Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат биологических наук Потапова, Надежда Ивановна

• Потапова, Надежда Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Потапова, Надежда Ивановна

ВВЕДЕНИЕ 5 I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Туберкулез - одна из основных проблем современной медицины

1.2. Клинические признаки туберкулеза

1.3. Характеристика возбудителя туберкулеза

1.4. Характеристика генома микобактерии туберкулеза

1.5. Диагностика туберкулеза

1.5.1 Полимеразная цепная реакция (ПНР)

1.5.2 Теоретические основы метода ПЦР

1.5.3 Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний

1.5.4 Ограничения метода ПЦР

1.5.5 Выделение ДНК из образцов

1.5.6 ПЦР в реальном времени

1.5.7 Генодиагностика туберкулеза

1.5.8 Стандартизация метода ПЦР

1.6. Основные проблемы, связанные с лечением туберкулеза

1.7. Резистентность к лекарственным препаратам

1.8. Профилактика туберкулеза

1.8.1. Неспецифическая профилактиака

1.8.2. Специфическая профилактика

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза»

Ежегодно в мире от туберкулеза умирают около 2 млн человек, а в развивающихся странах один из пяти случаев смерти связан с туберкулезом. Это больше, чем от СПИДа, малярии и всех тропических болезней вместе взятых [55].

Быстрое распространение туберкулеза, появление мультирезистентных форм, увеличение количества случаев заражения одновременно бактериями М. tuberculosis и вирусом иммунодефицита требуют применения экспресс-методов диагностики и эффективных методов противотуберкулезной терапии [139].

Использующиеся в настоящее время методы прямого обнаружения микобактерий в клиническом материале с применением микроскопии по Цилю-Нильсену и культурального метода, являются классическими и признаются «золотым стандартом» диагностики туберкулеза [55]. Специфичность микроскопии составляет 89-100%, но метод не позволяет отличить туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных. [139, 116, 88]. Диагностика с использованием культурального метода требует нескольких месяцев. Несмотря на длительное использование этих методов, споры по поводу чувствительности и правильности интерпретации результатов продолжаются [180].

В последние десятилетия развитие молекулярной биологии способствовало появлению новых экспресс-методов лабораторной диагностики туберкулеза. Среди них значительное место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода - ПЦР в реальном времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и классическими методами (микроскопией и культуральным методом) и позволяет получать результаты в течение нескольких часов. Кроме того, ПЦР в реальном времени позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ, а также упрощает разработку мультиплексных тестов.

На фармацевтическом рынке представлено очень незначительное количество тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза. Большая часть из них предназначена для обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и не позволяет дифференцировать микобактерии, выявлять их жизнеспособность, проводить количественный анализ и ускоренную диагностику с применением мультиплексных реакций.

Проблема туберкулеза усугубляется сложностью лечения мультирезистентных форм [177]. Исследования в области мультирезистентности к противотуберкулезным препаратам состредоточены на изучении взаимодействия микобактерии с лекарственным препаратом [184]. Однако в настоящее время нет исследований в области реакции клеток организма человека на воздействие противотуберкулезных препаратов.

Несмотря на широкое распространение метода ПЦР, в действующей ГФ отсутствуют как общая фармакопейная статья, так и статьи по применению конкретных тест-систем на основе ПЦР [9], например, для выявления и дифференцирования различных типов бактерий туберкулеза. Длительность сертификации, отсутствие или недоступность нормативной документации ограничивает распространение тест-систем на основе ПЦР, которые, в свою очередь, должны способствовать совершенствованию методов лечения и их стандартизации.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация тест-систем для диагностики туберкулеза на основе новой модификации ПЦР -метода ПЦР в реальном времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

2. Оптимизировать условия проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis;

3. Разработать тест-систему для количественного определения М. tuberculosis',

4. Оптимизировать условия для выявления жизнеспособности М. tuberculosis',

5. Провести исследование возможности применения разработанных тест-систем при использовании культурального материала и клинического материала от больных туберкулезом.

6. Исследовать экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом.

7. Разработать проекты ФСП, СТО и инструкцию по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

Научная новизна

Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая идентифицировать М. tuberculosis и М. bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Показано, что экспрессность реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР с сохранением одинаковой чувствительности.

Оптимизированы условия для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющей идентифицировать М. tuberculosis и М. bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Тест-система характеризуется более высокой экспрессностью в сравнении с обычной ПЦР в реальном времени.

Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени для количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце.

Впервые разработана отечественная тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для дифференцирования жизнеспособных и нежизнеспособных микобактерий. В основе разработанной тест-системы лежит обнаружение мРНК М. tuberculosis.

Сравнительные результаты использования тест-системы для обнаружения мРНК М. tuberculosis и культурального метода свидетельствуют о возможности использования разработанного теста для быстрого дифференцирования живых и неживых микобактерий, а также дормантных форм.

Экспериментальное использование разработанных тест-систем показало возможность их применения при работе как с культуральным материалом, так и с клиническим материалом от больных.

Впервые обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что открывает широкие перспективы продолжения исследований причин резистентности к лекарственным препаратам у больных туберкулезом.

Практическая значимость работы

Разработанные в ходе проведения исследовательской деятельности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР в реальном времени могут быть использованы в диагностических лабораториях для дифференциальной экспресс-диагностики М. tuberculosis и М. bovis.

Тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis применима для дифференцирования живых, неживых и дормантных форм М. tuberculosis, что важно для контроля эффективности лечения заболевания.

Разработанная тест-система для количественного анализа М. tuberculosis может быть использована для оценки эффективности лечения туберкулеза существующими лекарственными препаратами и прогнозировать эффективность новых лекарственных средств.

Обнаружение гена мультирезистентности у больных туберкулезом и проведение дополнительных исследований открывает перспективы выявления дополнительных причин лекарственной устойчивости и корректировки схем лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Возможность идентификации М. tuberculosis и M.bovis и дифференцирования их между собой и с другими микобактериями с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности реакции в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности.

2. Одновременное обнаружение и дифференцирование в одной пробирке М. tuberculosis и М. bovis с использованием разработанной тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности теста в сравнении с ПЦР в реальном времени.

3. Возможность количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце с применением разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

4. Возможность быстрого дифференцирования живых, неживых и дормантных форм микобактерий с использованием тест-системы на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis.

5. Возможность применения разработанных тест-систем на основе ПЦР в реальном времени при работе с культуральным материалом и клиническим материалом от больных.

6. Обнаружение экспрессии гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом и необходимость продолжения исследований резистентности к противотуберкулезным препаратам.

7. Проекты ФСП, СТО и инструкции по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и M.bovis.

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Потапова, Надежда Ивановна

V. выводы

1. Получены актуальные результаты по стандартизации диагностики туберкулеза с использованием ПЦР в реальном времени. Разработаны проекты ФСП, СТО и инструкция по применению для тест-системы для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

2. Разработан способ, позволяющий идентифицировать и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями с использованием теста на основе ПЦР в реальном времени; экспрессность проведения реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности (10"15 г ДНК).

3. Оптимизированы условия для одновременного выявления М. tuberculosis и М. bovis и дифференцирования их между собой и с другими микобактериями в одной пробирке с использованием мультиплексной ПЦР в реальном времени; экспрессность теста повышена в сравнении с ПЦР в реальном времени на 20% и более, в зависимости от количества исследуемых образцов.

4. Установлено, что тест-система на основе ПЦР в реальном времени для количественного анализа применима для оценки содержания ДНК M.tuberculosis в образцах.

5. Выявлено, что тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis применима для быстрого дифференцирования живых, неживых и дормантных форм микобактерий.

6. Установлено, что применение разработанных тест-систем на основе ПЦР в реальном времени возможно при работе с культуральным материалом и биологическими образцами.

7. Обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что свидетельствует о необходимости применения лекарственных препаратов; подавляющих экспрессию этого гена для повышения эффективности противотуберкулезной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследований разработаны тест-системы, основанные на современной модификации ПЦР в реальном времени. Тесты позволяют выявлять и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis, производить количественную оценку генетического материала в образце, дифференцировать живые, неживые и дормантные формы микобактерий М. tuberculosis. Мы попытались найти взаимосвязь между экспрессией гена мультирезистентности и туберкулезом, трудно поддающимся лечению. В работе продемонстрировано использование разработанных тестов в группах больных туберкулезом. Сравнительный анализ результатов ПЦР в реальном времени с «гнездовой» ПЦР, а также классическими тестами (микроскопией и культуральным методом) показал возможность применения разработанных тестов на практике, а обнаружение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости в группе больных теберкулезом, длительно получающих противотуберкулезную терапию, показал необходимость широкомасштабных исследований в этой области.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Потапова, Надежда Ивановна, 2006 год

1. Балышев А.В., Плетенева Т.В., Гребенникова Т.В., Каприльянц А.С.,

2. Сыроешкин А.В. К вопросу о разработке нового противотуберкулезного2+

3. Zn -содержащего препарата //Вестник ОГУ («Приложение «Биоэлементология»). -2004. -№4 (29). -С. 13-14.

4. Бардисявичене И., Сосновская А. Сравнительная эффективность ВАСТЕС 460 ТВ и ИФА в диагностике туберкулеза легких //В сб.: Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза. Материалы научно-практической конференции. Обнинск, 1996.-С.35.

5. Белкин А. Д. Новые звенья в патогенезе хронических инфекций //Врач. -1997.- №7.-С.-40-42.

6. Борисов С.Е., Соколова Г.Б. Этиотропное лечение туберкулеза при лекарственной устойчивости М. tuberculosis взгляды и рекомендации международных организаций //Consilium medicum. -2001. -Т.З. -№12. -С.1-18.

7. Браженко Н.А. Составные элементы современной профилактики туберкулеза //Большой целевой журнал о туберкулезе. -1999 -№4. -С. 2127.

8. Всемирная организация здравоохранения. Лечение туберкулеза. Рекомендации для национальных программ. -ВОЗ, Женева, 1998. -77с.

9. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 е., ил.

10. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа /МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 е., ил.

11. Ю.Гребенникова Т.В., Грабовецкий И.И., Шумский Н.И., Кальнов C.JL, Непоклонов Е.А. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции//Ветеринария. -1999. -№3. -С. 17-20.

12. П.Гребенникова Т.В. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний /Методические указания для студентов медицинского факультета РУДН.-М.-2005.-40с.

13. Земская, 3. С., Дорожков? И. Р. Скрыто протекающая туберкулезная инфекция /З.С. Земская, И.Р. Дорожкова. М.: Медицина, 1984. - 83 с.

14. Интенсивное комбинированное лечение туберкулеза (Записки практика) Издание III, дополненное и исправленное. Медпрактика, 96 е., 2001.

15. Козулицына Т.И. Микробиологические исследования./ В руководстве для врачей: Туберкулез органов дыхания. М.,1981.- с.136-149.

16. Мишин В.Ю. Современная стратегия лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких. //Лечащий врач. 2000. - № 3. - С.4-9.

17. Рекомендации по лечению резистентных форм туберкулеза.- ВОЗ -Женева, 1998.- Пер. с англ. 47.

18. Мишин В.Ю., Степанян И.Э. Контролируемая химиотерапии туберкулеза органов дыхания в современных условиях. Проблема лекарственной устойчивости. //Русский медицинский журнал. -2000. -№12. -С. 469-500.

19. Сазыкин Ю.О., Швец А.В., Иванов В.П. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий //Антибиотики и химиотерапия. -1999. -№9.-С.З-6.

20. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток //Биохимия. -2000. -Т.65. -вып.1. -С.112-126.

21. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р.Блума.- М.: Медицина, 2002.- 696 е.: ил.

22. Туберкулез. Руководство для врачей /Под ред. А.Г. Хоменко. -М.: Медицина, 1996.-496 с.

23. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В., Березинская Т.Л., Сыроешкин А.В., Бикетов С.Ф., Капрельянц А. С. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление //Микробиология. -2003. -Т.72. -с.76-83.

24. Abu-Amero К.К., Halablab М.А. Evaluation of the COBAS AMPLICOR MTB test for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex //East Mediterr Health J. -2004. -№10(3). -P.329-335.

25. Alfonso R., Romero R.E., Patarroyo M.E., Murillo L.A. Mtp-40 and alpha antigen gene fragment amplification for the detection of Mycobacterium tuberculosis in Colombian clinical specimens //Mem Inst Oswaldo Cruz. -1999. -№97(8).-P.l 157-1163/

26. Alvarez S., McCabe W.R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review ofexperience at Boston City and other hospitals //Medicine. -1984. -№63.-P.25-55.

27. An Q., Buxton D., Hendricks A., Robinson L., Shah J., Lu L., Vera-Garcia M., King W., Olive D.M. Comparison of amplified Q beta replicase and PCRassays for detection of Mycobacterium tuberculosis //J Clin Microbiol. -1995. -№33(4). -860-8677.

28. Andersen P., Doherty Т. M. The success and failure of BCG implifications for a novel tuberculosis vaccine //Nature Reviews. Microbiology. -2005.- Vol.3. -P.657-652.

29. Anon. Fifteen year follow up of trial of BCG vaccines in south India for tuberculosis prevention //Indian J. Med. Res. -1999. -№110.-P.56-69.

30. Anon. Global Tuberculosis control //World Health Organization (WHO) report. P.l81

31. Armstrong J.A., Hart P.D. Response of cultured macrophages to Mycobacterium tuberculosis, with observations on fusion of lysosomes with phagosomes //J. Exp. Med. 1971. -№1134.-P.713-740.

32. Balamurugan R, Vencataraman S., John K.R., Ramakrishna B.S. PCR amplification of the insertion elements of Mycobacterium tuberculosis in fecal samples from patients with intestinal tuberculosis //J Clin Microbiol. -2006. -№44(5). -p. 1884-1886.

33. Вагпит H. N., Tarantola, Setaidy I. F. Cost-effectiveness of an immunization programme in Indonesia//Bull. W.H. O. 1980. №58.-P.499-503.

34. Baylan O. Culture based diagnostic methods for tuberculosis. //Microbiyol Bui. 2005.- №39(1).-P.107-124.

35. Berger H.W., MejiaE. Tuberculous pleurisy//Chest. -1973. -№63.-P.88-92.

36. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry. 1999. - № 273.-P.221-228.

37. Berney S., Goldstein M., Bishko F. Clinical and diagnostic features of tuberculous arthritis //Am. J. Med. 1972. - №53.-P.36-42.

38. Beveridge, T.J., Murray R. G. E. Sites of metal deposition in the cell wall of Bacillus subtilis //J. Bacteriol. 1980. - №141.P.876-887.

39. Brewer T.F., Heymann SJV To control and beyong: moving towords eliminating the global tuberculosis treat //J Epidemiol Community Health.2004. №58.-P. 822-825.

40. Brodie D., Schluger N. W. The diagnosis of tuberculosis //Clin Chest Med.2005. №26(2).-P.247-271.

41. Butler W. R., Kilburn J. O. Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high-performance liquid chromatography of their mycolic acids //J. Clin. Microbiol. 1988. - №26.-P.50-53.

42. Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography //J. Clin. Microbiol. 1991. - №29.-P.2468-2472.

43. Cameron S. J. Tuberculosis and the blood //Tubercle. 1974. - №55.-P.55-72

44. Carr W.P., Kyle R.A., Bowie J.W. Hematologic changes in tuberculosis //Am. J. Med. 1964. - №248.-P.709-714.

45. Caws M, Wilson S. M, Clough C. Role of IS6110-targeted PCR, culture, biochemical, clinical, and immunological criteria for diagnosis of tuberculous meningitis //J Clinical Microbiol. 2000. - №38.-P.3150-3155.

46. Center for Disease Control and Prevention. Tuberculosis elimination revisited: obstacles, opportunities, and a renewed commitment //Advisory Council for Elimination of Tuberculosis (ACET). MMWR. 1999. - №48(RR-9).-P.l-13.

47. Chakhaiyar P., Hasnain S.E. Defining the mandate of tuberculosis research in post genomic era //Med Princ Prac. 2004. - №13.-P. 177-184.

48. Cheng V. C, Yew W. W., Yuen K. Y. Molecular diagnostics in tuberculosis //Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005. - №11.-P.711-720.

49. Chevrier D., Casademont I., Guesdon J.L., Cloning of a gene from Mycobacterium tuberculosis coding for a hypothetical 27 kDa protein and its use for the specific PCR identification of these mycobacteria //Mol Cell Probe. -2000.-№14.-P.241-248.

50. Christensen W. I. Genitourinary tuberculosis: review of 102 cases //Mediicine. 1974. - №53.-P.377-390.

51. Chua H.C. Use of ligase chain reaction in early diagnosis of tuberculosis meningitis //Ann Acad Med Singapore. 2005. - №34(2).-P. 149-53.

52. Cleary T.J., Roundel G., Casillas O., Miller N. Rapid and specific detection of Mycobacterium tuberculosis by using the Smart Cycler instrument and specific fluorogenic probe //J. Clin. Microbiol. 2003. - №41.-P.4783-4786.

53. Cole S.T., Brosh R., Parkhill J. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence //Nature. 1998. - №393. P.-537-544.

54. Colice G.L. Decision analysis, public health policy, and isoniasid chemoprophylaxis for young adult tuberculin skin reactors //Arch. Intern. Med.- 1990.-№150.-P.2517-2522.

55. Comstock G.W. Epidemiology of tuberculosis //Am. Rev. Respir. Dis. 1982.- №125.-P.8-16.

56. Corbett E.L., Watt C.J., Walker N., Maher D., Williams B.G., Raviglion M.C., Dye C. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic //Arch. Intern. Med. 2003. - №163.-P.-1009-10021.

57. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A., Nygren H., Ouchterlony O., Tarkowsky A.A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) essay for enumeration of specific antibody-secreting cells //J. Immunol. Methods. 1983. - №65.-P.109-121.

58. Davies J. Antibiotic resistance in mycobacteria //Novartis found symp. 1998.- №217.-P. 195-208.

59. Demkow U., Ziolkowski J., Filewska M., Bialas-Chromiec В., Zielonka Т.,

60. Michalowska-Mitczuk D., Ku.s J., Augustynowicz E., Zwolska Z., Skopinska

61. Rozewska E., Rowinska-Zakrzewska E. Diagnostic value of different serological tests for tuberculosis in Poland //J Physiol Pharmacol. -2004. -№55.-P.57-66.

62. Donald P.R., Schoeman J.F Tuberculous meningitis //N ENGL J MED. 2004.- №17.-P.1719-1722.

63. Drapper P. The walls of Mycobacterium leprae-murium: chemistry and ultrastructure //J. Gen. Microbiol. -1971. №69.-P.313-324.

64. Dyck V., Iemen V., Pattyn S., Damm V, Laga M. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by enzyme immunoassay, culture, and three nucleic acid amplification tests //J.Clin. Microbiol. -2001. -№39. -P.1751-1756.

65. Dye C., Dolin P., Pathania V., Raviglione M. For the WHO global surveillance and monitoring progect. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country //JAMA. 1999. - №282.-P.677-686.

66. Edwards, K., Logan, J., Saunders, N., 2004. Real-time PCR, An Essential Guide. //Horison Bioscence, Wymondham. 2004. P.346.

67. Ellner J.J. Pleural fluid and peripheral blood lymphocyte function in tuberculosis //Ann. Intern. Med. 1978. - №89.-P.932-933.

68. European Pharmacopoeia. Fourteenth Edition. Strasbourg. France. -2001. -2416 p.

69. Evans C.C. Historical background, in clinical tuberculosis (ed. Davies, P.D.O.) 1-19 (Chapman and Hall Medical, London, 1994).

70. Farer L.S., Lowell L.M., Meador M.P. Extrapulmonary tuberculosis in the United States //Am. J. Epidemiol. 1979. - №109.-P.205-217.

71. Fine P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity //Lancet. 1995. - №346.-P. 1339-1345.

72. Frehel C., Ryter A., Rastogy N., David H. Electron-transparent zone in phagocytosed Vycobacterium avium and other mycobacteria: formation, persistence and role in bacterial survival //Microbiol. -1986. -№137. -P.239-257.

73. Friden T.R, Sterling T.R, Munsiff S.S, Watt C.J, Dye C. Tuberculosis //Lancet. 2003. - №362.-P.887-899.

74. Frothingham R., Hills H.G., Wilson K.H. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex //J. Clin. Microbiol. 1994 - №32.-P. 1639-1643.

75. Gordin F, Slutkin G. The validity of acid-fast smears in the diagnosis of pulmonary tuberculosis //Arch Pathol Lab Med. 1990. - №114.-P.1025-1027.

76. Grebennicova T.V., Grabovetsky V.V., Kalnov S.L., Nepoklonov E.A. Differential diagnostics of mycobacteria by PCR in blood and tissues from animals. 1997, Conference, Madison, Wisconsin, USA, 27-31, July, P.72.

77. Grebennikova Т. V., Nepo^lonov E. A. //Detection and identification of Mycobacteria isolates from human clinical samples. -1999, 9th ECCMID. -March 21-24, Berlin, Germany, P. 204.

78. Grieco M.H., Chmel H. Acute disseminated tuberculosis as a diagnostic problem: a clinical study based on twenty-eight cases //Am. Rev. Respir. Dis. -1974. №109.-P.554-560.

79. Gruber F., Falkner F.G., Dcrner F., Hammerle T. Quantitation of viral DNA by real-time PCR applying duplex amplification, internal standardization, and two-color fluorescence detection. Appl Environ Microbiol. -2001 -№67(6). -P.2837-9.

80. Gupta S., Chatterji D. Stress responses in mycobacteria //IUBMB Life. -2005 -№57(3). -P.149-159.

81. Hammerschlag M.R. Nucleic acid amplification tests (polymerase chain reaction, ligase chain reaction) for the diagnosis of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in pediatric emergency medicine //Pediatr Emerg Care. -2005. -№21(10). -P.705.

82. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-P.986-994.

83. Heitmann A., Laue Т., Schottstedt V., Dotzauer A., Pichl L. Occurrence of hepatitis A virus genotype III in Germany requires the adaptation of commercially available diagnostic test systems //Transfusion. -2005. -№45(7). -P. 1097-1105.

84. Herrera E.F., Perez О., Segovia M. Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex-polymerase chain reaction //J Appl Bacteriol. 1996. - №80(6).-P.596-604.

85. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions//Biotechnology. 1993. - №11.-P.1026-1030.

86. Hines N., Payeur J.B., Hoffman L.J. Comparison of the recovery of Mycobacterium bovis isolates using the BACTEC MGIT 960 system, BACTEC 460 system, and Middlebrook 7H10 and 7H11 solid media //J Vet Diagn Invest. 2006. -№18(3). -P.-243-250.

87. Hirschfield G.R., McNeil M., Brennan P.J. Peptidoglycan-associated polypeptides of Mycobacterium tuberculosis //J. Bacteriol. 1990. - №172.-P.1005-1013.

88. Howell, W.M., Jobs, M., Brookes, A.J.iFREET:an improved fluorescence system for DNA-melting analisis. //Genome Res. 2002. -№12.-P.1401-1407.

89. Huitric E., Werngren J., Jureen P., Hoffner S. Resistance Levels and rpoB Gene Mutations among In Vitro-Selected Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Mutants //Antimicrob Agents Chemother. -2006. -№50(8). -P.2860-2862.

90. Hung, D.-K., Habbard W.W. Hyponatremia in untreated active pulmonary tuberculosis //Am. Rev. Respir. Dis. 1969. - №99.-P.595-597.

91. Huseby J.S., Hudson L. D. Miliary tuberculosis and the adult respiratory distress syndrome //Ann. Intern. Med. 1976. - №85.-P.609-611.

92. Jacobs M.R. Activity of quinolones against mycobacteria //Drugs. -1999. №58.-P.19-22.

93. Johansen I. S., Lundgren В., Tabak F., Petrini В., Hosoglu S., Saltoglu N., Thomsen V.O. Improved sensitivity of nucleic acid amplification for rapid diagnosis of tuberculosis meningitis //J Clin Microbiol. 2004. - №42(7).-P.3036-3040.

94. Kolk A.H., Кох L.F., I.eeuwen J., Kuijper S., Jansen H.M. Clinical utility of polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis //Eur Respir J. 1998. - №11.-P. 1222-1226.

95. Konya A., Andor A., Satorhelyi P., Nemeth K., Kurucz I. Inhibition of the MDR1 transporter by new phenothiazine derivatives //Biochemical and Biophysical research communications. -2006. -№30. -p.47-49.

96. Kopanoff D., Snider D., Caras G. Isoniasid-related hepatitis //Am. Rev. Respir. Dis. -1978. №117. - P.991-1001.

97. Lakshmi V, Patil MIA., Subhadha K., Himabindu V. Isolation of mycobacteria by BACTEC 460 ТВ system from clinical specimens //Indian J Med Microbiol.-2006. -№24(2).-P. 124-126.

98. Lanckriet C., Levy, B. D., Bingono E., Siopathis R. M., Gueerin N. Efficacy of BCG vaccination of the of the newborn: evaluation by a follow-up study of contacts in Banguil //Int. J. Epidemiol. 1995. - №24.-P. 1042-1049.

99. Lederer E., Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F., Wietzerbin J. Cell walls of mycobacteria and related organisms; chemistry and immunostimulant properties //Mol. Cell. Biochem. 1975. - №7.-P.87-104.

100. Lipsky B. A, Gates J;, Tenover F.C., Plorde J.J. Factors affecting the clinical value of microscopy for acid-fast bacilli //Rev Infect Dis. 1984. -№6.-P.-214-22.

101. Lu C.Z., Qiao J., Shen Т., Link H. Early diagnosis of tuberculosis meningitis by detection of anti-BCG secreting cells in cerebrospinal fluid //Lancet. 1990. - №336.-P.10-13.

102. McKenna SL., Padua RA. Multidrug resistance in leukaemia //Br. J. Haematol. -1997. -№96. -P.659-674.

103. Martins L. C., Paschoal I. A., von Nowakonski A., Silva S. A., Costa F.F., Ward L. S. Nested-PCR using MPB64 fragment improves the diagnosis of pleural and meningeal tuberculosis //Rev Soc Bras Med Trop. 2000. -№33.-P.253-257.

104. Massaro D., Katz S., Sachs M. Choroidal tubercles: a clue to hematogenous tuberculosis //Ann. Intern. Med. 1964. - №60.-P.-231-241.

105. McClatchy J. K., Waggoner R. F., Kanes W., Arnick M.S., Bolton T. L. Isolationof mycobacteria from clinical specimens by use of a selective 7H11 medium //Am. J. Clin. Pathol. 1976. - №65.-P.412-415.

106. McDonough K. A., Kress Y., Bloom B. R. Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages //Infect. Immun. 1993. - №61.-P.2763-2773.

107. Middlbrook G., Cohn M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods IIAm.. Public Health. 1958. - №48.-P.844-853.

108. Middlbrook G., Cohn M.L., Dye W.E. Microbiologic procedures of value in tuberculosis //Acta Tuberc. Scand. 1960. - №38.-P.66-81.

109. Middlbrook G., Riggiardo Z., Tigertt W. D. Automatable radiometric detection of growth of M. tuberculosis in selective media //Am. Rev. Respir. Dis. 1977. - №115.-P.1066-1069.

110. Mittal S.K., Aggarwal V., Rastogi A. Saini N. Does BCG vaccination prevent or postpone the occurrence of tuberculosis meningitis? //Indian J. Pediatr. 1996. - №63.-P.659r664.

111. Modok S., Mellor H., Calaghan R. Modulation of multidrug resistance efflux pump activity to overcome chemoresistance in cancer //Current Opinion in Pharmacology. -2006. -№6. -p. 1-5.

112. Moulding T.S., Redeker A.G, Kanel G.C. Twenty isoniazid-assotiated deaths in one state //Am. Rev. Respir. Dis. 1989. - №140. - P.700-705.

113. Munt P.W. Miliary tuberculosis in the chemotherapy era with a clinical review in 69 American adults //Medicine. 1971. - №51.- P.139-155.

114. Murray H.W., Tuazon C.U., Kirmani N., Sheagren J.H. The adult respiratory distress syndrome associated with military tuberculosis //Chest. -1978. №73.-P.37-43.

115. Negi S.S., Anand R., Pasha S.T., Gupta S., Basir S.F., Khare S., Lai S. Molecular characterization of mutation associated with rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates //Indian J Exp Biol. -2006 №44(7). P.547-553.

116. Netto E.M, Dye C, Raviglione M.C. Progress in global tuberculosis control 1995-1996, with emphasis on 22 high-incidence countries. Global Monitiring and Surveillance Project //Int J Tuberc Lung Dis. 1999. - №3.-P.310-320.

117. Nicaido H., Jarlier V. Permeability of the mycobacterial cell wall //Res. Miccrobiol. -1991. №142.-P.437-443.

118. Nikaido H., Thanassi D.G. Penetration of lypophilic agents of multiple protonation sites into bacterial cells: tetracyclines and fluoroquinolones as examples //Antimicrob. Agents Chemomether. 1993. - №37.-P.1393-1399.

119. Ninet B, Rohner P, Metral C, Auckenthaler R // Assessment of use of the COB AS AMPLICOR system with BACTEC 12B cultures for rapid detection of frequently identified mycobacteria. J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37. -№ 3.- P. 782-784.

120. O'Brien R. J., Paul P. Nunn. The need for new drugs against tuberculosis //Am. J. Respir Crit Care Med. 2001. - №162.-P. 1055-1058.

121. Pfyffer G. E, Broun-Elliot B. A, Wallace R. G. Mycobacterium: General characteristics, isolation, and staining procedures //Manual of clinical microbiology, Washington, District of Columbia. 2003.- 8th edn. - P.532-559.

122. Prout S., Benatar S. R. Disseminated tuberculosis: a study of 62 cases //S. Afr. Med. J. 1980. - №58.-P.835-842.

123. Rastogi N., Legrand E, Sola C. The mycobacteria: an introduction to nomenclature and patogenesis //Rev.Sci Tech. 2001. - №20(l).-P.21-54.

124. Ratledge C. Nutrition, growth and metabolism //Ratledge C., Stanford J. L. (ed.), Biology of Mycobacteria, vol. 1. Academic Press, Inc. (London) Ltd., London. 1982 .p. 186-212.

125. Raviglione M.C, Snider D.E, Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic //JAMA. -1995.-№273.-P.220-226.

126. Rosenblatt M. В., Fullan E. F., Gessler A. E. Studies of mycobacteria with the electron microscope //Am. Rev. Tuberc. 1942. - №46 587-599. 1942.

127. Sahn, S.A., and T.A. Neff.1974. Miliary tuberculosis //Am. J. Med. -№56.-P.495-505.

128. Saunders, N.A., 2004. Quantitative real-time PCR. In: Edwards, K., Logan, J., Saunders, N. (Eds.), Real-Time PCR, An Essential Guide. Horizon Bioscence, Wymondham.

129. Schluger N.W, Rom W.N. Current approaches to the diagnosis of active pulmonary tuberculosis //Am J Respir Crit Care Med. 1994. - №149.-P.264-267.

130. Sedgewick J.D., Holt P.G. A solid phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells //J. Immunol. Methods. 1983. - №65.-P.301-309.

131. Selwyn P.A., Sckell В., Alcabes M.P., Friedland G.H., Klein R.S., Schoenbaum E.E. High risk of active tuberculosis in HIV-infected drug users with cutaneus allergy //JAMA. 1992. - №268.-P.504-509.

132. Shaffer R.W, Edlin B.R. Tuberculosis in patients infected with human immunodeficiency virus: perspective on the past decade //Clin Infect Dis. -1996. №22.-P.683-704.

133. Shamputa I.C., Rigouts L., Portaels F. Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimence //APMIS. 2004. - №112.-P.728-752.

134. Shi X., Jarvis D.L. A new rapid amplification of cDNA ends method for extremely guanine plus cytosine-rich genes. //Anal Biochem. -2006. -№10. -P.-323.

135. Shilova M.Y, Dye C. The resurgence of tuberculosis in Russia //Philos Trans К Soc Lond Biol Sci. 2001. - №356. - P. 1069-1075.

136. Shrestha N., Tuohy J., Gerri S., Reischl U., Gordon S., Procop G. Detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterial isolates by Real-Time PCR //Clin. Microbiology. -2003. -№11. -p.5121-5126.

137. Silva M. Т., Macedo ?. M. The interpretation of the ultrastructure of mycobacterial cells in transmission electron microscopy of ultrathin sections //Int. J. Lepr. №51. - 1983.-P.225-234.

138. Simon H. В., Weinstein A. J., Pasternak M. S., Swartz M. N., Lunz L. J. Genitourinary tuberculosis: clinical features in general hospital //Am. J. Med. -1977.-№63.-P.410-420.

139. Slavin R. E., Walsh T. J., Pollack A. D. Late generalized tuberculosis: clinical patologic analysis of 100 cases in the preantibiotic and antibiotic eras //Medicine. 1980. - №59.-P.352-366.

140. Snider D.E., Caras G.J., Koplan J.P. Preventive therapy with izoniazid //JAMA. 1986. - №255. -P.1579-1583.

141. Sonnenberg P., Glyn J. R., Fielding K., Murray J., Godfrey-Faussett P., Shearer S. HIV and pulmonary tuberculosis: the impact goes beyond those infected with HIV //AIDS. 2004. - №18.-P.657-662.

142. Sra K.K., Torres G., Rady P., Hughes Т.К., Payne D.A., Tyring S.K. Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology //J Am Acad Dermatol. -2005. -№53(5). -P'.749-765.

143. Sterne J. A., Rodrigues L. C., Guedes I. N. Does the efficacy of BCG decline with time since vaccination? //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. - №2.-P.200-207.

144. Sybirna R.I, Kondratiuk N.V. Cultivating of Mycobacterium tuberculosis with application of the completely automated system Bactec MGIT 960 //Mikrobiol Z. -2006. -№68(3). -P.47-51.

145. Sybirna R.I., Kondratiuk N.V., Iavors'ka H.V. Isolation of infectious agent of extrapulmonary tuberculosis by different microbiological methods //Mikrobiol Z. -2004.-№66(l).-P.62-67.

146. Takashima Т., Ueta C., Tsuyuguchi I., Kishimoto S. Production of tumor necrosis factor alpha by monocytes from patients with pulmonary tuberculosis //Infect. Immun. 1990. - №58.-P.3286-3292.

147. Tarai В., Gupta A., Ray P., Shivaprakash M.R., Chakrabarti A. Polymerase chain reaction for early diagnosis of post-operative fungal endophthalmitis //Indian J Med Res. -2006. -№123(5). -P. 671-678.

148. Ten D., Hitze K. L. Does BCG vaccination protect the newborn and young infants //Bull. W.H.O. 1980. - №58.-P.37-41.

149. Tyagi S., Kramer F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization //Nat Biotechnol. 1996. - №14.-P.303-308.

150. Valone S. E., Rich E., Willis R. S., Ellner J. J. Expression of tumor necrosis factor in vivo by human mononuclear phagocytes stimulated with whole Mycobacterium tuberculosis, BCG, mycobacterial antigens //Infect. Immun. 1988,-№56.-P.3313-3315.

151. Vera-Cabrera Lucio, Howard S. Т., Laszlo A., Johnson W. M. Analisis of genetic Polymorphism in the Phospholipase Region of Mycobacterium tuberculosis //J Clin Microbiol. 1997. - №5.-P.l 190-1195.

152. Vergne I, Singh S, Roberts E, Kyei G, Master S, Harris J, de Haro S, Naylor J, Davis A, Delgado M, Deretic V. Autophagy in Immune Defense Against Mycobacterium tuberculosis //Autophagy. -2006. -№2(3). -P. 175178.

153. Wade K. A., June I. P., Joann L. C., Gail L. W. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR //J.Clin.Microbiol. 2005. -№43.-P.2471-2473.

154. Wade M. M, Zhang Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis /-Front Biosci. 2004. - №l;9.-P.975-94.

155. Wang H., Chen Z. Jbservations of properties of the L-form of M.tuberculosis induced by the antituberculosis drugs //Zhonghua Jie . -2001. -№24(1). -P.52-55.

156. Wei-Juin Su. Recent advances in molecular diagnosis of tuberculosis //J Microbiol Immunol Infect. 2002. - №35.-P.209-214.

157. Wheeler P. R. Biosynthesis and scavering of purines by pathogenic mycobacteria including Mycobacterium leprae //J. Gen. Microbiol. 1987. -№133.-P.2999-3011.

158. Wheeler P. R. Biosynthesis and scavering of pyrimidines by pathogenic mycobacteria//J. Gen. Microbiol. 1990. - №136.-P.189-201.

159. World Health Organization.: Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing, WHO Report 2003 (WHO/CDS/TB/2003.316). Geneva: WHO, 2003

160. Zhang Y, Telenti A. Genetics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis In: Molecular genetics of mycobacteria. Eds: Hatfull G, Jacobs

161. W.R, AMS Press, Washington D.C. 235-254 (2000)