Разработка подходов к разрушению кольцевой ковалентно замкнутой ДНК вируса гепатита В с помощью нуклеаз CRISPR/Cas9 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Костюшев Дмитрий Сергеевич

• Костюшев Дмитрий Сергеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Костюшев Дмитрий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Материалы и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Личное участие автора и получение результатов

Внедрение результатов исследования

Степень достоверности и апробация результатов

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирус гепатита В

1.1. Строение вируса гепатита В и структура генома

1.2. Цикл ВГВ

1.3. Регуляция репликации вируса

1.4. Особенности хронической инфекции и современные подходы к терапии

1.5. КкзДНК ВГВ как основная причина персистенции вируса

2. Системы сайт-специфических нуклеаз СМ8РК/Сав9

2.1. Системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9: классификация и принципы действия

2.2. Целевая и внецелевая активность CRISPR/Cas9

3. Описание ортологичных систем СМ8РК/Сав9

4. Системы СШ8РК/Сав9 и ВГВ

5. Системы CRISPR/Cas9 как основа для создания противовирусных препаратов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Культуры клеток

2. Трансфекция линий клеток

3.Синтез рекомбинантной ккзДНК ВГВ

4. Дизайн и получение компонентов систем CRISPR/Cas9

5. Выделение нуклеиновых кислот

6. ПЦР-анализ

7. Определение HBsAg

8. Иммуноцитохимическое окрашивание

9. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия

10. Анализ целевого и внецелевого действия методом секвенирования нового поколения

11. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ ОРТОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМ CRISPR/CAS9

3.1. Дизайн и синтез РНК-проводников

3.2. Поиск консервативных регионов-мишеней для CRISPR/Cas9 в геноме вируса гепатита В разных генотипов

3.3. Влияние ортологичных систем CRISPR/Cas9 на жизненный цикл вируса гепатита В

3.4. Деградация рекомбинантной ккзДНК под действием ортологичных систем CRISPR/Cas9

3.5. Системы CRISPR/Cas9 эффективно подавляют репликацию ВГВ на стабильных клеточных линиях

3.6. Нуклеолитическое разрезание ккзДНК системами CRISPR/Cas9

ГЛАВА 4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ОРТОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМ CRISPR/Cas9

4.1. Сравнение внецелевой активности классической системы S. pyogenes CRISPR/Cas9 и ортологичной системы S.thermophilus CRISPR/Cas9

4.2. Влияние несовпадений нуклеотидов между последовательностями РНК-проводника и ДНК-мишенью системы S.thermophilus CRISPR/Cas9

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГВ - вирус гепатита В (Hepatitis B Virus)

ОРС - открытая рамка считывания

кчдДНК - кольцевая частично двуцепочечная ДНК

ХГВ - хронический гепатит В

пгРНК - прегеномная РНК

ккзДНК - кольцевая ковалентно замкнутая ДНК

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

StCas9 - белок Cas9 Streptococcus thermophilus

SpCas9 - белок Cas9 Streptococcus pyogenes

rcDNA - кольцевая частично-двуцепочечная ДНК (relaxed circular DNA)

PAM - мотив, прилежащий к протоспейсеру (Protospacer Adjacent Motif)

NTCP - натрий таурохолат ко-транспортирующий полипептид (Na+-Taurochlorat Cotransporting Polypeptide)

NmCas9 - белок Cas9 Neisseria meningitidis

NGS - секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing) NLS - сигнал ядерной локализации (Nuclear Localization Signal) HBxAg - белок X вируса гепатита В (Hepatitis B Virus X Antigen) HBsAg - белок S вируса гепатита В (Hepatitis B Virus S Antigen)

HBeAg - белок Е вируса гепатита В (Hepatitis B Virus E Antigen) HBcAg - белок С вируса гепатита В (Hepatitis B Virus C Antigen) GFP - зеленый флуоресцентный белоке (Green Fluorescent Protein) FnCas9 - белок Cas9 Francisella novicida DR - прямые повторы (Direct Repeats) РНКп - РНК-проводник

CRISPR/Cas9 - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

crRNA - CRISPR-РНК (CRISPR-related RNA)

tracrRNA - транс-активационная РНК (trans-activating crRNA)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подходов к разрушению кольцевой ковалентно замкнутой ДНК вируса гепатита В с помощью нуклеаз CRISPR/Cas9»

Актуальность темы исследования

Гепатит В - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом гепатита В (ВГВ). По всему миру более 250 миллионов человек страдают от хронической формы инфекции (ХГВ), которая является причиной гибели более 1 миллиона человек ежегодно, что связано с последствиями заболевания, такими как цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома [21]. Ни один из современных методов терапии не приводит к полному излечению пациентов с ХГВ. Непосредственной причиной хронической инфекции и персистенции вируса в клетке является особая форма генома ВГВ, кольцевая ковалентно замкнутая ДНК ВГВ (ккзДНК) [92]. Матрицы ккзДНК способны в течение неограниченного срока находиться в ядре гепатоцитов и поддерживать репликацию вируса. КкзДНК ВГВ существует в виде минихромосомы в комплексе с белками вируса, гистоновыми и негистоновыми белками клетки [8].

Одной из наиболее перспективных технологий, которая может обеспечить деградацию генома ВГВ и полную элиминацию пула ккзДНК из инфицированных клеток, является технология сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9. В экспериментах in vitro и in vivo системы CRISPR/Cas9, нацеленные на участки генома ВГВ, индуцируют образование двуцепочечных разрывов в ккзДНК ВГВ и приводят к значительному снижению числа копий ккзДНК в клетке либо к образованию в ккзДНК мутаций со сдвигами рамок считывания по типу делеций и вставок нуклеотидов [18, 37, 71].

Элементами CRISPR-систем являются РНК-проводники и белки Cas, обладающие нуклеолитической активностью. Cas9 содержит каталитические домены RuvC и HNH, отвечающие за разрезание цепей ДНК. Узнавание мишени происходит за счет взаимодействия РНК-проводника (химерного конструкта с элементами распознавания Cas9 белка и целевой мишени) с комплементарным

участком ДНК. Разрезание целевой мишени возможно только при условии совпадения мишени (19-20 нуклеотидов) и наличия проксимального участка 5' РАМ. Существует несколько типов CRISPR-систем, но в генной инженерии наиболее часто используются CRISPR-системы типа II [49].

Несмотря на значительные успехи в деградации ккзДНК в условиях эксперимента, остается большое количество нерешенных вопросов, связанных с дальнейшим внедрением CRISPR/Cas9 в клиническую практику, к которым относятся: (а) высокая генетическая гетерогенность вируса и, следовательно, необходимость поиска эффективных РНК-проводников на высококонсервативные участки генома ВГВ; (б) высокая вероятность внецелевых эффектов CRISPR/Cas9, когда в геноме клеток хозяина присутствуют сайты, идентичные сайтам нуклеолитического расщепления в геноме вируса, что потенциально может приводить к мутациям, трансформации клеток или индукции их гибели; (в) необходимость поиска комбинаций, составленных из высокоэффективных РНК-проводников, мишенью которых являются высококонсервативные (пан-генотипные) участки ВГВ.

Ранее для элиминации ккзДНК ВГВ была использована CRISPR/Cas9 система от организма Streptococcus pyogenes (Sp), при использовании которой происходит образование частых внецелевых разрывов в геноме человека. Возможным способом решения перечисленных проблем является использование ортологичных систем CRISPR/Cas9 II типа, полученных от других организмов. Отличительными особенностями указанных систем является меньшая частота внесения разрывов в геном клеток по внецелевым сайтам.

Сегодня ХГВ является одной из самых сложных проблем мирового здравоохранения, это одно из самых распространенных заболеваний в мире, от исходов которого ежегодно погибает больше людей, чем от ВИЧ, туберкулеза и малярии [101, 124]. Для полного излечения ХГВ необходима разработка подхода по элиминации ккзДНК ВГВ, ключевого компонента вирусного цикла, из

инфицированных клеток. CRISPR/Cas9-CHCTeMbi являются одной из немногих технологий, способных оказывать прямое воздействие на геномы вируса и расщеплять матрицы ккзДНК. Расщепление ккзДНК - основное условие для разработки препарата, способного полностью вылечить ХГВ.

Степень разработанности темы исследования

Элиминация ккзДНК из инфицированных клеток - ключевая задача для создания подходов к полному излечению пациентов с хронической инфекцией. В ранее опубликованных работах было показано, что классическая система нуклеаз CRISPR/Cas9 от организма S.pyogenes (SpCas9) может эффективно разрезать ккзДНК ВГВ по запрограммированным сайтам и, тем самым, подавлять транскрипцию и репликацию вируса за счет частичного разрушения ккзДНК ВГВ и внесения мутаций в геном вируса по типу вставок и делеций. Основными проблемами использования CRISPR/Cas9 систем для элиминации инфекции ВГВ являются низкая эффективность действия и высокая частота образования внецелевых мутаций в геноме человека. Классическая система SpCas9 может снижать все показатели вирусного цикла ВГВ более, чем на 90%. Однако, при использовании SpCas9 детектируется разрезание не только генома ВГВ, но и участков в геноме человека. Внецелевое разрезание может нарушать функционирование генов, способствовать аберрантной экспрессии генов, вызывать гибель или трансформацию клеток. Таким образом, специфичность действия CRISPR/Cas9 играет ключевую роль при создании на их основе противовирусных препаратов. Среди большого разнообразия систем CRISPR/Cas9, наиболее пригодными для практического использования являются системы CRISPR/Cas9 типа II. Для функционирования систем данного типа необходимо всего два компонента: белок Cas9 и РНК-проводник. Среди ортологичных систем CRISPR/Cas9 типа II (систем, полученных от разных организмов) ранее были получены данные по использованию классической системы SpCas9 и системы CRISPR/Cas9 от организма Staphilococcus aureus,

которая имеет ряд преимуществ в сравнении с классической системой нуклеаз. Использование иных ортологичных систем CRISPR/Cas9 для разрезания ккзДНК ВГВ и сравнения их эффективности и специфичности действия в сравнении с классической системой ранее не проводилось. Помимо изучения систем CRISPR/Cas9 с увеличенной специфичностью (системы организмов Neisseria meningitidis и Streptococcus thermophilus), была изучена возможность использования перспективной системы CRISPR/Cas9 от организма Francisella novicida, мишенью которой может быть не только ДНК, но и РНК, что позволяет одновременной разрушать и геном вируса, и вирусные транскрипты. Особенно важно, что в данной работе впервые для подавления цикла ВГВ была использована система CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus (StCas9), проведена оценка эффективности действия этой системы, изучено внецелевое действие и влияние несовпадений нуклеотидов на возможность внесения нуклеолитических разрывов в мишень ДНК. В совокупности, данная работа охватывает наиболее перспективные системы CRISPR/Cas9 и приводит характеристику системы StCas9, как основу для разработки противовирусных препаратов и разрушения генома ВГВ.

Цель исследования

Разработка безопасного и эффективного подхода к элиминации ккзДНК с помощью систем CRISPR/Cas9.

Задачи исследования

1. Провести анализ консервативности генома вируса гепатита В разных генотипов.

2. Подобрать последовательности РНК-проводников к геному ВГВ для четырех типов систем CRISPR/Cas9 (Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Neisseria meningitidis, Francisella novicida) и провести сравнительный анализ

эффективности CRISPR/Cas9 на модели ко-трансфекции клеток HepG2 in vitro с единичными РНК-проводниками и их комбинациями.

3. Провести анализ безопасности РНК-проводников по наличию потенциальных внецелевых мишеней в геноме человека методами in silico.

4. Оценить влияние наиболее эффективных и безопасных CRISPR/Cas9 систем на транскрипцию, репликацию, продукцию вирусных белков ВГВ и уровни ккзДНК на модели хронической инфекции ВГВ HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV.

5. Оценить действие CRISPR/Cas9 на ккзДНК ВГВ с помощью секвенирования целевых участков нуклеолитических разрывов.

Научная новизна

Впервые проведена сравнительная оценка эффективности противовирусного действия и специфичности ортологичных систем нуклеаз CRISPR/Cas9 на моделях ВГВ-инфекции in vitro.

Впервые созданы РНК-проводники к высококонсервативным регионам генома ВГВ разных генотипов, которые обеспечивают эффективное прерывание жизненного цикла вируса и разрушение ключевой формы генома ВГВ (ккзДНК) любого генотипа или большинства генотипов вируса.

Впервые использована система CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus, продемонстрирована ее высокая противовирусная активность, изучены свойства системы по способности игнорировать несовпадения нуклеотидов между РНК-проводниками и ДНК-мишенью.

Впервые проведен анализ специфичности действия системы CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus в сравнении с классической системой нуклеаз, и продемонстрировано отсутствие внецелевого действия системы.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты сравнительной оценки эффективности действия ортологичных систем CRISPR/Cas9 с исчерпывающим набором РНК-проводником на консервативные регионы генома ВГВ продемонстрировали крайне низкую эффективность систем организмов Neisseria meningitidis и Francisella novicida, и в то же время схожую высокую эффективность систем организмов Streptococcus pyogenes и Streptococcus thermophilus.

Прямое сравнение частоты внецелевого разрезания генома человека системами Streptococcus pyogenes и Streptococcus thermophilus выявило частое внецелевое действие первой системы и его отсутствие для второй.

Продемонстрировано свойство системы организма Streptococcus thermophilus игнорировать несовпадения нуклеотидов между последовательностью РНК-проводника и ДНК-мишенью, что, с одной стороны, подтверждает возможность разрушения ккзДНК ВГВ с одиночными мутациями и, с другой стороны, характеризует специфичность действия системы.

В совокупности, в рамках данной работы были получены результаты анализа функционирования ортологичных систем CRISPR/Cas9, которые характеризуют систему CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus, состоящую из белка Cas9 и одного из РНК-проводников (St3, St4, St10), как перспективную систему для создания на ее основе генно-терапевтических препаратов для полной элиминации ВГВ из инфицированных клеток и лечения пациентов с хронической инфекцией.

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач использовали комплекс вирусологических, молекулярно-биологических, клеточных, биоинформатических и статистических методов исследования.

Положения, выносимые на защиту

1. Системы CRISPR/Cas9 от организмов Streptococcus pyogenes и Streptococcus thermophilus обладают схожей эффективностью противовирусного действия, элиминируя до 90% маркеров ВГВ в период эксперимента;

2. Системы CRISPR/Cas9 от организмов Neisseria meningitidis и Francisella novicida не обладают выраженной противовирусной активностью на моделях ВГВ;

3. Мишенью созданных РНК-проводников являются высококонсервативные регионы генома ВГВ, что позволяет использовать их для разрушения генома ВГВ практически любого генотипа;

4. Система CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus не проявляет внецелевой активности и является более безопасной в сравнении с классической системой нуклеаз CRISPR/Cas9;

5. Система CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus игнорирует однонуклеотидные несовпадения нуклеотидов между РНК-проводником и ДНК-мишенью, однако два и более несовпадения нуклеотидов значительно снижают или полностью блокируют активность системы.

Личное участие автора и получение результатов

Автором осуществлено планирование, организация и проведение исследований по разделам диссертации. Автор являлся основным исполнителем гранта Российского Научного Фонда №16-15-10426 «Элиминация ккзДНК вируса гепатита В при хронической инфекции за счет нуклеолитического действия CRISPR/Cas9 систем, эпигенетического ремоделирования и модуляции путей репарации двуцепочечных разрывов», в рамках которого происходило выполнение данной работы. Автором был проведен дизайн и синтез РНК-проводников, всесторонний анализ свойств РНК-проводников и систем CRISPR/Cas9, поставлены эксперименты по сравнению противовирусной активности систем CRISPR/Cas9, специфичности действия и способности

игнорировать неспаренные нуклеотиды, организовано создание алгоритмов для анализа целевого и внецелевого действия нуклеаз.

Самостоятельно было проведено планирование всех заявленных экспериментов, подготовлены основные публикации и патенты, сформулированы выводы и основные положения диссертации.

Внедрение результатов исследования

На основании результатов исследования получен патент «РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина», номер патентной заявки: 2017146777, номер публикации: 2652899, дата выдачи патента: 03.05.2018 и подана заявка на патент «РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифичной системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9), и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита В в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина», номер патентной заявки: 2018144265, дата подачи патентной заявки: 13.12.18. Результаты работы могут использоваться для создания генно-терапевтических препаратов для элиминации ВГВ из инфицированных клеток и, в перспективе, лечения пациентов с хронической инфекцией ВГВ.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных в ходе работы данных определяется

достаточным количеством исследований, всесторонним изучением активности и

специфичности систем CRISPR/Cas9 на большом числе различных моделей

хронической инфекции in vitro с использованием различных подходов к доставке

систем и анализом данных. Все результаты были воспроизведены как минимум в

3-5 независимых экспериментах. Противовирусная активность изучена на уровне

РНК, ДНК, белка и по детекции разрывов, вносимых нуклеазами, методом

13

высокопроизводительного секвенирования. Специфичность действия определяли в сравнении с уже описанной классической системой нуклеаз методом высокопроизводительного секвенирования и по определению способности игнорировать несовпадения нуклеотидов между РНК-проводником и ДНК-мишенью в достаточном количестве повторностей по 4 параметрам и детекции нуклеолитических разрывов.

Результаты работы были представлены и обсуждены на международных конференциях APASL 2019 (Philippines, Manila, 2019), 16th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases (Canada, Toronto, 2018), конгрессе HEP DART 2017 (USA, Kona, 2017), Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2017» (Москва, 2017), «Молекулярная диагностика 2018» (Беларусь, Минск, 2018), X Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 2018).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Основные научные положения диссертации соответствуют п. 5 и п. 10 паспорта специальности 03.02.02 «Вирусология».

Публикации

Основные результаты работы полностью отражены в печати. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, получен 1 патент, зарегистрирована 1 заявка на патент.

Список опубликованных работ

1) Чуланов В.П., Семененко Т.А., Карандашова И.В., Комарова С.В.,

Костюшев Д.С., Суслов А.П., Волчкова Е.В. Современный взгляд на

проблему выбора вакцины против гепатита В. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017, Т.16 4(95), с. 65-72;

2) Костюшев Д.С., Зуева А.П., Брезгин С.А., Липатников А.Д., Симирский В.Н., Glebe D., Волчкова Е.В., Шипулин Г.А., Чуланов В.П. Роль гиперэкспрессии ДНК-метилтрансфераз в персистенции кольцевой ковалентно замкнутой ДНК при хроническом гепатите В. Терапевтический архив. 2017, 89(11), с. 21-26;

3) Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Костюшева А.П., Липатников А.Д., Симирский В.Н., Мамонова Н.А., Волчкова Е.В., Малеев В.В., Чуланов В.П. Усиление образования фокусов фосфорилированного гистона Н2АХ в ядрах клеток при инфекции вирусами гепатита В и D. Вопросы Вирусологии. 2018 63(4), с. 165-170;

4) Костюшев Д.С., Зуева А.П., Брезгин С.А., Липатников А.Д., Волчкова Е.В., Малеев В.В., Чуланов В.П. Роль ДНК-метилтрансфераз в жизненном цикле вируса гепатита В и патогенезе хронического гепатита В. Вопросы вирусологии. 2018, 63(1). С. 19-29;

5) Dmitry Kostyushev, Sergey Brezgin, Anastasiya Kostyusheva, Dmitry Zarifyan, Irina Goptar, Vladimir Chulanov. Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus. Cellular and Molecular Life Sciences. 2019;76(9):1779-1794 .DOI: 10.1007/s00018-019-03021 -8.

Полученные патенты

1) Костюшев Д.С., Костюшева А.П., Зарифьян Д.Н., Брезгин С.А., Чуланов В.П. РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина. Номер патентной заявки: 2017146777. Номер публикации: 0002652899. Дата выдачи патента: 03.05.2018.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, двух глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 28 рисунками, 4 таблицами и 2 приложениями. Библиографический указатель содержит 141 источник.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирус гепатита В

1.1. Строение вируса гепатита В и структура генома

Зрелый вирион ВГВ (частица Дейна) включает нуклеокапсид, состоящий из молекул НВсЛ§, в котором находится вирусный геном, ковалентно связанный с вирусной полимеразой на 5'-конце минус-цепи [22]. Нуклеокапсид окружён липидной оболочкой клеточного происхождения с инкорпорированными в ней вирусными поверхностными белками иббл§. Геном вируса представляет собой частично двухцепочечную кольцевую ДНК размером около 3.2 кб.

Геном ВГВ имеет четыре открытых рамки считывания: Б, С, Р, Х. Рамка Б кодирует вирусный белок иббл§, который разделяется структурно и функционально на области пре-Б1, пре-Б2 и Б. Рамка С кодирует 2 белка: белок вирусного нуклеокапсида - НВсAg и НВеAg. Синтез определенного белка происходит в зависимости от сайта инициации транскрипции. ИБеЛ§ способен к самосборке в капсид-подобные структуры; на С-конце антигена находится область, состоящая из остатков основных аминокислот и необходимая для связывания с РНК [28].

Полимераза ВГВ кодируется открытой рамкой считывания Р и функционально подразделяется на три домена: (1) терминальный, участвующий в инкапсидации и инициации синтеза минус-цепи; (2) имеющий активность обратной транскриптазы - катализирует синтез генома; и (3) имеющий активность рибонуклеазы Н, который обеспечивает разрушение прегеномной РНК. Рамка считывания Х ВГВ кодирует белок НВх, выполняющий множество функций, среди которых активация транскрипции, эпигеномное ремоделирование ккзДНК [6][15] и ускорение инкапсидации прегеномной РНК [53]. Также установлено участие ИБхЛ§ в опухолевой

трансформации гепатоцитов, основные звенья патогенеза с участием НВх включают индукцию синтеза ДНК-метилтрансфераз ЭММЛ и ВММТЭЛ [12, 106], репрессию транскрипции генов-супрессоров опухолей [47], анти-апоптотическое действие, коллапс репликативной вилки и увеличение числа полиплоидных клеток [62].

Кроме структурных генов, геном вируса включает также регуляторные области, среди которых два прямых повтора (ОЮ и ОЯ2) на 5'-концах плюс-цепи ДНК ВГВ. Эти регионы генома необходимы для синтеза цепей вирусной ДНК в процессе репликации [69]. Индукция синтеза вирусных антигенов осуществляется при участии двух энхансеров - БпЫ и БпЪ2[90]. Общее строение генома вируса представлено на Рис. 1.

Рисунок 1. Строение генома ВГВ. По материалам Seeger and Mason[70]. Описание представлено в тексте. Polymerase - полимераза ВГВ; Х - Х-антиген.

1.2. Цикл ВГВ

При попадании в системный кровоток, вирионы ВГВ с током крови транспортируются к клеткам печени, где связываются с рецептором гепатоцитов ЫТСР, основной функцией которого является транспорт анионов желчных кислот [42]. Связывание вириона с ЫТСР-рецептором осуществляется в пре-Б-области иббл§, далее комплекс вирус-рецептор подвергается эндоцитозу [137]. После попадания в цитоплазму кольцевая частично двуцепочечная ДНК (кчдДНК) вируса в составе нуклеокапсида транспортируется в ядро. В ядре осуществляется достройка плюс-цепи с участием вирусной полимеразы [100], инициация достройки незавершенной цепи происходит после депротеинизации генома ВГВ под действием систем репарации клетки, в том числе с помощью клеточной тирозилфосфодиэстеразы TDP2 [25]. После достройки плюс-цепи кчдДНК конвертируется в ккзДНК с участием репаративных механизмов клетки [100], образовавшаяся ккзДНК является матрицей для транскрипции всех вирусных РНК. Транскрипционные процессы обеспечивают образование полноразмерной прегеномной РНК ВГВ (пгРНК), а также мРНК меньшей длины, необходимых для синтеза вирусных белков - ИББ-антигена (большой, малой и средней субъединиц); НВх-антигена, участвующего в регуляции вирусной репликации; ИБс-антигена и обратной транскриптазы ВГВ. пгРНК в комплексе обратной транскриптазой упаковываются в капсид, внутри которого происходит обратная транскрипция с образованием минус-цепи ДНК ВГВ. Нуклеокапсид, содержащий кчдДНК, связанную с полимеразой, взаимодействует с HBs-антигеном в эндоплазматическом ретикулуме, где инкапсулируется при участии HBs-антигена с образованием зрелого вириона, и высвобождается из гепатоцита во внеклеточную среду [86].

1.3. Регуляция репликации вируса

КкзДНК ВГВ присутствует в гепатоцитах в виде минихромосомы, связываясь с гистоновыми и негистоновыми белками. Основную роль в регуляции транскрипции играют эпигенетические механизмы - метилирование островков CpG, метилирование и ацетилирование гистонов [55]. Наиболее важным регулятором транскрипции вирусных генов является белок НВх. Привлечение ко-активаторов р300, СВР и PCAF к ккзДНК увеличивает уровни гистонов Н3 и Н4, связанных с ккзДНК, при этом общий положительный заряд молекул гистонов уменьшается, что приводит к ослаблению взаимодействия между гистонами и фосфатными группами ккзДНК. В результате, минихромосома ккзДНК расплетается и становится транскрипционно активной [15, 23, 61]. С другой стороны, активация гистоновых деацетилаз, в частности, HDAC1, снижает транскрипционную активность вирусного генома и подавляет репликацию вируса [6].

Метилирование гистонов также участвует в регуляции транскрипции генов

ВГВ. Метилтрансфераза SETDB1 катализирует метилирование остатка лизина

H3K9, вследствие этого снижается транскрипционная активность ккзДНК ВГВ и

уменьшается уровень прегеномной РНК ВГВ [65]. Противоположный эффект

оказывает лизин-специфичная деметилаза LSD1, деметилирующая остатки Н3К9

и усиливающая репликацию вирусного генома [2]. Метилирование ДНК

осуществляется ДНК-метилтрансферазами DNMT1, DNMT3A и DNMT3B,

причем DNMT1 необходима для поддержания метилирования ДНК при

полуконсервативной репликации, а DNMT3 обеспечивает метилирование

островков CpG de novo [57]. Уровень метилирования ккзДНК является третьим

фактором, определяющим транскрипционную активность вируса. На нескольких

моделях показано, что высокая степень метилирования CpG-островков генома

ВГВ негативно коррелирует с интенсивностью транскрипции. Так, ккзДНК в

клетках печени HBeAg-негативных пациентов имеет значительно более высокий

уровень метилирования, чем у HBeAg-позитивных пациентов [26]. При ко-

20

трансфекции генома ВГВ и DNMT3A на клеточных линиях Huh7 и HepG2 количество прегеномной и прекоровой РНК ВГВ значительно снижалось, а трансфекция полностью метилированной in vitro ДНК ВГВ приводило к тому, что транскрипты ВГВ почти не обнаруживались, и активность праймеров вируса была близка к нулевой [135]. Кроме того, обработка клеток ингибитором DNMT 5-азацитидином вызывает подавление метилирования ккзДНК и усиление образования вирионов ВГВ.

1.4. Особенности хронической инфекции и современные подходы к терапии

ВГВ может вызывать острую или хроническую инфекцию печени. Более 250 миллионов человек хронически инфицировано, и более 1 миллиона ежегодно погибает от последствий хронической инфекции ВГВ, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Длительная репликация ВГВ в гепатоцитах человека ассоциирована с прогрессирующим повреждением ДНК клеток, стрессом эндоплазматического ретикулума, нестабильностью генома и про-онкогенным действием Х белка ВГВ.

На сегодняшний день, существует два основных подхода к лечению

хронического гепатита В: использование нуклеоз(т)идных аналогов - ингибиторов

обратной транскриптазы, и терапия альфа-интерфероном. Среди аналогов

нуклеозидов и нуклеотидов наиболее эффективными препаратами являются

энтекавир и тенофовир. При пятилетнем наблюдении устойчивое подавление

вирусной репликации в ответ на терапию энтекавиром было продемонстрировано

у 94% пациентов [13]. Кроме того, резистентность к препарату развилась лишь у

одного пациента (1,2 %) [78]. В ходе клинических испытаний тенофовира

отмечена еще более высокая эффективность противовирусной терапии: за

восьмилетний период наблюдения устойчивое подавление вирусной репликации

наблюдалось у 98% НВе-положительных и 99% НВе-отрицательных пациентов,

при этом не было отмечено ни одного случая формирования резистентности к

21

тенофовиру [121]. Применение аналогов нуклеозидов способствует увеличению пятилетней выживаемости в 7 раз, кроме того, установлено, что терапия данной группой препаратов способна остановить, а порой и обратить прогрессирование фиброза и цирроза [67]. Использование данных препаратов снижает выраженность портальной гипертензии [43] и уменьшает риск развития гепатоцеллюлярной карциномы [59].

При применении препаратов интерферона наблюдается более длительный ответ, который сохраняется в течение нескольких месяцев после прекращения терапии, однако, частота сероконверсии по ИБеЛ§ наблюдается лишь у ~30% пациентов [33]. Причиной этого может служить подавление иммунного ответа и снижение экспрессии генов, опосредующих действие интерферона (ГОБ-3, МР-кВ, ЕЯКШ и др.), связанные с репликацией ВГВ [87]. Кроме того, терапия препаратами интерферонов сопряжена с большим количеством побочных эффектов и плохо переносится пациентами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Костюшев Дмитрий Сергеевич, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Akcakaya P. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. / P. Akcakaya, M. L. Bobbin, J. A. Guo, J. Malagon-Lopez, K. Clement, S. P. Garcia, M. D. Fellows, M. J. Porritt, M. A. Firth, A. Carreras, T. Baccega, F. Seeliger, M. Bjursell, S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, R. Nitsch, L. M. Mayr, L. Pinello, M. Bohlooly-Y, M. J. Aryee, M. Maresca, J. K. Joung // Nature - 201S.

2. Alarcon V. The enzymes LSD1 and Set1A cooperate with the viral protein HBx to establish an active hepatitis B viral chromatin state. / V. Alarcon, S. Hernández, L. Rubio, F. Alvarez, Y. Flores, M. Varas-Godoy, G. V De Ferrari, M. Kann, R. A. Villanueva, A. Loyola // Sci. Rep. - 2016. - Т. 6 - 25901с.

3. Allweiss L. Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection. / L. Allweiss, M. Dandri // J. Hepatol. - 2016. - Т. 64 - № 1 Suppl -S17-S31a

4. Anders C. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. / C. Anders, O. Niewoehner, A. Duerst, M. Jinek // Nature - 2014. - Т. 513 - № 7519 - 569-573с.

5. Andersson T.B. The HepaRG cell line: a unique in vitro tool for understanding drug metabolism and toxicology in human. / T. B. Andersson, K. P. Kanebratt, J. G. Kenna // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. - 2012. - Т. S - № 7 - 909-920с.

6. Belloni L. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. / L. Belloni, T. Pollicino, F. De Nicola, F. Guerrieri, G. Raffa, M. Fanciulli, G. Raimondo, M. Levrero // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2009. - Т. 106 - № 47 - 19975-19979с.

7. Block T.M. The Covalently Closed Circular Form of Hepatitis B Virus Genome: Is There Now an End in "Site"? // Gastroenterology. - 2016. - Т. 150. - № 1. - 34-36с.

S. Bock C.T. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. / C. T. Bock, S. Schwinn, S. Locarnini, J. Fyfe, M. P. Manns, C. Trautwein, H. Zentgraf // J.

91

Mol. Biol. - 2001. - T. 307 - № 1 - 183-196c.

9. Cai D. A southern blot assay for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA from cell cultures. / D. Cai, H. Nie, R. Yan, J.-T. Guo, T. M. Block, H. Guo // Methods Mol. Biol. - 2013. - T. 1030 - 151-161c.

10. Carte J. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. / J. Carte, R. Wang, H. Li, R. M. Terns, M. P. Terns // Genes Dev. -2008. - T. 22 - № 24 - 3489-3496c.

11. Cencic R. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. / R. Cencic, H. Miura, A. Malina, F. Robert, S. Ethier, T. M. Schmeing, J. Dostie, J. Pelletier // PLoS One - 2014. - T. 9 - № 10 - e109213c.

12. Cha M.-Y. Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. / M.-Y. Cha, C.-M. Kim, Y.-M. Park, W.-S. Ryu // Hepatology - 2004. - T. 39 - № 6 - 1683-1693c.

13. Chang T.-T. Entecavir treatment for up to 5 years in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. / T.-T. Chang, C.-L. Lai, S. Kew Yoon, S. S. Lee, H. S. M. Coelho, F. J. Carrilho, F. Poordad, W. Halota, Y. Horsmans, N. Tsai, H. Zhang, D. J. Tenney, R. Tamez, U. Iloeje // Hepatology - 2010. - T. 51 - № 2 - 422-430c.

14. Cong L. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. / L. Cong, F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P. D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L. A. Marraffini, F. Zhang // Science - 2013. - T. 339 - № 6121 - 819-823c.

15. Cougot D. Inhibition of PP1 phosphatase activity by HBx: a mechanism for the activation of hepatitis B virus transcription. / D. Cougot, E. Allemand, L. Riviere, S. Benhenda, K. Duroure, F. Levillayer, C. Muchardt, M.-A. Buendia, C. Neuveut // Sci. Signal. - 2012. - T. 5 - № 205 - ra1c.

16. Cradick T.J. COSMID: A Web-based Tool for Identifying and Validating

CRISPR/Cas Off-target Sites. / T. J. Cradick, P. Qiu, C. M. Lee, E. J. Fine, G. Bao // Mol. Ther. Nucleic Acids - 2014. - T. 3 - e214c.

17. Dandri M. Increased hepatocyte turnover and inhibition of woodchuck hepatitis B virus replication by adefovir in vitro do not lead to reduction of the closed circular DNA. / M. Dandri, M. R. Burda, H. Will, J. Petersen // Hepatology - 2000. - T. 32 - № 1 - 139-146c.

18. Dong C. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. / C. Dong, L. Qu, H. Wang, L. Wei, Y. Dong, S. Xiong // Antiviral Res. - 2015. - T. 118 - 110-117c.

19. Fonfara I. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. / I. Fonfara, A. Le Rhun, K. Chylinski, K. S. Makarova, A.-L. Lecrivain, J. Bzdrenga, E. V Koonin, E. Charpentier // Nucleic Acids Res. - 2014. - T. 42 - № 4 - 2577-2590c.

20. Fu Y. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. / Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung // Nat. Biotechnol. - 2014. -T. 32 - № 3 - 279-284c.

21. Ganem D. Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences. / D. Ganem, A. M. Prince // N. Engl. J. Med. - 2004. - T. 350 - № 11 - 1118-1129c.

22. Gerlich W.H. Hepatitis B virus contains protein attached to the 5' terminus of its complete DNA strand. / W. H. Gerlich, W. S. Robinson // Cell - 1980. - T. 21 - № 3 -801-809c.

23. Gong Q. Chromosome remodeling related to hepatitis B virus replication in HepG2 cells. / Q. Gong, S. Chen, J. Guo, H. Sun, G. Zheng, Q. Liu, H. Ren, S. He // DNA Cell Biol. - 2011. - T. 30 - № 6 - 347-354c.

24. Gripon P. Hepatitis B virus infection of adult human hepatocytes cultured in the presence of dimethyl sulfoxide. / P. Gripon, C. Diot, N. Theze, I. Fourel, O. Loreal, C.

Brechot, C. Guguen-Guillouzo // J. Virol. - 1988. - T. 62 - № 11 - 4136-4143c.

25. Guo H. Production and function of the cytoplasmic deproteinized relaxed circular DNA of hepadnaviruses. / H. Guo, R. Mao, T. M. Block, J.-T. Guo // J. Virol. - 2010. -T. 84 - № 1 - 387-396c.

26. Guo Y. Evidence that methylation of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in liver tissues of patients with chronic hepatitis B modulates HBV replication. / Y. Guo, Y. Li, S. Mu, J. Zhang, Z. Yan // J. Med. Virol. - 2009. - T. 81 - № 7 - 1177-1183c.

27. Haft D.H. A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. / D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson // PLoS Comput. Biol. - 2005. - T. 1 - № 6 - e60c.

28. Hatton T. RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a model for their roles in viral replication. / T. Hatton, S. Zhou, D. N. Standring // J. Virol. - 1992. - T. 66 - № 9 - 5232-5241 c.

29. Hendel A. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. / A. Hendel, R. O. Bak, J. T. Clark, A. B. Kennedy, D. E. Ryan, S. Roy, I. Steinfeld, B. D. Lunstad, R. J. Kaiser, A. B. Wilkens, R. Bacchetta, A. Tsalenko, D. Dellinger, L. Bruhn, M. H. Porteus // Nat. Biotechnol. - 2015. - T. 33 - № 9 - 985-989c.

30. Hiruta C. Targeted gene disruption by use of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes in the water flea Daphnia pulex. / C. Hiruta, K. Kakui, K. E. Tollefsen, T. Iguchi // Genes Cells - 2018. - T. 23 - № 6 - 494-502c.

31. Hoofnagle J.H. Reactivation of hepatitis B. / J. H. Hoofnagle // Hepatology - 2009. - T. 49 - № 5 Suppl - S156-65c.

32. Hsu P.D. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases // Nat. Biotechnol. - 2013. - T. 31. - № 9. - 827-832c.

33. Janssen H.L.A. Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial. / H. L. A. Janssen, M. van Zonneveld, H. Senturk, S. Zeuzem, U. S. Akarca, Y. Cakaloglu, C. Simon, T. M. K. So, G. Gerken, R. A. de Man, H. G. M. Niesters, P. Zondervan, B. Hansen, S. W. Schalm // Lancet (London, England) - 2005. - T. 365 - № 9454 - 123-129c.

34. Jinek M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. / M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentier // Science - 2012. - T. 337 - № 6096 - 816-821 c.

35. Jinek M. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. / M. Jinek, F. Jiang, D. W. Taylor, S. H. Sternberg, E. Kaya, E. Ma, C. Anders, M. Hauer, K. Zhou, S. Lin, M. Kaplan, A. T. Iavarone, E. Charpentier, E. Nogales, J. A. Doudna // Science - 2014. - T. 343 - № 6176 - 1247997c.

36. Karimova M. CRISPR/Cas9 nickase-mediated disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X. / M. Karimova, N. Beschorner, W. Dammermann, J. Chemnitz, D. Indenbirken, J.-H. Bockmann, A. Grundhoff, S. Luth, F. Buchholz, J. Schulze zur Wiesch, J. Hauber // Sci. Rep. - 2015. - T. 5 - 13734c.

37. Kennedy E.M. Targeting hepatitis B virus cccDNA using CRISPR/Cas9. / E. M. Kennedy, A. V. R. Kornepati, B. R. Cullen // Antiviral Res. - 2015. - T. 123 - 188-192c.

38. Kleinstiver B.P. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. / B. P. Kleinstiver, M. S. Prew, S. Q. Tsai, V. V Topkar, N. T. Nguyen, Z. Zheng, A. P. W. Gonzales, Z. Li, R. T. Peterson, J.-R. J. Yeh, M. J. Aryee, J. K. Joung // Nature - 2015. - T. 523 - № 7561 - 481-485c.

39. Konig A. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. / A. Konig, B. Doring, C. Mohr, A. Geipel, J. Geyer, D. Glebe // J. Hepatol. - 2014. - T. 61 - № 4 -

867-875c.

40. Koonin E. V CRISPR-Cas: evolution of an RNA-based adaptive immunity system in prokaryotes. / E. V Koonin, K. S. Makarova // RNA Biol. - 2013. - T. 10 - № 5 -679-686c.

41. Kostyushev D. Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus. / D. Kostyushev, S. Brezgin, A. Kostyusheva, D. Zarifyan, I. Goptar, V. Chulanov // Cell. Mol. Life Sci. -2019.

42. Kullak-Ublick G.A. Enterohepatic bile salt transporters in normal physiology and liver disease. / G. A. Kullak-Ublick, B. Stieger, P. J. Meier // Gastroenterology - 2004. - T. 126 - № 1 - 322-342c.

43. Kuscu C. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. / C. Kuscu, S. Arslan, R. Singh, J. Thorpe, M. Adli // Nat. Biotechnol. - 2014. - T. 32 - № 7 - 677-683c.

44. Li H. Removal of Integrated Hepatitis B Virus DNA Using CRISPR-Cas9. / H. Li, C. Sheng, S. Wang, L. Yang, Y. Liang, Y. Huang, H. Liu, P. Li, C. Yang, X. Yang, L. Jia, J. Xie, L. Wang, R. Hao, X. Du, D. Xu, J. Zhou, M. Li, Y. Sun, Y. Tong, Q. Li, S. Qiu, H. Song // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2017. - T. 7 - 91c.

45. Li Y. Intracellular delivery and biodistribution study of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein loaded bioreducible lipidoid nanoparticles. / Y. Li, J. Bolinger, Y. Yu, Z. Glass, N. Shi, L. Yang, M. Wang, Q. Xu // Biomater. Sci. - 2018.

46. Lin S.-R. The CRISPR/Cas9 System Facilitates Clearance of the Intrahepatic HBV Templates In Vivo. / S.-R. Lin, H.-C. Yang, Y.-T. Kuo, C.-J. Liu, T.-Y. Yang, K.-C. Sung, Y.-Y. Lin, H.-Y. Wang, C.-C. Wang, Y.-C. Shen, F.-Y. Wu, J.-H. Kao, D.-S. Chen, P.-J. Chen // Mol. Ther. Nucleic Acids - 2014. - T. 3 - e186c.

47. Liu S. Hepatitis B Virus X Protein and Hepatocarcinogenesis. / S. Liu, S. S. Y. Koh,

C. G. L. Lee // Int. J. Mol. Sci. - 2016. - T. 17 - № 6.

48. Liu Y. Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. / Y. Liu, M. Zhao, M. Gong, Y. Xu, C. Xie, H. Deng, X. Li, H. Wu, Z. Wang // Antiviral Res. - 2018. - T. 152 - 58-67c.

49. Makarova K.S. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. // Nat. Rev. Microbiol. - 2015. - T. 13. - № 11. - 722-736c.

50. Mali P. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. / P. Mali, J. Aach, P. B. Stranges, K. M. Esvelt, M. Moosburner, S. Kosuri, L. Yang, G. M. Church // Nat. Biotechnol. - 2013. -T. 31 - № 9 - 833-838c.

51. March S. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. / S. March, V. Ramanan, K. Trehan, S. Ng, A. Galstian, N. Gural, M. A. Scull, A. Shlomai, M. M. Mota, H. E. Fleming, S. R. Khetani, C. M. Rice, S. N. Bhatia // Nat. Protoc. - 2015. - T. 10 - № 12 - 2027-2053c.

52. Marraffini L.A. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. / L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer // Nat. Rev. Genet. - 2010. - T. 11 -№ 3 - 181-190c.

53. Melegari M. Hepatitis B virus DNA replication is coordinated by core protein serine phosphorylation and HBx expression. / M. Melegari, S. K. Wolf, R. J. Schneider // J. Virol. - 2005. - T. 79 - № 15 - 9810-9820c.

54. Moreno-Mateos M.A. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. / M. A. Moreno-Mateos, C. E. Vejnar, J.-D. Beaudoin, J. P. Fernandez, E. K. Mis, M. K. Khokha, A. J. Giraldez // Nat. Methods - 2015. - T. 12 - № 10 - 982-988c.

55. Newbold J.E. The covalently closed duplex form of the hepadnavirus genome exists in situ as a heterogeneous population of viral minichromosomes. / J. E. Newbold, H.

Xin, M. Tencza, G. Sherman, J. Dean, S. Bowden, S. Locarnini // J. Virol. - 1995. - T. 69 - № 6 - 3350-3357c.

56. Newton M.D. DNA stretching induces Cas9 off-target activity. / M. D. Newton, B. J. Taylor, R. P. C. Driessen, L. Roos, N. Cvetesic, S. Allyjaun, B. Lenhard, M. E. Cuomo, D. S. Rueda // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2019. - T. 26 - № 3 - 185-192c.

57. Okano M. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. / M. Okano, D. W. Bell, D. A. Haber, E. Li // Cell - 1999. - T. 99 - № 3 - 247-257c.

58. Ortega-Prieto A.M. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. / A. M. Ortega-Prieto, J. K. Skelton, S. N. Wai, E. Large, M. Lussignol, G. Vizcay-Barrena, D. Hughes, R. A. Fleck, M. Thursz, M. T. Catanese, M. Dorner // Nat. Commun. - 2018. - T. 9 - № 1 - 682c.

59. Papatheodoridis G. PAGE-B predicts the risk of developing hepatocellular carcinoma in Caucasians with chronic hepatitis B on 5-year antiviral therapy. / G. Papatheodoridis, G. Dalekos, V. Sypsa, C. Yurdaydin, M. Buti, J. Goulis, J. L. Calleja, H. Chi, S. Manolakopoulos, G. Mangia, N. Gatselis, O. Keskin, S. Savvidou, J. de la Revilla, B. E. Hansen, I. Vlachogiannakos, K. Galanis, R. Idilman, M. Colombo, R. Esteban, H. L. A. Janssen, P. Lampertico // J. Hepatol. - 2016. - T. 64 - № 4 - 800-806c.

60. Pattanayak V. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. / V. Pattanayak, S. Lin, J. P. Guilinger, E. Ma, J. A. Doudna, D. R. Liu // Nat. Biotechnol. - 2013. - T. 31 - № 9 - 839-843c.

61. Pollicino T. Hepatitis B virus replication is regulated by the acetylation status of hepatitis B virus cccDNA-bound H3 and H4 histones. / T. Pollicino, L. Belloni, G. Raffa, N. Pediconi, G. Squadrito, G. Raimondo, M. Levrero // Gastroenterology - 2006. - T. 130 - № 3 - 823-837c.

62. Rakotomalala L. Hepatitis B virus X protein increases the Cdt1-to-geminin ratio

98

inducing DNA re-replication and polyploidy. / L. Rakotomalala, L. Studach, W.-H. Wang, G. Gregori, R. L. Hullinger, O. Andrisani // J. Biol. Chem. - 2008. - T. 283 - № 42 - 28729-28740c.

63. Ren X. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. / X. Ren, Z. Yang, J. Xu, J. Sun, D. Mao, Y. Hu, S.-J. Yang, H.-H. Qiao, X. Wang, Q. Hu, P. Deng, L.-P. Liu, J.-Y. Ji, J. B. Li, J.-Q. Ni // Cell Rep. - 2014. - T. 9 - № 3 - 1151-1162c.

64. Ridruejo E. Relapse rates in chronic hepatitis B naive patients after discontinuation of antiviral therapy with entecavir. / E. Ridruejo, S. Marciano, O. Galdame, M. V Reggiardo, A. E. Munoz, R. Adrover, D. Cocozzella, N. Fernandez, C. Estepo, M. Mendizabal, G. A. Romero, D. Levi, T. Schroder, S. Paz, H. Fainboim, O. G. Mando, A. C. Gadano, M. O. Silva // J. Viral Hepat. - 2014. - T. 21 - № 8 - 590-596c.

65. Riviere L. HBx relieves chromatin-mediated transcriptional repression of hepatitis B viral cccDNA involving SETDB1 histone methyltransferase. / L. Riviere, L. Gerossier, A. Ducroux, S. Dion, Q. Deng, M.-L. Michel, M.-A. Buendia, O. Hantz, C. Neuveut // J. Hepatol. - 2015. - T. 63 - № 5 - 1093-1102c.

66. Sakuma T. Highly multiplexed CRISPR-Cas9-nuclease and Cas9-nickase vectors for inactivation of hepatitis B virus. / T. Sakuma, K. Masaki, H. Abe-Chayama, K. Mochida, T. Yamamoto, K. Chayama // Genes Cells - 2016. - T. 21 - № 11 - 1253-1262c.

67. Schiff E.R. Long-term treatment with entecavir induces reversal of advanced fibrosis or cirrhosis in patients with chronic hepatitis B. / E. R. Schiff, S. S. Lee, Y.-C. Chao, S. Kew Yoon, F. Bessone, S.-S. Wu, W. Kryczka, Y. Lurie, A. Gadano, G. Kitis, S. Beebe, D. Xu, H. Tang, U. Iloeje // Clin. Gastroenterol. Hepatol. - 2011. - T. 9 - № 3 - 274-276c.

68. Scott T. ssAAVs containing cassettes encoding SaCas9 and guides targeting hepatitis B virus inactivate replication of the virus in cultured cells. / T. Scott, B. Moyo,

S. Nicholson, M. B. Maepa, K. Watashi, A. Ely, M. S. Weinberg, P. Arbuthnot // Sci. Rep. - 2017. - T. 7 - № 1 - 7401c.

69. Seeger C. Biochemical and genetic evidence for the hepatitis B virus replication strategy. / C. Seeger, D. Ganem, H. E. Varmus // Science - 1986. - T. 232 - № 4749 -477-484c.

70. Seeger C. Hepatitis B virus biology. / C. Seeger, W. S. Mason // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2000. - T. 64 - № 1 - 51-68c.

71. Seeger C. Targeting Hepatitis B Virus With CRISPR/Cas9. / C. Seeger, J. A. Sohn // Mol. Ther. Nucleic Acids - 2014. - T. 3 - e216c.

72. Seeger C. Complete Spectrum of CRISPR/Cas9-induced Mutations on HBV cccDNA. / C. Seeger, J. A. Sohn // Mol. Ther. - 2016. - T. 24 - № 7 - 1258-1266c.

73. Sells M.A. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. / M. A. Sells, M. L. Chen, G. Acs // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1987. - T. 84 - № 4 - 1005-1009c.

74. Semenova E. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. / E. Semenova, M. M. Jore, K. A. Datsenko, A. Semenova, E. R. Westra, B. Wanner, J. van der Oost, S. J. J. Brouns, K. Severinov // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2011. - T. 108 - № 25 - 10098-10103c.

75. Slaymaker I.M. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. / I. M. Slaymaker, L. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. Yan, F. Zhang // Science - 2016. - T. 351 - № 6268 - 84-88c.

76. Sureau C. Production of hepatitis B virus by a differentiated human hepatoma cell line after transfection with cloned circular HBV DNA. / C. Sureau, J. L. Romet-Lemonne, J. I. Mullins, M. Essex // Cell - 1986. - T. 47 - № 1 - 37-47c.

77. Swarts D.C. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. / D. C.

Swarts, C. Mosterd, M. W. J. van Passel, S. J. J. Brouns // PLoS One - 2012. - T. 7 - № 4 - e35888c.

78. Tenney D.J. Long-term monitoring shows hepatitis B virus resistance to entecavir in nucleoside-naive patients is rare through 5 years of therapy. / D. J. Tenney, R. E. Rose, C. J. Baldick, K. A. Pokornowski, B. J. Eggers, J. Fang, M. J. Wichroski, D. Xu, J. Yang, R. B. Wilber, R. J. Colonno // Hepatology - 2009. - T. 49 - № 5 - 1503-1514c.

79. Thomas C.E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. / C. E. Thomas, A. Ehrhardt, M. A. Kay // Nat. Rev. Genet. - 2003. - T. 4 - № 5 - 346-358c.

80. Tropberger P. Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation. / P. Tropberger, A. Mercier, M. Robinson, W. Zhong, D. E. Ganem, M. Holdorf // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2015. - T. 112 - № 42 - E5715-24c.

81. Tsai S.Q. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. / S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V Topkar, V. Thapar, N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung // Nat. Biotechnol. - 2015. - T. 33 - № 2 - 187-197c.

82. Vivekanandan P. Methylation regulates hepatitis B viral protein expression. / P. Vivekanandan, D. Thomas, M. Torbenson // J. Infect. Dis. - 2009. - T. 199 - № 9 -1286-1291c.

83. Wang J. Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication. / J. Wang, Z.-W. Xu, S. Liu, R.-Y. Zhang, S.-L. Ding, X.-M. Xie, L. Long, X.-M. Chen, H. Zhuang, F.-M. Lu // World J. Gastroenterol. - 2015. - T. 21 - № 32 -9554-9565c.

84. Wang L. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. / L. Wang, Y. Shao, Y. Guan, L. Li, L. Wu, F. Chen, M. Liu, H. Chen, Y. Ma, X. Ma, M. Liu, D. Li // Sci.

101

Rep. - 2015. - T. 5 - 17517c.

85. Wang X. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. / X. Wang, Y. Wang, X. Wu, J. Wang, Y. Wang, Z. Qiu, T. Chang, H. Huang, R.-J. Lin, J.-K. Yee // Nat. Biotechnol. - 2015. - T. 33 - № 2 - 175-178c.

86. Will H. Replication strategy of human hepatitis B virus. / H. Will, W. Reiser, T. Weimer, E. Pfaff, M. Büscher, R. Sprengel, R. Cattaneo, H. Schaller // J. Virol. - 1987. - T. 61 - № 3 - 904-911 c.

87. Wu J. Hepatitis B virus suppresses toll-like receptor-mediated innate immune responses in murine parenchymal and nonparenchymal liver cells. / J. Wu, Z. Meng, M. Jiang, R. Pei, M. Trippler, R. Broering, A. Bucchi, J.-P. Sowa, U. Dittmer, D. Yang, M. Roggendorf, G. Gerken, M. Lu, J. F. Schlaak // Hepatology - 2009. - T. 49 - № 4 -

1132-1140c.

88. Wu X. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. / X. Wu, D. A. Scott, A. J. Kriz, A. C. Chiu, P. D. Hsu, D. B. Dadon, A. W. Cheng, A. E. Trevino, S. Konermann, S. Chen, R. Jaenisch, F. Zhang, P. A. Sharp // Nat. Biotechnol. - 2014. - T. 32 - № 7 - 670-676c.

89. Xiao A. CasOT: a genome-wide Cas9/gRNA off-target searching tool. / A. Xiao, Z. Cheng, L. Kong, Z. Zhu, S. Lin, G. Gao, B. Zhang // Bioinformatics - 2014. - T. 30 -№ 8 - 1180-1182c.

90. Yee J.K. A liver-specific enhancer in the core promoter region of human hepatitis B virus. / J. K. Yee // Science - 1989. - T. 246 - № 4930 - 658-661 c.

91. Zhu W. CRISPR/Cas9 produces anti-hepatitis B virus effect in hepatoma cells and transgenic mouse. / W. Zhu, K. Xie, Y. Xu, L. Wang, K. Chen, L. Zhang, J. Fang // Virus Res. - 2016. - T. 217 - 125-132c.

92. Zoulim F. New insight on hepatitis B virus persistence from the study of

intrahepatic viral cccDNA. / F. Zoulim // J. Hepatol. - 2005. - T. 42 - № 3 - 302-308c.

93. Zuris J.A. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. / J. A. Zuris, D. B. Thompson, Y. Shu, J. P. Guilinger, J. L. Bessen, J. H. Hu, M. L. Maeder, J. K. Joung, Z.-Y. Chen, D. R. Liu // Nat. Biotechnol. - 2015. - T. 33 - № 1 - 73-80c.

94. Aragri M. Multiple hepatitis B virus (HBV) quasispecies and immune-escape mutations are present in HBV surface antigen and reverse transcriptase of patients with acute hepatitis B / M. Aragri, C. Alteri, A. Battisti, D. Di Carlo, C. Minichini, C. Sagnelli, M. C. Bellocchi, M. A. Pisaturo, M. Starace, D. Armenia // J. Infect. Dis. -2016. - T. 213 - № 12 - 1897-1905c.

95. Caligiuri P. Overview of hepatitis B virus mutations and their implications in the management of infection / P. Caligiuri, R. Cerruti, G. Icardi, B. Bruzzone // World J. Gastroenterol. - 2016. - T. 22 - № 1 - 145c.

96. Cho S.W. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases / S. W. Cho, S. Kim, Y. Kim, J. Kweon, H. S. Kim, S. Bae, J.-S. Kim // Genome Res. - 2014. - T. 24 - № 1 - 132-141 c.

97. Doudna J.A. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 / J. A. Doudna, E. Charpentier // Science (80-. ). - 2014. - T. 346 - № 6213 - 1258096c.

98. Esvelt K.M. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing / K. M. Esvelt, P. Mali, J. L. Braff, M. Moosburner, S. J. Yaung, G. M. Church // Nat. Methods - 2013. - T. 10 - № 11 - 1116-1123c.

99. Fu Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells / Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander // Nat Biotech - 2013. - T. 31 - № 9 - 822-826c.

100. Gao W. Formation of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA: Removal of Genome-Linked Protein / W. Gao, J. Hu // J. Virol. - 2007. - T. 81 - № 12

- 6164-6174c.

101. Graber-Stiehl I. The silent epidemic killing more people than HIV, malaria or TB. / I. Graber-Stiehl // Nature - 2018. - T. 564 - № 7734 - 24c.

102. Haapaniemi E. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response / E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale // Nat. Med. - 2018. - T. 24 - № 7 - 927-930c.

103. Hirano H. Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9 / H. Hirano, J. S. Gootenberg, T. Horii, O. O. Abudayyeh, M. Kimura, P. D. Hsu, T. Nakane, R. Ishitani, I. Hatada, F. Zhang, H. Nishimasu, O. Nureki // Cell - 2016. - T. 164 - № 5 - 950-961c.

104. Ihry R.J. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells / R. J. Ihry, K. A. Worringer, M. R. Salick, E. Frias, D. Ho, K. Theriault, S. Kommineni, J. Chen, M. Sondey, C. Ye // Nat. Med. - 2018. - 1c.

105. Jiang F. CRISPR - Cas9 Structures and Mechanisms / F. Jiang, J. A. Doudna // Annu.Rev.Biophys - 2017. - T. 46 - № March - 505-529c.

106. Jin J. Nuclear Expression of Hepatitis B Virus X Protein Is Associated with Recurrence of Early-Stage Hepatocellular Carcinomas: Role of Viral Protein in Tumor Recurrence / J. Jin, H. Y. Jung, K. H. Lee, N.-J. Yi, K.-S. Suh, J.-J. Jang, K.-B. Lee // J. Pathol. Transl. Med. - 2016. - T. 50 - № 3 - 181-189c.

107. Kim J.H. Molecular diagnosis and treatment of drug-resistant hepatitis B virus / J. H. Kim, Y. K. Park, E.-S. Park, K.-H. Kim // World J. Gastroenterol. WJG - 2014. - T. 20 - № 19 - 5708c.

108. Kim S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins / S. Kim, D. Kim, S. W. Cho, J. Kim, J.-S. Kim // Genome Res. - 2014. - T. 24 - № 6 - 1012-1019c.

109. Kleinstiver B.P. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable

genome-wide off-target effects / B. P. Kleinstiver, V. Pattanayak, M. S. Prew, S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, Z. Zheng, J. Keith Joung // Nature - 2016. - T. 529 - № 7587 -490-495c.

110. Köck J. Hypermutation of hepatitis B virus genomes by APOBEC3G, APOBEC3C and APOBEC3H / J. Köck, H. E. Blum // J. Gen. Virol. - 2008. - T. 89 - № 5 - 1184-1191c.

111. Köck J. Efficient infection of primary tupaia hepatocytes with purified human and woolly monkey hepatitis B virus / J. Köck, M. Nassal, S. MacNelly, T. F. Baumert, H. E. Blum, F. von Weizsäcker // J. Virol. - 2001. - T. 75 - № 11 - 5084-5089c.

112. Kosicki M. Repair of CRISPR-Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements / M. Kosicki, A. Bradley // Nat. Publ. Gr. -2018. - № June.

113. Labuhn M. Refined sgRNA efficacy prediction improves large-and small-scale CRISPR-Cas9 applications / M. Labuhn, F. F. Adams, M. Ng, S. Knoess, A. Schambach, E. M. Charpentier, A. Schwarzer, J. L. Mateo, J.-H. Klusmann, D. Heckl // Nucleic Acids Res. - 2017. - T. 46 - № 3 - 1375-1385c.

114. Ladner S.K. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication / S. K. Ladner, M. J. Otto, C. S. Barker, K. Zaifert, G. H. Wang, J. T. Guo, C. Seeger, R. W. King // Antimicrob. Agents Chemother. - 1997. - T. 41 - № 8 -1715-1720c.

115. Lee B. Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours / B. Lee, K. Lee, S. Panda, R. Gonzales-Rojas, A. Chong, V. Bugay, H. M. Park, R. Brenner, N. Murthy, H. Y. Lee // Nat. Biomed. Eng. - 2018. - T. 2 - № 7 - 497-507c.

116. Lee C.M. The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Editing in Mammalian Cells / C. M. Lee, T. J. Cradick, G. Bao // Mol. Ther. -

105

2016. - T. 24 - № 3 - 645-654c.

117. Li F. Minicircle HBV cccDNA with a Gaussia luciferase reporter for investigating HBV cccDNA biology and developing cccDNA-targeting drugs / F. Li, L. Cheng, C. M. Murphy, N. J. Reszka-Blanco, Y. Wu, L. Chi, J. Hu, L. Su // Sci. Rep. - 2016. - T. 6 -36483c.

118. Li F. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing / F. Li, D. Zhang, Y. Li, D. Jiang, S. Luo, N. Du, W. Chen, L. Deng, C. Zeng // Clin. Microbiol. Infect. - 2015. - T. 21 - № 3 - 280-287c.

119. Li G. Recombinant covalently closed circular DNA of hepatitis B virus induces long-term viral persistence with chronic hepatitis in a mouse model / G. Li, Y. Zhu, D. Shao, H. Chang, X. Zhang, D. Zhou, Y. Gao, K. Lan, Q. Deng // Hepatology - 2018. -T. 67 - № 1 - 56-70c.

120. Liu Y. Hepatitis B Virus Polymerase Disrupts K63-Linked Ubiquitination of STING To Block Innate Cytosolic DNA-Sensing Pathways / Y. Liu, J. Li, J. Chen, Y. Li, W. Wang, X. Du, W. Song, W. Zhang, L. Lin, Z. Yuan // J. Virol. - 2015. - T. 89 -№ 4 - 2287-2300c.

121. Marcellin P. long Term Treatment with Tenofovir Disoproxil Fumarate for Chronic Hepatitis B Infection is Safe and Well Tolerated and Associated with Durable Virologic Response with no Detectable Resistance: 8 Year Results from Two Phase 3 Trials: 229 / P. Marcellin, E. J. Gane, R. Flisiak, H. N. Trinh, J. Petersen, S. Gurel, K. D. Kaita, I. A. Kotzev, N. Tsai, J. F. Flaherty // Hepatology - 2014. - T. 60 - 313A-314Ac.

122. Müller M. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome / M. Müller, C. M. Lee, G. Gasiunas, T. H. Davis, T. J. Cradick, V. Siksnys, G. Bao, T. Cathomen, C. Mussolino // Mol. Ther. - 2016. - T. 24 -№ 3 - 636-644c.

123. Noguchi C. G to A hypermutation of hepatitis B virus / C. Noguchi, H. Ishino, M.

106

Tsuge, Y. Fujimoto, M. Imamura, S. Takahashi, K. Chayama // Hepatology - 2005. - T. 41 - № 3 - 626-633c.

124. Organization W.H.Global hepatitis report 2017 / W. H. Organization - World Health Organization, 2017.

125. Price A.A. Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells / A. A. Price, T. R. Sampson, H. K. Ratner, A. Grakoui, D. S. Weiss // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2015.

- T. 112 - № 19 - 6164-6169c.

126. Ramanan V. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus / V. Ramanan, A. Shlomai, D. B. T. Cox, R. E. Schwartz, E. Michailidis, A. Bhatta, D. A. Scott, F. Zhang, C. M. Rice, S. N. Bhatia // Sci. Rep. - 2015. - T. 5 -10833c.

127. Ran F.A. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9 / F. A. Ran, L. Cong, W. X. Yan, D. A. Scott, J. S. Gootenberg, A. J. Kriz, B. Zetsche, O. Shalem, X. Wu, K. S. Makarova, E. Koonin, P. A. Sharp, F. Zhang // Nature - 2015. - T. 520 - № 7546 - 186-191c.

128. Ran F.A. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity / F. A. Ran, P. D. Hsu, C.-Y. Lin, J. S. Gootenberg, S. Konermann, A. E. Trevino, D. A. Scott, A. Inoue, S. Matoba, Y. Zhang, F. Zhang // Cell - 2013. - T. 154 - № 6 - 1380-1389c.

129. Ran F.A. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system / F. A. Ran, P. D. Hsu, J. Wright, V. Agarwala, D. A. Scott, F. Zhang // Nat. Protoc. - 2013. - T. 8 - № 11 - 2281-2308c.

130. Schmidt-Wolf G.D. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update / G. D. Schmidt-Wolf, I. G. H. Schmidt-Wolf // Trends Mol. Med. - 2003. - T. 9

- № 2 - 67-72c.

131. Slaymaker I.M. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity /

I. M. Slaymaker, L. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. Yan, F. Zhang // Science (80-. ). - 2015. - aad5227c.

132. Stemmer M. CCTop: an intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool / M. Stemmer, T. Thumberger, M. del Sol Keyer, J. Wittbrodt, J. L. Mateo // PLoS One - 2015. - T. 10 - № 4 - e0124633c.

133. Sternberg S.H. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9 / S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna // Nature -2014. - T. 507 - № 7490 - 62-67c.

134. Vartanian J.P. Massive APOBEC3 editing of hepatitis B viral DNA in cirrhosis / J. P. Vartanian, M. Henry, A. Marchio, R. Suspene, M. M. Aynaud, D. Guetard, M. Cervantes-Gonzalez, C. Battiston, V. Mazzaferro, P. Pineau, A. Dejean, S. Wain-Hobson // PLoS Pathog. - 2010. - T. 6 - № 5 - 1-9c.

135. Vivekanandan P. Hepatitis B virus replication induces methylation of both host and viral DNA / P. Vivekanandan, H. D.-J. Daniel, R. Kannangai, F. Martinez-Murillo, M. Torbenson // J. Virol. - 2010. - T. 84 - № 9 - 4321-4329c.

136. Wang J. Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication / J. Wang, Z. W. Xu, S. Liu, R. Y. Zhang, S. L. Ding, X. M. Xie, L. Long, X. M. Chen, H. Zhuang, F. M. Lu // World J. Gastroenterol. - 2015. - T. 21 - № 32 -9554-9565c.

137. Yan H. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus / H. Yan, G. Zhong, G. Xu, W. He, Z. Jing, Z. Gao, Y. Huang, Y. Qi, B. Peng, H. Wang, L. Fu, M. Song, P. Chen, W. Gao, B. Ren, Y. Sun, T. Cai, X. Feng, J. Sui, W. Li // Elife - 2012. - T. 1 - e00049c.

138. Yang H.-C. Persistence of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in hepatocytes: molecular mechanisms and clinical significance / H.-C. Yang, J.-H. Kao // Emerg. Microbes Infect. - 2014. - T. 3 - № 9 - e64c.

139. Zhang J. The CRISPR-Cas9 system: a promising tool for discovering potential approaches to overcome drug resistance in cancer / J. Zhang, W. Zhou, X. Wang, L. Wang // RSC Adv. - 2018. - T. 8 - № 58 - 33464-33472c.

140. Zhang X.-H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering / X.-H. Zhang, L. Y. Tee, X.-G. Wang, Q.-S. Huang, S.-H. Yang // Mol. Ther. - Nucleic Acids - 2015. - T. 4 - e264c.

141. Zhang X.H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering / X. H. Zhang, L. Y. Tee, X. G. Wang, Q. S. Huang, S. H. Yang // Mol. Ther. - Nucleic Acids - 2015. - T. 4 - № 11.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1. Список праймеров и зондов, использованных в работе.

№ Наименование 5'-3' последовательность нуклеотидов

1 АйАРВН ссАоатаатстсстстаАстт

2 гОАРБН аттастатАассАААттсаттат

3 БА_Оарё Ь БАМ-ААсАасаАсАсссАстсстссАсс-ВНО 1

4 иНгатегБ Т1_г тАтАтАОстАОсАААААААсАссстассАтААААтОАс

5 и11гатегК М1_г тАтАтАастАасАААААААасссаттАААасАОААас

6 иНгатегБ Р1_г тАтАтАастАасАААААААасАссаАстсаа

7 иНгатеги 6_f тАтАтАООАтссаАааасстАтттсссАтаАттссттсАтАт тта

8 стстасАсатсасАтааАааттттАОАастАаААлтАа

9 Бр1_г стссАтасаАсатасАОАасаататттсатсстттс

10 Sp2_f ЛЛTGTCЛЛCGЛCCGЛCCTTGGTTTTЛGЛGCTЛGЛЛЛTЛG

11 Бр2_г CAAGGTCGGTCGTTGACATTCGGTGTTTCGTCCTTTC

12 Sp3_f CGCCCЛCCЛЛЛTЛTTGCCCЛGTTTTЛGЛGCTЛGЛЛЛTЛG

13 Sp3_г TGGGCЛЛTЛTTTGGTGGGCGCGGTGTTTCGTCCTTTC

14 Sp4_f GGGTTGCGTCAGCAAACACTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

15 Sp4_r AGTGTTTGCTGACGCAACCCCGGTGTTTCGTCCTTTC

16 Sp5_f GCAAACACTTGGCACAGACCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

17 Sp5_r GGTCTGTGCCAAGTGTTTGCCGGTGTTTCGTCCTTTC

18 Sp6_f AGCTTGGAGGCTTGAACAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

19 Sp6_r ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTCGGTGTTTCGTCCTTTC

20 Sp7_f TAGCTCCAAATTCTTTATAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

21 Sp7_r TTATAAAGAATTTGGAGCTACGGTGTTTCGTCCTTTC

22 Sp8_f GCATACAAAGGCATCAACGCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

23 Sp8_r GCGTTGATGCCTTTGTATGCCGGTGTTTCGTCCTTTC

24 Sp9_f GACCTTCGTCTGCGAGGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

25 Sp9_r TCGCCTCGCAGACGAAGGTCCGGTGTTTCGTCCTTTC

26 Sp10_f CTTTCCACCAGCAATCCTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

27 Sp10_r AGAGGATTGCTGGTGGAAAGCGGTGTTTCGTCCTTTC

28 Sp11_f AAATACAGGCCTCTCACTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

29 Sp11_r AGAGTGAGAGGCCTGTATTTCGGTGTTTCGTCCTTTC

30 Sp12_f ACCCCGCCTGTAACACGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

31 Sp12_r TCTCGTGTTACAGGCGGGGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

32 Sp13_f TAACTGAAAGCCAAACAGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

33 Sp13_r CACTGTTTGGCTTTCAGTTACGGTGTTTCGTCCTTTC

34 Sp14_f AAACAAAGGACGTCCCGCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

35 Sp14_r GCGCGGGACGTCCTTTGTTTCGGTGTTTCGTCCTTTC

36 Sp15_f TAAAGAATTTGGAGCTACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

37 Sp15_r CAGTAGCTCCAAATTCTTTACGGTGTTTCGTCCTTTC

3S Sp16_f CGCCGACGGGACGTAAACAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

39 Sp17_f CTGGGTTTCACCCCACCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

40 Sp1S_f GTCAATCTTCTCGAGGATTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

41 Sp19_f CCTTATCGTCAATCTTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

42 Sp20_f TCCGCAGTATGGATCGGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

43 Sp21_f TGCTGTACCAAACCTTCGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

44 Sp22_f CACCTCACCATACTGCACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

45 Sp23_f TGAGGATGAGTGTTTCTCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

46 Sp24_f GAAGATTGACGATAAGGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

47 Sp25_f CCGCAGGATTCAGCGCCGACGTTTTAGAGCTAGAAATAG

4S Sp26_f CGAATTTTGGCCAAGACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

49 Sp27_f TGAACCTTTACCCCGTTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

50 Sp2S_f TAAAGACTGGGAGGAGTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

51 Sp29_f CAGGTATTGTTTACACAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

52 Sp30_f CTGGCCGTTGCCGGGCAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

53 Sp31_f GACCAAGCCCCAGCCAGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

54 Sp32_f CATGACCAAGCCCCAGCCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

55 Sp33_f TGACCAAGCCCCAGCCAGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

56 Sp34_f CCTGCTGCGAGCAAAACAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

57 Sp35_f CGGGGAGTCCGCGTAAAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

58 Sp36_f ATGGGCCATCAGCGCATGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

59 Sp37_f GCAGATGAGAAGGCACAGACGTTTTAGAGCTAGAAATAG

60 Sp38_f ACACGGTCCGGCAGATGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

61 Sp39_f GAGGTGAAGCGAAGTGCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

62 Sp40_f GGTCTCCATGCGACGTGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

63 Sp41_f ACCTTGAGGCATACTTCAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

64 Sp42_f CTTCACCTCTGCACGTCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG

65 Sp43_f TGCCGTTCCGACCGACCACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

66 Sp44_f ACTACTAGGTCTCTAGACGCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

67 Sp45_f ATGACTCTAGCTACCTGGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG

68 Sp46_f GGGGCGCACCTCTCTTTACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

69 Sp47_f CTGTTGTTAGACGACGAGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAG

70 Sp48_f ACTACTGTTGTTAGACGACGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

71 Sp49_f GGTTTCACCCCACCGCACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

72 Sp50_f CAAAAGGCCTCCGTGCGGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAG

73 Sp16_r TTGTTTACGTCCCGTCGGCGCGGTGTTTCGTCCTTTC

74 Sp17_r TGCGGTGGGGTGAAACCCAGCGGTGTTTCGTCCTTTC

75 Sp1S_r CAATCCTCGAGAAGATTGACCGGTGTTTCGTCCTTTC

76 Sp19_r CGAGAAGATTGACGATAAGGCGGTGTTTCGTCCTTTC

77 Sp20_r CTGCCGATCCATACTGCGGACGGTGTTTCGTCCTTTC

7S Sp21_r TCCGAAGGTTTGGTACAGCACGGTGTTTCGTCCTTTC

79 Sp22_r GAGTGCAGTATGGTGAGGTGCGGTGTTTCGTCCTTTC

S0 Sp23_r TTGAGAAACACTCATCCTCACGGTGTTTCGTCCTTTC

S1 Sp24_r CTCCCTTATCGTCAATCTTCCGGTGTTTCGTCCTTTC

S2 Sp25_r GTCGGCGCTGAATCCTGCGGCGGTGTTTCGTCCTTTC

S3 Sp26_r TGTGTCTTGGCCAAAATTCGCGGTGTTTCGTCCTTTC

S4 Sp27_r GGCAACGGGGTAAAGGTTCACGGTGTTTCGTCCTTTC

S5 Sp2S_r CCAACTCCTCCCAGTCTTTACGGTGTTTCGTCCTTTC

S6 Sp29_r TTCTGTGTAAACAATACCTGCGGTGTTTCGTCCTTTC

S7 Sp30_r CGTTGCCCGGCAACGGCCAGCGGTGTTTCGTCCTTTC

SS Sp31_r CCACTGGCTGGGGCTTGGTCCGGTGTTTCGTCCTTTC

S9 Sp32_r CTGGCTGGGGCTTGGTCATGCGGTGTTTCGTCCTTTC

90 Sp33_r CACTGGCTGGGGCTTGGTCACGGTGTTTCGTCCTTTC

91 Sp34_r CTTGTTTTGCTCGCAGCAGGCGGTGTTTCGTCCTTTC

92 Sp35_r CTCTTTACGCGGACTCCCCGCGGTGTTTCGTCCTTTC

93 Sp36_r CGCATGCGCTGATGGCCCATCGGTGTTTCGTCCTTTC

94 Sp37_r GTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGTGTTTCGTCCTTTC

95 Sp38_r TCTCATCTGCCGGACCGTGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

96 Sp39_r TGTGCACTTCGCTTCACCTCCGGTGTTTCGTCCTTTC

97 Sp40_r CTGCACGTCGCATGGAGACCCGGTGTTTCGTCCTTTC

98 Sp41_r TTTGAAGTATGCCTCAAGGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

99 Sp42_r TGCGACGTGCAGAGGTGAAGCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 0 Sp43_r CGTGGTCGGTCGGAACGGCACGGTGTTTCGTCCTTTC

10 1 Sp44_r GCGTCTAGAGACCTAGTAGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 2 Sp45_r ACCCAGGTAGCTAGAGTCATCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 3 Sp46_r CGTAAAGAGAGGTGCGCCCCCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 4 Sp47_r GCCTCGTCGTCTAACAACAGCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 5 Sp48_r CGTCGTCTAACAACAGTAGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 6 Sp49_r CCGTGCGGTGGGGTGAAACCCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 7 Sp50_r CACCGCACGGAGGCCTTTTGCGGTGTTTCGTCCTTTC

10 Nm1_f AACAGTAGGACATGAACAAGGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

S

10 9 Nm1 r CTTGTTCATGTCCTACTGTTCGGTGTTTCGTCCTTTCC

11 0 Nm2_f GACCCCGAGAAGGGTCGTCCGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

11 1 Nm2 r GGACGACCCTTCTCGGGGTCCGGTGTTTCGTCCTTTCC

11 2 Nm3_f GGCGAGAAAGTGAAAGCCTGGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

11 3 Nm3 r CAGGCTTTCACTTTCTCGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCC

11 4 Nm4_f ATCTTTCCACCAGCAATCCTGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

11 5 Nm4_r AGGATTGCTGGTGGAAAGATCGGTGTTTCGTCCTTTC

11 6 Nm5_f AACAGTAGGACATGAACAAGGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

11 7 Nm5 r CAATACCGCAGAGTCTAGACCGGTGTTTCGTCCTTTC

11 S Nm6_f GTCTAGACTCTGCGGTATTGGTTGTAGCTCCCTTTCTCG

11 9 Nm6 r CAATACCGCAGAGTCTAGACCGGTGTTTCGTCCTTTC

12 St1_f GATTAAAGACAGGTACAGTAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT

0 AAG

12 1 St1_r TACTGTACCTGTCTTTAATCCGGTGTTTCGTCCTTCC

12 2 St2_f GGATCCAACTGGTGGTCGGGGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

12 3 St2_r CCCGACCACCAGTTGGATCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

12 4 St3_f GGCGGGGTTTTTCTTGTTGAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

12 5 St3_r TCAACAAGAAAAACCCCGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

12 6 St4_f GGCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

12 7 St4_r TGGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

12 8 St5_f AAGGTTCAGGTATTGTTTACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

12 9 St5_r GTAAACAATACCTGAACCTTCGGTGTTTCGTCCTTCC

13 0 St6_f GCATGGACATCGACCCTTATGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

13 1 St6_r ATAAGGGTCGATGTCCATGCCGGTGTTTCGTCCTTCC

13 St7_f AGGCGGGTATATTATATAAGGTTTTTGTACTCTCAAGATTT

2 AAG

13 3 St7_r CTTATATAATATACCCGCCTCGGTGTTTCGTCCTTCC

13 4 StS_f TAAATGTATACCCAAAGACAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

13 5 StS_r TGTCTTTGGGTATACATTTACGGTGTTTCGTCCTTCC

13 6 St9_f ATTGTGAGGATTCTTGTCAAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

13 7 St9_r TTGACAAGAATCCTCACAATCGGTGTTTCGTCCTTCC

13 S St10_f AGAAAGGCCTTGTAAGTTGGGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

13 9 St10_r CCAACTTACAAGGCCTTTCTCGGTGTTTCGTCCTTCC

14 0 Fn1_f TCCGCAGTATGGATCGGCAGCTCGTAATTAATAAACCATGA AAGTATGGTTTATTAGATTGTTGAAGGCTAGTCCGTTATCA AC

14 1 Fn2_f ACCCCGCCTGTAACACGAGACTCGTAATTAATAAACCATGA AAGTATGGTTTATTAGATTGTTGAAGGCTAGTCCGTTATCA AC

14 2 Fn3_f CGCCGACGGGACGTAAACAACTCGTAATTAATAAACCATG AAAGTATGGTTTATTAGATTGTTGAAGGCTAGTCCGTTATC AAC

14 3 Fn4_f CGAATTTTGGCCAAGACACACTCGTAATTAATAAACCATGA AAGTATGGTTTATTAGATTGTTGAAGGCTAGTCCGTTATCA AC

14 4 Fn5_f GCATACAAAGGCATCAACGCCTCGTAATTAATAAACCATGA AAGTATGGTTTATTAGATTGTTGAAGGCTAGTCCGTTATCA AC

14 5 Fn1 r CTGCCGATCCATACTGCGGACGGTGTTTCGTCCTTTC

14 6 Fn2 r TCTCGTGTTACAGGCGGGGTCGGTGTTTCGTCCTTTC

14 7 Fn3 r TTGTTTACGTCCCGTCGGCGCGGTGTTTCGTCCTTTC

14 8 Fn4 r CGAATTTTGGCCAAGACACACGGTGTTTCGTCCTTTC

14 9 Fn5 r GCATACAAAGGCATCAACGCCGGTGTTTCGTCCTTTC

15 0 cccDNA_f CCGTGTGCACTTCGCTTCA

15 1 cccDNA_r GCACAGCTTGGAGGCTTGA

15 2 cccDNA_ probe FAM-CATGGAGACCACCGTGAACGCCC-BHQ1

15 3 pgrna_f GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCT

15 4 pgrna_r CATTGAGATTCCCGAGATTGAGAT

15 5 pgrna_pro be FAM-TCTCAATCGCCGCGTCGCAGA-BHQ1

15 6 srna_f TCCTCCAACTTGTCCTGGTTATC

15 7 srna_r AGATGAGGCATAGCAGCAGGAT

15 S srna_prob e FAM-ATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGC-BHQ1

15 9 St4_seq_f ACTACTGCTCAAGGAACCTCT

16 0 St4_seq_r ACAAAAGAAAATTGGTAACAGCGG

16 1 SPCas9_f TCCTGCTGAGCGACATCCTG

16 2 SPCas9_r GCGTAGCCGTTCTTGCTCTG

16 3 SPCas9_q pcr FAM-TCAGGCAGCTGCTGCCGCACGA-BHQ1

16 4 STCas9_p robe FAM-GCAGGAGCACTTCCGCGCCC-BHQ1

16 5 STCas9_f GAAGTTCATCGAGCGCAAC

16 6 STCas9_r TGGCTAGAAGCCGCAATGAT

16 7 NMCas9_ f CTGCAGAAGTTCGACGAGGA

16 8 NMCas9_ r AAGTGGGTCTTCTGGTGCAG

16 9 FNCas9_f GCTTATAGGTCTGAGCGCGT

17 0 FNCas9_r CGTCTGCCCTGCTATCTGAG

17 1 bglobin_f V31-FEP-CE - AMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE)

17 2 bglobin r V31-FEP-CE - AMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE)

17 3 bglobin_pr obe V31-FEP-CE - AMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE)

17 4 ST4_M11 _f GGCACTAGTTAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

17 5 ST4_M12 _f GGCACTAGAAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

17 6 ST4_M13 _f GGCACTACTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

17 7 ST4_M14 _f GGCACTTGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

17 S ST4_M15 _f GGCACAAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

17 9 ST4_M16 _f GGCAGTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 0 ST4_M17 _f GGCTCTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 1 ST4_M1S _f GGGACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 2 ST4_M19 _f GCCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 3 ST4_M20 _f CGCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 4 ST4_M1 M2_f GGCACTAGTAAACTGAGCGTGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 5 ST4_M3 M4_f GGCACTAGTAAACTGACGCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 6 ST4_M5 M6_f GGCACTAGTAAACTCTGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

1S 7 ST4_M6 M7_f GGCACTAGTAAACACAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S S ST4_M1 M2M3_f GGCACTAGTAAACTGAGGGTGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

1S 9 ST4_M4 M5M6_f GGCACTAGTAAACTCTCCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTA AG

19 0 ST4_M5 M6M7_f GGCACTAGTAAACAGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

19 1 ST4_M11 r TGGCTCAGTTAACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 2 ST4_M12 r TGGCTCAGTTTTCTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 3 ST4_M13 r TGGCTCAGTTTAGTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 4 ST4_M14 r TGGCTCAGTTTACAAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 5 ST4_M15 r TGGCTCAGTTTACTTGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 6 ST4_M16 r TGGCTCAGTTTACTACTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 7 ST4_M17 r TGGCTCAGTTTACTAGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 8 ST4_M18 r TGGCTCAGTTTACTAGTCCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

19 9 ST4_M19 r TGGCTCAGTTTACTAGTGGCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 0 ST4_M20 r TGGCTCAGTTTACTAGTGCGCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 1 ST4_M1 M2_r ACGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 2 ST4_M3 M4_r TGCGTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 3 ST4_M5 M6_r TGGCAGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 4 ST4_M6 M7_r TGGCTGTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 5 ST4_M1 M2M3_r ACCCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 б ST4_M4 M5M6_r TGGGAGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 7 ST4_M5 M6M7_r TGGCTCTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

20 S ST4_M1_f GGCACTAGTAAACTGAGCCTGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

20 9 ST4_M2_f GGCACTAGTAAACTGAGCGAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 0 ST4_M3_f GGCACTAGTAAACTGAGGCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 1 ST4_M4_f GGCACTAGTAAACTGACCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 2 ST4_M5_f GGCACTAGTAAACTGTGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 3 ST4_M6_f GGCACTAGTAAACTCAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 4 ST4_M7_f GGCACTAGTAAACAGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 5 ST4_M8_f GGCACTAGTAAAGTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 б ST4_M9_f GGCACTAGTAATCTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 V ST4_M10 _f GGCACTAGTATACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG

21 S ST4_M1_r AGGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

21 9 ST4_M2_r TCGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 0 ST4_M3_r TGCCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 1 ST4_M4_r TGGGTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 2 ST4_M5_r TGGCACAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 3 ST4_M6_r TGGCTGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 4 ST4_MV_r TGGCTCTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 5 ST4_M8_r TGGCTCACTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 б ST4_M9_r TGGCTCAGATTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 V ST4_M10 r TGGCTCAGTATACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC

22 8 ST4_M1_f GGCACTAGTAAACTGAGCCTGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAG