Разработка способов получения и исследование свойств рекомбинантных иммуноглобулинов класса A, специфичных к гемагглютинину вируса гриппа A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Алиев, Теймур Кантамирович

• Алиев, Теймур Кантамирович
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Алиев, Теймур Кантамирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ГРИППА

1.1 Общие сведения о биологии и эпидемиологии вируса гриппа А

1.2 Строение вируса гриппа

1.3 Мембранные белки вируса гриппа А

1.4 Белки вируса гриппа как мишени для создания терапевтических средств. Существующие терапевтические препараты

1.5 Антигенная изменчивость вируса гриппа А

1.6 Моноклональные антитела как потенциальные препараты для терапии гриппа

1.7 Структура и свойства антитела И6

2 ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

2.1 Системы экспрессии рекомбинантных моноклональных антител

2.2 Особенности строения и экспрессии антител ^А изотипа

2.3 Биологическая активность ^А

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Реагенты и оборудование

3.2 Методы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ МОНОМЕРНЫХ И ДИМЕРНЫХ ФОРМ ИММУНОГЛОБУЛИНА А, СПЕЦИФИЧНЫХ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА А

4.1 Химико-ферментативный синтез и клонирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены антитела И6

4.2 Конструирование плазмид для экспрессии в клетках СНО полноразмерного антитела И6 ^01-изотипа

4.3. Получение нуклеотидных последовательностей, кодирующих константные домены тяжелых цепей иммуноглобулинов человека ^А1- и ^А2ш1-изотипов

4.4 Конструирование бипромоторных плазмид для экспрессии мономерных форм рекомбинантных антител И6 ^А1- и ^А2ш1-изотипов

4.5. Конструирование экспрессионной плазмиды для получения 1-цепи

5 ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИИ-ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

5.1 Получение клеточных линий-продуцентов мономеров и димеров IgA1- и ^А2т1-изотипов, а также контрольного антитела IgGl-изотипа

5.2 Конструирование системы экспрессии и получение димерных форм рекомбинантных антител FI6 ^А1- и ^А2т1-изотипов

6 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ИЗОФОРМ ИММУНОГЛОБУЛИНА А

7 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ДИМЕРА ИММУНОГЛОБУЛИНА ЮА1-ИЮТИПА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO

8 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ДИМЕРА ИММУНОГЛОБУЛИНА ЮА1-ИЗОТИПА НА МОДЕЛИ ГРИППОЗНОЙ ПНЕВМОНИИ У МЫШЕЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГА - вирус гриппа А (influenza А virus) ДМСО - диметилсульфоксид

ПААГ-ДСН - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (денатурирующий электрофорез)

ТМБ - тетраметил бензидин

Об/мин - оборотов в минуту

ФБС - эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота

ФИТЦ - флуоресцеин-5 изотиоцианат

ФНО - фактор некроза опухоли альфа

ФСБ - фосфатносолевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

BGH - (терминатор) бычьего гормона роста

CH - константный домен тяжелой цепи антитела

CL - константный домен легкой цепи антитела

CMV - цитомегаловирус

DHFR - дигидрофолатредуктаза

dIgA - димерная форма иммуноглобулина класса А

EF1 а - фактор элонгации трансляции EF1 а

EMCV IRES - сайт внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колиниестимулирующий фактор GS - глутаминсинтетаза,

HA1, HA2 - субъединицы молекулы гемагглютинина, активированной путем частичного протеолиза

HCDR - гипервариабельный участок вариабельного домена тяжелой цепи

HT - гипоксантин и тимидин

HTLV - Т-лимфотропный вирус человека

IgA - иммуноглобулин А класса

IgG - иммуноглобулин класса G

IgM - иммуноглобулин класса М

1RES - сайт внутренней посадки рибосомы (Internal ribosome entry site) LCDR - гипервариабельный участок вариабельного домена легкой цепи mIgA - мономерная форма иммуноглобулина класса А PGK - фосфоглицераткиназа

pIgR - рецептор полимерных форм иммуноглобулинов RSV - респираторно-синцитиальный вирус человек SC - секреторный компонент

sIgA - секреторная форма иммуноглобулина класса А TPI - триозофосфатизомераза VH - вариабельный домен тяжелой цепи антитела VL - вариабельный домен легкой цепи антитела

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка способов получения и исследование свойств рекомбинантных иммуноглобулинов класса A, специфичных к гемагглютинину вируса гриппа A»

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноглобулины класса А являются основными компонентами гуморального иммунитета слизистого эпителия. Представляя собой первичный барьер на пути проникновения патогенов в организм человека через слизистые оболочки, иммуноглобулины класса А способны задействовать различные механизмы нейтрализации вирусов: блокировать их взаимодействие с поверхностью клеток человека, осуществлять внутриклеточную нейтрализацию вирусных частиц, посредством привлечения и активации нейтрофилов способствовать уничтожению клеток, подвергшихся заражению вирусом [1]. Перечисленные свойства обусловливают значительный интерес к иммуноглобулинам данного класса как к потенциальным компонентам средств профилактики и лечения вирусных заболеваний.

Пассивная иммунотерапия с использованием антител к компонентам вирусного капсида является перспективным направлением разработки новых лекарственных средств для борьбы с гриппом [2, 3]. Особое значение данный подход приобретает в связи с высокой изменчивостью поверхностных антигенов вируса гриппа А (ВГА), приводящей к уменьшению эффективности применяемых вакцин и низкомолекулярных терапевтических средств. С целью создания универсальных препаратов широкой специфичности на протяжении последних лет ведется активный поиск нейтрализующих моноклональных антител, проявляющих кросс-реактивность в отношении различных серотипов ВГА. Наибольший успех в данном направлении был достигнут в результате масштабного скрининга более 100 тыс. отдельных культивированных антителопродуцирующих В-клеток нескольких доноров, у которых наблюдали значительную гетеротипичность иммунного ответа в отношении ряда подтипов ВГА [4]. Было найдено уникальное антитело Б16, обладающее способностью связывать рекомбинантные и природные гемагглютинины 1-й и 2-й филогенетических групп. Широкая специфичность данного антитела, по-видимому, обусловлена тем, что оно взаимодействует с консервативным эпитопом в Б субдомене гемагглютинина, менее подверженном мутагенезу, чем домен НА1 гемагглютинина. На мышах и хорьках, инфицированных штаммами ВГА Н1Ш и Н5Ш в летальной дозе, было показано, что полная защита достигается при введении данного антитела в дозах от 2 до 20мг/кг веса. Обнаружение данного универсального антитела открывает широкие возможности для создания на его основе различных рекомбинантных вариантов иммуноглобулинов.

Дыхательные пути являются основным способом проникновения ВГА в организм, поэтому интраназальное введение нейтрализующих антител может значительно способствовать повышению эффективности пассивной иммунотерапии [5]. При данной форме введения препаратов значительный профилактический эффект может быть достигнут при использовании рекомбинантного иммуноглобулина А, обладающего вируснейтрализующими свойствами. При этом препараты на основе рекомбинантных антител человека должны обладать минимумом побочных эффектов по сравнению с низкомолекулярными фармацевтическими препаратами и могут быть рекомендованы широкому кругу пациентов.

В отличие от антител класса О, занимающих значительную долю фармацевтического рынка, рекомбинантные иммуноглобулины класса А пока не заняли свою нишу в арсенале терапевтических препаратов. Во-многом, это обусловлено более сложной молекулярной структурой данного класса иммуноглобулинов по сравнению с антителами класса О, а также недостаточно высоким уровнем их продукции в гетерологичных системах экспрессии.

В связи с этим разработка и оптимизация способов получения рекомбинантных иммуноглобулинов класса А в эукариотических системах экспрессии является актуальной задачей современной биотехнологии.

Целью выполнения работы являлось получение рекомбинантных аналогов антитела к гемагглютинину вируса гриппа А в формате иммуноглобулина А и исследование их биологических свойств в сравнении с антителом !§О1-изотипа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ГРИППА

1.1 Общие сведения о биологии и эпидемиологии вируса гриппа А

Вирусы гриппа А, В и С относятся к семейству ОгШошухоутёае (порядок Мопопе§ау1га1еБ). Из трех видов вирусов первым был открыт вирус гриппа А [6]. Вирулентностью обладают все 3 вида вирусов, однако, именно ВГА является причиной эпидемий и пандемий у человека. Также данный вид вируса способен инфицировать животных и использовать их в своем репродуктивном цикле.

Грипп представляет собой наиболее распространенную и опасную респираторную вирусную инфекцию. Он вызывает ежегодные эпидемии и пандемии, приводящие к значительному повышению заболеваемости и смертности во всех регионах земного шара

[7]. Благодаря невысокой точности работы вирусной РНК-полимеразы, не обладающей 3' --> 5' экзонуклеазной корректирующей активностью, происходит накопление ошибок в репликации РНК, что приводит к существованию популяций квазивидов вируса гриппа А

[8]. Случайные мутации могут быстро отбираться в зависимости от существующего давления отбора, включающего такие факторы, как новый организм хозяина [9], действие сформированного ранее иммунитета к вирусу, что приводит к дрифту антигенов [10], или использование противовирусных препаратов, приводящее к развитию устойчивых к ним вариантов вируса [11]. Благодаря высокой генетической изменчивости, грипп остается трудно контролируемой инфекцией, несмотря на успехи, достигнутые в области химиотерапии, вакцинопрофилактики и иммунологии гриппа.

Имеется 16 подтипов гриппа А, определяемых по их НА. 16 НА, Н1-Н16, могут быть классифицированы в две группы. Группа 1 состоит из Н1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11-Н13 и Н16 подтипов и группа 2, включающая Н3, Н4, Н7, Н10, Н14, Н15 подтипы. Все подтипы присутствуют у птиц, а подтипы Н1, Н2 и Н3 в большинстве случаев являются причиной болезни у людей. Подтипы Н5, Н7 и Н9 являются причиной острых спорадических инфекций у людей и могут быть причиной новых пандемий. Вирусы Н1 и Н3 постоянно вовлечены в генерацию новых вариантов вируса - этот феномен назван дрейфом антигенов. Следовательно, антитела, продуцируемые в ответ на вирусы Н1 и Н3

предыдущих лет, дают слабый или вовсе не дают ответа на появление новых дрейфующих вирусов. Таким образом, новая вакцина должна производиться заново каждый год.

Дыхательные пути являются основным способом проникновения ВГА в организм. После того, как вирус попадает в респираторную систему, он, как правило, поражает эпителиальные клетки верхних и нижних дыхательных путей, иногда инфекция проникает вглубь легких. Основными признаками заболевания могут служить следующие симптомы: повышение температуры тела выше субфебрильной, головная боль, слабость, боль в суставах и при движении глазными яблоками, головокружение, першение и боль в горле, боль в области груди во время кашля и чихания, заложенность носа, приступообразный кашель и ряд других симптомов, проявление которых зависит от степени и тяжести протекания заболевания и проявления того или иного синдрома [6]. В ХХ веке основное эпидемиологическое значение представляли штаммы НШ1 («испанский грипп»), унесший жизни от 20 до 40 млн человек, азиатский грипп А/Сингапур/1/57 (Н2К2), эпидемия которого в 1957 г. сопровождалась 2-4 млн. случаев с летальным исходом, а также А/Гонконг/1/68 (Н3К2), приведшая к гибели 1 млн человек [12]. В последние годы эпидемиологическая ситуация приобрела иной характер. Особую опасность представляют зоонозные штаммы Н5Ш (птичий грипп) и ряд других штаммов - Н5К6, Н7К2, Н7№, Н7К7, Н7К9, Н10К9 [13]. Особенностями данных возбудителей является относительная высокая летальность при более низкой вирулентности. Однако, вероятность генетической рекомбинации с циркулирующими среди человека подтипами может вызвать эпидемию с чрезвычайно высоким уровнем летальности.

1.2 Строение вируса гриппа

В работе [14] подробно описана структура вириона вируса гриппа А. Мембрана вируса гриппа состоит из липидного бислоя, на поверхности которого представлены различные белки. На внешней поверхности располагаются молекулы гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (КА). Внутренняя поверхность мембраны выстлана белком М1, который образует матриксный слой, а белок М2 интегрирован в мембрану и пронизывает её насквозь. Геном вируса, составляющий около 14 000 нуклеотидов, представлен 8 антисмысловыми молекулами РНК. С молекулами РНК связан белок нуклеопротеин (КР), который участвует в упаковке и организации рибонуклеиновой кислоты. Белки РНК-зависимой РНК-полимеразы КА, РВ1, РВ2 взаимодействуют с РНК и КР и тоже располагаются внутри вириона (Рис. 1).

0 НА

ш£? М2 О ИР

РА,РВ1,РВ2

О N32

М1 1ауег

Рисунок 1. Строение вируса гриппа А. Из статьи [15] НА - гемагглютинин, КА -нейраминидаза, КР - нуклепротеин, М1 - белок - матриксный белок 1, М2 - матриксный белок 2, N82 - неструктурный белок 2.

1.3 Мембранные белки вируса гриппа А

Основными мишенями иммунного ответа и, в частности, образующихся нейтрализующих ВГА антител, являются мембранные белки вируса, к которым относятся гемагглютинин (НА), нейраминидаза (КА) и белок М2.

Наиболее представленными на поверхности мембраны вируса гриппа являются молекулы гемагглютинина. Гемагглютинин обеспечивает связывание вирусной частицы с рецептором, находящимся на поверхности клетки и слияние клеточной мембраны с мембраной вириона, а затем проникновение вирусного рибонуклеопротеина в цитоплазму клетки. В зависимости от аминокислотной последовательности молекул гемагглютинина и способности быть связанными различными моноклональными антителами для серотипирования выделяют 18 подтипов гемагглютинина. Каждый подтип обозначается буквой Н и номером от 1 до 18, например Н1 или Н5. Все молекулы внутри определенного подтипа являются гомологичными более, чем на 90% и взаимодействуют с мАТ, используемыми для серотипирования.

Гемагглютинин представляет собой гомотример с общей молекулярной массой 215 кДа. Мономер гемагглютинина состоит из двух цепей: тяжелой -HA1 и легкой -HA2 с молекулярными массами 55 кДа и 20 кДа, соответственно. Обе цепи соединены с дисульфидной связью, образованной остатками цистеина 14 и 137 тяжелой и легкой цепей, соответственно, и образуют два домена: глобулярный и стеблевой (stem domain). Как тяжелая, так и легкая цепи гемагглютинина имеют общее происхождение и образуются из полипептида-предшественника (HA0) путем протеолиза по остатку аргинина 329. Расщепление полипептида-предшественника приводит к образованию на N конце цепи HA2 пептида слияния, который играет важную роль в процессе слияния мембран вирусной частицы и клетки. Каждый мономер молекулы гемагглютинина имеет семь сайтов гликозилирования по остаткам аспарагина, 6 сайтов наНА1 цепи (8, 22, 38, 81, 165, 285) и один сайт на НА2 цепи (154). В состав глобулярного домена гемагглютинина входит только цепь НА1. Его основным структурным мотивом является антипараллельный ß-слой, который образуют восемь участков полипептидной цепи. На дистальной поверхности домена расположен участок, осуществляющий связывание с рецептором. Клеточный рецептор, с которым связываются молекулы гемагглютинина, располагается является олигосахаридом, содержащим остаток сиаловой кислоты. Подобные рецепторы входят в состав гликозилированных белков и гликолипидов. Как правило, в таких рецепторах сиаловая кислота присоединена с помощью 2-3 или 2-6 а-О-гликозидной связи к остатку галактозы, входящей в состав олигосахарида. Комплементарный рецептору лиганд-связывающий карман гемагглютинина образован наиболее консервативными аминокислотными остатками: Tyr 98, His 183, Glu 190, Trp 153, Leu 194, участвующими во взаимодействии с остатком сиаловой кислоты. Другие консервативные аминокислотные остатки, Cys 97, Pro 99, Cys 139, Pro 147, Tyr 195, стабилизируют структуру участка, связывающего клеточный рецептор.

Стеблевой домен гемагглютинина образован обеими цепями, HA1 и HA2. N-конец

цепи HA1 представлен 18-аминокислотным сигнальным пептидом, N-конец HA2 цепи-

пептидом слияния. Гидрофобная С-концевая последовательность цепи НА2 обеспечивает

закрепление молекулы гемагглютинина в мембране вириона. Прилежащая к мембране

вирусной частицы часть стеблевого домена представлена двумя короткими альфа-

спиралями и ß-структурой, образованной четырьмя фрагментами полипептидной цепи

HA2 и одним фрагментом полипептидной цепи HA1. Дистальная часть домена

представлена двумя альфа-спиралями (А и В), ß-петлей, располагающейся между

спиралями, и пептидом слияния. Взаимодействия альфа-спиралей разных мономеров

11

гемагглютинина обеспечивают контакты отдельных субъединиц, что приводит к образованию тримера [16]. При понижении рН до значения, близкого к 5, происходят существенные конформационные изменения молекулы НА. Они затрагивают две дистальные альфа-спирали стеблевого домена, Р-петлю и пептид слияния. При этом альфа-спирали и Р-петля реорганизуются в одну длинную альфа-спираль с пептидом слияния на конце [17]. Глобулярный домен во время этих изменений крайне подвижен и меняет свое положение, в результате чего пептид слияния становится экспонированным на верхней поверхности молекулы гемагглютинина и способен взаимодействовать с мембраной клетки. В результате этих изменений осуществляется процесс слияния мембран вирусной частицы и клетки. Было показано, что взаимодействие гемагглютинина с клеточной мембраной носит гидрофобный характер, не нуждается в присутствии заряженных фосфолипидов, не ингибируется высокими и низкими значениями ионной силы, низким значением температуры, а также наличием хелатирующих агентов, а также сопровождается перемешиванием липидов обеих мембран [18].

Различные части молекулы гемагглютинина являются эпитопами для значительной части антител, вырабатываемых в организме при инфицировании ВГА. Выделяют пять участков молекулы НА, с которыми связываются антитела. Считается, что каждый участок является эпитопом, и в каждом новом патогенном штамме должны возникнуть мутации во всех пяти участках НА, для того, чтобы избежать нейтрализации антителами, появившимися при предыдущем заражении вирусом гриппа. Некоторые из возникших мутаций практически не влияют на структуру молекулы гемагглютинина, но позволяют избегать нейтрализации антителами. Такие мутации связаны с потерей или приобретением дополнительного участка гликозилирования, что приводит к экранированию эпитопа с помощью олигосахарида, а следовательно к препятствованию связывания антител с данным участком.

Вторым поверхностным белком является нейраминидаза. Нейраминидаза является

гликозил-гидролазой, которая удаляет из состава олигосахаридов сиаловую кислоту,

присоединенную с помощью а-О-гликозидной связи. Известно, что данный фермент

необходим для высвобождения новых вирусных частиц вируса гриппа от поверхности

клетки после их сборки. Без активности нейраминидазы вирус гриппа не способен

распространяться в организме и участвовать в следующих циклах репродукции. В

зависимости от аминокислотной последовательности молекул нейраминидазы и

способности быть связанной моноклональными антителами для серотипирования

выделяют 10 подтипов нейраминидазы. Все молекулы внутри определенного подтипа

12

имеют высокий уровень гомологии (более 90%) и взаимодействуют с моноклональными антителами, используемыми для серотипирования.

На мембране вириона нейраминидаза представлена в виде гомотетрамера с молекулярной массой около 240 кДа. В молекуле нейраминидазы выделяют три домена: глобулярный, стеблевой и трансмембранный. Восемь или девять дисульфидных связей стаблилизируют структуру молекулы NA. Активный центр фермента образован глобулярным доменом, который обильно гликозилирован по консервативным остаткам аспарагина (Вб, 14б, 200, 234). Гликозидные остатки играют важную роль в структуре и функционировании нейраминидазы. Так, отсутствие гликозилирования по аспарагину 14б приводит к снижению активности фермента в 20 раз. Некоторые из гликозидных остатков необходимы для правильного фолдинга фермента у некоторых штаммов [19]. Основным структурным мотивом глобулярного домена является ß-пропеллер, образованный шестью антипараллельными ß-листами, каждый из которых представлен четырьмя фрагментами полипептидной цепи. В центре пропеллера располагается активный центр, образованный структурными аминокислотами (Glu 119, Arg ^б, Trp 17В, Ser 179, Asp/Asn 19В, Ile 222, Glu 227, Asp 293, Glu 42S) и функциональными аминокислотами (Arg 11В, Asp 1S1, Arg 1S2, Arg 224, Glu 27б, Arg 292, Arg 371, Tyr 40б) [1В]. Ключевую роль в катализе играет пара Tyr 40б и Glu 277 [20].

Нейраминидаза является перспективной мишенью для разработки лекарственных препаратов. В настоящее время существует несколько фармацевтических препаратов, ингибирующих нейраминидазу вируса гриппа. Наиболее известными среди них являются Реленза и Тамифлю. Но внедрение таких препаратов во клиническую практику привело к распространению к ним устойчивости. В 2009 г. в Японии доля резистентных к Тамифлю штаммов достигла 100%. Тем не менее, существенным преимуществом данных препаратов можно считать способность ингибировать репродукцию как вируса гриппа А, так и вируса гриппа В, что делает привлекательной работу в данном направлении. Разработка терапевтических антител против нейраминидазы представляется затруднительной, так как данный белок используется вирусом лишь на поздних стадиях репродуктивного цикла, когда клетка уже заражена вирусом.

Третьим белком, представленным на поверхности мембраны вириона ВГА, является

белок М2, который выполняет функцию рН-зависимого протонного канала. М-ген вируса

гриппа кодирует 2 белка в перекрывающихся рамках считывания: Ml, представляющего

собой капсидный белок и М2- белок ионного канала. Оба белка, Ml и М2, высоко

консервативны. Белок М2 совмещает функции ионного канала и отпочковывания

l3

дочерних вирионов от плазматической мембраны клетки. К вирусной мембране изнутри прилегает слой молекул матриксного белка М1 - основного структурного белка вириона. Полагают, что белок М1 взаимодействует как с внутривирионными сегментами интегральных белков: НА, NA, М2, так и рибонуклеокапсидом, обеспечивая сборку всех компонентов для формирования компетентных вирионов [21].

Белок М2 является гомотетрамером с молекулярной массой 44 кДа. N-конец белка направлен к внешней поверхности вириона, С-конец- к внутренней. В структуре белка имеются три функционально важные области: эктодомен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. За проводимость протонов преимущественно отвечает трансмембранный домен, представленный аминокислотами 24-44, образующими альфа-спираль. В функционировании канала наиболее существенную роль играют аминокислотные остатки Val 27, Ala 30, Ser 31, Ala/Gly 34, His 37, Trp 41, Asp 44, Arg 45. Боковые группы Val 27 образуют внешнее гидрофобное кольцо, которое при нейтральных значениях рН находится в открытом состоянии и не ограничивает доступ молекул и ионов в полость канала. Полость канала прерывают боковые группы His 37, которые образуют гистидиновый бокс. Имидазольные кольца гистидина не взаимодействуют друг с другом непосредственно, а только через водяные кластеры, располагающиеся сверху и снизу от бокса. За гистидиновым боксом следуют триптофановые ворота, образованные Trp 41. При нейтральных значениях рН они находятся в закрытом состоянии и обеспечивают постоянство состава внутренней среды вириона. На выходе из канала располагается апспарагиново-аргининовый бокс, образованный Asp44, Arg 45. При нейтральных значениях рН он образует пору размером в 8 Á. При понижении рН боковые группы His37 протонируются, что приводит к ряду конформационных изменений.

Вирионы, у которых нарушено функционирование канала, не способны инфицировать клетку и участвовать в дальнейших стадиях репродукции. Без понижения рН внутри вириона не может произойти слияние мембран клетки и вириона, а также высвобождение вирусного рибонуклеопротеина в цитоплазму клетки. Некоторые из препаратов, такие как ремантадин и амантадин способны связываться с каналом внутрии нарушать его проводимость [22].

1.4 Белки вируса гриппа как мишени для создания терапевтических средств. Существующие терапевтические препараты

Гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) - это два основных антигена для

стимуляции продукции антител. Однако, из-за частых и непредсказуемых антигенных

14

вариаций НА, вакцина часто не обеспечивает оптимальную защиту иммунитета против дивергентных вирусных штаммов, в связи с чем дальнейшее развитие терапевтических препаратов для этой мишени не представлялось оптимальным решением. Дальнейшие усилия, связанные с разработкой лекарственных препаратов, были направлены на глубокое изучение молекулярных механизмов инфицирования и взаимодействия вируса и клетки хозяина. Ингибиторы нейраминидазы (NAI) препятствуют выходу вновь сформированных вирионов из клеточной поверхности и их распространению.

Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа применяются наряду с вакцинацией для предотвращения и лечения заболевания. Из этиотропных препаратов, т. е. средств специфической противогриппозной терапии, в клинике используются соединения двух групп, отличающиеся по механизму действия и вирусным мишеням. Препараты первой группы - ремантадин (а- метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид) и амантадин (1-аминоадамантан) - блокируют белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [23]. Препараты второй группы ингибируют вирусную нейраминидазу - фермент, обеспечивающий почкование вирусных частиц и их дальнейшее распространение.

На данный момент имеется четыре запатентованных средства для лечения и

профилактики гриппа, основанных на действии NAI.K этой группе соединений относятся

занамивир (действующее начало препарата Реленца®), озелтамивир (Тамифлю®),

перамивир (Рапиакта®) и ланинамивир (Инавир®) [24], последние два в России не

зарегистрированы. Разработка занамивира основывалась на двух принципах. Первый -

аналог сайта DANA (2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid), был известен как

слабый ингибитор NA. Второй - основывался на особенностях структуры субстрата

сиаловой кислоты в комплексе активным сайтом фермента. Занамивир применяется с

помощью ингаляций в дозах 10мг/ 2 раза в день, а озельтамивир - перорально (для приема

внутрь) 75мг/2 раза в день. Другие препараты, такие как перамивир и ланинамивир -

являются производными, основанными на структуре занамивира. Ланинамивир (Инавир)

был запатентован в Японии, суточная доза составляет 40мг в виде ингаляций. Было

замечено, что более эффективное действие препарата и, при этом уменьшение

резистентности, проявлялось, когда концентрации лекарства доставлялись

непосредственно к верхним дыхательным путям. Однако, пандемичный вирус A (H1N1)

pdm09 и основные сезонные A (H3N2) вирусы приобрели устойчивость с середины

2000-х годов к озельтамивиру и, кроме того, наблюдалось увеличение подтипов вирусов,

15

устойчивых к озельтамивиру и адамантану [21, 25, 26]. Важно отметить, что некоторые из штаммов высокопатогенного птичьего вируса гриппа Н5Ш также приобрели устойчивость к используемым лекарственным препаратам. Так, например, большинство подтипов вируса гриппа Н5Ш стали устойчивы к адамантину, а озельтамивир-устойчивые вирусы гриппа Н5Ш имеют нейраминидазные мутации (Н274У и N2948), выделенные у пациентов во время и после лечения [27]. Необходимо отметить, что из-за различий в химической структуре ингибиторов, многие мутации не вызывают уменьшение чувствительности ко всем ингибиторам NA. Это может объясняться тем, что в активном сайте содержатся высоко консервативные остатки и мутации могут вызывать устойчивость только к какому-нибудь одному подтипу вируса гриппа. Так, например, мутация Я292К дает высокую устойчивость к озельтамивиру только для вирусов гриппа N2. Хотя, имеются данные, что устойчивость вирусов гриппа В к озельтамивиру и перамивиру меньше, чем у вирусов гриппа А [28].

Известен единичный случай, когда устойчивый вирус гриппа В, с мутацией Ю52К, дающей уменьшение чувствительности ко всем ингибиторам нейраминадазы, был выявлен у ребенка с нарушенной иммунологической реактивностью, находящегося на терапии занамивиром [29]. Рост невосприимчивости больных к терапии озельтамивиром вынуждает использовать другие терапевтические подходы. В 2009 г. для лечения некоторого количества больных вирусом гриппа НШ1 и острой пневмонией было применено пролонгированное лечение кортикостероидами. В основном больные имели устойчивость к озельтамивиру, и течение болезни представляло угрозу для жизни. Введение стрессовых доз метилпреднизолона (1 мг/кг/24 ч) в качестве неотложной помощи, дало положительный эффект. Согласно литературным данным [30], для лечения более 34% острых инфекций вирусом НШ1, были применены кортикостероиды. Данная статья также подтверждает возможность применения кортикостероидов при серьезных случаях заболевания вирусной инфекцией (вирусом гриппа НШ1). Однако в том же 2009 г., ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) в своих рекомендация по лечению пандемии гриппа не рекомендовала использовать кортикостероиды при повседневном лечении пациентов с инфекцией вируса гриппа А НШ1. Возможные риски при употреблении кортикостероидов включают вторичную инфекцию, гипергликемию, плохое заживление мелких ран, длительную мышечную слабость с нарушениями функционального состояния, панкреатит [31].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алиев, Теймур Кантамирович, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bakema J.E. and van Egmond M. (2011) The human immunoglobulin A Fc receptor FcalphaRI: a multifaceted regulator of mucosal immunity. Mucosal Immunol. 4(6): p. 612-624.

2. Gerhard W. (2001) The role of the antibody response in influenza virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 260: p. 171-190.

3. Lachmann P.J. (2012) The use of antibodies in the prophylaxis and treatment of infections. EmergMicrobes Infect. 1(8): p. e11.

4. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., Silacci C., Fernandez-Rodriguez B.M., Agatic G., Bianchi S., Giacchetto-Sasselli I., Calder L., Sallusto F., Collins P., Haire L.F., Temperton N., Langedijk J.P., Skehel J.J., and Lanzavecchia A. (2011) A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science. 333(6044): p. 850-856.

5. Tamura S. and Kurata T. (2004) Defense mechanisms against influenza virus infection in the respiratory tract mucosa. Jpn J Infect Dis. 57(6): p. 236-247.

6. Киселев О. И. Цыбалова. Л.М., Покровский В. И, Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика. (2012), Москва: Медицинское информационное агентство. с. 12-15.

7. Ahmed R., Oldstone M.B., and Palese P. (2007) Protective immunity and susceptibility to infectious diseases: lessons from the 1918 influenza pandemic. Nat Immunol. 8(11): p. 1188-1193.

8. Domingo E., Baranowski E., Ruiz-Jarabo C.M., Martin-Hernandez A.M., Saiz J.C., and Escarmis C. (1998) Quasispecies structure and persistence of RNA viruses. Emerg Infect Dis. 4(4): p. 521-527.

9. Landolt G.A. and Olsen C.W. (2007) Up to new tricks - a review of cross-species transmission of influenza A viruses. Anim Health Res Rev. 8(1): p. 1-21.

10. Smith D.J., Lapedes A.S., de Jong J.C., Bestebroer T.M., Rimmelzwaan G.F., Osterhaus A.D., and Fouchier R.A. (2004) Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus. Science. 305(5682): p. 371-376.

11. Ong A.K. and Hayden F.G. (2007) John F. Enders lecture 2006: antivirals for influenza. J Infect Dis. 196(2): p. 181-190.

12. Баранов А. А. М.А.Н. (2009) Страсти по гриппу. Вопросы диагностики в педиатрии. 1(6): p. 5-7.

13. Маянский А.Н. (2009) Вирус гриппа А: строение , экология, патология. Вопросы диагностики в педиатрии. 1(6): p. 8-17.

14. Ильичева Т. Н. Н.С.В., Гуреев В. Н, в кн. ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ Вирусы гриппа, Новосибирского национального исследовательского государственного университета, (2012): Новосибирск. p. 20-24.

15. Taubenberger J.K. and Kash J.C. (2010) Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic formation. Cell Host Microbe. 7(6): p. 440-451.

16. Wiley D.C. and Skehel J.J. (1987) The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. AnnuRevBiochem. 56: p. 365-394.

17. Chen J., Skehel J.J., and Wiley D.C. (1999) N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil. Proc Natl Acad Sci US A. 96(16): p. 8967-8972.

18. Doms R.W., Helenius A., and White J. (1985) Membrane fusion activity of the influenza virus hemagglutinin. The low pH-induced conformational change. J Biol Chem. 260(5): p. 2973-2981.

19. Saito T. and Kawano K. (1997) Loss of glycosylation at Asn144 alters the substrate preference of the N8 influenza A virus neuraminidase. J Vet Med Sci. 59(10): p. 923-926.

20. Colman P.M. (1994) Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. Protein Sci. 3(10): p. 1687-1696.

21. McKimm-Breschkin J.L. (2013) Influenza neuraminidase inhibitors: antiviral action and mechanisms of resistance. Influenza Other Respir Viruses. 7 Suppl 1: p. 25-36.

22. Acharya R., Carnevale V., Fiorin G., Levine B.G., Polishchuk A.L., Balannik V., Samish I., Lamb R.A., Pinto L.H., DeGrado W.F., and Klein ML. (2010) Structure and mechanism of proton transport through the transmembrane tetrameric M2 protein bundle of the influenza A virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107(34): p. 15075-15080.

23. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., and Rott R. (1978) On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2. Virology. 87(1): p. 13-20.

24. Fiore A.E., Fry A., Shay D., Gubareva L., Bresee J.S., Uyeki T.M., Centers for Disease C., and Prevention (2011) Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of

influenza — recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60(1): p. 1-24.

25. Saito R., Suzuki Y., Li D., Zaraket H., Sato I., Masaki H., Kawashima T., Hibi S., Sano Y., Shobugawa Y., Oguma T., and Suzuki H. (2008) Increased incidence of adamantane-resistant influenza A(H1N1) and A(H3N2) viruses during the 2006-2007 influenza season in Japan. J Infect Dis. 197(4): p. 630-632; author reply 632-633.

26. Bright R.A., Shay D.K., Shu B., Cox N.J., and Klimov A.I. (2006) Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the United States. JAMA. 295(8): p. 891-894.

27. de Jong M.D., Tran T.T., Truong H.K., Vo M.H., Smith G.J., Nguyen V.C., Bach V.C., Phan T.Q., Do Q.H., Guan Y., Peiris J.S., Tran T.H., and Farrar J. (2005) Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection. N Engl J Med. 353(25): p. 2667-2672.

28. Ives J., Carr, J., Roberts, N.A. (2000) An oseltamivir treatment-selected influenza A:N2 virus with a R292K mutation in the neuraminidase gene has reduced infectivity in vivo. Journal of Clinical Viroly. 18: p. 251-269.

29. Gubareva L.V., Matrosovich M.N., Brenner M.K., Bethell R.C., and Webster R.G. (1998) Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus. J Infect Dis. 178(5): p. 1257-1262.

30. Confalonieri M., Cifaldi R., Dreas L., Viviani M., Biolo M., and Gabrielli M. (2010) Methylprednisolone infusion for life-threatening H1N1-virus infection. Ther Adv Respir Dis. 4(4): p. 233-237.

31. Caliandro F., Crerar-Gilbert A., and Madden B. (2013) Should high-dose steroid therapy and inhaled nitric oxide be considered for adult patients with H1N1 respiratory failure? JRSMShort Rep. 4(2): p. 15.

32. Rossman J.S., Jing X., Leser G.P., Balannik V., Pinto L.H., and Lamb R.A. (2010) Influenza virus m2 ion channel protein is necessary for filamentous virion formation. J Virol. 84(10): p. 5078-5088.

33. Zebedee S.L. and Lamb R.A. (1988) Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol. 62(8): p. 2762-2772.

34. Gabbard J., Velappan N., Di Niro R., Schmidt J., Jones C.A., Tompkins S.M., and Bradbury A.R. (2009) A humanized anti-M2 scFv shows protective in vitro activity against influenza. Protein EngDes Sel. 22(3): p. 189-198.

35. Furuta Y., Takahashi K., Shiraki K., Sakamoto K., Smee D.F., Barnard D.L., Gowen

B.B., Julander J.G., and Morrey J.D. (2009) T-705 (favipiravir) and related compounds: Novel broad-spectrum inhibitors of RNA viral infections. Antiviral Res. 82(3): p. 95-102.

36. Pizzorno A., Abed Y., and Boivin G. (2011) Influenza drug resistance. Semin Respir Crit Care Med. 32(4): p. 409-422.

37. Hauge S.H., Dudman S., Borgen K., Lackenby A., and Hungnes O. (2009) Oseltamivir-resistant influenza viruses A (H1N1), Norway, 2007-08. Emerg Infect Dis. 15(2): p. 155162.

38. Thorlund K., Awad T., Boivin G., and Thabane L. (2011) Systematic review of influenza resistance to the neuraminidase inhibitors. BMC Infect Dis. 11: p. 134.

39. Chen R. and Holmes E.C. (2010) Hitchhiking and the population genetic structure of avian influenza virus. J Mol Evol. 70(1): p. 98-105.

40. Dugan V.G., Chen R., Spiro D.J., Sengamalay N., Zaborsky J., Ghedin E., Nolting J., Swayne D.E., Runstadler J.A., Happ G.M., Senne D.A., Wang R., Slemons R.D., Holmes E.C., and Taubenberger J.K. (2008) The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoSPathog. 4(5): p. e1000076.

41. Holmes E.C., Ghedin E., Miller N., Taylor J., Bao Y., St George K., Grenfell B.T., Salzberg S.L., Fraser C.M., Lipman D.J., and Taubenberger J.K. (2005) Whole-genome analysis of human influenza A virus reveals multiple persistent lineages and reassortment among recent H3N2 viruses. PLoS Biol. 3(9): p. e300.

42. Garten R.J., Davis C.T., Russell C.A., Shu B., Lindstrom S., Balish A., Sessions W.M., Xu X., Skepner E., Deyde V., Okomo-Adhiambo M., Gubareva L., Barnes J., Smith

C.B., Emery S.L., Hillman M.J., Rivailler P., Smagala J., de Graaf M., Burke D.F., Fouchier R.A., Pappas C., Alpuche-Aranda C.M., Lopez-Gatell H., Olivera H., Lopez I., Myers C.A., Faix D., Blair P.J., Yu C., Keene K.M., Dotson P.D., Jr., Boxrud D., Sambol A.R., Abid S.H., St George K., Bannerman T., Moore A.L., Stringer D.J., Blevins P., Demmler-Harrison G.J., Ginsberg M., Kriner P., Waterman S., Smole S., Guevara H.F., Belongia E.A., Clark P.A., Beatrice S.T., Donis R., Katz J., Finelli L., Bridges C.B., Shaw M., Jernigan D.B., Uyeki T.M., Smith D.J., Klimov A.I., and Cox N.J. (2009) Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. 325 (5937): p. 197-201.

43. Friesen R.H., Lee P.S., Stoop E.J., Hoffman R.M., Ekiert D.C., Bhabha G., Yu W.,

Juraszek J., Koudstaal W., Jongeneelen M., Korse H.J., Ophorst C., Brinkman-van der

Linden E.C., Throsby M., Kwakkenbos M.J., Bakker A.Q., Beaumont T., Spits H.,

102

Kwaks T., Vogels R., Ward A.B., Goudsmit J., and Wilson I.A. (2014) A common solution to group 2 influenza virus neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111(1): p. 445-450.

44. Knossow M. and Skehel J.J. (2006) Variation and infectivity neutralization in influenza. Immunology. 119(1): p. 1-7.

45. Sui J., Hwang W.C., Perez S., Wei G., Aird D., Chen L.M., Santelli E., Stec B., Cadwell G., Ali M., Wan H., Murakami A., Yammanuru A., Han T., Cox N.J., Bankston L.A., Donis R.O., Liddington R.C., and Marasco W.A. (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol. 16(3): p. 265-273.

46. Kashyap A.K., Steel J., Oner A.F., Dillon M.A., Swale R.E., Wall K.M., Perry K.J., Faynboym A., Ilhan M., Horowitz M., Horowitz L., Palese P., Bhatt R.R., and Lerner R.A. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(16): p. 5986-5991.

47. Ekiert D.C., Bhabha G., Elsliger M.A., Friesen R.H., Jongeneelen M., Throsby M., Goudsmit J., and Wilson I.A. (2009) Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324(5924): p. 246-251.

48. Ekiert D.C., Friesen R.H., Bhabha G., Kwaks T., Jongeneelen M., Yu W., Ophorst C., Cox F., Korse H.J., Brandenburg B., Vogels R., Brakenhoff J.P., Kompier R., Koldijk M.H., Cornelissen L.A., Poon L.L., Peiris M., Koudstaal W., Wilson I.A., and Goudsmit J. (2011) A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science. 333(6044): p. 843-850.

49. Russell C.J. (2011) Stalking influenza diversity with a universal antibody. N Engl J Med. 365(16): p. 1541-1542.

50. Clementi N., De Marco D., Mancini N., Solforosi L., Moreno G.J., Gubareva L.V., Mishin V., Di Pietro A., Vicenzi E., Siccardi A.G., Clementi M., and Burioni R. (2011) A human monoclonal antibody with neutralizing activity against highly divergent influenza subtypes. PLoS One. 6(12): p. e28001.

51. Dreyfus C., Laursen N.S., Kwaks T., Zuijdgeest D., Khayat R., Ekiert D.C., Lee J.H.,

Metlagel Z., Bujny M.V., Jongeneelen M., van der Vlugt R., Lamrani M., Korse H.J.,

Geelen E., Sahin O., Sieuwerts M., Brakenhoff J.P., Vogels R., Li O.T., Poon L.L., Peiris

M., Koudstaal W., Ward A.B., Wilson I.A., Goudsmit J., and Friesen RH. (2012) Highly

conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337(6100): p. 1343-1348.

103

52. Rodrigues M.E., Costa A.R., Henriques M., Azeredo J., and Oliveira R. (2010) Technological progresses in monoclonal antibody production systems. Biotechnol Prog. 26(2): p. 332-351.

53. Skerra A. and Pluckthun A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 240(4855): p. 1038-1041.

54. Simmons L.C., Reilly D., Klimowski L., Raju T.S., Meng G., Sims P., Hong K., Shields R.L., Damico L.A., Rancatore P., and Yansura D.G. (2002) Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies. J Immunol Methods. 263(1-2): p. 133-147.

55. Steiner D., Forrer P., Stumpp M.T., and Pluckthun A. (2006) Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display. Nat Biotechnol. 24(7): p. 823-831.

56. Levy R., Weiss R., Chen G., Iverson B.L., and Georgiou G. (2001) Production of correctly folded Fab antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli trxB gor mutants via the coexpression of molecular chaperones. Protein Expr Purif. 23(2): p. 338347.

57. Humphreys D.P., Weir N., Lawson A., Mountain A., and Lund P.A. (1996) Co-expression of human protein disulphide isomerase (PDI) can increase the yield of an antibody Fab' fragment expressed in Escherichia coli. FEBSLett. 380(1-2): p. 194-197.

58. Corisdeo S. and Wang B. (2004) Functional expression and display of an antibody Fab fragment in Escherichia coli: study of vector designs and culture conditions. Protein Expr Purif. 34(2): p. 270-279.

59. Ridder R., Schmitz R., Legay F., and Gram H. (1995) Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris. Biotechnology (N Y). 13(3): p. 255-260.

60. Cregg J.M., Vedvick T.S., and Raschke W.C. (1993) Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Biotechnology (N Y). 11(8): p. 905-910.

61. Davis G.T., Bedzyk W.D., Voss E.W., and Jacobs T.W. (1991) Single chain antibody (SCA) encoding genes: one-step construction and expression in eukaryotic cells. Biotechnology (N Y). 9(2): p. 165-169.

62. Sethuraman N. and Stadheim T.A. (2006) Challenges in therapeutic glycoprotein production. Curr Opin Biotechnol. 17(4): p. 341-346.

63. zu Putlitz J., Kubasek W.L., Duchene M., Marget M., von Specht B.U., and Domdey H. (1990) Antibody production in baculovirus-infected insect cells. Biotechnology (N Y). 8(7): p. 651-654.

64. Legardinier S., Duonor-Cerutti M., Devauchelle G., Combarnous Y., and Cahoreau C. (2005) Biological activities of recombinant equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (eLH/CG) expressed in Sf9 and Mimic insect cell lines. J Mol Endocrinol. 34(1): p. 47-60.

65. Schmidt F.R. (2005) Optimization and scale up of industrial fermentation processes. Appl MicrobiolBiotechnol. 68(4): p. 425-435.

66. Л.И П., Экспрессия генов. 2000, Москва: Наука. 605.

67. Kim J.Y., Kim Y.G., and Lee G.M. (2012) CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 93(3): p. 917-930.

68. Hossler P., Khattak S.F., and Li Z.J. (2009) Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19(9): p. 936-949.

69. Shahrokh Z., Royle L., Saldova R., Bones J., Abrahams J.L., Artemenko N.V., Flatman S., Davies M., Baycroft A., Sehgal S., Heartlein M.W., Harvey D.J., and Rudd P.M. (2011) Erythropoietin produced in a human cell line (Dynepo) has significant differences in glycosylation compared with erythropoietins produced in CHO cell lines. Mol Pharm. 8(1): p. 286-296.

70. Morton H.C., Atkin J.D., Owens R.J., and Woof J.M. (1993) Purification and characterization of chimeric human IgA1 and IgA2 expressed in COS and Chinese hamster ovary cells. J Immunol. 151(9): p. 4743-4752.

71. Berdoz J., Blanc C.T., Reinhardt M., Kraehenbuhl J.P., and Corthesy B. (1999) In vitro comparison of the antigen-binding and stability properties of the various molecular forms of IgA antibodies assembled and produced in CHO cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(6): p. 3029-3034.

72. Reinhart D., Weik R., and Kunert R. (2012) Recombinant IgA production: single step affinity purification using camelid ligands and product characterization. J Immunol Methods. 378(1-2): p. 95-101.

73. Balu S., Reljic R., Lewis M.J., Pleass R.J., McIntosh R., van Kooten C., van Egmond M., Challacombe S., Woof J.M., and Ivanyi J. (2011) A novel human IgA monoclonal antibody protects against tuberculosis. J Immunol. 186(5): p. 3113-3119.

74. Moldt B., Saye-Francisco K., Schultz N., Burton D.R., and Hessell A.J. (2014) Simplifying the synthesis of SIgA: combination of dIgA and rhSC using affinity chromatography. Methods. 65(1): p. 127-132.

75. Hiatt A., Cafferkey R., and Bowdish K. (1989) Production of antibodies in transgenic plants. Nature. 342(6245): p. 76-78.

76. J.F H., Immunoglobulin A. The Antigens. Vol. 2. 1974, N. Y. San Fracisco, London.

77. Tomasi T.B., Jr. and Bienenstock J. (1968) Secretory immunoglobulins. Adv Immunol. 9: p. 1-96.

78. Tomasi T.B. and Grey H.M. (1972) Structure and function of immunoglobulin A. Prog Allergy. 16: p. 81-213.

79. Juncuera Luiz C. J.C., Basic Histology. 10th ed. 2003, New York: McGraw-Hill Publishing Co., inc. 515.

80. Holmgren J. and Czerkinsky C. (2005) Mucosal immunity and vaccines. Nat Med. 11(4 Suppl): p. S45-53.

81. Johansen F.E. and Kaetzel C.S. (2011) Regulation of the polymeric immunoglobulin receptor and IgA transport: new advances in environmental factors that stimulate pIgR expression and its role in mucosal immunity. Mucosal Immunol. 4(6): p. 598-602.

82. Snoeck V., Peters I.R., and Cox E. (2006) The IgA system: a comparison of structure and function in different species. Vet Res. 37(3): p. 455-467.

83. Huang Y.T., Wright A., Gao X., Kulick L., Yan H., and Lamm M.E. (2005) Intraepithelial cell neutralization of HIV-1 replication by IgA. J Immunol. 174(8): p. 4828-4835.

84. Corthesy B., Benureau Y., Perrier C., Fourgeux C., Parez N., Greenberg H., and Schwartz-Cornil I. (2006) Rotavirus anti-VP6 secretory immunoglobulin A contributes to protection via intracellular neutralization but not via immune exclusion. J Virol. 80(21): p. 10692-10699.

85. Mattu T.S., Pleass R.J., Willis A.C., Kilian M., Wormald M.R., Lellouch A.C., Rudd P.M., Woof J.M., and Dwek R.A. (1998) The glycosylation and structure of human serum IgA1, Fab, and Fc regions and the role of N-glycosylation on Fcalpha receptor interactions. J Biol Chem. 273(4): p. 2260-2272.

86. Delacroix D.L., Dive C., Rambaud J.C., and Vaerman J.P. (1982) IgA subclasses in various secretions and in serum. Immunology. 47(2): p. 383-385.

87. Simell B., Kilpi T., and Kayhty H. (2006) Subclass distribution of natural salivary IgA antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide of type 14 and pneumococcal surface adhesin A (PsaA) in children. Clin Exp Immunol. 143(3): p. 543-549.

88. Климович В.Б. С.М.П. (2006) Иммуноглобулин А (IgA) и его рецепторы. Медицинская иммунология. 8(4): p. 483-500.

89. Bakema J.E. and van Egmond M. (2011) Immunoglobulin A: A next generation of therapeutic antibodies?MAbs. 3(4): p. 352-361.

90. Beyer T., Lohse S., Berger S., Peipp M., Valerius T., and Dechant M. (2009) Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies. J Immunol Methods. 346(1-2): p. 26-37.

91. Renegar K.B., Small P.A., Jr., Boykins L.G., and Wright P.F. (2004) Role of IgA versus IgG in the control of influenza viral infection in the murine respiratory tract. J Immunol. 173(3): p. 1978-1986.

92. Taylor H.P. and Dimmock N.J. (1985) Mechanism of neutralization of influenza virus by secretory IgA is different from that of monomeric IgA or IgG. J Exp Med. 161(1): p. 198209.

93. Muramatsu M., Yoshida R., Yokoyama A., Miyamoto H., Kajihara M., Maruyama J., Nao N., Manzoor R., and Takada A. (2014) Comparison of antiviral activity between IgA and IgG specific to influenza virus hemagglutinin: increased potential of IgA for heterosubtypic immunity. PLoS One. 9(1): p. e85582.

94. Abraham Bout D.H., Ashton Jones, Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells, C.H. B.V., Editor. 2005.

95. David Reinhart W.S., Monika Debreczeny, Elisabeth Gludovacz, and Renate Kunert (2013) Characterization of recombinant IgA producing CHO cell lines by qPCR. BMC Proc. 7: p. 114.

96. Woof J.M. and Russell M.W. (2011) Structure and function relationships in IgA. Mucosal Immunol. 4(6): p. 590-597.

97. Norderhaug I.N., Johansen F.E., Schjerven H., and Brandtzaeg P. (1999) Regulation of the formation and external transport of secretory immunoglobulins. Crit Rev Immunol. 19(5-6): p. 481-508.

98. Strugnell R.A. and Wijburg O.L. (2010) The role of secretory antibodies in infection immunity. Nat Rev Microbiol. 8(9): p. 656-667.

99. Phalipon A., Cardona A., Kraehenbuhl J.P., Edelman L., Sansonetti P.J., and Corthesy B. (2002) Secretory component: a new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo. Immunity. 17(1): p. 107-115.

100. Macpherson A.J., McCoy K.D., Johansen F.E., and Brandtzaeg P. (2008) The immune geography of IgA induction and function. Mucosal Immunol. 1(1): p. 11-22.

101. Zhou D., Zhang Y., Li Q., Chen Y., He B., Yang J., Tu H., Lei L., and Yan H. (2011) Matrix protein-specific IgA antibody inhibits measles virus replication by intracellular neutralization. J Virol. 85(21): p. 11090-11097.

102. Woof J.M. and Mestecky J. (2005) Mucosal immunoglobulins. Immunol Rev. 206: p. 6482.

103. Lohse S., Derer S., Beyer T., Klausz K., Peipp M., Leusen J.H., van de Winkel J.G., Dechant M., and Valerius T. (2011) Recombinant dimeric IgA antibodies against the epidermal growth factor receptor mediate effective tumor cell killing. J Immunol. 186(6): p. 3770-3778.

104. Ye J., Shao H., Hickman D., Angel M., Xu K., Cai Y., Song H., Fouchier R.A., Qin A., and Perez D.R. (2010) Intranasal delivery of an IgA monoclonal antibody effective against sublethal H5N1 influenza virus infection in mice. Clin Vaccine Immunol. 17(9): p. 1363-1370.

105. He F., Kumar S.R., Syed Khader S.M., Tan Y., Prabakaran M., and Kwang J. (2013) Effective intranasal therapeutics and prophylactics with monoclonal antibody against lethal infection of H7N7 influenza virus. Antiviral Res. 100(1): p. 207-214.

106. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., and Goldberg M.E. (1985) Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods. 77(2): p. 305-319.

107. Klotz I.M. (1946) The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9: p. 109-117.

108. Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65(1-2): p. 5563.

109. Larina M.V., Aliev T.K., Solopova O.N., Pozdnyakova L.P., Korobova S.V., Yakimov S.A., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., and Kirpichnikov MP. (2015) [Neutralizing Monoclonal and Chimeric Antibodies to Human IFN-gamma]. Bioorg Khim. 41(3): p. 316-326.

110. Теймур Кантамирович Алиев, Дмитрий Сергеевич Балабашин, Дмитрий Александрович Долгих, Михаил Петрович Кирпичников, Анна Алексеевна Панина, Виктория Александровна Топорова, Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия экуариотических клеток-продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела. 2013, Патент РФ № 2555533

111. Mak T.M., Hanson B.J., and Tan Y.J. (2014) Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. Antiviral Res. 107: p. 76-83.

112. Seibert C.W., Rahmat S., Krause J.C., Eggink D., Albrecht R.A., Goff P.H., Krammer F., Duty J.A., Bouvier N.M., Garcia-Sastre A., and Palese P. (2013) Recombinant IgA is sufficient to prevent influenza virus transmission in guinea pigs. J Virol. 87(14): p. 77937804.

113. Ward K.A., DiPette D.J., Held T.N., and Jain R.K. (1991) Effect of intravenous versus intraperitoneal glucose injection on systemic hemodynamics and blood flow rate in normal and tumor tissues in rats. Cancer Res. 51(13): p. 3612-3616.

114. Smee D.F., von Itzstein M., Bhatt B., and Tarbet E.B. (2012) Exacerbation of influenza virus infections in mice by intranasal treatments and implications for evaluation of antiviral drugs. Antimicrob Agents Chemother. 56(12): p. 6328-6333.