты исследования и их обсуждение", выводов и

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Коломейчук, Сергей Николаевич

выводы.

1. Создана генетическая конструкция, экспрессирующая функционально активный рекомбинантный цитохром человека Р450 2В6 клетках E.coli и эукариот.

2. Комплексы катионных липосом с плазмидной ДНК представляют собой сферические частицы диаметром 300-400 нм, с находящейся внутри ДНК.

3. Среди десяти синтезированных катионных липидов для трансфекции были отобраны два наименее токсичных для клеток эукариот. Данные липиды могут быть рекомендованы в качестве невирусных систем доставки генетического материала в клетки.

4. Клетки эпителия почки человека линии 293, трансфицированные рекомбинантной плазмидой, содержащей ген цитохрома Р450 2В6, активируют циклофосфамид, повышая эффективность действия препарата.

Благодарности.

Спасибо моей семье за терпение!

Автор выражает глубокую благодарность академику РАМН А.И. Арчакову за создание благоприятных условий работы. Автор искренне признателен своим научным руководителям H.H. Соколову и В.И.Швецу за научное руководство, покровительство и поддержку. Особая благодарность сотрудникам ИБМХ В.Ю. Кузнецову (за помощь в проведении экспериментов по атомно-силовой микроскопии), О.Ю.Абакумовой (за содействие в экспериментах по оценке цитотоксических свойств липидов), а также сотруднице МГНЦ РАМН Е.А. Калашниковой (за содействие в экспериментах по оценке цитотоксического влияния ЦФА). Автор благодарен также всем сотрудникам лаборатории медицинской биотехнологии ИБМХ РАМН, сотрудникам лаборатории генетической инженерии центра "Биоинженерия" РАН и сотрудникам лаборатории Г.А. Серебренниковой (МИТХТ, каф. ХТТОС).

3.6. Заключение.

Несмотря на многочисленные сложности, сопутствующие использованию генотерапевтических подходов в терапии и лечении самых разнообразных заболеваний [23, 24, 25, 45, 99], это направление по-прежнему привлекает внимание как теоретиков, так и клиницистов. Применительно к лечению онкологических заболеваний генотерапевтический подход может решить один из краеугольных камней химиотерапии - избирательность доставки противоопухолевых аге'нтов либо направленность цитотоксического эффекта именно в опухолевых клеток. Одним из способов избирательной цитотоксичности модет стать использование генов цитохрома Р450, которые вовлечены во многочисленные реакции биотрансформации различных ксенобиотиков, включая лекарственные средства [100]. Белки семейства цитохрома Р450 катализируют реакции метаболической активации или деградации лекарственных средств. Особенно интересным в этом плане является цитохром Р450 2В6, осуществляющий активацию противоопухолевого агента - циклофосфамида, широко используемого в клинике для лечения целого ряда опухолей [128]. Поэтому представляется интересным посмотреть может ли трансфекция клеток геном Р450 2В6 увеличивать их чувствительность к циклофосфамиду.

Таким образом показано, что клетки эпителия почки человека линии 293, трансфицированные геном цитохрома человека CYP2B6, становятся чувствительными к ЦФА. Полученное значение концентрации ЦФА (0,25 мМ), при которой достигается гибель 45-50% трансфицированных клеток линии 293, находится в интервале концентраций препарата (0,1-0,5 мМ) в плазме после введения его пациентам [129]. Величина IC50, установленная для клеток линии 293, может быть далее использована в качестве начальной точки для экспериментов по исследованию чувствительности опухолей к комбинированной терапии in vivo.

Результаты настоящей работы доработки данный подход может протокола комбинированной терапии свидетельствуют о том, что после быть использован для разработки опухолей различной морфологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коломейчук, Сергей Николаевич, 2002 год

1. American Cancer Society. 1973-1999 Annual Reports.

2. Mountain A. Gene therapy: the first decade. Trends in Biotechnology, 18, 119128, 2000.

3. Roth J.A. Gene therapy for cancer. Am. Cancer Soc., 37: 1234-1245, 1999.

4. Hollon T. Researchers and regulations on first gene therapy death. Nat. Med. 6 (6), 2000.

5. Karle P., Renner M., Salmons В., Gunzburg W.H. Necrotic rather than apoptotic cell death caused by cytochrome P450-activated ifosfamide. Cancer Gene Ther., 8 (3): 220-230, 2001.

6. Anderson W.F., Blaese R.M., Culver K. The ADA human gene therapy clinical protocol: Points to Consider response with clinical protocol. Hum Gene Ther 1990 Fall; 1(3):331-62 July 6, 1990.

7. Blaese M. Vectors in cancer therapy:how will they deliver? Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995.

8. Баранов B.C. Генная терапия медицина XXI века. Соросовский образовательный журнал.№3. 1999. с.1-6.9. http:www.wiley. со. uk/genetherapy/clinical

9. Kuryama S. et al. Expression of a retrovirally-transduced gene under control of internal housekeeping gene promoter does not persist due to methylation a nd is restricted partially by 5-azacytidine treatment. Gene Ther., 5: 1299-1305, 1998.

10. Chu P. Retro virus-mediated gene transfer into human hematopoietic stem cells. J Mol Med 76, 184-192,1998

11. DeMatteo, R.P. et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. J Virol 71, 5330-5335, 1997.

12. Goins, W.F. et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol 3 Suppl 1, 80-88, 1997.

13. Подобед О.В., Жданов Р.И. Генный перенос с помошью невирусных векторов на основе поликатионов гидрофобных поликатионов в целях генной терапии. Генная терапия медицине будущего. Под редакцией А.В. Зеленина. 2000, с. 47-59.

14. Condon С. et al. DNA-based immunisation by in vivo transfection of dendritic cells. Nat.Med., 2: 1122-1128, 1996.

15. Mathei C. et al. Hepatitis В vaccine administration: comparison between jetgun and syringe and needle. Vaccine, 15:402-404, 1997.

16. Beltinger C., Uckert W., Debatin K.-M. Suicide gene therapy for pediatric tumors.

17. Wolff J.A. et al. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. Hum.Mol.Genet., 1: 363-369, 1992.

18. Hengge U. et al. Cytokine gene expression in epidermis with biological effects following injection of plasmid DNA. Nat. Genet., 10: 161-166, 1995.

19. Wang R. et al. Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans injected with a malaria DNA vaccine. Science, 282: 476-480, 1996.

20. Feigner P.L., Gadek Т., Holm M., Roman R., Chan W., Wenz M., Northtrop J.P., Ringold G.M., Danielson M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci. U S A., 84 (21):7413-7417. 1987.

21. Жданов P.И., Куценко Н.Г., Подобед О.В., Цветкова Т.А., Коневец Д.Н., Власов В.В. Холестериноилпроизводные олигоэтиленимина как медиаторы трансфекции эукариотическихклеток в генной терапии. Доклады Академии Наук, т.361, №5, 1998, с.695-699.

22. Hope M.J., Mui В., Ansell S., Ahkong Q.F. Cationic lipids, phosphatidylethanolamine and the intracellular delivery of polymeric, nucleic acid-based drugs. Molecular Membrane Biology. 15, 1-14, 1998.

23. Wiethoff C.M., Gill M.L., Кое G.S., Кое J.G., Middaugh C.R. The structural organization of cationic lipid/DNA complexes. J. Biol. Chem. 2002 Sep 23; v.140, p.567-580, 2002.26. basic D. D. Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997.

24. Sylvius R., Leventis J.R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochim. Biophys. Acta, v.1023 (1): 124-132, 1997.

25. Templeton N.S., basic D.D. New directions in liposome gene delivery. Mol Biotechnol.; v. 11 (2): 175-180, Apr, 1999.

26. Benimetskaya L., Takle G.B., Vilenchik M. Cationic porphyrins: novel delivery vehicles for antisense oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 26: 5310-5317, 1998.

27. Citro G., Perrotti D., Cucco C. Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 7031-7035,1992.

28. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res., 25:2730-2736, 1997.

29. Schoen P., Chonn A., Cullis P.R., Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles. Gene Ther., 6: 823-832, 1999.

30. Boussif O. et al. Optimized galenics improve in vitro gene transfer by cationic molecules up to 1000-fold. Gene Ther., 3: 1074-1080, 1996.

31. Goula D. et al. Polyethyleneimine-based intravenous delivery of transgene into mouse lung. Gene Ther., 5: 1291-1295, 1998.

32. Yu L., Nielsen M., Han S.O., Wan Kim S. TerplexDNA gene carrier system targeting artery wall cells. Journal of Controlled Release.,vol. 72, No. 1-3, 14-May, 2001.

33. Merdan T., Kopecbreveek J., Kissel T. Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer. Adv Drug Deliv Rev 2002 Sep 13;54(5):715, 2002.

34. Searle P.F., Mautner V. Adenoviral vectors: not to be sneezed at. Gene ther., 5: 725-727, 1998.

35. Bilbao G. Improving adenoviral vectors for gene delivery. Tumor Targeting, 3: 59-79, 1998.

36. Kaplan J.M. et al. Humoral and cellular immune responces of nonhuman patients to long-term repeated lung exposure to Ad2/CFTR-2. Gene Ther., 3: 117127, 1996.

37. Fine H.A. Prospect for gene therapy as an innovative approach to malignant gliomas. Persp. Neurol. Surg., 5: 115-127, 1994.

38. Miller N., Whealan J. Progress in transcriptionally targeted and regulatable vectors for genetic therapy. Hum. Gene Ther., 8: 803-815, 1997.

39. Ory D.S. et al. A stable human-derived packaging cell line for production high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A., 93: 11400-11406, 1996.

40. Donahue B.A. et al. Selective uptake and sustained expression of AAV vectors following subcutaneous delivery. J.Gene Med., 1: 31-42, 1999.

41. Linden R.M., Woo S.L. AAVant-garde gene therapy. Nat. Med., 5: 21-22, 1999.

42. Conrad C.K. et al. Safety of a single-dose administration of an adeno-associated virus (AAV)-CFTR vector in the primate lung. Gene Ther., 3: 658-668, 1996.

43. Wagner J.A. Efficient and persistent gene transfer of AAV-CFTR in maxillamus. Lancet, 351:1702-1703, 1998.

44. Xiao W. et al. Gene therapy vectors based on adeno-associated virus type 2. J.Virol., 73: 3994-4003, 1999.

45. Bartlett J.S. et al. Targeted adeno-associated virus vector transduction of nonpermissive cells mediated by a bispecific F (ab' gamma)2 antibody. NatBiotechnol, 171: 181-186, 1999.

46. Kanai F., Hamada H., Shiratori Y., Omata M. Adenovirus-mediated enzyme-prodrug therapy for cancer. Cancer Journal, v.10 (6): 215-221, 1997.

47. Hunter E., Swanstrom R. Retrovirus envelope glycoproteins. Curr.Top. Microbiol. Immunol., 1999. 157: 187-253.

48. Gunzburg W.H., Salmons B. Development of retroviral vectors as safe, targeted gene delivery systems. J. Mol. Med., 74: 171-182, 1996.

49. Gladow M., Becker C., Blankenstein T., Uckert W. MLV-10A1 retrovirus pseudotype efficiently transduces primary human CD4+ T lymphocytes. J Gene Med, 2(6):409-15, Nov-Dec 2000.

50. Peng K.W., Vile R. Strategies for targeting therapeutic gene delivery. Mol. Med. Today., 5(10):448-53. Oct. 1999.

51. Richards C.A., Austin E.A., Huber B.E. Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen: identification and use with cytosine deaminase for tumor-specific gene therapy. Hum Gene Ther. 6(7):881-93, Jul, 1995.

52. Furth P.A., St Onge L., Boger H., Gruss P., Gossen M., Kistner A., Bujard H., Hennighausen L. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sci USA, v.91(20):9302-6, Sep. 27,1994

53. Lu B., Federoff H.J. Herpes simplex virus type 1 amplicon vectors with glucocorticoid-inducible gene expression. Hum Gene Ther., 6(4):419-28, Apr 1995.

54. Koh G.Y., Kim S.J., Klug M.G., Park K., Soonpaa M.H., Field L.J. Targeted expression of transforming growth factor-beta 1 in intracardiac grafts promotes vascular endothelial cell DNA synthesis. J Clin Invest., 95(1): 114-21, Jan, 1995.

55. Kaneko S., Hallenbeck P., Kotani T. et al. Adenovirus-mediated gene therapy of hepatocellular carcinoma using cancer-specific gene expression. Cancer Res., 55: 5283-5287, 1995.

56. Kanai F., Shiratori Y., Yoshida Y. et al. Gene therapy for alpha-fetoprotein producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hepatology, 23: 1359-1368, 1996.

57. Osaki T., Tanio Y., Tachibana I. Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type-specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene. Cancer Res., 54: 5258-5261, 1994.

58. Tanaka T., Kanai F., Okabe S. Adenovirus-mediated prodrug gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human gastric carcinoma cells in vitro. Cancer Res., 56: 1341-1345, 1996.

59. Lan K.H., Kanai F., Shiratori Y. Tumor-specific gene expression in carcinoembryonic antigen-producing gastric cancer cells using adenovirus vectors. Gastroenterology, 111:1241-1251, 1996.

60. Harris J.D., Gutierres A.A., Hurst H.C. Gene therapy for cancer using tumor-specific prodrug activation. Gene Ther., 1: 170-175, 1994.

61. Chen L, Chen D., Manome Y. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. J.Clin. Invest, 96:2775-2782, 1995.

62. Aird W.C, Jahroudi N, Weiler-Giettler H. Human von Willebrand factor gene sequences target expression to asubpopulation of endothelial cells in transgenic mice. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 92:4567-4571, 1995.

63. Ozaki K, Yoshida T, Ide H. Use of von Willebrand factor promoter to transduce suicidal gene to human endothelial cells HUVEC. Hum. Gene Ther, 7: 1483-1490, 1996.

64. Vile R.G, Hart I.R. In vitro and in vivo targeting of gene expression to melanoma cells. Cancer Res, 53: 962-967,1993.

65. Lee C.-H, Liu M, Sie K-L. Prostate-specific antigen promoter driven gene therapy targeting DNA polymerase A and topoisomerase IIA in prostate cancer. Anticancer Res, 16: 1805-1812, 1996.

66. Lee S, Kim H, Yu R, Lee K, Gardner T, Jung C, Jeng M, Yeung F, Cheng L, Kao C. Novel Prostate-Specific Promoter Derived from PSA and PSMA Enhancers. Mol Ther. 2002 Sep;6(3):415.

67. Rossi J.J, Cantin E.M, Sarver N, Chang P.F. The potential use of catalytic RNAs in therapy of HIV infection and other diseases. Pharmacol. Ther, 50:245, 1991.

68. Kobayashi H, Dorai T, Holland J.F, Ohnuma T. Reversal of drug sensitivity in multidrug-resistant tumor cells by an MDR1 (PGY1) rybozyme. Cancer Res, 54: 1271, 1994.

69. Kashani-Sabet M, Funato T, Florenes V.A, Fodstad O, Scanlon K.J. Suppression of the neoplastic phenotype in vivo by an anti-ras rybozyme. Cancer Res, 54: 900, 1994.

70. James H.A, Gibson I. The therapeutic potential of rybozymes. Blood, v.91(2):371-382, 1998.

71. Jen K-Y., Gewirtz A.M. Suppression of gene expression by targeted disruption of messenger RNA: available options and current strategies. Stem cells, v. 18 (5):307-319, 2000.

72. Sharp P.A. RNAi and double-stranded RNA. Genes Dev., 13: 139-142, 1999.

73. Nielson P.E., Egholm M., Berg R.H. Peptide nucleic acids (PNA): potential antisense and anti-gene agents. Anticancer Drug Res., 8: 53-63, 1993.

74. Renner C., Kubuschok B., Trumper L., Pfreundschuh M. Clinical approaches to vaccination in oncology. Ann. Hematol., 80: 255-266, 2001.

75. Viret C., Lindemann A. Tumor immunotherapy by vaccinationwith cytokine gene transfected cells. Int. Rev. Immunol., 14: 193-212, 1997.

76. Golumbek P.T., Lazenby A.J., Levitsky H.I., Jaffee L.M., Karasuyama H., Baker M., Pardoll D.M. Treatment of established renal cancer by tumor cells engineered to secrete interleukin-4. Science., 254(5032):713-716, Nov 1, 1991.

77. Agha-Mohammadi S., Lotze M.T. Immunomodulation of cancer: potential use of selectively replicated agents. J. Clin.Invest., 105: 1173-1176, 2000.

78. Roth J.A., Cristiano R.J. Gene therapy for cancer: what have we done and where are we going? J. Natl. Cancer Inst., 89: 21-39, 1997.

79. Guo Y., Wu M., Chen H., Wang X, Liu G., Li G., Ma J., Sy M.S. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science. 263 (5146):518-520, Jan 28, 1994.

80. Roth J.A., Grammer S.F., Swisher S.G., Komaki R., Nemunaitis J., Merritt J., Fujiwara T., Meyn R.E. Jr. Gene therapy approaches for the management of non-small cell lung cancer. Semin Oncol., 28 (4 Suppl 14): 50-56, Aug 2001.

81. Tait D.L., Obermiller P.S., Hatmaker A.R., Redlin-Frazier S., Holt J.T. Ovarian cancer BRCA1 gene therapy: Phase I and II trial differences in immune response and vector stability. Clin Cancer Res., 5(7): 1708-1714, Jul 1999.

82. Mountain A. Trends in Biotechnology, 18, 119-128, 2000.

83. Beltinger C„ Uckert W., Debatin K.M. J Mol Med; 78, 598-612, 2001.

84. Kammertoens T., Gelbmann W., Karle P., Alton K., Sailer R., Salmons B., Gunzburg W.H., Uckert W. Cancer Gene Ther; 7: 629-636, 2000.

85. Pan X, Li Z, Xu G, Et AI. Adenoviral mediated suicide gene transfer in the treatment of pancreatic cancer.Chin Med J (Engl). 2002 Aug;l 15(8):1205-1208

86. Hunt S. Technology evaluation: MetXia-P450, Oxford Biomedica. Curr Opin Mol Ther 2001 Dec;3(6): 595-598, 2001.

87. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and Molecular Oxygen. Taylor & Francis. 1990, 339 p.

88. Sladek N.E. Metabolism of oxazophosphorines. Pharmacol. Ther., 37: 1988, 301-355.

89. Patterson L.H., McKeown S.R., Robson T., Gallagher R., Raleigh S.M., Orr S. Antitumour prodrug development using cytochrome P450 (CYP) mediated activation. Anticancer Drug Des. 1999 Dec; 14(6): 473-86, 1999.

90. Weber G.F., Waxman D.J. Activation of the anti-cancer drug ifosphamide by rat liver microsomal P450 enzymes. Biochem Pharmacol., 45(8): 1685-1694, Apr 22,1993.

91. Chen L., Waxman D.J., Chen D., Kufe D.W. Sensitization of human breast cancer cells to cyclophosphamide and ifosfamide by transfer of a liver cytochrome P450 gene. Cancer Res., 56(6):1331-1340, Mar 15, 1996.

92. Grignet-Debrus C., Calberg-Bacq C.M. Potential of Varicella zoster virus thymidine kinase as a suicide gene in breast cancer cells. Gene Ther 1997 Jun; 4(6):560-9, 1997.

93. Kievit E., Bershad E., Ng E., Sethna P., Dev I., Lawrence T.S., Rehemtulla A. Superiority of yeast over bacterial cytosine deaminase for enzyme/prodrug gene therapy in colon cancer xenografts. Cancer Res. 1999 Apr 1; 59(7): 1417-21, 1999.

94. Schwartz P.S., Waxman D.J. Cyclophosphamide induces caspase 9-dependent apoptosis in 9L tumor cells. Mol. Pharmacol. 2001 Dec;60(6): 1268-79, 2001.

95. Guengerich F.P., Martin M.V., Guo Z., Chun Y.-J. Purification of Functional Recombinant P450s from Bacteria. In Methods of Enzymology, v.272, pp 35 44.

96. Bustamante C., Vesenka J., Tang C.L., Lees W., Guthold M., and Keller R. Biochemistry 31, 22-26, 1992.

97. P.Wagner. FEBS Letters, 430, 112-115, 1998.

98. Константинова T.B., Дюбанкова H.H., Клыков B.H., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Биоорг. Химия; 2002. 28:180-184.

99. Promega. Transfection guide. Pp.60. 1999.

100. Abakumova O.Yu., Podobed O.V., Tsvetkova T.A., Yakusheva I.V., Moskvitina T.A., Kondakova L.I., Navasardyantz D.G., Medvedev A.E. J. Neural. Transm. Suppl; 52:87-91, 1998.

101. Альберте, Брей. Справочник биохимика. Москва, Мир, 1994.

102. Papahajopoulos D., Szoka F. Annu Rev Biophys Bioeng, 9: 4 67-508, 1980.

103. Smisterova J., Wagenaar A., Stuart М.С., Polushkin E., ten Brinke G., Hulst R., Engberts J.B, Hoekstra D. J. Biol. Chem., 276, 47615 47622, 2001.

104. Filion M.C., Phillips N.C. Biochimica et Biophysica Acta, 1329, 345-356, 1997.

105. Kawaura C., Noguchi A., Furuno Т., Nakanishi M. Atomic force microscopy for studying gene transfection mediated by cationic liposomes with a cationic cholesterol derivative. FEBSLett., 421, 69-72, 1998.

106. Xie H.J., Lundgren S., Broberg U., Finnstrom N., Rane A., Hassan M. Effect of cyclophosphamide on gene expression of cytochromes p450 and beta-actin in the HL-60 cell line. Eur J Pharmacol. 2002; v.449(3): 197-205.

107. Chabot G.G. Factors involved in clinical pharmacology variability in oncology. Anticancer Res. 1994. V. 14, p. 2269-2272.

108. Wright J.E. Analysis of 4-hydroxycyclophosphamide in human blood. Analyt. Biochem., 224, p. 154-158, 1995.