Разработка технологии создания эндотелизированного сосудистого протеза и оценка его эффективности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.44, Андреев, Дмитрий Юрьевич

• Андреев, Дмитрий Юрьевич
• 2005

Оглавление диссертации Андреев, Дмитрий Юрьевич

Введение.

Глава 1. Эндотелизация - способ улучшения качества сосудистых протезов (обзор литературы).

Глава 2. Разработка оптимальной методики эндотелиального покрытия внутренней поверхности сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена.

2.1 Аппарат для эндотелизации in vitro сосудистых протезов.

2.2 Разработка методики предварительной подготовки сосудистых протезов к эндотелизации in vitro.

2.2.1 Методика создания стабильного положительного поверхностного потенциала на внутренней поверхности сосудистых протезов.

2.2.2 Методика преклоттинга.

2.2.3 Методика обработки фибронектином.

2.2.4 Методика нанесения коллагенового геля.

2.2.5 Методика обработки сосудистых протезов смесью растворов фактора роста эндотелиальных клеток и гепарина.

2.3 Сравнительная оценка эффективности различных способов эндотелизации сосудистых протезов.

Глава 3. Материалы и методы экспериментальных исследований.

3.1 Характеристика и методика экспериментов.

3.2 Методика культивирования эндотелиоцитов in vitro.

3.3 Методика непрямого трехэтапного иммуномечения антигена, связанного с фактором VIII свертывания крови.

3.4 Методика нанесения эндотелия на внутреннюю поверхность сосудистых протезов и подготовка протезов к имплантации.

3.5 Методика сканирующей электронной микроскопии.

3.6 Методика трансмиссионной электронной микроскопии.

3.7 Методика световой микроскопии.

Глава 4. Эффективность протезирования сосудов эндотелизированными имплантатами.

4.1 Результаты выращивания эндотелия в культуре.

4.2 Результаты эндотелизации сосудистых протезов in vitro.

4.3 Результаты имплантации эндотелизированных сосудистых протезов.

4.3.1 Результаты протезирования инфраренального отдела брюшной аорты собак.

4.3.2 Результаты протезирования сонных и бедренных артерий собак.

4.4 Результаты морфологических исследований сосудистых протезов в различные сроки после их имплантации.

4.4.1 Морфологическая характеристика тканевой организации стандартных сосудистых протезов, имплантированных в инфраренальный отдел брюшной аорты, сонные и бедренные артерии собак.

4.4.2 Морфологическая характеристика тканевой организации эндотелизированных сосудистых протезов, имплантированных в инфраренальный отдел брюшной аорты, сонные и бедренные артерии собак.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии создания эндотелизированного сосудистого протеза и оценка его эффективности»

Атеросклероз в настоящее время является главной причиной смерти в большинстве развитых стран Запада. Заболевание, обычно развивающееся уже на третьем десятилетии жизни, может поражать артерии практически всех локализаций и часто приобретает генерализованный характер (Покровский А.В., 1979, 1996). Эффективное лечение атеро-склеротических поражений сосудов стало возможным лишь с развитием протезирования кровеносных сосудов. Результаты реконструктивных операций с использованием сосудистых протезов во многом зависят от вида и качества имплантатов (Бокерия JI.A. с соавт., 1996; DeBakey М.Е., 1979).

Несмотря на то, что в настоящее время созданы надежные сосудистые протезы для аорты и артерий крупного (>10 мм) калибра, по-прежнему остро стоит проблема протезирования артерий малого (<6 мм) и среднего (<8 мм) диаметров. Лучшими заменителями этих артерий остаются аутогенные артерии и вены. Однако, применение аутоартерий крайне ограничено прежде всего из-за опасности ишемии донорской зоны, а использование аутовен примерно в 30 % случаев невозможно по целому ряду причин (Степанов Г.А. с соавт., 1979; Amgwerg R. et al., 1976; Buxton В. et al., 1980; Suma H. et al, 1991).

Предложение покрывать сосудистые протезы эндотелиальными клетками было сделано в расчете на то, что надежно фиксированный слитный монослой функционирующих эндотелиоцитов обеспечит ат-ромбогенность сосудистых протезов малого и среднего диаметров (Mansfield Р.В., 1970).

Однако, при создании подобного имплантата имеется много нерешенных вопросов, связанных с получением достаточного количества эн-дотелиоцитов, с технологией эндотелизации протезов и изучением их эксплуатационных свойств.

В Российской Федерации не разработана методика эндотелизации сосудистых заменителей из модифицированного политетрафторэтилена (ПТФЭ) и отсутствует опыт имплантации подобных протезов.

Цель работы

Разработка оптимальной технологии эндотелизации сосудистых протезов для улучшения результатов шунтирующих и пластических операций на артериях малого и среднего калибров.

Задачи исследования

1. Разработать метод получения первичной культуры эндотелия с донорского сосуда.

2. Разработать методику выращивания необходимого количества жизнеспособных эндотелиальных клеток в культуре.

3. Провести сравнительную оценку различных способов предварительной подготовки внутренней поверхности сосудистого протеза для эндотелизации.

4. Создать оптимальный способ эндотелизации сосудистых протезов.

5. Изучить в экспериментальных условиях эффективность использования эндотелизированных сосудистых протезов при пластике аорты, сонных и бедренных артерий.

Научная новизна

• Создан оригинальный аппарат для нанесения эндотелия на внутреннюю поверхность сосудистых протезов и разработана оригинальная методика эндотелизации in vitro сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена.

• Разработана методика выращивания эндотелиоцитов в культуре, включающая использование полученных по оригинальной технологии ростовых факторов и позволяющая за короткий срок многократно умножать исходное количество клеток.

• Показана принципиальная возможность получения и использования «универсальной» культуры эндотелиальных клеток для эндотелизации in vitro сосудистых протезов - эндотелия плодов человека на стадии внутриутробного развития 16 — 24 недели.

• Разработана оригинальная методика создания стабильного положительного поверхностного потенциала на внутренней поверхности сосудистого протеза из модифицированного политетрафторэтилена с целью улучшения условий его эндотелизации.

• Доказано, что оптимальная предварительная подготовка внутренней поверхности сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена, обеспечивающая наилучшие результаты их эндотелизации in vitro, достигается созданием стабильного положительного поверхностного потенциала и дальнейшей обработкой протеза коллагеновым гелем или преклоттингом цельной кровью.

• В экспериментах на животных показано, что эндотелизированные сосудистые трансплантаты, использованные в качестве протезов аорты, сонных и бедренных артерий, обладают хорошими эксплуатационными свойствами, значительно лучшей вживляемостью и проходимостью по сравнению со стандартными протезами.

Положения, выносимые на защиту

1. Технология выращивания эндотелиоцитов в культуре, включающая использование экстракта мозга плодов человека в качестве источника ростовых факторов, позволяет добиться массовой пролиферации этих клеток.

2. Технология эндотелизации сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена должна предусматривать предварительную обработку их внутренней поверхности. Оптимальная обработка достигается созданием стабильного положительного поверхностного потенциала и дальнейшим покрытием протеза коллагеновым гелем или преклоттингом цельной кровью.

3. Разработанная методика эндотелизации позволяет получить in vitro слитный монослой эндотелиальных клеток на внутренней поверхности сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена.

4. Использование эндотелизированных сосудистых трансплантатов в качестве протезов аорты, сонных и бедренных артерий в экспериментах на животных доказало надежность фиксации эндотелиальной выстилки и значительно лучшую проходимость и вживляемость данных протезов по сравнению с контрольными стандартными имплантатами.

5. Отсутствие отторжения эндотелия плодов человека и надежность функционирования покрытых этими клетками протезов в эксперименте позволяет рассматривать возможность использования данной культуры в качестве «универсальных» клеток для эндотелизации сосудистых протезов.

Практическое значение результатов исследования

Разработана оригинальная, доступная по стоимости и временным затратам, эффективная технология создания эндотелизированных сосудистых протезов, которая включает несколько последовательных этапов: • выделение культуры эндотелиальных клеток с донорского сосуда (наружной яремной вены или пупочной вены плода человека);

• выращивание необходимого количества эндотелиоцитов в культуре с использованием полученных по оригинальной методике ростовых факторов;

• обработку внутренней поверхности сосудистых протезов по оригинальной методике;

• эндотелизацию протезов с применением разработанного специального аппарата.

В экспериментах на животных доказана эффективность использования эндотелизированных сосудистых протезов для пластики артерий малого и среднего диаметров. В эксперименте на животных данные трансплантаты продемонстрировали значительно лучшую проходимость и вживляемость по сравнению с контрольными протезами.

Апробация и внедрение результатов исследования

Основные положения и материалы диссертации были доложены, обсуждены и одобрены на совместных заседаниях проблемной комиссии №2 «Сердечно-сосудистая хирургия» и кафедры факультетской хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (1999, 2002 гг.), на юбилейной конференции, посвященной 100-летию кафедр факультетской хирургии и факультетской терапии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова «Прогресс и проблемы в диагностике и лечении заболеваний сердца и сосудов» (Санкт-Петербург, 2000 г.), на международной конференции "XVIIth Meeting of the Federation of the European Connective Tissue Societies" (Patras, Greece, 2000 г.) а также на конгрессе "2nd Lithuanian Congress of Vascular Surgeons and Angiologists" (Klaipeda, Lithuania, 2002).

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, получены приоритетные справки на 3 патента Российской Федерации на изобретения ("Способ эндотелизации in vitro протезов кровеносных сосудов", "Устройство для эндотелизации протезов кровеносных сосудов", "Средство для стимуляции пролиферации клеток, состав для стимуляции пролиферации клеток и способ лечения ран, ожогов и язв различной этиологии").

Результаты исследования используются в практической деятельности клиники факультетской хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (СПб, ул. Льва Толстого 6/8), отделения сосудистой хирургии городской многопрофильной больницы № 2 (СПб, Учебный пер. 2), Отдела клеточных культур Института Цитологии РАН (СПб, Тихорецкий пр. 4), ЗАО НПК «Экофлон» (СПб, ул. Коломенская 4А).

Основные материалы представлены также в учебных программах обучения студентов на кафедре факультетской хирургии и курсантов -на курсе последипломного образования «Сердечно-сосудистая хирургия» СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (СПб, ул. Льва Толстого 6/8).

Структура диссертации

Содержание диссертации изложено на 171 странице текста и иллюстрировано 65 рисунками и 9 таблицами. Библиографический список содержит 166 литературных источников, в том числе 33 отечественных и 133 зарубежных.

Глина 1

Эндотелизация - способ улучшения эксплуатационных свойств сосудистых протезов. Обзор литературы

До настоящего времени проходимость сосудистых протезов малого (<6 мм) и среднего (<8 мм) диаметров в отдаленные сроки после имплантации остается неудовлетворительной. При низких скоростях кровотока они часто тромбируются и не могут конкурировать с аутовенами. Однако, последние по целому ряду причин (использование в предыдущих операциях, варикозное поражение, особенности анатомического строения) в 25-30 % случаев недоступны (1), Поэтому создание атромоо-генного искусственного протеза является важной задачей.

Улучшение характеристик синтетических протезов идет по двум направлениям: механическому и биологическому. Сторонники последнего направления считают, что улучшить протез можно, если его внутренняя поверхность будет имитировать естественную интиму артерии, то есть будет выстлана эндотелием, способным противостоять адгезии тромбоцитов (Рис. 1.1).

Рис. 1.1 Внутренняя поверхность подвздошной артерии собаки. Сканирующая электронная микроскопия, увеличение хбОО. Слитный монослой эн д отел и ал ь и ы х кл ето к полностью покрывает всю внутреннюю поверхность артерии. Клетки ориентированы но поток) крови. Видны выступающие ядра эндотелноцитов.

К сожалению, спонтанная эндотелизация протезов у людей обычно ограничивается врастанием эндотелия примерно на 1 см от каждого анастомоза (40), хотя островки эндотелия были обнаружены по всей длине дакроновых протезов (123).

Концепция покрытия сосудистых протезов эндотелиальными клетками ("endothelial cell seeding" - "посев эндотелия") впервые была представлена в 1970 году P.B. Mansfield (101). Автор использовал грануляционную ткань с ложа кожного лоскута на ножке в качестве источника взвеси клеток (эндотелия, фибробластов и макрофагов). Эта смесь клеток наносилась на кусочки дакроновых протезов, которые вшивались в артерии у собак и исследовались через 3 недели. Заплаты с аутогенным покрытием продемонстрировали полное отсутствие тромбов на своей поверхности; воспалительная инфильтрация не наблюдалась.

Эти эксперименты вызвали огромный объем исследований, целью которых стало получение на сосудистых протезах слитного функционирующего эндотелиального монослоя. Принципиально это возможно двумя путями. Первый - одностадийная технология. Забранные эндотелиальные клетки засеваются на протез, который имплантируется сразу же после их адгезии. Метод основан на предположении, что прикрепившиеся клетки, разбросанные по всей поверхности протеза, будут пролиферировать in vivo и, в конце концов, образуют слитную выстилку. Действительно, в опытах на животных (собаки, бабуины, овцы) этот метод позволял наблюдать практически полную эндотелизацию протезов через несколько недель после засевания (86). Однако у человека не удалось получить таких впечатляющих результатов. Здесь более перспективной оказалась двухстадийная технология. Смысл ее в том, что забранные клетки выращиваются в культуре и лишь затем наносятся на протез. Эта методика позволяет получить слитную эндотелизацию протеза уже к моменту имплантации.

Прогресс технологии "эндотелиального посева" был достигнут в нескольких областях: забор эндотелия, его культурирование и техника нанесения на протезы. Получена возможность манипулирования экспрессией генов эндотелиальных клеток, наносимых на протезы, с целью усилить их антитромботические свойства (58).

В 1978 году М.В. Herring опубликовал предварительные результаты применения одностадийной технологии (72). Дакроновые протезы покрывались аутогенным эндотелием, который механически снимался с внутренней поверхности подкожной вены собаки с помощью тампонов из тонкой стальной проволоки. Эти клетки смешивались с кровью, использовавшейся для преклоттинга протезов, которые имплантировались собакам. Продемонстрированы более выраженное увеличение свободной от тромбов поверхности с течением времени по сравнению с контрольными протезами, а также значительно более тонкая внутренняя капсула этих имплантатов. Эндотелиальная природа выстилки была подтверждена идентификацией специфичных для эндотелия телец Wiebel-Palade и с помощью меченых изотопами антител к фактору VIII свертывания крови (фактор von Willebrand'а). M.B. Herring с соавторами получил дальнейшие обнадеживающие результаты, используя различные типы сосудистых протезов (73). Ими также были исследованы методики для достижения оптимальной эффективности "засевания"; установлено, что соотношение площади поверхности вены и артерии должно быть больше 0,425 для того, чтобы получить эндотелизацию протеза через 1 месяц. Позднее этими авторами было показано, что эндотелиальная выстилка на "засеянных" политетрафторэтиленовых протезах образуется заметно быстрее, чем на дакроновых, с ограниченным врастанием фибробластов и более тонкой внутренней капсулой (76).

L.M. Graham с соавторами описали "эверсионный" способ забора эндотелия, при котором наружная яремная вена у собак иссекалась и выворачивалась; эндотелий затем удалялся с помощью ферментов (65). Клетки выращивались в культуре и добавлялись к крови, использовавшейся для преклоттинга дакроновых протезов. Последние вшивались собакам в аортальную позицию. Оказалось, что через 4 недели "засеянные" трансплантаты были покрыты эндотелием на 80 %, по сравнению с 10 %-ным покрытием в контрольных протезах. В дальнейшем обнадеживающие результаты применения "эверсионного" метода были получены авторами при непосредственном "засевании" дакроновых и политетрафторэтиленовых протезов (66).

В 1983 году J.B. Sharefkin описал методику забора эндотелиальных клеток, при которой сегмент собачьей аорты пережимался, канюлировался и заполнялся раствором трипсина и коллагеназы (129). Забранные клетки смешивались с кровью и засевались на аортальные дакроновые протезы, имплантировавшиеся этим собакам. Через 6 недель протезы были полностью эндотелизированы, без видимых тромбов; при этом в просвете контрольных незасеянных протезов отмечалось пристеночное отложение большого количества фибрина и красных тромбов. Эта методика канюляции позднее была сравнена с эверсионным методом ферментного забора эндотелия (104). Было найдено, что канюляционная методика позволяет получить намного большее количество жизнеспособных функционирующих клеток венозного эндотелия. Дальнейшие модификации этого метода были опубликованы Р. Zilla с соавторами в 1990 году (162).

Количество эндотелиальных клеток, выделяемых из небольшого участка аутогенной вены (так называемый «макроваскулярный» эндотелий) недостаточно для полного покрытия внутренней поверхности сосудистого протеза требуемой длины. Для этого выделенные клетки необходимо размножить в культуре. Культурирование клеток — достаточно долгий и трудоемкий этап. Стремясь его избежать, исследователи потратили много усилий на поиск альтернативных источников аутогенных эндотелиальных клеток, которые позволили бы сразу выделять нужное количество эндотелия. В нескольких ранних работах было описано успешное выделение и выращивание микроваскулярных эндотелиальных клеток (62,46), но длительное культурирование оказалось безуспешным. Прогресс в этой области был достигнут P.A. Kern с соавторами, которые использовали последовательную фильтрацию для разделения эндотелиальных и стромальных клеток, получаемых из подкожной клетчатки и из сальника (91). Группа В.Е. Jarrell использовала градиент плотности РегсоН'а, чтобы получить относительно чистую культуру эндотелия. Позднее эти авторы получили 100 %-но чистую культуру эндотелиальных клеток из подкожной жировой клетчатки, забранной путем липосакции (158). Дальнейшие модификации этих методик позволили увеличить число клеток, получаемых при заборе, улучшить их рост и устойчивость к воздействию потока крови (111, 140). Чистая культура микрососудистого эндотелия была также выделена путем инкубации забранной смеси клеток с гранулами, покрытыми Ulex europaeus-1 [UEA-1] (83). Последний является лектином, специфически связывающимся с L-фукозными группами на поверхности эндотелиальных клеток. Эндотелий селективно связывается с UEA-1 покрытыми гранулами, тогда как стромальные клетки - при промывании физиологическим раствором - удаляются.

Несмотря на эти сообщения, описанные в них методики относительно мало использовались для эндотелизации сосудистых протезов в связи с сомнениями в чистоте культур полученных клеток. Однако Р.К. Park с соавторами описал успешную эндотелизацию дакронового протеза, "засеянного" клетками эндотелия, полученными из подкожной клетчатки (109). Этот шунт, имплантированный пациенту с синдромом Бадда - Киари девятью месяцами ранее, был резецирован в связи со сдавлением его средней порции; слитный монослой эндотелиальных клеток на ней был идентифицирован при световой и электронной микроскопии и подтвержден при иммуномечении антителами к VIII фактору свертывания крови.

Микроваскулярные эндотелиальные клетки, получаемые из сальника, часто путают с морфологически похожими мезотелиальными клетками, которые тоже синтезируют простациклин (150). После того, как in vitro была доказана нетромбогенность мышиного мезотелия (105), аутогенные мезотелиальные клетки, забранные ферментной обработкой сальника собак, смешивались с кровью для преклоттинга и "засевались" на дакроновые протезы (51). Через 1 месяц, извлеченные трансплантаты имели слитную выстилку из мезотелиальных клеток. Данные "засеянные" трансплантаты синтезировали значительно больше простациклина, чем незасеянные контрольные протезы (47). G.J.L. Thomson с сотрудниками сравнил способность эндотелиальных и мезотелиальных клеток взрослого человека прикрепляться к внутренней поверхности политетрафторэтиленовых (ПТФЭ) протезов и распластываться на ней (146). Процентное отношение мезотелиальных клеток, прикрепившихся к ПТФЭ протезам, несмотря на отсутствие предварительного покрытия последних, было довольно высоким. Но прикрепившиеся мезотелиальные клетки, даже после длительного воздействия на них потока крови, сохраняли свою округлую форму, что, вероятно, делает их менее устойчивыми к "сдвигающему" действию потока крови по сравнению с эндотелием.

Хотя преимущества аутогенных эндотелиальных клеток для "засевания" не вызывают сомнений (153), получение культур этих клеток сопряжено со значительными трудностями и неудобствами. Поэтому неоднократно предпринимались попытки использования гомогенных и ксеногенных клеток для эндотелизации сосудистых протезов. Так, N.M. Vo с соавторами вшивали ПТФЭ протезы, засеянные культурой эндотелиальных клеток, выделенной из аорты свиней в позицию нижней полой вены собакам. Помимо отсутствия каких-либо признаков отторжения ксеногенных эндотелиальных клеток, они выявили статистически достоверное повышение проходимости эндотелизированных имплантатов по сравнению с контрольными ПТФЭ протезами. Теми же авторами с помощью кариотипирования продемонстрировано сохранение ксеногенного эндотелия на внутренней поверхности имплантированных протезов через 1 месяц после операции (151). R.C. Pennell (112) и J.L. Zamora (161) также не выявили реакции отторжения имплантатов, покрытых культурами гомогенного и ксеногенного (свиного) эндотелия. Это несколько неожиданные результаты, так как экспериментально было показано, что активированные гамма интерфероном эндотелиальные клетки способны презентировать антигены Т-лимфоцитам и, таким образом, инициировать реакцию отторжения (113). В этой связи представляют интерес данные G. Nunez с соавторами, которые выявили, что, хотя эндотелиальные клетки обладают HLA-A, HLA-B и HLA-c антигенами, только 1% эндотелиальных клеток пупочной вены человека несет поверхностные D антигены. Теоретически недостача этих антигенов может приводить к тому, что подавляющее большинство пересаженных неаутогенных эндотелиальных клеток не отторгаются (106).

Помечая эндотелиальные клетки с помощью indium-Ill oxine по методике J.B. Sharefkin'a (130), J.E. Rosenman с соавторами засевали эти клетки, смешанные с кровью для преклоттинга, на ПТФЭ протезы. Последние вшивались собакам в положении артериовенозных шунтов. Количество клеток, удерживающихся на поверхности протезов, определялось с помощью гамма-счетчика (121). После восстановления потока крови было обнаружено, что 30 % клеток отделялось в течение первых 30 минут. В течение следующих 24 часов отделение клеток снизилось до 2 % за 1 час; далее потеря клеток была незначительной. Подобные результаты были получены J. Campbell и К.А. Kesler при использовании как политетрафторэтиленовых, так и полиэфирноэластомерных протезов (49, 92).

J.M. Seeger с соавторами обнаружили, что предварительное покрытие ПТФЭ протезов человеческим фибронектином значительно улучшает эндотелиальную адгезию (126). Однако воздействие на эти трансплантаты потока крови in vivo (эксперименты на животных) привело к одинаковому проценту отделения эндотелиальных клеток как с покрытых фибронектином, так и с непокрытых протезов. Это могло быть связано с очень низкой концентрацией фибронектина, использовавшейся для покрытия протезов в этих опытах. Она составляла 5 мкг/мл. G.R. Ramalanjaona с соавторами засевали меченные indium-111 oxine'oM аутогенные эндотелиальные клетки на ПТФЭ протезы, которые имплантировались собакам в сонные артерии. Было замечено 6-кратное увеличение удержания клеток на трансплантатах, предварительно обработанных фибронектином в концентрации 250 мкг/мл (117). Эти же авторы провели исследование in vitro, используя роликовый насос для предварительно покрытия ПТФЭ протезов фибронектином различных концентраций в течение различных промежутков времени (118). Они установили, что фибронектин в концентрации 250 мкг/мл, перфузируемый через протез в течение 60 минут, позволяет получить самое эффективное покрытие. Исследования, выполненные R.K. Vohra с соавторами, показали, что прикрепление фибронектина к различным сосудистым протезам (ПТФЭ и дакроновые протезы с желатиновым покрытием) прямо пропорционально времени контакта фибронектина с протезом и его концентрации. Причем для оптимальной эндотелиальной адгезии необходимы концентрации фибронектина не менее 50 мкг/мл. Преклоттинг также улучшал адгезию эндотелия и приводил к значительно лучшему удержанию клеток на протезах. Выявлено, что после преклоттинга на поверхности протезов остается 75,4 ± 9,5% адгезированных клеток при воздействии потока со скоростями вплоть до 200 мл/мин в течение 2-х часов. Это превосходит результаты, полученные после фибронектинового покрытия (152). Преимущество преклоттинга перед фибронектином для предварительно покрытия протезов продемонстрировали и В. 1Лпс1Ыас1 с коллегами в экспериментах на животных (97). Было показано, что эффективность эндотелиального засевания (адгезию, рост эндотелиальных клеток, а также их способность противостоять "сдвигающему" действию потока крови) можно повысить, если предварительно покрывать протезы и такими материалами как фибриновый клей, межклеточное вещество, коллагеновый гель, гликозаминогликановый кератин (163, 138).

Ранние попытки вырастить эндотелиальную выстилку на ПТФЭ и дакроновых протезах в культуре дали очень скромные результаты (75). Более обнадеживающие результаты были получены, когда ПТФЭ протезы, предварительно покрытые фибронектином в концентрации 100 мкг/мл и "засеянные" выращенными в культуре аутогенными эндотелиальными клетками, выдерживались в СОг - инкубаторе в течение 3-х часов перед имплантацией в сонные артерии собак (145). Дальнейшие эксперименты на животных по культурированию эндотелиальной выстилки продемонстрировали повышение устойчивости эндотелия к "сдвигающему" влиянию потока крови (124), уменьшение отложения тромбоцитов (125), более полную эндотелизацию (164) и улучшение проходимости (136) данных протезов.

Первые исследования по культивированию эндотелия взрослых людей были опубликованы в 1984 году В.Е. .ГагтеН'и соавторами (85), которые получали эндотелиальные клетки путем ферментной обработки артерий и вен трупов. Эндотелий быстро прикреплялся к покрытому желатином полистиролу (культуральному пластику), но для оптимального роста клеточной культуры требовалось добавление среды, содержащей гепарин и фактор роста эндотелия. Эндотелий взрослых людей был впоследствии успешно собран и культивирован из сегментов подкожных вен нижних конечностей у больных, которым выполнялись операции коронарного шунтирования (157) и флебэктомии по поводу варикозной болезни (94). Было показано, что, как и в опытах с эндотелием животных, адгезия и распластывание культивируемых эндотелиальных клеток человека на культуральном пластике и протезах могут быть значительно улучшены при условии предварительного покрытия последних межклеточным веществом, коллагеном, человеческим фибронектином, фибриновым клеем и плазмой, обогащенной тромбоцитами (90, 88).

ЗЬагейап с соавторами в опытах на животных показали, что эндотелиальное засевание уменьшает степень взаимодействия тромбоцитов с протезами, восстанавливая таким образом нормальное время жизни тромбоцитов к моменту, когда эндотелизация становится полной (50). Авторы отметили, что засеянные протезы продуцируют значительно больше простациклина (Рв^), чем обычные трансплантаты. Эти результаты подтверждены другими исследователями (160). в.А. Бюагс! с соавторами исследовал взаимосвязь адгезии тромбоцитов с секрецией РвЬ и тромбоксана (ТХА2) артериальными аутотрансплантатами, нативными артериями в области анастомозов и засеянными" и "незасеянными" дакроновыми протезами малого диаметра. Когда указанные протезы имплантировались в сонные и бедренные артерии собак (137), "засеянные" трансплантаты аккумулировали значительно меньшее количество тромбоцитов, чем "незасеянные", но все же значительно больше, чем артериальные аутотрансплантаты. Также было обнаружено, что PGI2/TXA2 соотношение наивысшее у артериальных аутотрансплантатов и наименьшее у "незасеянных" дакроновых протезов. Авторы заключили, что баланс между PGI2 и ТХ А2 в стенке трансплантата может быть лучшим показателем отложения тромбоцитов и, возможно, долгосрочной проходимости трансплантата. A.D. Shepard с сотрудниками изучали отложение тромбоцитов и вживление протезов под влиянием эндотелиального "засевания" у бабуинов (135). Исследователи имплантировали дакроновые протезы, покрытые аутогенным венозным эндотелием в сонные артерии и обнаружили, что хотя "засевание" ускоряет вживление протеза, оно не изменяет ранней тромбоцитарной активности. Для того, чтобы уменьшить последнюю, В.Т. Allen с соавторами изучил влияние аспирина на "засеянные" и "незасеянные" дакроновые протезы, имплантировавшиеся в сонные и бедренные артерии у собак (35). Аспирин уменьшал отложение тромбоцитов и улучшал проходимость протезов на ранних сроках в обеих группах, хотя "засеянные" протезы аккумулировали значительно больше тромбоцитов, чем контрольные, через 24 часа после имплантации. Однако, 2 недели спустя, отложение тромбоцитов на покрытых протезах уменьшилось до уровня, который был намного меньше, чем у контрольных протезов, и продолжало уменьшаться вплоть до семи месяцев. Адгезия тромбоцитов на контрольных протезах разительно возросла после отмены аспириновой терапии, что сочеталось с резким возрастанием частоты тромбозов; этот эффект не наблюдался у покрытых протезов. Подобные результаты были получены и J.C. Stanley с соавторами, которые назначали аспирин и дипиридамол после имплантации двусторонних подвздошно-бедренных дакроновых протезов; причем одна бранша была засеяна эндотелием, а вторая использовалась как контроль (139). Все протезы оставались проходимыми, пока применялись указанные препараты. Через 2 недели препараты были отменены, после чего проходимость составила 73 % у покрытых протезов и 27 % - у контрольных. Дальнейшие исследования подтвердили, что сочетание эндотелиального покрытия и антитромбоцитарной терапии намного увеличивает свободную от тромбов внутреннюю поверхность протезов и заметно улучшает проходимость на ранних сроках (155), несмотря на то, что антитромбоцитарная терапия значительно уменьшает среднюю PGb продукцию покрытыми протезами по сравнению с "засеянными" протезами, когда данная терапия не проводилась (133).

Когда собакам с имплантированными дакроновыми протезами через различные промежутки времени после операции внутривенно вводилась культура Staphylococcus aureus, было замечено, что почти 100 % протезов становятся инфицированными, если эти инфузии проводились в течение первого месяца после операции (100). Частота инфицирования протезов затем постепенно уменьшалась, но все еще составляла 30 % у собак, которыми внутривенные введения проводились через 1 год после имплантации протезов. Важно, что у всех трансплантатов, дававших рост Staphylococcus aureus в культуре, псевдоинтима была либо не на всем протяжении, либо вообще отсутствовала. В одном из более поздних исследований, когда культура Staphylococcus aureus вводилась через 1 месяц после имплантации покрытых эндотелием дакроновых протезов, хотя эндотелиальное "засевание" не предотвратило инфекцию, была очевидная связь между степенью эндотелизации и устойчивостью протезов к бактериальной адгезии и инфицированию (37). Подобные исследования с использованием политетрафторэтиленовых протезов продемонстрировали значительно меньшую бактериальную адгезию к засеянным протезам (41).

A.D. Shepard с соавторами обнаружили, что как засеянные, так и незасеянные протезы, извлеченные после 2-х недель имплантации, имели выраженную инфильтрацию полиморфноядерными лейкоцитами (134). Авторы предположили, что активация комплемента может оказаться барьером к успешному эндотелиальному покрытию. Плазма здоровых доноров была исследована на активность комплемента после инкубации с короткими сегментами дакроновых и ПТФЭ протезов. Наблюдалась значительная активация комплемента после инкубации с дакроновыми трансплантатами, причем комплемент практически не активировался ПТФЭ протезами. Р. Libby с сотрудниками показали, что имеется прямая связь между лейкоцитарной инфильтрацией и потерей эндотелия как венозными трансплантатами, так и "засеянными" протезами (96). Эти данные согласуются с результатами опытов S. Emerick с коллегами,- которые выявили, что у животных с искусственно вызванной лейкопенией эндотелий на сосудистых протезах удерживается в значительно большей степени (57).

Обращено внимание на некоторые дополнительные факторы, влияющие на успех покрытия трансплантатов клетками эндотелия человека. J.B. Sharefkin с сотрудниками продемонстрировали, что способность эндотелиальных клеток фиксироваться и пролиферировать может быть изменена специфической ферментной обработкой, которая используется при заборе эндотелия (132). Исследования, сравнивавшие возраст клеток, применявшихся для засевания трансплантатов двухэтапным методом, показали более успешное прикрепление к дакроновым и ПТФЭ протезам клеток ранних пересевов (пассажей) (116). Криоконсервированные клетки эндотелия подкожных вен нижних конечностей сохраняли способность прикрепляться к трансплантатам, но были менее устойчивы к воздействию "сдвигающей силы" потока жидкости (87).

Самые первые результаты эндотелиального засевания в клинике были опубликованы М.В. Herring в 1984 году (77). Автор наносил забранные механическим путем эндотелиальные клетки на дакроновые протезы, имплантировавшиеся в бедренно-подколенных, подмышечно-бедренных и бедренно-бедренных положениях. При сравнении проходимости "засеянных" и "незасеянных" протезов разницы выявлено не было. В группе "засеянных" протезов ранняя проходимость была значительно хуже у больных, которые продолжали курить. Это может быть частично объяснено сниженной репродуктивной способностью эндотелиальных клеток курильщиков (165). Позднее М.В. Herring с соавторами сообщили о случае полной эндотелизации in vivo "засеянного" ПТФЭ протеза (78). M.G. Walker с сотрудниками (154) также не смогли обнаружить в клинике заметных различий в проходимости "засеянных" и "незасеянных" ПТФЭ трансплантатов. В дальнейшем, чтобы найти более тонкие различия между этими двумя типами протезов, различными исследователями применялись маркировка тромбоцитов indium-111 и выполнение сцинтиграфии через различные промежутки времени после операции. P. Ortenwall с коллегами описали значительно меньшее отложение меченых изотопом тромбоцитов в засеянных эндотелием браншах аортальных бифукационных протезов (108). В последующей серии бедренно-подколенных реконструкций авторы покрывали половину каждого имплантируемого ПТФЭ протеза аутогенными эндотелиальными клетками. Ими было обнаружено, что "засеянные" сегменты аккумулируют значительно меньше тромбоцитов через один и через 6 месяцев после операции (107). В противоположность им, R. Fásol с соавторами не выявили разницы в адгезии тромбоцитов на ранних и поздних сроках между покрытыми фибриновым клеем засеянными и незасеянными эндотелием ПТФЭ протезами, которые были имплантированы в бедренно-подколенное положение (59). Неутешительные результаты получили и N. Jensen с коллегами (86).

М.В. Herring с соавторами провели исследование, в котором сравнивались результаты бедренно-подколенного шунтирования с помощью засеянных ПТФЭ протезов (66 больных) и аутогенных вен (53 пациента). Результаты, полученные авторами, выглядели пессимистично: проходимость засеянных трансплантатов была значительно хуже, чем аутовенозных и составила через 30 месяцев 37,8 % ± 9,4 % против 91,6 % ± 4,1% (79).

Во всех этих работах применялся одностадийный способ. Вследствие своей относительной простоты он казался более приемлемым в клинике. Причина противоречивых и, большей частью, разочаровывающих результатов, по-видимому, в том, что та плотность засевания, которую дает этот метод, у человека оказывается недостаточной для того, чтобы на трансплантате в последующем сформировался слитный слой эндотелия.

Альтернативой стала двухстадийная технология. Первое клиническое исследование, где использовалась эта методика, опубликовали P. Zilla с соавторами в 1994 году (166). Эндотелизированные ПТФЭ протезы были имплантированы 33 больным, остальные 16 человек (незасеянные ПТФЭ шунты) - составили контрольную группу. Для получения аутогенного эндотелия под местной анестезией резецировался участок наружной яремной вены (его длина составляла в среднем 2,61 ± 1,30 см). Вена канюлировалась и заполнялась 0,1 %-ным раствором коллагеназы на 15 минут. Таким путем удавалось выделить 55,6 ± 12,8 • 103 эндотелиальных клеток, которые затем выращивались в культуре в течение 25,1 ± 11,2 дней. Рост эндотелия не удалось получить у 27,3 % больных. До засевания трансплантат покрывался фибриновым клеем и фибронектином. Далее он заполнялся клеточной взвесью (8,13 ± 4,22 • 105 эндотелиальных клеток / мл) и с помощью специального устройства вращался со скоростью 6 оборотов/час в течение 3-х часов (цель - равномерное осаждение эндотелия). После этого протез инкубировался в особом резервуаре с питательной средой в течение 11,6 ± 3,0 дней. Как было показано, это необходимо для полного развития цитоскелета эндотелиальных клеток (61). Сканирующая электронная и световая микроскопия, проводившиеся непосредственно перед имплантацией протезов, выявили полную (слитную) эндотелизацию внутренней поверхности 88,9 % шунтов. Через 32 месяца наблюдения проходимость составляла 84,7 % для "засеянных" и 55,4 % для "незасеянных" трансплантатов.

В 1995 году G. Leseche с соавторами также опубликовали результаты 5-летнего клинического опыта использования ПТФЭ протезов, покрытых аутогенным эндотелием в два этапа (93). 1-й этап состоял в резекции (под местной анестезией) аутогенной вены; затем эндотелиальные клетки путем ферментной обработки отделялись и выращивались in vitro (2-й этап). Во время сосудистой реконструкции протез пассивно покрывался аутогенной цельной кровью или плазмой в течение 30 минут, а затем "засевался" путем инкубации с эндотелиальными клетками на протяжении 45 минут. В исследование было включено 32 пациента. У 21 больного (69 %) удалось выполнить бедренно-подколенное шунтирование с использованием "засеянных" ПТФЭ протезов (7 мм в диаметре). Средний размер резецируемой вены в пересчете на площадь) составил 10,5 ± 3,5 см . Средняя продолжительность культурирования in vitro - 23,5 ± 8,5 дней. Средняя плотность "засевания" - 2,9 ± 0,8 • 105 клеток/см2 протеза. Первичная проходимость (метод Kaplan-Meier'a) составила 95 % через 3 месяца, 89 % - через 10 и 48 месяцев и 67 % - через 53 и 76 месяцев. Методика не увеличивала периоперативную заболеваемость и смертность.

Таким образом, несмотря на свою трудоемкость по сравнению с одностадийным методом, засевание аутогенного эндотелия в 2 этапа показало свою перспективность в клинической практике. На сегодняшний день эта технология дает возможность эффективно модифицировать сосудистые протезы малого и среднего диаметров и приблизить их проходимость к проходимости аутовенозных имплантатов.

Глава 2

Разработка оптимальной методики эидотелиальиого покрытия внутренней поверхности сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена

Эффективная эндотелизация in vitro сосудистого протеза подразумевает создание на внутренней поверхности данного протеза до его имплантации слитного, надежно фиксированного функционирующего монослоя эндотелиальных клеток. Для этого, во-первых, необходимо получить достаточное количество жизнеспособных эндотелиальных клеток. Полученная культура должна быть «чистой» т.е. содержать не более 10% «балластных» клеток (фибробластов и др.) чтобы не спровоцировать развитие гиперплазии неоинтимы (38). Внутренняя поверхность сосудистого протеза должна быть обработана таким образом, чтобы обеспечить адгезию, распластывание и надежную фиксацию эндотелиоцитов. Способ нанесения эндотелия на протезы должен обеспечивать их равномерное распределение по всей внутренней поверхности при условии сохранения жизнеспособности клеток. И, наконец, все этапы должны быть осуществлены в максимально сжатые сроки с минимальным риском инфицирования эндотелизируемого сосудистого протеза.

В качестве основы для создания эндотелизированного сосудистого трансплантата нами были выбраны сосудистые протезы из модифицированного политетрафторэтилена, как наиболее подходящие для пластики артерий малого и среднего диаметров. В работе использовались стандартные отечественные сосудистые протезы «Экофлон» диаметром 4, 6, и 8 миллиметров (Рис. 2.1).

Рис. 2.1 Внешний вид стандартных протезов «Экофлон».

Заключение диссертации по теме «Сердечно-сосудистая хирургия», Андреев, Дмитрий Юрьевич

Выводы

Разработанная методика эндотелизации внутренней поверхности сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена существенно улучшает их эксплуатационные свойства, снижает риск тромботических осложнений.

Успех эндотелизации сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена в большой степени определяется предварительной подготовкой их внутренней поверхности, включающей создание стабильного поверхностного положительного потенциала и нанесение коллагенового геля или преклоттинг цельной кровью.

Разработанная методика выращивания эндотелиоцитов в культуре, включающая использование экстракта головного мозга плодов человека в качестве источника ростовых факторов, позволяет за короткий срок вырастить in vitro количество клеток, необходимое для полного покрытия внутренней поверхности длинных сосудистых протезов.

Эндотелий плодов человека на сроке внутриутробного развития 16-24 недели является реальным источником «универсальной» культуры эндотелиальных клеток для эндотелизации сосудистых протезов.

Практические рекомендации

1. Эндотелизированные in vitro сосудистые протезы, характеризующиеся хорошей вживляемостью и низким уровнем тромботических осложнений по сравнению со стандартными имплантатами, рекомендуется использовать для пластики артерий среднего и малого калибров.

2. Равномерной эндотелизации сосудистых протезов с минимальной травмой эндотелиальных клеток можно добиться с использованием разработанного оригинального аппарата.

3. Осуществлению эндотелизации сосудистых протезов из модифицированного политетрафторэтилена должна предшествовать специальная подготовка внутренней поверхности им-плантатов. Эффективными способами такой подготовки является создание стабильного поверхностного положительного потенциала 212 ± 25 В и, затем, нанесение специального коллагенового геля или преклоттинг цельной кровью.

4. В качестве источника ростовых факторов для эффективной стимуляции пролиферации эндотелиоцитов в культуре целесообразно применять экстракт головного мозга плодов человека, полученный по разработанной оригинальной технологии.

Список литературы диссертационного исследования Андреев, Дмитрий Юрьевич, 2005 год

1. Абзианидзе Г.А., Микадзе И.Ш., Молдобаева А.К., Инаишвили В.И., Данилов С.М. Эндотелизация сосудистых протезов культивированными эндотелиальными клетками человека. // Хирургия. 1989. - № 6. - С. 124128.

2. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина. - 1990 -С. 91-232.

3. Азизов Г.А. Трансплантация аллогенных вен и ксеногенных артерий при окклюзионных поражениях артерий нижних конечностей. // Авто-реф. дис. канд. мед. наук. М. - 1987. - 17 с.

4. Атушев А.Ф. Опыт применения различных сосудистых заменителей в реконструктивной хирургии артерий среднего и малого диаметра. // Проблемы сосудистой трансплантологии. Под ред. A.A. Спиридонова и Г.А. Абзианидзе.- Тбилиси, 1990. С.75.

5. Белорусов О.С., Гамбарин Б.Л., Азизов Г.А. Трансплантация аллоген-ных вен и ксеногенных артерий в реконструктивной хирургии окклюзи-онных поражений артерий. // Хирургия. 1989. - № 6. - С.3-6.

6. Венедиктов Д. Д. Сравнительная оценка пластмассовых протезов аорты в эксперименте. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1961.- 16 с.

7. Говорунов Г.В. Хирургическое лечение рецидива ишемии после реконструктивных операций на аорте и артериях нижних конечностей. // Автореф. дис. докт. мед. наук. М. - 1987. - 25 с.

8. Горбунов Г.Н. Протезирование мелких кровеносных сосудов с использованием микрохирургической техники. // Дис. . канд. мед. наук. -Л. 1984.-281 с.

9. Гусинский A.B. Разработка и изучение нового ксенопротеза в эксперименте. // Дис. канд. мед. наук. СПб. - 1993. - 179 с.

10. Дронов А.Ф., Кротовский Г.С., Дземешкевич С.А., Феданов Л. В., Коробов H.H. Экспериментальное изучение и первый опыт клиническогоприменения модифицированных армированных ксеногенных артерий имплантатов. // Хирургия. 1983. - № 12 - С.99-104.

11. Ефимова М.Р., Петрова Е.В., Румянцев В.Н. Общая теория статистики. М.: ИНФРА-М. - 2002. - 416 с.

12. Заварзин A.A. Основы сравнительной гистологии. JL: Издательство ЛГУ. - 1985.-370 с.

13. Лебедев Л.В. Сосудистая хирургия на исходе XX столетия. // Мир медицины. СПб. - № 5. - 1997. - С.25-27.

14. Лебедев Л.В., Плоткин Л.Л., Смирнов А.Д., Вавилов В.Н., Лукьянов Ю.В., Горбунов Г.Н. Протезы кровеносных сосудов. СПб.: "Петербург -XXI век" совместно с ТОО "ШКС".- 1994. - С.6-35.

15. Лебедев Л.В., Плоткин Л.Л., Смирнов А.Д. Протезы кровеносных сосудов. Л.: Медицина. - 1981. - 191 с.

16. Лосев Р.З., Гаврилов В.А., Балацкий O.A. Венозные трансплантаты "in situ" в хирургии атеросклеротических поражений артерий нижних конечностей. // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. 1990. - № 3. -С. 17-22.

17. Лукьянов Ю.В. Сравнительная оценка различных пластических материалов и видов операций на артериях в эксперименте и клинике. // Ав-тореф. дис. . докт. мед. наук. СПб. - 1992. - 43 с.

18. Миронов A.A., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: "Наука". - 1994.

19. Покровский A.B. Заболевания аорты и ее ветвей. М.: Медицина. -1979.-326 с.

20. Покровский A.B., Зотиков А.Е. Перспективы и действительность в лечении атеросклеротических поражений аорты. М.: ИПС. - 1996. - 196 с.

21. Седов В.М., Андреев Д.Ю., Дьяков В.Е. Устройство для эндотелиза-ции протезов кровеносных сосудов. // Патент РФ; приоритетная справка №2001115741/14(016635) от 01.06.01.

22. Серебрянский Ю.Б. Возможности использования Российских сосудистых протезов из пористого политетрафторэтилена в различных гемоди-намических условиях в реконструктивной хирургии нижних конечностей. // Автореф. дис. канд. мед. наук. СПб. - 2001.

23. Сорока В.В., Дьяков В.Е., Щеглов Д.Г., Крыжановский A.B., Пугачев А.К. Первый опыт использования сосудистых протезов "Витафлон" при реконструктивных операциях на ветвях дуги аорты. // Ангиология и сосудистая хирургия. 1997. - № 1. - С.80-82.

24. Спиридонов A.A., Клионер Л.И. Хроническая ишемия нижних конечностей. // Сердечно-сосудистая хирургия. Под ред. В.И. Бураковско-го, JI.A. Бокерия. М.: Медицина. - 1989. - С.675-684.

25. Степанов Г.А., Рудольфи В.А., Акчурин P.C., Ушаков В. Флебогра-фичесская оценка большой подкожной вены как аутотрансплантата. // Хирургия. 1979. - № 1. - С.35-38.

26. Степанов Н.В., Паргалова Н.Ш., Щербаков A.B. Реконструктивные операции на сосудах нижних конечностей с использованием большой подножной вены "in situ". // Вестник хирургии. -1989. № 3. - С. 136-142.

27. Фокин А.А., Зотов С.П., Вербовецкий Л.П. Замещение инфицированного сосудистого протеза бедренной веной. // Хирургия. 1991. - № 6. -С.57-60.

28. Херрингтон С., Макги Дж., ред. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. - 1999.

29. Хэм А., Кормак Д. Гистология. М.: Мир. - 1982.

30. Allaire Е, Clowes AW. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. // Ann. Thorac. Surg. 1997. - Vol. 63. - P. 582-591.

31. Allen ВТ, Long Jae, Clark RE. Influence of endothelial cell seeding on platelet deposition and patency in small diameter Dacron arterial grafts. // J. Vase. Surg. -1984. Vol. 1, № 1 - P. 224-232.

32. Amgwerg R., Sede D. Der bovine heterograft eine ideale gefassprathese bei fehlender v.saphena magna. // Helv. Chir. Acta. 1976. - Bd.44, № 1-2. -P.79-82.

33. Arregui M, Dilley R. The effect of bacteremia on arterial prostheses seeded with endothelium. // J. Am. Soc. Artif. Inf. Organs. -1985. Vol. 8. -P. 118-121.

34. Baker KS, Williams SK, Jarrell BE, et al. Endothelialization of human collagen surfaces with human adult endothelial cells // Am. J. Surg. 1985. -Vol. 150.-P. 197-200.

35. Berger KE, Sauvage LR, Rao AM. Healing of arterial prostheses in man: its incompleteness.//Ann. Surg. 1972. - Vol. 175, № 1. - P. 118-127.

36. Birinyi LK, Douville EC, Lewis SA. Increased resistance to bacteremic graft infection after endothelial cell seeding. // J. Vase. Surg. 1987. - Vol. 5, № l.-P. 193-197.

37. Bourke BM, Roche WR, Appleberg M. Endothelial cell harvest for seeding vascular prostheses: the influence of technique on cell function, viability, and number. // J. Vase. Surg. 1986. - Vol. 4. - P. 257-263.

38. Bowlin GJ, Rittgers SE. Electrostatic endothelial sell seeding technique for small-diameter (<6 mm) vascular prostheses: feasibility testing. // Cell Transplantation. 1997. - Vol. 6, № 6 - P. 623-629.

39. Bowlin GJ, Rittgers SE. Electrostatic endothelial sell transplantation within small-diameter (<6 mm) vascular prostheses: a prototype apparatus and procedure. // Cell Transplantation. 1997. - Vol.6, № 6 - P. 631-637.

40. Bowlin GJ, Rittgers SE, Milsted A, et al. In vitro evaluation of electrostatic endothelial sell transplantation onto 4 mm inferior diameter expanded polytetrafluoroethylene grafts. // J. Vase. Surg. 1998. - Vol.27. - P. 504-511.

41. Bowman PD, Betz AL, AR D. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. // In Vitro. 1981. - Vol. 17, № 4. - P. 353-362.

42. Bull HA, Pittilo RM, Drury J. Effects of autologous mesothelial cell seeding on prostacyclin production within Dacron arterial prostheses. // Br. J. Surg. 1988. -Vol. 75, № 7. - P. 671-674.

43. Buxton B., Lambert R.P., Ritt T.T. The significance of vein thickness and diameter in relation to the patency of femoro-popliteal saphenous vein bypass grafts. // Surgery. 1980. - V.87. - № 4. - P.425-431.

44. Campbell J, Lundgren C, Herring M. Attachment and retention of indium-111 labelled endothelial cells on to polyester elastomer. // J. Am. Soc. Artif. Int. Organs.-1985. Vol. 8. - P. 113-117.

45. Clagett GP, Burkel WE. Platelet reactivity in vivo in dogs with arterial prostheses seeded with endothelial cells. // Circulation. 1984. - Vol. 69, № 3 - P. 632-639.

46. Clarke JMF, Marston A. Seeding of arterial prostheses with living cells. // Eur. J. Vase. Surg. 1988. - Vol. 2, № 6. - P. 353-355.

47. DeBakey M.E. The development of vascular surgery. // Amer. J. Surg. -1979. V.137, № 6. - P. 697-738.

48. Deutsch M, Meinhart J, Fischlein T, Preiss P, Zilla P. Clinical autologous in vitro endothelialization of infrainguinal ePTFE grafts in 100 patients: a 9-year experience. // Surgery. 1999. - Vol.126. - P. 847-855.

49. Deutsch M, Meinhart J, Vesely M, Groscurth P, Von Oppell U, Zilla P. In vitro endothelialization of ePTFE grafts: A clinical case report after 41 months of implantation. // J. Vase. Surg. 1997. - Vol. 25. - P. 757-763.

50. Echave V, Koornick AR, Haimov M, Jacobson JH II. Intimal hyperplasia as a complication of the use of the polytetrafluoroethylene graft for femoral-popliteal bypass. // Surgery. 1979. - Vol. 86. - P. 791-798.

51. Emerick S, Herring MB. Leucocyte depletion enhances cultured endothelial retention on vascular prostheses. // J. Vase. Surg. 1987. - Vol. 5, № 2. -P. 342-347.

52. Falk J, Townsend LE, Vogel LM. Improved adherence of genetically modified endothelial cells to small-diameter expanded polytetrafluoroethylene grafts in a canine model. // J. Vase. Surg. 1998. - Vol. 27, № 5. - P. 902-908.

53. Fasol R, Zilla P, Deutsch M. Human endothelial cell seeding: evaluation of its effectiveness by platelet parameters after one year. // J. Vase. Surg. -1989. Vol. 9, № 3. - P. 432-436.

54. Fasol R, Zilla P, Groscurth P, et al. Experimental in vitro cultivation of human endothelial cells on artificial surfaces. // Trans. Am. Soc. Artif. Int. Org. -1985. Vol. 31. - P. 276-283.

55. Fasol R, Zilla P. Allogenic, multidonor in vitro endothelialization of small diameter PTFE grafts in baboons. // Vase. Surg. 1991. - Vol. 25. - P. 64-71.

56. Folkman J, Handenschild CC, Zetter BR. Long-term culture of capillary endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. - Vol. 76, № 10. - P. 5217-5221.

57. Gallop PM, Seifter S. Preparation and properties of soluble collagen. // Methods in Enzymology. 1963. - Vol. 6. - P. 635- 641.

58. Gimbrone MA, Cotran RS, Folkman J. Human vascular endothelial cells in culture. // The Journal of Cell Biology. 1974. -Vol. 60. - P. 673-684.

59. Graham LM, Vinter DW, Ford JW et al. Cultured autologous endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts. // Surg. Forum. 1979. - Vol. 30. -P.204-206.

60. Graham LM, Burkel WE, Ford JW. Expanded polytetrafluoroethylene vascular prostheses seeded with enzymatically derived and cultured endothelial cells. // Surgery. 1982. - Vol. 91, № 5. - P. 550-558.

61. Harris R, ed. Electron microscopy in biology: A practical approach. Oxford. - 1991. - P. 203.

62. Hartree E.F. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. // Analytical Biochemistry. -1972.-Vol. 48.-P. 422-427.

63. Hasenkam JM. Jensen BF. Mortensen AR. European standards for cardiovascular implants. [Danish] // Ugeskrift for Laeger. 1997. - V. 159.-P.4497-4501.

64. Hasson Je, Wiebe DH, Sharefkin JB, et al. Migration of adult vascular human endothelial cells: effect of extracellular matrix proteins. // Surgery. -1986.-Vol. 100. P.384-390.

65. Haus S.S. Late complication of autogenous vein and dacron graft anastomosis in renal and lower extremity reconstruction. // Vase. Surg. 1989. - V. 23, № 4. - P.249-253.

66. Herring MB, Gardner A, Glover JL. A single-staged technique for seeding vascular grafts with autogenous endothelium. // Surgery. 1978. - Vol. 84, № 4. - P. 498-504.

67. Herring MB, Dilley R. Graft material, length and diameter determine the patency of small arterial prostheses in dogs. // J. Surg. Res. 1982. - Vol. 32, №2.-P. 138-142.

68. Herring MB, Dilley R, Cullison T, et al. Seeding endothelium on canine arterial prostheses the size of the inoculum. // J. Surg. Res. - 1980. - Vol. 28. -P. 35-38.

69. Herring M, Hubbard A. Endothelium-lined small artery prosthesis a preliminary report. // J. Am. Soc. Artif. Int. Organs. - 1983. - Vol. 6. - P. 93-102.

70. Herring MB, Baughman S, Glover JL. Endothelial seeding of Dacron and polytetrafluoroethylene grafts: the cellular events of healing. // Surgery. -1984. Vol. 96, № 4. - P. 745-754.

71. Herring MB, Gardner A, Glover JL. Seeding human arterial prostheses with mechanically derived endothelium: the detrimental effect of smoking. // J. Vase. Surg. 1984. - Vol. 1, № 2. - P. 279-288.

72. Herring MB, Baughman S, Glover JL. Endothelium develops on seeded arterial prostheses: a brief clinical report. // J. Vase. Surg. 1985. - Vol. 2, № 5. - P. 727-730.

73. Herring MB, Smith J. Endothelial seeding of polytetrafluoroethylene femoral popliteal bypasses: the failure of low-density seeding to improve patency. // J. Vase. Surg. 1994. - Vol. 20. - P. 650-655.

74. Hughes SE. Functional characterization of the spontaneously transformed human umbilical vein endothelial cell line ECV-304: use in an in vitro model of angiogenesis. // Experimental Cell Research. 1996. - Vol. 225. - P. 171185.

75. Huszar G, Maiocco J, Naftolin F. Monitoring of collagen and collagen fragments in chromatography of protein mixtures. // Analytical Biochemistry. 1980. - Vol. 105. - P. 424-429.

76. Imparato AM, Bracco A, Kim GE, Zeff R. Intimal and neointimal fibrous proliferation causing failure of arterial reconstructions. // Surgery. 1972. -Vol. 72.-P. 1007-1017.

77. Jackson CJ, Garbett PK. Binding of human endothelium to Ulex eu-ropaeus-1-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. // J. Cell. Sei. 1990. - Vol. 96, № 2. - P. 257-262.

78. Jaffe E, Nachman RL, Becker CG, Minick R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. // J. Clin. Invest. 1973. - Vol. 52. - P. 2745-2756.

79. Jarrell BE, Levine E, Shapiro S. Human adult endothelial cell growth in culture. // J. Vase. Surg. 1984. - Vol. 1, № 6. - P. 757-764.

80. Jensen N, Lindblad B, Bergqkvist D. Endothelial cell seeded dacron aor-tobifucated grafts; platelet deposition and long-term follow-up. // J. Cardio-vasc. Surg. 1994. - Vol. 35. - P.425-429.

81. Kadletz M, Moser R. In vitro lining of fibronectin coated PTFE grafts with cryopreserved saphenous vein endothelial cells. // Thorac. Cardiovasc. Surg. -1987.-Vol. 35.-P. 143-147.

82. Kaehler J, Zilla P. Precoating substrate and surface configuration determine adherence and spreading of seeded endothelial cells on PTFE grafts. // J. Vase. Surg. -1989. Vol. 9, № 4. - P. 535-541.

83. Kempczinski RF, Rosenman JE, Pearce WH, Roedersheimer LR, Ber-latzky Y, Ramalanjaona GR. Endothelial cell seeding of a new PTFE vascular prosthesis. // J. Vase. Surg. 1985. - Vol. 2. - P. 424-429.

84. Kent KC, Oshima A. An in vitro model for human endothelial cell seeding of a small diameter vascular graft. // Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs. -1988. Vol. 34, № 3. - P. 578-580.

85. Kern PA, Knedler A, Eckel RH. Isolation and culture of microvascular endothelium from human adipose tissue. // J. Clin. Invest. 1983. -Vol. 71, № 6.-P. 1822-1829.

86. Kesler KA, Herring MB. Enhanced strength of endothelial attachment on polyester elastomer and PTFE graft surfaces with fibronectin substrate. // J. Vase. Surg. 1986. Vol. 3, № 1. - P. 58-64.

87. Leseche G, Ohan J. Above knee femoropopliteal bypass grafting using endothelial cell seeded PTFE grafts; five-year clinical experience. // Ann. Vase. Surg. - 1995. - Vol. 9. - P. 15- 23.

88. Leseche L, Bikfalvi A. Prelining of PTFE grafts with cultured human endothelial cells isolated from varicose veins. // Surgery. 1989. - Vol. 105, № 1.-P. 36-45.

89. Libby P, Birinyi KL. The dynamic nature of vascular endothelial functions. // In: Zilla P, Fasol R, Deutsch M, eds. Endothelialization of vascular grafts; Karger: Basel. 1987. - P. 80-99.

90. Libby P, Birinyi LK, Callow AD. In: Herring MB, Glover JL, eds. Endothelial Seeding in Vascular Surgery. // Grune & Stratton, Inc.-1987.

91. Lindblad B, Wright SW. Alternative techniques of seeding cultured endothelial cells to ePTFE grafts of different diameters, porosities and surfaces. // J. Biomed. Mater. Res. 1987. - Vol. 21. - P. 1013-1022.

92. Lo Gerfo FW, Quist WC, Nowak MD, et al. Downstream anastomotic hyperplasia: a mechanism of failure in Dacron arterial grafts. // Ann. Surg. -1983.-Vol. 197.-P. 479-483.

93. Maciag T., Cerudolo J., Ilsley S., Kelley P.R., Forand R. An endothelial cell growth factor from bovine hypothalamus: Identifications and partial characterization. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. - Vol. 76. - № 11. - P. 5674-5678.

94. Malone JM, Moore WS. Bacteremic infectability of vascular grafts: the influence of pseudointimal integrity and duration of graft function. // Surgery. 1975. - Vol. 78, № 2. - P. 211-216.

95. Mansfield PB. Tissue cultured endothelium for vascular prosthetic devices. // Rev. Surg. 1970. - Vol. 2. - P. 291-293.

96. Martakoski P., Karwoski T. Healing characteristics of hybrid and conventional polytetrafluoroethylene vascular grafts. // ASAIO Journal. 1995. -V. 41,№3.-P.735-741.

97. Meinhart J, Deutsch M, Zilla P. Eight years of clinical endothelial cell transplantation. Closing the gap between prosthetic grafts and vein grafts. // ASAIO J. 1997. - Vol. 45. - P. M515-521.

98. Muller-Glauser W, Bay W, Lehnman KH. An improved procedure for enzymatic harvesting of highly purified canine venous endothelial cells for experimental small diameter vascular prostheses. // Ann. Vase. Surg. 1989. -Vol.3, №2.- P. 134-139.

99. Nicholson LJ, Clarke JM. The mesothelial cell as a non-thrombogenic flow surface. // Thromb. Haemost. 1984. - Vol. 52, № 2. - P. 102-104.

100. Nunez G, Ball JrE, Stastny P. Accessory cell function of human endothelial cells. A subpopulation of IA positive cells is required for antigen presentation. //J. Immunol. 1983. - Vol. 131. - P. 666-673.

101. Ortenwall P, Wadenvik H, Risberg B. Reduced platelet deposition on seeded versus unseeded segments of e PTFE grafts: clinical observations after a 6 month follow-up. // J. Vase. Surg. 1989. Vol. 10, № 4. - P. 374-380.

102. Ortenwall P, Wadenvik H. Endothelial cell seeding reduces throm-bogenicity of Dacron grafts in humans. // J. Vase. Surg. 1990. - Vol. 11, № 3.-P. 403-410.

103. Pasic M, Muller-Glauser W, Odermatt B, et al. Seeding with omental cells prevents late neointimal hyperplasia in small-diameter Dacron grafts. // Circulation. 1995. - Vol. 92. - P. 2605-2616.

104. Pearce WH, Rutherford RB, Whitehill TA. Successful endothelial cell seeding with omentally derived microvascular endothelial cells. // J. Vase. Surg. 1987. - Vol. 5, № 1. - P. 203-206.

105. Pennell RC, Hollier LH, Solis E, et al. Xenograft seeding of Dacron grafts in dogs. // J. Surg. Res. 1986. - Vol. 40. - P.332-339.

106. Pober JS, Collins T, Gimbrone MA. Lymphocytes recognize human vascular endothelial and dermal fibroblast IA antigens induced by recombinant immune interferon // Nature. 1983. - Vol. 305. - P. 726-730.

107. Prendiville EJ, Coleman JE. Increased in vitro incubation time of endothelial cells on fibronectin treated ePTFE increased cell retention in blood flow. //Eur. J. Vase. Surg. - 1991. - Vol. 5, № 6. - P. 311-319.

108. Quinones-Baldrich WJ, Alfredo AP, Ahn SS, et al. Long-term results of infrainguinal revascularization with polytetrafluoroethylene: a ten-year experience. // J. Vase. Surg. 1992. - Vol. 16. - P. 209-217.

109. Radomski JS, Jarrell BE. Initial adherence of human capillary endothelial cells to Dacron. // J. Surg. Res. 1987. - Vol. 42, № 2. - P. 133-140.

110. Ramalanjaona GR, Kempczinski RR The effect of fibronectin coating on endothelial cell kinetics in PTFE grafts. // J. Vase. Surg. 1986. - Vol. 3, № 2.- P. 264-270.

111. Ramalanjaona GR, Kempczinski RF. Fibronectin coating of experimental PTFE vascular prostheses. // J. Surg. Res. 1986. - Vol. 41, № 5. - P. 479483.

112. Rausis C., Erasmi H., Gremion G., Horsh S. Gefassersantz bei kleinuali-brigen arterien.Eine neue nollagenprothese (Solcograft P). // Helv. Chir. Acta.- 1983. V. 50, № 4. - P. 407-412.

113. Rosenman JE, Pearce WH, Kempczinski RF. Bacterial adherence to vascular grafts after in vitro bacteremia. // J. Surg. Res. 1985. - Vol. 38. - P. 648-55.

114. Rosenman JF, Kempczinski RF. Kinetics of endothelial cell seeding. // J. Vase. Surg. 1985. - Vol.2, № 6. - P. 778-784.

115. Rutherford RM, Nishikimi N. Graft thrombosis and thromboembolic complications. // Rutherford RB, ed. Vascular Surgery. 3rd edition. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co. 1989. - P. 501-510.

116. Sauvage LR, Berger KE, Beilin LB. Presence of endothelium in an axillary femoral graft of knitted Dacron with an external velour surface. // Ann. Surg. 1975. - Vol. 182, № 6. - P. 749-753.

117. Schneider PA, Hanson SR, Price TM. Durability of confluent endothelial cell monolayers on small-caliber vascular prostheses in vitro. // Surgery. -1988. Vol. 103, № 4. - P. 456-462.

118. Schneider PA, Hanson SR. Preformed confluent endothelial cell monolayers prevent early platelet deposition on vascular prostheses. // J. Vase. Surg. 1988. - Vol. 8, № 3. - P. 229-235.

119. Seeger JM, Klingman N. Improved endothelial cell seeding with cultured cells and fibronectin-coated grafts. // J. Surg. Res. 1985. - Vol. 38, № 6. - P. 641-647.

120. Selman SH, Rhodes RS, Anderson JM, et al. Atheromatous changes in expanded polytetrafluoroethylene grafts. // Surgery. 1980. - Vol. 87. - P. 630-637.

121. Sharefkin JB, Latker CH. Seeding of Dacron vascular prostheses with endothelium of aortic origin. // J. Surg. Res. 1983. - Vol. 34, № 1. - P. 33-43.

122. Sharefkin JB, Latker CH. Endothelial cell labelling in indium 111-oxine as a marker of cell attachment to bioprostheses. // J. Biomed. Mater. Res. -1983.-Vol.17.-P. 345-357.

123. Sharefkin JB, Latker CH, Smith M, et al. Early normalization of platelet survival by endothelial cell seeding of Dacron arterial prostheses in dogs. // Surgery. -1982. Vol. 92. - P. 385-393.

124. Sharp WV, Schmidt SP, Donovan DL. Prostaglandin biochemistry of seeded endothelial cells on Dacron prostheses. // J. Vase. Surg. 1986. - Vol. 3, № 2. - P. 256-263.

125. Shepard AD, Gelfand JA, Callow AD, et al. Complement activation by synthetic vascular prostheses. // J. Vase. Surg. 1984. - Vol. 1, № 6. - P. 829838.

126. Shepard AD, Eldrup-Jorgensen J. Endothelial cell seeding of small-caliber synthetic grafts in the baboon. // Surgery. 1986. - Vol. 99, № 3. - P. 318-326.

127. Shindo S, Taitagi A, W^hittemore AD. Improved patency of collagen -impregnated grafts after in vitro autogenous endothelial cell seeding. // J. Vase. Surg. 1987. - Vol. 6, № 4. - P. 325-332.

128. Sicard GA, Allen BT. Prostaglandin production and platelet reactivity of small diameter grafts. // J. Vase. Surg. 1984. Vol. 1, № 6. - P. 774-781.

129. Sobinsky KR, Flanagan P. Glycosaminoglycan-keratin coating enhances endothelial cell growth rate on seeded vascular prostheses. // Surg. Forum. -1984.-Vol. 35.-P. 435-436.

130. Stanley JC, Burkel WE, Ford JW, et al. Enhanced patency of small-diameter, externally supported Dacron iliofemoral grafts seeded with endothelial cells. // Surgery. 1982. - Vol. 92, № 6. - P. 994-1005.

131. Sterpett AV, Schultz RD. Comparison of two techniques to isolate microvascular endothelial cells from the omentum. // J. Surg. Res. 1990. - Vol. 48, №2.-P. 101-106.

132. Suma H., Wanibuchi Y., Terada Y., Fukuda S., Tsutomu S., Isshini T., Yamaguchi T. Bovine internal thoracic artery graft. Successful use at urgent coronary bypass surgery. // J.Cardiovasc. Surg. 1991. - Vol. 32, № 2. -P.268-270.

133. Szilagyi DE, Smith RF, Elliot JP, Allen HM. Long-term behaviour of a Dacron arterial substitute: clinical, roentgenologic and histologic correlations. // Ann. Surg. 1965. - Vol. 162. - P. 453-477.

134. Takahashi K, Sawasaki Y. Rare spontaneously transformed human endothelial cell line provides useful research tool. // In Vitro Cell. Dev. Biol. -1992. Vol. 28A. - P. 380-382.

135. Takahashi K, Sawasaki Y, Hata JI, et al. Spontaneous transformation and immortalization of human endothelial cells. // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1990. - Vol. 26. - P. 265-274.

136. Tannenbaum G, Ahlborn T. High density seeding to rapid coverage of PTFE grafts. // Curr. Surg. 1987. - Vol. 4. - P. 318-321.

137. Thomson GJL. A cellular lining for ePTFE grafts: studies using adult human endothelial and mesothelial cells. // M.D.Thesis, University of Glasgow. 1989.

138. Tiwari A, Salacinski HJ, Hamilton G, et al. Tissue engineering of vascular bypass grafts: role of endothelial cell extraction. // Eur J. Vase. Endovasc. Surg. 2001. - Vol.21, №3. - P. 193-201.

139. Van Wachem PB, Beugeling T, Feijen J, et al. Interaction of cultured human endothelial cells with polymeric surfaces of different wettabilities. // Biomaterials. 1985. - Vol. 6. - P. 403-408.

140. Van Wachem PB, Mallens BW, Dekker A, et al. Adsorption of fi-bronectin derived from serum and from human endothelial cells on to tissue culture polystyrene. // J. Biomed. Mater. Res. 1987. - Vol. 21. - P. 13171327.

141. Visser MJT, Van Bockel H. Cells derived from omental fat tissue and used for seeding vascular prostheses are not endothelial in origin. // J. Vase. Surg. 1991. - Vol.13, № 3. - P. 373-381.

142. Vo NM, Arbogast LH, Mashburn R. Origin of seeded endothelial cells. // Vase. Surg. 1989. - May/June. - P. 183-187.

143. Vohra RK, Thomson GJL. Effects of shear stress on endothelial cell monolayers on expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) grafts using preclot and fibronectin matrices. // Eur. J.Vase. Surg. 1990. - Vol. 4, № 2. - P. 3341.

144. Wang ZG. Seeding of autologous endothelial cells to inner surfaces of small caliber Dacron vascular prostheses: an experimental study on canines. // Chin. Med. J. (Engl.). 1989. - Vol. 102, № 8. - P. 606-613.

145. Warren JB. Large vessel endothelial isolation. // The Endothelium: An Introduction to Current Research. Wiley-Liss, inc. - 1990. - P. 263-272.170i

146. Watkins MT, Sharefkin JB. Adult human saphenous vein endothelial cells: assessment of their reproductive capacity for use in endothelial seeding of vascular prostheses. // J. Surg. Res. 1984. - Vol. 36, № 6. - P. 588-596.

147. Williams SK, Jarrell BE. Human microvessel endothelial cell isolation and vascular graft sodding in the operating room. // Ann. Vase. Surg. 1989. -Vol.3, №2.-P. 146-152.

148. Williams SK. Human clinical trials of microvascular endothelial cell sodding // Zilla P, Greisler HP, eds. Tissue engineering of vascular prosthetic grafts. Texas: R.G. Landes Company. - 1999. - P. 143-147.

149. Whitehouse WM, Wakefield TW. Indium Ill-labelled platelet imaging of endothelial seeded Dacron thoracoabdominal vascular prostheses in a canine model. // Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs. 1983. - Vol. 29. - P. 183187.

150. Zamora JL, Navarro LT, Ives CL, et al. Seeding of arteriovenous prostheses with homologous endothelium. // J. Vase. Surg. 1986. - Vol. 3. - P. 860-866.

151. Zilla P, Fasol R. In situ cannulation, microgrid follow-up and low-density planting provide first passage endothelial cell mass cultures for in vitro lining. // J. Vase. Surg. 1990. - Vol. 12, № 2. - P. 180-189.

152. Zilla P, Fasol R, Preiss P, Kadletz M, et al. Use of fibrin glue as a substrate for in vitro endothelialization of PTFE vascular grafts. // Surgery. -1989.-Vol. 105.-P. 515-522.

153. Zilla P, Siedler S, Fasol R, Sharefkin JB. Reduced reproductive capacity of freshly harvested endothelial cells in smokers: a possible shortcoming in the success of seeding? // J. Vase. Surg. 1989. - Vol. 10, № 2. - P. 143-148.

154. Zilla P, Deutsch M, Meinhart J et al. Clinical in vitro endothelialization of femoropopliteal bypass grafts: An actual follow-up over three years. // J. Vase. Surg. 1994. - Vol. 19. - P.540-548.