Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Аль-Названи Нассер Салем

• Аль-Названи Нассер Салем
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аль-Названи Нассер Салем

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Свойства опухолевой ткани, делающие осуществимой терапию конъюгированными препаратами.

1.1.1. Антигены, ассоциируемые с опухолями.

1.1.2. Интернализация.

1.1.3. Особенности опухолевых кровеносных сосудов и проникновение лекарства через них.

1.1.4. Особенности опухолевого метаболизма.

1.2. Стратегии получения биоконъюгатов для направленной доставки и выбора сшивающего агента.

1.2.1. Функциональные группы белков.

1.2.2. Реагенты для модификации белков.

1.3. Бифункциональные реагенты.

1.3.1. САТА.

1.3.2. СПДП.

1.4. Иммуноконъюгаты на основе моноклональных антител.

1.4.1. Конъюгирование лекарственных средств с МАТ.

1.4.2. Мишени для антител.

1.4.3. Факторы, влияющие на эффективность конъюгатов противораковых препаратов с антителами.

1.4.4. Доставка антрациклинов с помощью МАТ.

1.4.5. Ограничения эффективности конъюгатов лекарственных средств с антителами.

1.5. Альфа-фетопротеин.

1.5.1. Функции.

1.5.2. Структура.

1.5.3. АФП как вектор для направленной доставки противораковых средств.

1.5.4. Регуляция экспрессии АФП.

1.5.5. Генетическое разнообразие АФП.

1.5.6. Антигенные разновидности.

1.5.7. Рецептор АФП.

1.6. Рецептор эпидермального фактора роста как мишень для лекарственных средств направленного действия.

1.6.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР).

1.6.2. Структура ЭФР.

1.6.3. Потенциал использования ЭФР в лечении рака.

1.6.4. Синтез конъюгатов ЭФР.

1.6.5. Рецептор ЭФР.

1.6.6. Структура рецептора эпидермального фактора роста.

1.6.7. Передача сигнала с помощью РЭФР.

1.6.8. Усиление внутриклеточного сигнала РЭФР.

1.6.9. Мутантные формы РЭФР.

1.6.10. РЭФР и рак.

1.7. Подходы, основанные на применении липосом.

1.8. Декстраны.

1.9. Использование человеческого сывороточного альбумина в качестве носителя

1.10. Опухолевый ангиогенез в качестве мишени для терапии.

1.10.1. Механизмы, способствующие ангиогенезу.

1.10.2. Основной ФРФ.

1.10. 3. Протеолитические ферменты.

1.10.4. Клетки, ответственные за воспалительную реакцию.

1.10.5. Роль интегринов в ангиогенезе.

1.10.6. Ингибиторы ангиогенеза.

1.10.7. Антиангиогенная терапия рака.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Использованные оборудование и материалы.

2.2. Выделение и очистка АФП.

2.2.1. Иммобилизация моноклональных антител на сефарозе.

2.2.2. Фракционирование полиэтиленгликолем.

2.2.3. Аффинная хроматография.

2.2.4. Ионообменная хроматография.

2.2.5. Гель-проникающая хроматография.

2.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3. Выделение и очистка ЭФР.

2.3.1. Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рч ЭФР).

2.3.2. Выделение мышиного ЭФР.

2.3.3.Синтез и очистка ЭФРфр и его модифицированных форм.

2.4. Получение конъюгатов ДР с АФП.

2.4.1. Модификация ДР с помощью Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионата. (СПДГТ).

2.4.2. Модификация АФП с помощью СПДП.

2.4.3. Получение конъюгатов ДР с АФП с помощью СПДП.

2.5. Получение конъюгатов ДР с ЭФР и ЭФРфрго-з1.

2.6. Получение конъюгатов ДР с ЭФРфрго-зь ЭФРфр 1 и ЭФРфр2.

2.7. Получение конъюгатов ДР с МАТдфпр.

2.7.1. Активация доксорубицина с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира S-ацетилтиогликолевой кислоты (SATА).

2.7.2. Синтез конъюгата моноклонального антитела с доксорубицином.

2.8. Исследование биологической и специфической противоопухолевой активности препаратов in vitro.

2.8.1. Культивирование клеток.

2.8.2. Митогенная активность ЭФР, ЭФРфрго-зь ЭФРфр 1 и ЭФРфр2.

2.8.3. Определение цитотоксической активности (ЦТА) конъюгатов in vitro.

2.8.4. Оценка жизнеспособности клеток.

2.9. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo.

2.9.1. Животные и опухоли.

2.9.2. Дозы препаратов и их введение.

2.9.3. Объем опухолей.

2.9.4. Продолжительность жизни животных.

2.9.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение а-фетопротеина человека.

3.1.1. Аффинная хроматография.

3.1.2. Ионообменная хроматография.

3.1.3. Гель-проникающая хроматография.

3.2. Выделение ЭФР.

3.2.1. Выделение ЭФР из подчелюстных желез мыши.

3.2.3. Выделение рекомбинантного человеческого ЭФР (рчЭФР).

3.3. Синтез конъюгатов векторных белков с доксорубицином.

3.3.1. Конъюгаты АФП и МАТдфпр с доксорубицином (ДР).

3.3.2. Получение конъюгата ДР с МАТдфпр.

3.4. Исследования ЦТА конъюгатов АФП-ДР и МАТдфпр-ДР.

3.5. Получение конъюгатов ДР -ЭФР и ДР-ЭФРфр2о-з1.

3.6. Определение митогенной активности ЭФР и ЭФРфр20-31.

3.7. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР-ДР и ЭФРфрю-згДР.

3.8. Цитотоксическая активность конъюгатов в отношении эндотелиальных клеток (HUVEC).

3.9. Получение конъюгатов рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР и его модифицированных форм (ЭФРфр 1, ЭФРфр2) с помощью сшивающего реагента СПДП.

3.10. Цитотоксическая активность ДР и его конъюгатов с ЭФР-пептидами в отношении клеток карциномы человека HeLa.

3.11. ЦТА ДР и конъюгатов в отношении клеток меланомы линии В16 in vitro.

3.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов»

Направленную доставку нередко подразделяют на активную и пассивную, причем пассивная предполагает накопление лекарства вследствие действия физико-химических или фармакологических факторов, тогда как активная направленная доставка обусловлена специфическим взаимодействием между системой доставки и компонентами клеток или тканей. Терапия рака с помощью направленной доставки лекарственных средств осуществляется преимущественно применением цитотоксических препаратов, которые убивают клетки, вместо того, чтобы оказывать постепенное фармакологическое действие за счет биологического ответа. Большинство этих препаратов было разработано на основании того факта, что раковые клетки делятся быстрее, нежели нормальные. В целом это действительно так, однако проблема состоит в том, что разница их активностей по отношению к опухолевой и нормальной тканям настолько мала, что между концентрацией, вызывающей гибель всех опухолевых клеток и концентрацией, ведущей к серьезным повреждениям нормальной ткани остается лишь небольшое «окно». Очевидно, что возможность более эффективной доставки препарата к его мишени и сопутствующее уменьшение количества препарата, поступающего в нормальные ткани, привели бы к сокращению числа опасных для жизни побочных эффектов и значительному прогрессу терапии рака.

Открытие опухолевых антигенов заставило возлагать на эти идеи большие надежды и стимулировало проведение большого числа разнообразных опытов по направленной доставке. Однако вскоре стало ясно, что в большинстве своем предложенные мишени относились к опухолеассоциированным антигенам, различие в экспрессии которых опухолевой и нормальной тканями носит лишь количественный характер. На данном этапе возник вопрос о том, может ли такая разница в экспрессии антигена иметь терапевтическое применение. Чтобы ответить на него необходимо, в первую очередь, определить характерные различия между нормальными и раковыми клетками, которые могут быть использованы. Молекула клеточной поверхности, распознаваемая векторным агентом может быть опухолеспецифическим антигеном, например гликопротеином или онкобелком, рецептором фактора роста или гормона роста. В идеальном случае такая молекула на клеточной поверхности должна обладать следующими свойствами: (А) уникальная молекула, экспрессируемая только в ткани опухоли, (Б) отсутствие экспрессии в нормальных тканях, (В) высокая аффинность связывания с векторной молекулой, (Г) однородность экспрессии на всех клетках ткани-мишени, (Д) экспрессия в опухолях всех больных с одинаковым типом рака, (Е) не выделяется в сыворотку больных. Главной предпосылкой подхода, основанного на направленной доставке лекарственных средств, является то, что конъюгирование лекарства с молекулой, специфично связывающейся с опухолью, приводит его в неактивное состояние до тех пор, пока оно не достигнет своей мишени. Оказавшись в опухоли, конъюгированный препарат связывается с поверхностью опухолевых клеток и в дальнейшем интернализуется и отщепляется от молекулы-носителя. Таким образом, конъюгированные препараты можно рассматривать как опухолеактивируемые пролекарства (ОАПЛ).

В то время как наиболее распространенные пролекарства превращаются в лекарственную форму за счет таких механизмов, как химический или ферментативный гидролиз, восстановление активности ОАПЛ должно целиком зависеть от антигенов или рецепторов, которые специфичны для поверхности опухолевых клеток. Как правило, подобные лекарственные средства разрабатывались для преодоления физиологических барьеров, таких как быстрый метаболизм или выведение из циркуляции. Обычные пролекарства разрабатываются в предположении того, что улучшение фармакокинетических свойств исходного лекарства приведет к увеличению его уровня в циркуляции и через это - к большей активности за счет улучшения его накопления в опухоли. При терапии ОАПЛ специфическое сродство опухолеассоциированного антигена или рецептора к векторной составляющей конъюгата ведет, вдобавок, к большему поглощению и накоплению ОАПЛ в опухоли, против которой оно направлено и, таким образом, к увеличенной селективности. За этим следует высвобождение активного лекарства, следствием которого является его высокая местная концентрация в области мишени. В идеальном случае конъюгаты стабильны в кровотоке, поэтому активное лекарство не высвобождается вовне опухоли. Конъюгаты также не должны связываться с тканями, не являющимися их мишенью и, следовательно, должны быть нетоксичны при применении in vivo.

В ранних испытаниях конъюгированных препаратов широко использовались моноклональные антитела, однако различными методами, например иммунофлуоресцентным, было показано, что большинство антител связывается с опухолеассоциированными антигенами, которые лишь преимущественно, но не исключительно, экспрессируются на поверхности опухолевых клеток. В большинстве случаев антитела также связываются, хотя и в меньшей степени, с нормальными тканями. Применение же небольших фрагментов антител показало, что они обладают большей скоростью клиренса и неспособны транспортировать достаточное количество активного лекарства.

В качестве векторных агентов наиболее привлекательны другие молекулы, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), обладающий малым размером, высоким сродством к рецептору и быстро интернализирующийся после связывания с рецептором. Вдобавок ЭФР не обладает иммуногенностью по отношению к организму-хозяину. Альфа-фетопротеин (АФП) является онкофетальным белком, который широко используется в качестве векторной молекулы, поскольку его рецептор избирательно экспрессируется в различных типах опухолей. Ряд других векторных агентов с небольшой молекулярной массой, включая трансформирующий фактор роста (ТФР-а) и лактоферрин, также связывается преимущественно с опухолевыми мишенями.

Подчеркнутые выше проблемы можно преодолеть путем тщательного исследования характеристик процесса конъюгации, которые ведут к улучшению доставки и избирательности конъюгированного препарата. Оно включает выбор вектора, природы связи между фармакологическим агентом и вектором и улучшение понимания механизмов высвобождения лекарства внутри клетки.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Главной целью исследования являлось получение конъюгатов биологически активных пептидов и белков с подходящими химиопрепаратами, обладающими противоопухолевой активностью, для создания эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

• Изучение свойств пептидных и белковых векторов с точки зрения сродства к раковой клетке.

• Получение выбранных пептидов и белков из различных биологических источников или химическим синтезом.

• Изучение противоопухолевых и структурных свойств ряда противоопухолевых антибиотиков с оценкой пригодности для синтеза конъюгатов.

• Изучение различных методов синтеза конъюгатов с применением ряда конденсирующих агентов и выбор оптимального метода.

• Синтез ряда конъюгатов и изучение их биологических свойств.

• Изучение противоопухолевой активности полученных препаратов напровленного действия.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Аль-Названи Нассер Салем

выводы

1. Разработаны модифицированные методы выделения а-фетопротеина из сыворотки пуповинной крови и эпидермального фактора роста из подчелюстных желез мыши и штамма-продуцента Е. coli (человеческий ЭФР), позволившие получать высокоочищенные белки в нативном состоянии.

2. Продемонстрировано, что in vitro ЭФР и его рецепторсвязывающий фрагмент характеризуются близкими уровнями пролиферативной активности.

3. Получены синтетические аналоги рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР (ЭФРфр 1 и ЭФРфр2) и показана их способность к связыванию с рецептором ЭФР. Целевые аминокислотные замены, произведенные в рецепторсвязывающем участке ЭФР, не привели к потере биологической активности пептидов и позволили упростить процедуру синтеза их конъюгатов с ДР и увеличить эффективность действия конъюгатов.

4. Путем химического синтеза получены конъюгаты ЭФР и его рецепторсвязывающих фрагментов, АФП и МАТАФПр с ДР, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека, значительно превышающую активность свободного ДР.

5. Продемонстрировано значительное снижение резистентности опухолевых клеток к ДР при использовании конъюгатов ЭФР и ЭФРфр, АФП, и МАТдфпр с ДР.

6. В модельных экспериментах in vivo убедительно продемонстрировано, что терапевтическое применение конъюгатов ДР как с ЭФР, так и с ЭФРфр приводит к заметному подавлению опухолевого роста и значительному увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем. Применение свободного ДР не приводило к детектируемому терапевтическому эффекту.

7. Продемонстрировано, что АФП, МФТафпр, ЭФР и его рецепторсвязывающие фрагменты могут быть успешно использованы для избирательной доставки ДР в опухолевые клетки. Применение всех полученных препаратов позволяет значительно снизить резистентность опухолевых клеток к ДР.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аль-Названи Нассер Салем, 2004 год

1. Hanahan, D., Weiberger, R.A. the hallmarks of cance. Cell, 2000,100, 57-70.

2. Bolten, B.M. and Georgeo, T. trends in development cycles. Nat. Rev. Drug Discovery, 2002, 1, 335-336.

3. Multhof, G., Botzler, C., Jennen, L., Ellwart, J.,and Issels, R. shock protein 22 on tumor cells-a recognition structure for natural killer cells. J.Immunol, 1997, 158, 4341-4350.

4. Jain, R.K. Whitaker lecture: delivery of molecules, particles, and cells to solid tumors. Ann Biomed Eng, 1996, 24, 457-473.

5. Folkman, J. fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am, 1996, 275,150154.

6. Olson, T.A, Mohanraj, D., Roy, S., and Ramakrishnan. Targeting the tumor vasculature: inhibition of tumor growth by a vascular endothelial growth factor-toxin conjugate. Intj Cancer, 1997, 73, 865-870.

7. Yamagata, M. and Tannock, I. F. the chronic administration of drugs that inhibit the regulation of intracellular pH: in vitro and antitumor effects. Br J Cancer, 1996, 73, 1328-1334.

8. Tannok, I., Lee, C., Thaker, J., and Houghton, P. pH-dependent activity of the diarylsulfonyluria N-(5-indanylsulfonyl)-N'-(4-chlorofenyl)-urea. Cell pharmacol, 1995,2, 193-198.

9. De Lange, R.J., and Huang, T.S. Egg white avidin 3. sequence of the 78-residue middle cyanogens bromide peptide. Complete amino acid sequences of the protein subunit. J. Biol. Chem, 1971,246, 698.

10. Fasman, G. D., Ed. Practical handbook of biochemistry and molecular biology, p 13, CRS press, Boca Raton, FL, 1989.

11. Korn, A. H., Feairheller, S. H., and Filachione, E. M. Glutaraldehyde: nature of the reagent. J. Mol. Biol. 1972, 66, 525.

12. Riordan, J. F., and Vallee, B. L. Diazonium salts as specific reagents and probes of protein configuration. Methods Enzymol, 1972,25, 251.

13. Renthal, R., Cothran, M., Dawson, N, and Harris, G. J. Fluorescent labeling of bacteriorhodopsin: implication for helix connection. Biochim. Biophys. Acta 1987, 897,384.

14. Bragg, P. D., and Hou, C. subunit composition, function and special arrangements in the Ca2+ and Mg2+-activated adenosine triphosphatases of Echerichia coli and Salmonella typhimurium. Arch. Biochem. Biophys. 1975, 167, 311.

15. Lomants, A. L., and Fairbanks, G. Chemical probes of cleavable protein cross-linking reagent 35S.dithiobis(succinimidyl propionate). J. Mol. Biol. 1976, 102,243.

16. Kosower, N. S. Bimane fluorescent labels: labeling of normal human red cells under physiological conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76, 3382.

17. Gundlach, H. C., Moore, S., and Stein, W. H. The reaction of iodoacetate with methionine. J. Biol. Chem. 1959,234, 1761.

18. Julian, R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassays. Bioconjugate Chem. 1990,1,222.

19. Duncan, R. J. S., Weston, P. D. and Wrigglesworth, R. A new reagent which may be used to introduce -SH group at 5'OH terminus of oligonucleotide. Nucleotides & nucleotides. 1992,11(5), 1003-1007.

20. Trail, A. P. and Bianchi, A. B. Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of camcer. Current Openion in Immunology, 1999, 11, 584-588.

21. Sievers, E. L., Appelbaum, F. R.,Spielberger, R. Т., Forman, S. J., Flowers, D., Smith

22. F. O., Shannon-Dorcy, K.,Berger, M. S., Bernstien, I. D. selective ablation of acute myeloid leukemia using antibody-targeting chemotherapy: a phase 1 study of an anti-CD33 calicheamicin immunoconjugate. Blood, 1999, 93, 3678-3684.

23. Saleh, M. N., LoBuglio, A. F., Trail, P. A. Immunoconjugate therapy of solid tumors: studies with BR96-doxorubicin. In Monoclonal-Antibody Based Therapy of Cancer. Edited by Grossbard M. New York: Marcel Dekker, 1998 397-416.

24. Firestone, R. A., Willner, D., Hofstead, S. J., King, H. D., Kaneko, Т., Braslawsky,

25. G.R., Greenfield, R. S., Trail, P. A., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Casazza, A. M., Hellstrom, К. E., Hollstrom, I. Synthesis and antitumor activity of the immunoconjugate BR96-Dox. J. Control. Releasae, 1996, 39,251-259.

26. Go Saito, Joel A. Swanson, Kyung-Dall Lee. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55,199-215.

27. Stan, A. C., Rdu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T, -D. Antineoplastic efficacy of doxorubicin enzymatically assembled on galactose residues of amonoclonal antibody specific for the carcinoembryonic antigen. Cancer Res, 1999, 59,115-121.

28. Hashida, S., Imagawa, M., Inoue, S., Ruan, К. -H, Ishikawa, E. More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab' to forseradish peroxidase through thiol groups in the hinge. J. Appl. Biochem. 6, 1984, 56-63.

29. Wahl, A. F., Donaldson, K. L., Mixan, B. J., Trial, P. A., Siegal, С. B. selective tumor sensitization to taxans with the mAb-drug conjugate cBR96-doxorubicin, Int. J. Cancer 93,2001,590-600.

30. Hamman, P. R., Hinman, L. M., Beyer, C. F., Lindh, D., Upeslacis, J., Flowers, D. A., Bernstein, I. an anti-CD33 antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Choice of linker. Bioconjug. Chem. 13,2002,40-46.

31. Duncan, R., Gac-Briton, S., Keane, R., Musila, R., Sat, N. Y., Satchi, R., Searle, F. Polymer-drug conjugates, PDEPT and PELT: basic principles for design and transfer from the laboratory to clinic. J. Controlled Release, 74,2001, 135-146.

32. Daussin, F. Boschetti, E., Delmotte, F., Monsigny, M. p- Benzylthiocarbamoyl-aspartyl-daunorubicin-substituted polytrisacryl. A new dug acid labile arm-carrier conjugate. Eur. J. Biochem, 176, 1988, 625-628.

33. Zwick, E, Bange, J., Ullrich, A. Receptor tyrosine kinases as targets for anticancer drugs. Trends Mol Med, 2002, 8, 17-23.

34. Hicklin, D. J., Witte, L., Zhu, Z., Liao, F., Wu, Y., Li, Y., Bohlen, P., Monoclonal antibody strategies to block angiogenesis. Drug Discovery Today, 2001,6, 517-528.

35. Anna Bagnato and Francessca Spinella. Emerging role of endothelin 1 in tumor angiogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 2002,14:1.

36. Plate, K. From angiogenesis to lymphangiogenesis. Nat Med 2001, 7: 151-152.

37. Trikha, M., Yan, L. and Nakada, M. T. Monoclonal antibodies as therapeutics in oncology. Current Openion in Biotechnology, 2002, 13, 609-614.

38. Sedlacek, H. H., Seemann, G., Hoffmann, D., Czech, J., Lorenz, P., Kolar, C., Boslet, K. antibodies as carriers of cytotoxicity. Huber, H., Queiber (Eds.), contrib. Oncology, Karger, Basel, 43,1992, 75-82.

39. Trial, P. A., Willner D., Hellstrom, К. E. Site-directed delivery of anthracyclines for cancer therapy. Drug Dev Res, 1995, 34, 196-209.

40. Trail, P. A., Wilnwr, D., Lasch, S. J, Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrom, I., Hellstrom, К. E. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. Science, 1993, 261, 212-215.

41. Shih, L. В., Goldenberg, D. M., Xuan H. Lu, H., Sharkey, R. M., Hall, Т. C. Anthracycline immunoconjugates prepared by a site specific linkage via an amino-dextran intermediate carrier. Cancer Res, 1991,51,4192-4198.

42. Yang, F., Luna, V. J., McAnelly, R. D., Neberhaus, К. H., Cupples, R. I., Bowman, В. H., Evolutionary and structural relationship among the group specific component, albumin and alpha-fetoprotein. Nucleic Acids Res, 1985, 13, 8007-8017.

43. Deutsch, H. F. Chemistry and biology of a-fetoprotein. Adv. Cancer Res. 1991, 56, 253-312.

44. Seppala, M., Ruoslahti, E. Alpha fetoprotein: physiology and pathology during pregnancy and application to antenatal diagnosis. J. Perin. Med, 1973, 1,104-113.

45. Brock, D. J., Srimgeour, J. В., Nelson, M. M. Ameniotic fluid alpha fetoprotein measurements in the early prenatal diagnosis of central nervous system disorders. Clin. Genet. 1975,7,163-169.

46. Seppala, M. Fetal pathophysiology of human alpha fetoprotein. Ann. New York Acad. Sci. 1975,259, 59-73.

47. Ruoslahti, E. Alpha fetoprotein in cancer and fetal development. Adv. Cancer. Res, 1979,29, 275-3467.

48. Hisa, J. C., Er, J. S., Tan, С. Т., Ester, Т., Rouslahti, E. a-Fetoprotein binding specificity for arachidonate, bilirubin, docosahexaenoate and palmitate. A spin label study. J. Biol. Chem. 1980,255,4224-4227.

49. Ruoslahti, E., Ester, Т., Seppala, M. Binding of bilirubin by bovine and human alpha-fetoprotein. Biochim. Biophys. Acta. 1979, 578, 511-519.

50. Aoyagi, Y., Ikenaka, Т., Ichida, F. Copper2+-binding ability of human alpha fetoprotein. Cancer Res. 1978, 38, 3483-3486.

51. Torres, J. M., Laborda, J., Naval. J., Darracq, N., Calvo, M., Mishal, Z., Uriel, J. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. Mol. Immunol. 1989,26, 851-857.

52. Morinaga Т., Sakai M., Weggman G., Tamaoki T. Primary structure of human alpha fetoprotein and mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80,4604-4608.

53. Mizejewski G. I, Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier. Relevance to domain and subdomain structure. Proc. Soc. Exp Biol Med, 1997, 215, 333-362.

54. Torres J., M., Carracq N., Uriel J. Membrane proteins from lymphoblastoid cells showing cross-affinity for alpha-fetoprotein and albumin. Isolation and characterization. Biochem Biophs Acta, 1992, 1159, 60-66.

55. Suzuki Y., Zeng CQY., Alpert E. Isolation and characterization of specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. J. Clin Invest. 1992,90, 1530-1536.

56. Flynn G. C., Chappel T. G., Rothman J. E. Peptide binding and release by protein assembly. Science. 1989,245,385-390.

57. Torres J. M., Anel A., Uriel J. AFP-mediated uptake of fatty acids by human T-lymphocytes. J Cell Physiol, 1992, 150,456-462.

58. Feldman N. В., Kiselev S. M., Gukasova N. V., Posypanova G. A., Lutsenko S. V., Severin S. E. Antitumor activity of AFP conjugate with Doxorubicin in vitro and in vivo. Biochemistry (Moscow), 2000, 65, 8,1140-1145.

59. Gibbs P. M. P., Zielinski R., Boyd C., Dugaiczyk A. Structure, Polymorphism and Novel repeated DNA Elements revealed by a complete sequence of the human alpha-fetoprotein gene. Biochemistry, 1987,26, 1332-1343.

60. Matsumura M., Shiratori Y., Niwa Y., Tanaka Т., Ogura K. Presence of alpha fetoprotein mRNA in blood correlates with outcome in patients with hepatocellular carcinoma. J. Hepatol, 1999,31, 332-339.

61. Ido A., Ishikawa H., Wakata K., Eguchi K. Gene therapy for hepatoma cells using a retrovirus vector carrying herpes simplex virus thymidine kinase gene under the control of the AFP gene promoter. Cancer Res, 1995, 53, 3105-3109.

62. Wang X. W., Xie H. Growth inhibition of human liver cancer cells by alpha fetoprotein antisense strategy. In vitro Cell Dev Biol-Animal, 1999, 35, 3064-3067.

63. Wan N. J. Y., Jimenez-Molina J. J., Chou J. Y. Fetal and variant AFPs are encoded by mRNAs that differ in sequence at the 5' end. Biochemistry, 1988,27, 7269-7276.

64. Rouslahti E., Engvall E. Immunological crossreaction between AFP and albumin. Proc Natl Acad Sci USA. 1976, 73, 4641-4644.

65. Pekkala-Flagan A., Roulahti E. Unfolded transferring polypeptide chain is immunologically cross-reactive with similar derivatives of serum albumin and AFP. J Immunol, 1982,128, 1163-1167.

66. Villavampa M. J., Moro R., Naval J. Faillt-Cripin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. Biochem Biophys Res Commun, 1984, 122, 1322-1327.

67. Salomon D. S., Brandt R., Ciardiello F., Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol, 1995, 19, 183-232.

68. Brabender J., Danenberg K. D., Metzger R. Epidermal growth factor receptor and HER-2-neu mRNA expression in non-small cell lung cancer is correlated with survival. Clin Cancer Res, 2001, 7, 1850-1855.

69. Tsutsi S., Ohno S., Murakami S., Hatchitanda Y., Oda S. Prognostic value of EGFR and its relationship to the estrogen receptor status in patients with breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2002,1029, 7167-7175.

70. Liberman T. A., Razon N., Bartal A. D., Yarden Y., Schlessinger J., Sorq H. Expression of epidermal growth factor receptors in human brain tumors. Cancer Res, 1984,44, 753-760.

71. Filmus J., Pollak M. N., Caileau R., Buik R. N. MDA-468; a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem. Biophys. 1985, 128, 898905.

72. Bigner S. H., Humphrey P. A., Wong A. J., Vogelstein В., Mark J., Friedman H. S., Bigner D. D. Characterisation of the EGF receptor in human glioma cell lines and xenografts. Cancer Res, 1990, 50, 8017-8022.

73. Klijn J. G., Berns P. M., Schmitz P. I., Foeken J. A. the clinical significance of epidermal growth factor receptor in human breast cancer: a review on 5232 patients. EndocrRev, 1992,13,3-17.

74. Mendelson J. Growth Factor Receptors as targets for antitumor therapy with monoclonal antibodies. Prog. Allergy, 1988,45, 147-160.

75. Carpenter G. Receptor for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Ann. Rev. Biochem, 1989, 56, 881-914.

76. Westphal M., Magnusson A., Heldin С. H. Growth factor biology and oncogene activation in human malignant glioma. Neuro Clinics, 1995, 3, 785-799.

77. Mendelsohn J. Epidermal growth factor receptor inhibition by a monoclonal antibody as anticancer therapy. Clin. Cancer Res, 1997, 3, 2703-2707.

78. Pawlikowska T. R. В., Hooker G., Myers M., Epenetos A. A. Treatment of tumor with radiolabeled antibodies. Cli. Oncol, 1986, 5, 93-107.

79. Prigent S. A., Lemoine N. R. The typr 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Progress in Growth Factor Research, 1992,4, 1-24.

80. Savage C. R., Chetterjee V. K., Gregory H., Bloom S. R. Epidermal growth factor in blood. Regulatory Peptides, 1986,16, 199-20.

81. Savage C. R. Jr., Hash J. H., Cohen S. Epidermal growth factor. J of Biological Chemistry, 1973,247 (22), 7669-7672.

82. Zaman G.J., Flens M. J., VanLeusden M. R. The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump. Proc Natl Acad Sci USA. 1994,91,8822-8826

83. Cowley O., Smith J. A., Gusterson B. The amount of EGF receptors is elevated in squamous cell carcinoma cancer cells. Cancer Cells, 1984, 1, 5-10.

84. Ciardiello F. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents. Drugs, 2000, 60 (suppl. 1), 25-32.

85. Cardiello F., Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor. Clin Cance Res, 2001, 7, 2958-2970.

86. Sartor C.I. Biological modifiers as potential radiosensitisors: targeting the epidermal growth factor receptor family. Semin Oncol, 2000, 27, 15-20.

87. Woodburn J. R. The epidermal growth factor and its inhibition in cancer therapy. Pharmacol Ther, 1999, 82, 241-250.

88. Mayers EL. V., Waterfield M. D. Biosynthesis of the epidermal growth factor receptor in A431 cells. J.EMBO. 1984, 3, 531-537.

89. Weber W., Gill G. N., Dpiess J. Production of an epidermal growth factor receptor-related protein. Science 1984,224,294-297.

90. Boulougouris P., Elder J. B. Epidermal growth factor receptor and transformations. Surg Today, 2002, 32, 667-671.

91. Hunter Т., Cooper J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell, 1984,24, 741-52.

92. Downward J., Yarden Y., Mayes E. Close similarity of epidermal growth factor and v-erb oncogene protein sequence. Nature, 1984, 307, 521-527.

93. Cohen B. D., Green J. M., Foy L., Fell H. P. HER4-mediated biological and biochemical properties in NIH 3T3 cells. Evidence for HER1-HER4 heterodimers. J. Biol-Chem, 1996,271,4813-4818.

94. Heldin С. H., Ostman A. Ligand induced dimerisation of growth factor: variations on the theme. Cytokine-Growth-Factor-Rev, 1996, 7, 3-10.

95. Earp H. S., Dawson T. L., Li X., Yu H. Heterodimerisation and functional interactions between EGF receptor family members: a new signaling paradigmwith implications for breast cancer research. Breast Cancer Res Treat, 1995, 35, 115-32.

96. Moscatello D. K., Holgado-Madruga M., Emlet D. R., Montegomry R. В., Wong A. J. Constitutive activation of phosphotidylinositol 3-kinase by naturally occurring mutant epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 1998, 273,200-206.

97. Normanno N., Ciardiello F. EGF-related peptides in the pathophysiology of the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1997,2, 143-151.

98. Tateishi M., Ishida Т., Mitsudomi Т., Kaneko S., Sugimachi K. Immunohistochemical evidence of autocrine growth factors in adenocarcinoma of the human lung. Cancer Res, 1990, 50, 7077-7080.

99. Modjtahedi H., Dean C. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer. Int J Oncol, 1994,4,277-296.

100. Moscatello D. K., Holgado-Madruga M., Godwin A. K., Ramirez G., Gunn G., Zoltic P. W., Biegel J. A., Hayes R. L., Wong A. J. Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. Cancer Res, 1995,55,5536-5539.

101. Nicholson R. I., Gee J. M. W., Harper M. E. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer, 2001,37 (supl.4), S9-15.

102. Magne N., Pivot X., Bensadoun R. J. The relationship of epidermal growth factor receptor levels to the prognosis of unresectable pharyngeal cancer patients treated bychemo-radiotherapy. Eur J Cancer, 2001, 37, 2169-2177.

103. Drummond D. C., Meyer O., Hong K., Kirpotin D. В., Papahadjopoulos D. Optimising liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacol. Rev, 1999, 51, 691-743.

104. Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and th eantitumor agent samncs. Cancer Res, 1986,46, 6387-6392.

105. Senior I. H. Fate and behaviour of liposomes in vivo: a review of factors. Crit. Ret: ther. Drug Carrier Syst. 1998, 3, 123-193.

106. Trubetskoy, V. S., Torchilin V. P. use of polyoxyethylene-lipid conjugates as long circulating cariers for delivery of therapeutic and diagnostic agents. Adv. Drug Deliv, Ret, 1995, 16,311-320.

107. Yuan E, F, et al. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human xenograft. Cancer Res. 1994, 54, 3352-3356.

108. Gabizon A. A. Pegylated liposomal doxorubicin: metamorphosis of an old drug into a new form of chemotherapy. Cancer Invest, 2001, 19, 424-436.

109. Torchilin V. P., Lukyanov A. N. Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges and solutions. Drug Discovery Today, 2003, 8 (6), 259-266.

110. Reza Mehvar. Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents. J. Control Release, 2000, 69, 1-25.

111. Zhu Z. Kralovec J. Ghose T. Mammen M. Inhibition of Epstein-Barr-virus-transformed human chronic, lymphcytic leukemic В cells with monoclonal antibody-adriamycin (doxorubicin) conjugates. Cancer Immunol. Immunother. 1994, 40, 257267.

112. Marcia Barinaga. Peptide-guided cancer drugs show promise in mice. Science, 1998,279,323-324.

113. Akiyama S. K., Olden K., Yamada К. M. Fibronectin and intigrins in invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1995, 14,173-189.

114. Varner J. A., Cheresh D. A. Integrins and cancer. Curr Opin Cell Biol, 1996, 8, 724-730.

115. Jiang W. G., Mansel R. E. Progress in anti-invasion and anti-metastasis research and treatment. Int J Oncol, 1996, 9, 1013-1028.

116. Garnett M. С.,Baldwin R. W. An improved synthesis of a methotrexate-albumin-791T/36 monoclonal antibody conjugate cytotoxic to human osteogenic sarcoma cell lines. Cancer Res, 1986,46,2407-2412.

117. Garnett M. C., Embleton M. J., Jacobs E., Baldwin R. W. Preparatio and properties of a drug-carrier conjugate showing selective antibody-directed cytotoxicity in vitro. Int J Cancer, 1983, 31, 661-670.

118. Garnett M. C., Embleton M. J., Jacobc E., Baldwin R. W. Studies on the mechanism of action of an antibody-targeted drug-carrier conjugate. Anti-Cancer Drug Design, 1985, 1, 3-12.

119. Affleck K., Embleton M. J. Monoclonal antibody targeting of methotrexate (MTX) against MTX-resistant tumor cell lines. Br J Cancer, 1992, 65, 838-844.

120. Stehl G., Sinn H., Wunder A., Schrenk H. H., Schutt S., Maier-Borst W., Heene D. L. The loading rate determines tumor targeting properties of methotrexate-albumin conjugates in rates. Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685.

121. Pimm M. V., Clegg J. A., Caten J. E., Ballantyne K. D., Perkins A. C., Garnett M. C., Baldwin R. W. Biosdistribution of methotrexate-antibody conjugates and complexes: experimental and clinical studies. Cancer Treatment Rev. 1987, 14, 411-420.

122. Endo N. Kato Y., Takeda Y., Saito M., Umemoto N. Kishida К., Нага T. In vitro cytotoxicity of a human serum albumin-mediated conjugate of methotrexate with anti-MM46 monoclonal antibody. Cancer Res, 1987,47, 1076-1080.

123. Hen T. F. G., Garnett M. C., Chhabra S. R., Bycrofy B. W., Baldwin R. W. Synthesis of 2'-deoxyuridine derivatives and evaluation in antibody-targeting studies.J MedChem, 1993, 36, 1570-1579.

124. Fitzpatric J. J., Garnett M. C. Design, synthesis and in vitro testing of methotrexate carrier conjugates linked via oligopeptide spacers. Anticancer Drug Des 1995, 10, 19.

125. Cross M. J., Claesson-Welsh L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signaling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trend in Pharmacological Sciences, 2001, 22, 201-207.

126. Folkman J. Angiogenesis and apoptosis. Seminar in Cancer Biology, 2003, 13, 159-167.

127. Jones N., Iljin K., Dumont D. J., Alitalo K. The receptors new modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2, 2572567.

128. Connoly D., Heuvelman D., Nelson R., Olander J., Eppley B.,Delfino J. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest, 1989, 54, 1470-1478.

129. Plate K., Breier G., Weich H., Risau W.Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature, 1992, 359, 845-848.

130. Cornali E., Zietz C., Benelli R., Weninger W., Masiello I., Breier G. Vascular endothelial growth factor regulates angiogenesis and vascular permeability in Kaposi sarcomoa. Am J Path, 1996, 149, 185101869.

131. Yoshiji H., Gomez D., Shibuya M., Thorgirsson U. Expression of vascular endothelial growth factor, its receptor and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res, 1996, 56, 2013-2016.

132. Neufeld G., Cohen T, Gengrinovitch S., Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J, 1999, 13, 9-22.

133. Cross M., Cleasson-Welsh L. FGF and VRGF function in angiogenesis signaling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends Pharmacol Sci, 2001,22, 201-207.

134. Shweiki D., Itin A., Soffer D., Kechet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature, 1992, 350, 843-845.

135. Westermarck J., Kahari V. Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor inivasion. FASEB J, 1999, 13, 781-792.

136. Sternlicht M., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behaviour. Ann Rev Cell Dev Biol, 2001,17,463-516.

137. Meade-Tollein L., Way D., Witte M. Expression of multiple metalloproteinase and urokinse type plasminogen activator in cultured Kaposi sarcoma cell. Acta Histochem, 1999,101, 305-326.

138. Di Carlo E., Forni G., Lollini P., Colombo M. P., Modesti P. The intriguing role of polymorphnuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood 2001, 97, 339-345.

139. Parkin D., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics. CA Cancer J, Clin, 1999, 49, 33-64.

140. Plow E. F., Haas T. A., Zhang I., Loftus J., Smith J. W. Ligand binding of integrins. J Biol Chem, 2000, 275,21785.

141. Augustin H. G. Antiangiogenic tumor therapy: will it work?. Tips, 1998, 19, 216222.

142. O'reily M., Воет Т., Shing Y., Fukai N., Vaios G., Lane W. Endostatin an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88, 277-285.

143. O'Reilly M., Holmgren L., Shing Y., Chen C., Rosenthal R., Moses M. Angiostatin a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastasis by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79, 315-328.

144. Cao Y., Veitonmaki N., Keough K., Chen H., Lee L., Zurakowski D. Elevated levels of urine angiostatin and plasminogen/plasmin in cancer patients. Int J Mol Med, 2000, 5, 547-551.

145. Gutterman J. U., Cytokine therapeutics: lessons from interferon alpha. Proc Nal Acad Sci USA, 1994, 91, 1198-205.

146. Wiechelman K. J., Braun R. D., Fitzpatrick J. D. Investigation of the Bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation. Analytical Biochemistiy, 1988, 175, 231-237.

147. Fisher E. A. In: affinity chromatography and related techniques. Gribnau Т. C. J. Visser J., Nivard R. J. F. (Eds) Elsevier, Amesterdam, 1982, poster A15.

148. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 1970,227, 681-685.

149. Savage C. R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedure and chemical characterization. J Biol Chem, 1972, 247, 76097611.

150. Marglin A., Merrifield R. B. Chemical synthesis of peptides and proteins. Annu Rev Biochem. 1970,39, 841-866.

151. Hurwitz E., Levy R., Mavon R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies with retention of both drug and antibody activities. Cancer Res. 1975, 35, 1175-1181.

152. Клаус Д. Лимфоциты и методы, 1990 М., с. 292-293.

153. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Meth., 1983,65, 55-63.

154. Lawrence T. W., Zou J. X. Fractionation of rat a-fetoprotein by high performance liquid chromatography. J. Chromatography, 1985, 341,452-456.

155. Lawrence Т. W., Zou J. X. Simple purification procedure for rat a-fetoprotein by а combination of Cibacron blue gel affinity chromatography and ion-exchange high performance liquid chromatography. J. Chromatography, 1985, 338,410-416.

156. Chudy D., Zikzkovsky V. A. A simple and rapid method for the isolation of human alpha-fetoprotein from human cord serum. Neoplasia, 1987, 34,491-496.

157. Strop P., Zikzkovcky V., Kocakova J., Havranova M., Mikes F. Conformational transitions of human alpha 1 fetoprotein and serum albumin at acid and alkaline pH. Int. J. Biochem, 1984, 16, 805.

158. Stavrovskaya A. A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells. Biochemistry (Moscow), 2000, 65, 112-126.

159. Dillman R. O., Jonson D. E., Shawler D. L., Koziol J. A. Superiority of an acid-label Daynorubicin-monoclonal antibody conjugate compared to free drug. Canser Res., 1988,48, 6097-6102.

160. Rogers К. E., Carr В. I., Tokes Z. A. Cell surface-mediated cytotoxicity of polymer-bond adriamycin against drug-resistant hepatocytes. Cancer Res., 1983, 43(6), 27412748.

161. Shih L. В., Goldenberg D.M., Xuan H. Internalization of an intact doxorubicin immunoconjugate. Cancer Immunol. Immunother., 1994, 38, 92-98.

162. Lemieux P. Page М. Sensitivity of multidrug-resistant MCF-7 cells to a transferrin-doxorubicin conjugate. Anticancer Research, 1994, 14, 397-403.

163. Fitzpatrick, S. L., La Chance, M. P. Schultz, G. S. Characterization of epidermal growth factor receptor and action on human breast cancer cells in culture. Cancer Res. 1984,44, 3442-3447.

164. Hatano, Т., Ohkawa, K. Matsuda, M. Cytotoxic effect of the protein-doxorubicin conjugates on the multidrug-resistant human myelogenous leukaemia cell line, K562, in vitro. Tumor Biol. 1993,14,288-294.

165. Maciag, Т. Molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Important Adv. Oncol. 1990, 85-98.