Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, доктор биологических наук Лунин, Владимир Глебович

• Лунин, Владимир Глебович
• доктор биологических наук
• 2011

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Лунин, Владимир Глебович

выводы

1. Разработана система научно-обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной сельскохозяйственной и медицинской- биотехнологии, а также нанобиотехнологии. Основу этой системы составляют: способ направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами, а также технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полисахаридных и других матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков. Практическая реализация данных технологических решений привела к созданию эффективных биологически активных препаратов на основе рекомбинантных белков.

2. Созданы мультидоменные рекомбинантные белки (нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и эффективную доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки.

3. На основе микробиологического синтеза создан высокоэффективный препарат — стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «САТ-С ом», основанный на принципах, аутоиммунной коррекции ингибитора роста-животных соматостатина.

4. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию).

5. Показано, что иммобилизация вакцинно-ценных белков на полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных свойств: полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта и стимулирует развитие более сильного иммунного ответа на вводимые белки.

6. Разработаны основанные на принципе самосборки подходы для получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. Получены препараты, на основе которых могут быть созданы кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

7. Получен двухкомпонентный белок, обладающий способностью к аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термо стабильной р-галактозидазы. На основе этого гибридного белка создан проточный реактор, позволяющий проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Данный подход может использоваться в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток.

8. На основе технологии аффинных доменов получены препараты ряда важных для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов: EGF, FGF, бета-интерферон, обладающие специфической активностью. Наличие аффинного домена обеспечивает одностадийную очистку белков до 95% чистоты и возможность различных вариантов практического использования препаратов, в том числе, для усовершенствования методов культивирования эукариотических клеток. БЛАГОДАРНОСТИ

Экспериментальные работы проводились на базе ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии и ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России при участии О.В. Сергиенко, M.-B.JI. Ходуна, Т.В. Тихоновой, A.C. Карягиной-Жулиной, М.А. Грачевой, З.М. Галушкиной, Е.М. Рязановой, Н.В.Лавровой, H.H. Полетаевой, A.M. Лящука, О.Л. Ворониной, проф. И.С. Мещеряковой, E.H. Аксеновой, Н.Е. Шараповой, проф. Ю.В. Ананьиной, A.C. Семихина, A.M. Лящука, А.П. Котновой, Д.Ю. Логунова, А.И. Тухватулина, М.В. Мезенцевой и других сотрудников.

Работы по оценке функциональности доменов мультидоменных белков-нанотранспортеров выполнялись на базе Института биологии гена РАН под руководством проф. A.C. Соболева совместно с A.A. Розенкранцем, П.В. Гулаком, Д.Г. Гилязовой, Ю.В. Храмцовым и другими сотрудниками лаборатории; работы с использованием атомно-силовой микроскопии — совместно с сотрудниками НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова Ю.Н. Антоненко и Т.И. Рокицкой.

В работах по созданию препаратов соматостатина принимали участие сотрудники Института экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН Е.Т. Сазина и С.К. Карпова, в работах по исследованию свойств гибридных белков на основе термостабильной бета-галактозидазы — сотрудники Института молекулярной генетики РАН проф. Г.А.Великодворская, Н.А.Лунина и сотрудник НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова В.Н.Ташлицкий.

Работа по оценке иммуногенности и протективного эффекта препаратов на основе гибридных белков с антигенами возбудителя туберкулеза проводилась на базе лаборатории иммуногенетики Центрального научно-исследовательского института туберкулёза РАМН под руководством проф. A.C. Апта с участием сотрудников лаборатории Э.Н. Рубаковой, Т.К. Кондратьевой.

Автор выражает глубокую признательность всем коллегам, принимавшим участие в работе, обсуждении результатов, оформлении

49 диссертации, а также руководству институтов и лабораторий, предоставивших возможность для проведения исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных рецензируемых журналах:

1. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Скрипкин Е.А., Смирнов'В.Д. Выделение эндонуклеазы рестрикции с //^¿////-специфичностью из Bordetella bronchiseptica II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1986. -№4.-С. 16-19.

2. Карягина А.С., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С. Функциональная характеристика плазмид штамма S. sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1986. - № 10. - С. 16-21.

3. Grabko V.I., Lunin V.G., Naroditsky B.S., Khilko S.N., Tickhonenko T.I., Makhov A.M., Karpova O.V. Study of avian adenovirus DNA infectivity in chick embryos // Acta Virol. - 1987. - Vol. 31. - P. 97-102.

4. Карягина A.C., Лунин В: Г., Грубер И.И., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы &о11 в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47" // Молекулярная генетика. - 1987. - № 12. - С. 26-29.

5. Rivkina М.В., Lunin V.G., Mahov A.M., Tikchonenko T.I., Kukain R.A. Nucleotide sequence of integrated,hepatitis В virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene. - 1988. - Vol. 64. - P. 285-296:

6. Карпов B.A., Лунин В.Г., Тихоненко Т.И. Фазированный полилинкер для' клонирования и экспрессии генов // Молекулярная генетика, микробиология- и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 28-33.

7. Сергиенко О.В., Лунин В .Г., Тихоненко Т.И. Полимеризация фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, в клетках Escherichia coli II Молекулярная,'генетика, микробиология'и вирусология. — 1989-№ 10.-С. 24-29.

8. Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Смирнов В.Д., Тихоненко Т.И. Синтез и. экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов• вируса гепатита В, клетками Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 39-42.

9. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII-restriction endonuclease and modification methyltransferase // Gene. - 1990.-Vol. 87.-P. 113-118.

10. Akopian T.A., Lunin V.G. Kruglyak V.A., Ruchadze G.G., Bakhutashvili V.I., Naroditsky B.S., Tichonenko T.I. Nucleotide sequence of the cDNA for porcine rotavirus VP7 gene (strain K) // Virus Genes. - 1992. - Vol. 6. - P. 393-396.

11. Karyagina A.S., Lunin V.G. Degtyarenko K.N., Uvarov V.Y., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the Ssol restriction endonuclease and methyltransferase // Gene. - 1993. -Vol. 124. - P. 13-19.

12. Карпова C.K., Сазина E.T., Бадер Л.Б., Сергиенко О.В., Ходун М.Л., Кривцов В.Ф., Лунин В.Г. Тихоненко Т.И., Панков Ю.А. Генетическая инженерия в бактериальном синтезе соматостатина // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 1994. -№12. - С. 24-29:

13. Karyagina A.S., Lunin V.G. Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The &0II and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis // Gene. - 1995. - Vol. 157 -P. 93-96.

14. Парашина E.B., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В .Г. Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина-редьки // Физиология растений. - 2000. -Т. 47.-С. 471.

15. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Lunin V.G., Sergienko O.V., Voronina O.L., Leiser M., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J Biochem Biophys Methods. - 2001. - Vol. 50 - P. 79-89.

16. Чалов C.E., Воронина О.Л., Сергиенко O.B., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма archaeon Archaeoglobus fulgidus VC16 и её свойства // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - С. 366-374.

17. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В .Г. Термостабильная ДНК-полимераза из archaeon Archaeoglobus fulgidus II Доклады Академии Наук. -2002. - Т. 382.-С. 707-709.

18. Yakimovich O.Yu., Alekseev Ya.I., Voronina O.L., Kolobova O.B., Anisimova S.S., Lunin V.G. Hot-start polymerase chain reaction using a DNA-ligand // Biotechnology in Russia. -2002. -№ 6. - C. 86-89.

19. Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Сергиенко O.B., Гилязова Д.Г., Шумянцева М.А., Воронина О.Л., Янс Д.Э., Кофнер А.А., Миронов А.Ф., Соболев А.С. Направленная внутриклеточная доставка локально действующих лекарств: Специфическая доставка фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы // Генетика. - 2003. - № 39. - С. 259-268.

20. Zhuravleva Yu.N., Lugovtsev V.Yu., Voronina O.L., Shilov I.A., Vaniusheva O.V., Lunin V.G. Naumova MA., Mamaeva T.A., Tikhonova N.T. Genetic analysis of wild measles virus strains isolated in the european part of the Russian Federation // Vopr Virusol. - 2003. - Vol. 48. - P. 29-35.

21. Гудим E.A., Агапов И.И., Лунин ВТ., Комолов И.С. Клонирование и экспрессия белка NS3 вируса гепатита С // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 8086.

22. Анисимова С.С., Корнеева И.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Аветисов В. А. Создание многокомпонентного химерного белка для повышения эффективности трансформации томатов на основе природного опыления-оплодотворения // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С. 35-41.

23. Анисимова С.С., Сергиенко О.В., Ванюшева О.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г. Влияние рекомбинантного белка TTRECA на специфичность, эффективность и точность ТАО ДНК-полимеразы в ПЦР // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С. 90-96.

24. Артеменко Е.О., Гилязова Д.Г., Розенкранц А.А., Лунин В .Г., Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев А.С. Влияние присоединения бактериохлорина р к модульным рекомбинантным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. - 2005. - № 3. - С. 43-47.

25. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В .Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный 1Ча+/Н+антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс // Биохимия. - 2005. - Т. 70. — С. 123— 132.

26. Дмитренко O.A., Шагинян И.А., Прохоров В.Я., Матвеев С.М., Аляпкина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Лунин В.Г. Гинцбург A.J1. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 3. - С. 27-32.

27. Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Зубков A.B., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Буркин М.А., Летаров A.B., Лаврова Н.В., Рязанова Е.М. Моноклональные антитела к человеческой пероксидазе щитовидной железы // Биотехнология. - 2005. - № 1. — С. 51—58.

28. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G. Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers//Proc. SPIE.-2005.-Vol. 5973.-P. 101-110.

29. Ершова A.C., Лаврова H.B., Тихонова T.B., Кузнецова А.Ю., Мостовенко Е.В., Алексеевский A.B., Лунин В.Г., Карягина A.C. Разработка модификации метода SELEX и ее использование для определения нуклеотидных последовательностей, узнаваемых гомеодоменом. Antennapediа // Доклады РАСХН. -2006.-№5.-С. 5-9:

30. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. - 2006; - Vol. 66. - P. 10534-10540.

31. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н. Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно-меченых зондов^ для- ПЦР Bi реальном времени* // Доклады* Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 6. - С. 7-11.

32. Насонова Д.С., Раскатов' В.А., Лунин, В .Г. Оценка переноса генов- при выращивание трансгенных растений сои // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2007. - № 2. - с. 136-138.

33. Семененко Т. А., Лунин В .Г., Гинцбург А. Л. Банк сывороток, крови как компонент системы^ биологической безопасности // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. -№ 4. - С. 73-78.

34. Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Романенко В.В., Карпова Т.И., Аляпкина Ю.С., Омон' Е.П., Романова Ю.М., Воронина О .Л., Лунин В.Г., Яцишина С.Б., Шипулин Г.А. Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки' пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. — Т.9. — С. 361-368

35. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г. Филясова Е.И., Шишкин A.M., Сергеенко О.В., Рязанова Е.М., Воронина О.Л., Боженко В.К. Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов циклиновых киназ // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53. - С. 448452.

36. Воронина О.Л., Лунин В.Г. Молекулярно-генетическое типирование Legionella pneumophila серогруппы 1, выделенных в г. Верхняя Пышма, с использованием международных стандартов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 2. - С. 20-23;

37. Воронина О.Л., Кунда М.С., Лунин В .Г. Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской федерации // Клиническая микробиология и антимикробная:химиотерапия: - 2008. - Т. 10.-С. 154-162.

38. Грачева М.А., Попадьин, П.В., Евстифеев В.В., Галушкина. З.М., Полетаева H.H., Верховская Л.В., Лунин В .Г., Швец В.И. Экспрессия^в Escherichia coli А- и В-субъединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная; очистка на целлюлозе // Вопр. биол., мед. и фармацевт, химии. - 2008. - № 3. - С. 50-56.

39. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лунин В.Г., Грабко В. И., Шарапова Н.Е., Нестеренко В.Г. Влияние сыворотки крови мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы Л, на эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников m vitro И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146. - С. 663-666.

40. Гришин Д.В., Гудов В.П., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Харченко П.Н; Получение- белковой векторной конструкции, включающей ДНК—связывающий домен SSBTNE и сигнал ядерной локализации VIRD2 // Доклады Российской академии*сельскохозяйственных наук. - 2008. - № 5. - С. 38-41.

41. Романова Ю.М., Томова A.C., Шингарова Л.Н., Лунин В.Г., Карягина A.C., Лупу И.П, Гинцбург А.Л- Механизм взаимодействия: фактора некроза опухолей: (ФНОа) макроорганизма с клетками Salmonella enterica (ser. Typhimurium) // Молекул, генетика. - 2008: - T. 4. - С. 18-22.

42: Rosenkranz A.A, Vaidyanathan G., Pozzi O.R. Lunin V.G. Zalutskv MiR., Sobolev A.S: Engineered.modular recombinant transporters: applicationof new platform for targeted radiotherapeutic agents to alpha-particle emitting 211 // International* Journal: of Radiation Oncology Biology Physics. - 2008. - Vol. 72. - P. 193-200.

43. Гудов В.П., Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов1 для? твердофазного синтеза зондов для ПЦР в; реальном масштабе времени // Вестник МИТХТ им. М.В1 Ломоносова. - 2009; -Т. 4. - С. 25-30.

44. Зайцев В.В1, Карягина A.C., Лунин В.Г. Костные морфогенетические белки (BMP): общая-; характеристика; перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии // Вестник травматологии; и- ортопедии им. H.H. Приорова. - 2009. - № 4. - С. 79-84.

45. Лунин В.Г. Шарапова U.E., Тихонова Т.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М:, Аксенова Е.И., Грабко В.И., Великодворская Г.А., Лаврова Н.В., Ананьина Ю.В. и др. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного целлюлозосвязывающего домена Anaerocellum thermophilum in vitro II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - № 1. — С. 21-26.

46. Семихин A.C., Лящук A.M., Мезенцева М.В., Трегубова М.И1, Сергиенко О.В., Полетаева H.H., Народицкий Б.С., Карягина,A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л-Получение рекомбинантного интерферона-ß человека на основе технологии аффинных доменов // Молекул, генетика. - 2009: - № 4. — С. 38-41.

47. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Лаврова Н.В':, Аксенова Е.И., Семихин A.C., Карягина A.C., Лунин В.Г. Получение и характеристика коллаген-связывающих. доменов из факторов фон Виллебранда (vWF) человека // Молекул, генетика. - 2009. -№ 1. - С. 31-35.

48; Владимирский; М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е. И., Сергиенко О.В;, Ляшук A.M., Неретина T.B 1, Карягина A.C., Лунин

В.Г^ Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская-Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест-системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона-гамма. в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2010. - №2. - С. 49-53. % 49. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева

Н.Н., Тухватуллин А.Э:, Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергеенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo II t Молекулярная биология. - 2010. - Т44. - С. 1036-1044.

1 50. Velikodvorskaya G.A., Tikhonova T.V., Gurvits I.D., Karyagina A.S.,

Lavrova N.V., Sergienko O.V., Tashlitskii V.N., Lunina N.A. and Lunin V.G. Chimeric lactase capable of spontaneous and strong immobilization on cellulose and developmrnt of continuous-flow system for lactose hydrolysis at high temperatures. Applied1 and Environmental Microbiology. - 2010. - V.76. Published online ahead of print on 8 October 2010.

51. Глушков A.H., Апалько C.B., Филипенко М.Л., Матвеева В А., Бакулина А.Ю., Лунин В .Г. Костянко М1В. Новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин // Acta Naturae. - 2010. - Т.2. - С. 51-57.

Патенты и авторские свидетельства:

52. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Золотова 0:М., Тихоненко Т.И. А.С 1040794 МКИ C12N15/00, C12N9/22. Штамм Bordenella bronchiseptica-A99A -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы. - №3385723/28-13, заявлено 11.01.82, опубликовано 05.30.1985 Открытия, изобретения №20. - С. 242.

53. Дебов- С.С., Карягина А.С., Лунин- В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В:М., Никольская-Санович-И.И. А.с.1539205 от 1 октября. 1989 г МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d33, кодирующая синтез метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d33 - продуцент метилазы SsoII. (заявка №4394464 от 18 марта 1988 г.). опубл. 01.30.1990. Бюл. № 4. - С.72.

54. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г.,' Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская-Санович И.И. А.с 1532585 от 1 сентября 1989 г. МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d24, кодирующая синтез рестриктазьь и метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d24 - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII. (заявка №4394643 от 18 марта 1988 г.). опубл. 30.12.89 Бюл. № 48. - С.161.

55. Лунин В.Г. Сергиенко О.В,. Ходун М.-В. Л., Бадер Л. Б., Карпов Вг. А., Тихоненко Т. И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения рекомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина—14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / — № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8: - С.136.

56. Лунин ВТ. Сергиенко О.В., Ходун М.-В., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения реомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина-14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / - № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8.

57. Лунин В.Г. Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.Б., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2034457 С1 РФ; МПК6 А01К67/02, А61К39/385, C12N15/16. Способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и препарат для его осуществления /- № 93031157/13; заявлено 22.06.93, опубл. 10.05.95. Бюл. № 13. -С. 108.

58. Народицкий Б.С., Лунин В .Г., Анисимова С.С., Сердобинский Л.А., Лаврова Н.В., Ковалева М.В. Пат. RU 2176669 С1 РФ, МПК7 C12N15/29, C12N15/82. Ген rs-ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения / - № 2000124582/13; заявлено 28.09.00, опубл. 10.12.01. Бюл. № 34 (И ч.)- С.271.

59. Лунин В.Г. Тимофеева Т.В., Сучков A.B. Пат. RU 2207374 С1 РФ, МПК7 C12N15/51, C12N15/81, А61К39/29, C12N1/19. Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (HBSAg) вируса гепатита В, ее получение и штамм», дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент поверхностного антигена (HBSAG) вируса гепатита В / - № 2002112447/14; заявлено 14.05.02, опубл. 27.06.03. Бюл. №18(1Уч). - С. 860.

60. Lunin V.G. Sergienko O.V., Khodin M.-V.L., Bader L.B., Karpov V.A., Tikhonenko T.I. United States Patent. 6,316,004 МПК A61K38/31, A61K39/385, C12P21/02, C07K14/655. November 13, 2001. Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals - № 264042; заявлено 22.06.94. Изобретения стран мира №21/2002, выпуск 008, С. 69.

61. Лунин В.Г. Сергиенко О.В., Воронина О.Л., Рязанова,Е.М., Розенкранц A.A., Соболев A.C. Пат. RU 2265055 С2 РФ; МПК7 C12N15/62, C12N15/70, C12N1/21, С07К19/00, А61К41/00, А61К47/42, C12N1/21, C12R1:19. Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая модульный полипептид для доставки фотосенсибилизатора, и штамм Escherichia coli ВКПМ В-8356 - продуцент модульного полипептида / - № 2004100070/13; заявлено 05.01.04; опубл. 27.11.05, Бюл. №33(1 ч.). - С. 181.

62. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Карягина-Жулина A.C., Лаврова Н.В., Лунин В.Г., Лунина H.A., Рязанова Е.М., Сергиенко О.В., Тихонова Т.В. Пат. RU №2278160 С2 РФ, МПК C12N9/38 (2006.01), C12N15/56 (2006.01), C12N15/72 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12N11/12 (2006.01), С12Р19/00 (2006.01), C12R1/19 (2006.01). Рекомбинантный белок LACspCBD, обладающий бета-галактозидазной активностью и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентами, рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка LACspCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, LACspCBD] - продуцент рекомбинатного белка LACspCBD, способ получения иммобилизованного рекомбинантного белка LACspCBD на целлюлозе и способ ферментативного расщепления лактозы / - № 2004110981/13 ; заявлено 13.04.04; опубл. 20.06.06, Бюл. № 17(11 ч.) - С.368.

63. Гинцбург А.Л., Карягина-Жулина А.С., Кормилицина М.И., Лаврова Н.В., Лящук A.M., Лунин В.Г. Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Родионова И.В., Сергиенко О.В., Шмаров М.В. Пат. RU №2270249 С1 РФ, МПК C12N15/11 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С07К19/00 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмидная- ДНК, кодирующая! синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD; штамм Escherichia coli M15[pREP4, pTUL4spCBD] - продуцент рекомбинатного белка- TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD. и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD / -№ 2004135849/13; заявлено 20.02.06; опубл. 20.02.06, Бюл. № 5(11 ч). - С. 399.

64. Аксенова Е.И., Лунин В.Г. Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. Пат. RU №2378371 С1 РФ, МПК C12N1/21 (2006.01), C12N15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида (варианты), штамм Escherichia coli (варианты) - продуцент химерных белков, химерный белок (варианты), способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе, способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях/-№2008145612/13; заявлено 19.11.08; опубл. 10.01.10, Бюл. № 1 (III ч.)

- С.713-714.

65. Шарапова Н.Е., Лунин В .Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401302 С2 РФ, МПК C12N 15/00 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pDlspGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка Dl—GBD, рекомбинантный белок Dl—GBD< и способ его получения, способ исследования связывания белка D1-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D1-GBD / - № 2008146597/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

66. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401305 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD4spGBD* штамм Escherichia coli — продуцент рекомбинантного белка D4-GBD, рекомбинантный белок D4-GBD и способ его получения, способ исследования, связывания белка D4-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D4-GBD / - № 2008146598/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

• 67. Шарапова-Н.Е., Лунин В.Г. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401304 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), G12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), С12Р21/08 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD5spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D5-GBD, рекомбинантный белок D5-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D5-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D5-GBD / - № 2008146599/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28«.

Заявка на патент с положительным решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам:

1. Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Лунин В.Г. Карягина-Жулина А.С., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Гинцбург А.Л. Рекомбинантный белок Collbd-CBD, рекомбинантная плазмида pOC-Collbd, штамм Escherichia coli

- продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD; способ получения рекомбинантного 6enKaCollbd-CBD. Заявка № 2009144489 от 02.12.2"""

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе-разработанных в настоящем исследовании-технологических решений получено значительное количество1 белковых антигенов и других белков. Помимо белков, описанных в тексте, автором также были получены, разнообразные ДНЕС-связывающие белки и белки нуклеотидного обмена, вирусные и бактериальные белки, белки растений, многокомпонентные белки-векторы для трансформации растений, пептиды, содержащие активные* центры ингибиторов циклиновых киназ для применения в онкологии и др. белки, получение и перспективы практического использования которых детально изложены в соответствующих публикациях. Разработанные технологические решения позволяют в короткие сроки конструировать белки, состоящие из двух или более модулей, а также обеспечивают эффективную очистку, концентрирование и иммобилизацию белков, что делает данные продукты перспективными для применения в сельскохозяйственной биотехнологии и медицине.