Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Конвисарев, Андрей Петрович

• Конвисарев, Андрей Петрович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Конвисарев, Андрей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая ситуация по сибирской язве.

2.2. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы.

2.3. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.4. Характеристика природных плазмид бацилл.

2.5. Диагностика сибирской язвы.

2.6. Применение реакции латекс-агглютинации в диагностике инфекционных болезней.

2.7. Идентификация возбудителя сибирской язвы на основе анализа генома.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Реактивы.

3.1.4. Растворы и питательные среды. 46

3.1.5. Животные.

3.1.6. Лабораторное оборудование.

3.2. Методы.

3.2.1. Выращивание бактерий.

3.2.2. Определение культурально-морфо логических свойств возбудителя сибирской язвы.

3.2.3. Выделение хромосомной ДНК.

3.2.4. Электрофорез ДНК и полипепшдов.

3.2.5. Иммуноблоттинг.

3.2.6. Постановка полимеразной цепной реакции.

3.2.7. Постановка реакции латекс агглютинации.

3.2.8. Серологические исследования.

3.2.9. Компьютерный анализ, сравнение первичных структур нуклеиновых кислот и расчет олигонуклеотидов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом полимеразной цепной реакции.

4.1.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы. 51 4.1.1.1. Выявление капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы методом ПЦР.

4.1.1.2. Выявление возбудителя сибирской язвы методом ПЦР на основе праймеров, комплементарных гену токсина.

4.2. Получение растворимых антигенов Вас. апйигашв.и изучение их специфической активности.

4.3. Разработка реакции латекс-агглютинации для выявления специфических антител и антигенов к возбудителя сибирской язвы.

4.3.1. Получение очищенных антигенов и

4.3.2. Отработка реакции латекс-агглютинации для выявления специфических антител к возбудителя сибирской язвы

4.3.3. Отработка реакции латекс-агглютинации для дифференциации бацилл.

4.4. Изучение возбудителя сибирской язвы, выделенного из органов павших животных и проб почв.

4.4.1. Биологические свойства полевого изолята сибирской язвы.

4.4.2.Изучение диагностической ценности ПЦР для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в пробах почвы скотомогильника.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы»

Актуальность работы. Сибирская язва - опасная инфекционная болезнь большинства видов животных и человека, характеризующаяся признаками септицемии, тяжелой интоксикации и образованием специфических карбункулов. Сибирская язва относится к почвенно-очаговым заболеваниям и носит стационарный характер. В настоящее время она реже проявляется эпидемиями и эпизоотиями с массовым поражением людей и животных, но часто напоминает о себе спорадическими случаями и вспышками, сопровождающимися гибелью животных и людей, т.е. не утратила своего эпидемиологического значения.

По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает сибирской язвой около миллиона голов скота и до 2000 человек (Н.Г.ИпатенкоД982; Б.Л.Черкасский, 1983; В.А.Гаврилов, И.А. Бакулов, 2000).

Для России указанная болезнь также остается чрезвычайно опасной и требует постоянного внимания, так как несмотря на значительные успехи в деле предупреждения и искоренения сибирской язвы в России в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической и эпидемической ситуации, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства, особенно при круглогодовом отгонно-пастбищном содержании животных (Ургуев И.А., 1999; Бакулов И.А, Гаврилов В.А., 2000).

Увеличение в отдельных пунктах числа животных, заболевших и павших от сибирской язвы, обусловлено запоздалой постановкой диагноза и не своевременным проведением профилактических мероприятий, что является результатом роста числа мелких ферм и увеличения поголовья в личных подворьях, где животных иногда не вакцинируют против сибирской язвы. Вспышки сибирской язвы в основном регистрируют с июня по сентябрь, а пик заболеваемости во всех регионах приходится на июль-август.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы широко используют серологические, биохимические, микробиологические методы, определение чувствительности к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постановку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный и комплексный характер исследований при идентификации предназначен для исключения диагностических ошибок, которые могут иметь место из-за таксономической схожести представителей рода Bacillus, когда отдельные идентификационные критерии различных видов бацилл могут совпадать. Достоверным отличительным признаком вирулентных штаммов B.anthracis является положительный результат биологической пробы: выявление капсулообразущих бацилл in vitro и гибель лабораторных животных. Однако постановка биопробы - это наиболее продолжительный по времени и не всегда доступный идентификационный тест, а, кроме того, этот метод не позволяет идентифицировать бескапсульные штаммы возбудителя.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность применяемых в настоящее время методов заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвы, основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позволяющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарного надзора.

Нуклеотидные последовательности генов, связанных с патогенностью бактерий, используются при разработке ПЦР-диагностикумов. Исследования в области молекулярной биологии сибиреязвенного микроба показали присутствие в клетках вирулентных штаммов плазмид с молекулярной массой 60 и 110 МДа, на которых локализованы гены двух факторов патогенности - капсулообразования и трехкомпонентного токсина, соответственно. Так как применяемые в России вакцинные штаммы лишены плазмиды с молекулярной массой 60 МДа, то это может служить основой для разработки тест-систем для идентификации вирулентных и вакцинных бескапсульных штаммов сибиреязвенного микроба с использованием нуклеотидных последовательностей, гомологичных сар-оперону и гену токсина.

Эффективные диагностические препараты при сибирской язве могут быть созданы путем разработки серологических методов, основанных на использовании протективного антигена или его иммуногенных доменов, а применение генетического маркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бактериальных вакцин позволит, в перспективе, разработать лабораторные тесты позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от вирулентных и авирулентных изолятов Вас. апШгашз, а также других непатогенных бацилл.

Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о необходимости изучения структурно-функциональной организации генома и разработки чувствительных и специфичных тест-систем на основе методов клеточной биотехнологии и генной инженерии для выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, выделенных из проб почвы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась разработка тест-систем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определение их значимости при проведении диагностических исследований на сибирскую язву.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выбрать праймеры для избирательной амплификации различных участков генома и оптимизировать условия постановки ПЦР для обнаружения фрагментов генома возбудителя сибирской язвы;

- отработать условия получения концентрированных, очищенных антигенов возбудителя сибирской язвы и оптимизировать условия постановки латексагглютинации для обнаружения специфических антигенов и антител при сибирской язве;

- изучить морфологические, культуральные и патогенные свойства микробов, выделенных из патматериала и проб почв скотомогильников в Бурятии и оценить пригодность ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна работы. Разработана чувствительная и специфичная тест-система на основе ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентные свойства и определены оптимальные условия ее проведения при выявлении ДНК возбудителя сибирской язвы.

Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В. сегеш. Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования.

При изучении культурально-морфологических свойств и проведении исследований с помощью ПЦР 12 бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского района Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентных свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов.

Практическая значимость работы. Разработана тест-система на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, пригодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации вирулентных капсулообразующих штаммов от бескапсульных вакцинных штаммов. Разработанная тест-система может быть использована в качестве сигнального метода при исследовании смешанных культур микроорганизмов, выделяемых из проб патологического материала, почвы, воды при подозрении на сибирскую язву.

Отработана реакция латекс-агглютинации для выявления антител к Вас.апЙиж^, пригодная для серологических исследований при определении эффективности вакцинации животных.

На основании проведенных исследований разработаны "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы полимеразной цепной реакцией" рассмотренные на заседании ученого совета института (протокол №.10 от 13.10.2000г.) и утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- результаты исследований по разработке тест-системы на основе полимеразной цепной реакции, позволяющие идентифицировать Вас.апЙнж^ в пробах патматериала, почв и дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл;

- результаты исследований по очистке растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и использованию их в разработке тест-системы на основе латекс-агглютинации, позволяющей выявлять специфические антитела против сибирской язвы в сыворотках вакцинированных и переболевших животных.

- изучение морфологических, культуральных и патогенных свойства бацилл, выделенных из патматериала и проб почв скотомогильников в Бурятии и оценка пригодности ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы.

Апробация и публикация результатов. Материалы исследований доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию Прикаспийского ЗНИВИ «Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях реформирования сельскохозяйственного производства прикаспийского региона», г. Махачкала, 1997 г.; международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВиМ «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных», г.Покров, 1998г; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов", г. Щелково, 2000 г., Международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных», г. Покров, 2000г.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2000 г.г.: в лабораториях "Биофизики" и "Экспериментальной микробиологии" ВНИИВВиМ, на базе центральной заводской лаборатории Федерального Государственного Унитарного Предприятия "Покровский завод биопрепаратов" (ФГУП, "ПЗБ") и на кафедре вирусологии, микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской Государственной сельскохозяйственной академии, г. Улан-Удэ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 161 источник (из них 73 отечественных). Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 7 рисунками.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2000 г.г. в лабораториях Биофизики и Экспериментальной микробиологии ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. «Разработать и усовершенствовать средства и методы дифференциальной диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота, свиней, овец и бактериальных болезней животных».

В выполнении отдельных разделов работы принимали участие заведующий лабораторией «Экспериментальной микробиологии»

11

ВНИИВВиМ кандидат биологических наук Селянинов Ю.О., старший научный сотрудник лаборатории «Биофизики», кандидат биологических наук Цыбанова Л.Я., аспирант лаборатории «Биофизики» Колбасов Д.В., зав. кафедрой микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р.Филиппова доктор ветеринарных наук, профессор Цыдыпов В.Ц., доцент кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова кандидат ветеринарных наук Муруева Г.Б., которым автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Конвисарев, Андрей Петрович

6. ВЫВОДЫ

6.1. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с праймерами , комплементарными последовательностям плазм иды рХО 1 и рХ02 возбудителя сибирской язвы, позволяющие при температуре отжига 50° С для праймеров протективного антигена и 55° С для праймеров капсулообразования выявлять ДНК вакцинных и капсулоообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы.

6.2. Разработанная модификация ГТЦР с использованием гнездовых праймеров позволяет обнаружить ДНК капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы в патологическом материале и бульонных культурах, что соответствует 10-100 КОЕ 50/мл.

6.3. Сравнительный анализ растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В.сегеш показал, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования.

89

6.4. Результаты исследований показали, что реакция латекс-агглютинации может быть использована для обнаружения специфических антител в сыворотках иммунизированных или переболевших животных. Уровень титров в РЛА полностью коррелировал с результатами РИГА и составлял от 1:5 до 1:160, причем титр антител зависел от препарата используемого для иммунизации и способа иммунизации.

6.5. При изучении культурально-морфологических свойств и исследований с помощью ПЦР 12 бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника установлено, что четыре идентифицированы как атипичные сибиреязвенные культуры (№2, № 3 , №10, №12), а две из которых ( № 3, № 10) как бескапсульные с остаточной вирулентностью. Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне изменчивости, выделенных из проб почвы бацилл вплоть до полной утраты ими вирулентных свойств, но с сохранением отдельных признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы.

90

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью полимеразной цепной реакции утвержденные директором ВНИИВВиМ от 14.10.2000г. могут быть использованы в качестве сигнального теста для выявления возбудителя сибирской язвы в патологическом материале, пробах почвы при проведении лабораторных исследований.

Разработанные условия получения растворимого антигена из культуральной жидкости вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, могут быть использованы для постановки латекс-агглютинации для выявления специфических антител.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Конвисарев, Андрей Петрович, 2000 год

1. Ахмедзянов Ю.А., Найманов П.И. Использование плазмидного скрининга для дифференциации штаммов Bac.anthracis от близкородственных видов почвенных бацилл.//Журнал микроб.эпидем.и иммунологии. 1989,11, с. 26-28. М. " Медицина

2. Александер С.К., Лукин Ю.В., Юминова Н.В., Краснова В.П., Анджарпаридзе О.Г. Использование теста латекс-агглютинации для определения титров противокоревых антител.//Вопр. вирусологии, 1995, 5, с. 231-234.

3. Александер С.К., Лукин Ю.В., Фидлер Л.М. Приготовление IgG -диагноетикума на основе окрашенных полиакролеиновых латексов для применения в реакции латексной агглютинации.//ЖМЭИ, 1990, 6, с. 8488

4. Асеева В.Г., Падюков Л.Н. Латекс агглютинация и коагглютинация для диагностики инфекционных заболеваний .//ЖМЭИ, 1994,1, с. 107-113.

5. Балаева Н.М., Артемьев М.И., Игнатович В.Ф. Генотипическая характеристика штаммов Rickettsia sibirica.// Мол. ген. мик. и вир.,1993, 4, с.15-18. М." Медицина

6. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы животных.//Вестник с-х наук, 1991, 8, с.128-132.

7. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Караханов А.Г. Опыт использования эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума.//Ветеринария, 1987, 7, с. 40-42.

8. Бакулов И.А. Законы и категории эпизоотологии //Вестник РАСХН,1994, 1, с.44-46.

9. Ю.Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из шт. 55-ВНИИВВиМ//Ветеринария, 1994, 8, с.11-15.

10. П.Бакулов И.А. Современные проблемы эпизоотологии// Ветеринария, 1991, 7, с.32-36.

11. Бакулов И.А., Макаров В.В. О роли патогенности микроорганизмов в инфекционной паразитарной системе//Вестник РАСХН, 1990, 7, с.92-98.

12. Бакулов И.А., Ведерников В.А., Харкевич А.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Дальнейшее совершенствование системы мероприятий по профилактике и борьбе с сибирской язвой животных.//Ветеринария, 1997, 5, с.7-12

13. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косяченко Н.С. Изучение штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории России.// Доклады РАСХН, 1997, 2, с.42-43.

14. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косяченко Н.С. Современные воззрения на безопасность живых сибиреязвенных вакцин.// Ветеринария,- 1993,- 1. с. 22-25.

15. Бортюк Я.А. Молекулярное клонирование ДНК M.bovis, БЦЖ. Ветеринарная иммунология и биотехнология.// Труды ВИЭВ, 1988, том 66, с. 26-28. М.

16. Брода П. Плазмиды// 1982, с.Ю, М. " Мир"

17. Буланцев A.JI., А.В.Липницкий. Влияние гетерологических бацилл на инфекционный процесс при сибирской язве в эксперименте.// Микробиология эпидемиология и иммунология, 2000, 3, с. 24-27.

18. Булат С.А. Геноидентификация видов и сероваров бактерий методом ПЦР с универсальными олигонуклеотидами: реидентификация ранее выделенных штаммов Yersinia pseudotuberculosis.// ЖМЭИ, 1994, Т 12, с. 2-7. М." Наука ".

19. Ведерников В.А., Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Эпизоотологическая обстановка по сибирской язве животных в РФ.//Вестник РАСХН, 1996, 2, с.68-71.

20. Вернер О.М., Синяк К.М., Волкова В .П. Состав жирных кислот Вас. anthracis и других почвообитающих бацилл.// Изв. АН СССР. Сер.биология. 1988, 1, с. 36-41.

21. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л., Лукин Ю.В. Реакция латекс-агглютинации для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.//Ветеринария, 1996, 4, с, 27-28.

22. Воробьева З.Г., Лазовская А.И. Диагностика чумы плотоядных. //Ветеринария, 1996, 6, с. 53-54.

23. Гаврилов В. А. Иммуногенетические аспекты разработки противосибиреязвенных вакцин. //Ветеринария. 1987, 10, с.27-29.

24. Гаврилов В.А., Матвеева Н.Б. Бациллоносительство у свиней, роль бациллоносителей в распространении сибирской язвы .//Съезд паразитоценологов, Харьков, 1995, с.36-37.

25. Гаврилов В.А., Матвеева Н.Б. Диагностика сибирской язвы.//Съезд паразитоценологов, Харьков, 1995, с.35-36.

26. Гаврилов В.А., Сафонов Г.А. Симпозиум по особо опасным инфекционным болезням животных//Вестник РАСХН, 1996, 3, с.13-15.

27. Гаврилов В.А., Бакулов И.А., Селиверстов В.В., Числов Ю.В. Концепция применения и производства сибиреязвенных вакцин.//Материалы межрегионального рабочего совещания ВОЗ/ФАО по сибирской язве, Казахстан, 1997, с.41-43.

28. Гаврилов В.А. Иммуноморфологическая и ветеринарно-санитарная экспертиза мясопродуктов от овец, привитых вакциной из штамма 55-ВНИЙВВиМ.//Научные основы технологии пром. произв. вет. биол. препаратов. Щелково, 1996, с.287-288.

29. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. Определение гена холерного токсина у штаммов холерных вибрионов методом ДНК-ДНК-гибридизации.// Молек.генетика, 1987, №11. с. 9-13.

30. Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной " дактилоскопии".//Генетика, 1989, 25, с. 1320-1324.

31. Гинсбург Я.Я. //Живые вакцины. — М., 1969.

32. Гинцбург А.Г., Шагинян И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций.//Молек. ген. мик. вир., 1991, № 12, с. 3-9.

33. Голубинский Е.П., Тафелыптейн Э.Е. О динамике сибиреязвенного токсина в организме.// ЖМЭИ, 1989, 3, с, 98-100.

34. Езепчук Ю.В.// Патогенность как функция биомолекул. М.,1985, с. 6773.

35. Еремин С.А, Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Определение плазмидного профиля у штаммов сибиреязвенного микроба методом электрофореза в агарозном геле.// Микробиол. иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1987, с.91-95.

36. Еремин С.А., Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид.// Мол. ген. микр. вирус., 1989,10, с.35.

37. Ипатенко Н.Г., Гущин В.Н., Маничев A.A. Профилактика сибирской язвы.// Ветеринария, 1992, 2, с. 31-32.

38. Ипатенко Н.Г., Маничев A.A., Саленко A.C., Гаврилов В.А. Иммуногенные свойства вакцины против сибирской язвы из штамма 55. // Ветеринария, 1993, 3, с. 17-19.

39. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Зелепукин B.C. и др.// Сибирская язва. М. Колос, 1996, 335 с.

40. Ипатенко Н. Г., Маничев A.A., Шморгун В. Л., Тихонов Ю. А. Дифференциация Вас. anthracis от спорообразующих почвенных бацилл.// Ветеринария, 1999,

41. Ипатенко Н.Г. Яковлева И.А., С.И.Бахтаров. Лечение животных, больных сибирской язвой.//Ветеринария, 1999, с. 18-23.

42. Ипатенко Н.Г. Патогенез сибирской язвы у свиней.// Ветеринария, 3, 1999, с, 15-17.

43. Ипатенко Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов. //Ветеринария. 2000, 6, с. 22-23.

44. Ипатенко Н.Г., Б.И.Шморгун, Л.С.Саленко. Компоненты для реакции преципитации при сибирской язве.// Ветеринария, 10,1999, с. 15-17.

45. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. //Методы молекулярной генетики и генной инженерии // 1990, с.116.

46. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием ПЦР.// Молек. генетика микроб. вирусол.1993, 2., с. 3-9.

47. Мальков И.Г. Идентификация M.tuberculosis и М. bovis от атипичных видов микобактерий методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной реакции.//Автореф. дисс. 1993, с. 8-16. Москва.

48. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.// Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984, с. 102-103, М. «Мир».

49. Маничев A.A., Шморгун Б.И. Производство стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинных штаммов Bac.anthracis. // Ветеринария, 1991, 7, с. 30-31.

50. Маренникова С.С., Носков Ф.С., Шелухина Э.М. Выявление антигена ВИЧ и антител к нему с помощью теста агглютинации с отечественным латексом.//Вопросы вирусологии, 1990, 3, с. 245-248.

51. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н., Е.И.Седых, Н.К.Михась.// Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов.//Молекул. генетика микроб, вирусол. 1993, 4, с.8-11.

52. Никшис Н.И., Степанов A.C. Питательные потребности штаммов Bacillus anthracis //Актуал. пробл. и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. /Всес. н-и противочум. ин-т "Микроб", Саратов, 1991, с. 122-127.

53. Проскурина В.А. Скрининг плазмидной ДНК сибиреязвенного микроба //Совр. Аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профилактики особо опасных инф. болезней: Тез. докл. науч. конф., Омск, окт. 1993 г. Ставрополь, 1993,- с.347-348.

54. Пехов А. // Плазмиды бактерий. 1986, с.7, М," Мир

55. Романова Л.В., Мишанкин Б.Н.,Сучков И.Ю. Полимеразная цепная реакция: генотип ический скрининг штаммов Fran.tularensis с использованием неспецифических праймеров.// Биотехнология, 1993, № 6, с. 8-9.

56. Рысков А.П., Токарская О.Н., Вербовая Л.В. Геномная дактилоскопия микроорганизмов. Использование в качестве гибридизационного зонда ДНК фага М-13.// Генетика, 1988, № 7, т. 24, с.1310-1313.

57. Рысков А.Р., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп. Использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М-13. // Генетика, 1988, № 2, т. 24, с. 227-238.

58. Степанов A.C., Пузанова О.Б., Гаврилов C.B. Глицинзависимая криотрансформация Вас. anthracis ДНК различных плазмид.// Мол. ген. микроб, и вирус., 1989, № 12, с.39-44.

59. Степанов A.C. О молекулярной природе токсина Вас.anthracis.// Мол. ген. микроб, и вирус., 1991, 1, с. 3-8.

60. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Вас. anthracis в клетках E.coli, Вас. subtilis, Вас. anthracis. // Мол. ген. микроб, и вирус., 1993, № 2, М. с.3-8.

61. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий A.B. Видоспецифический ДНК-зонд для обнаружения токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы.// Молек. ген. микроб, виру со л., 1994, 1, с. 30-32.

62. Шагинян И.А., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М. Современные направления медицинских диагностикумов.//М.1990.с.80.

63. Шагинян И.А, Романова Ю.М, Уткин В.В и др. Изучение геномного полиморфизма штаммов Shigella Flexneri, изолированных в разных географических регионах.//Мол. ген. микроб, и вирус.,1993, № 1.- с. 8.

64. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. Геномная "дактилоскопия" возбудителей сапронозов.// Журн.микробиол, 1991, № 6. с. 25-31.

65. Шишкина О.Г., Попов Ю.А., Кириллина О.А. Конструирование видоспецифического ДНК-зонда на основе плазмиды pFra чумного микроба.// Мол. ген. вир. микроб., 1991, №10, с. 16-19.

66. Шубин Ф.Н., Сибирцев Н.Т., Рассказов В.А. Плазмиды Yersinia pseudotuberculosis и их значение в реализации эпидемического процесса при псевдотуберкулезе.// Ж. микробиологии, 1985, № 12, с.53-56.

67. Ургуев К.Р., М.И.Нажалов, З.М.Джамбулатов Эпизоотическая обстановка по сибирской язве животных в Дагестане. //Ветеринария, 1999, 2, с,22-25.

68. Andersen G., Simshock J.M., Wilson К.Н. Identification of a region of genetic variability among Вас. Anthraeis strains and related species.// J.Bacter., 1996, 178, p.377-384.

69. Ash C., Collins D. Comparative analysis of 23 S ribosomal RNA gene sequences of Вас. Anthraeis and emetic Вас. Cereus determined by PCR-direct sequencing.//FEMS Microbiol., 1992, 94, p.75-80

70. Ash C., Farrow A., Dorsh M., Stackebrandt E., Collins D. Comparative analysis of Вас. Anthraeis, Вас. Cereus and related species on the basis ofreverse transcriptase sequencing 16S rRNA.//Int J. Syst. Bacterid, 1991, 41, p.45-50

71. Baillie-LWJ, Jones-M.N, Turnbull-P.C.B, Manchee-R.J. Evaluation of the Biolog. System for the Identification of Bacillus Anthracis.// Letters Appl. Microbiology,1995, Vol 20, p. 209-211

72. Beal F.A., Taylor M.J.,Thome C.B. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bac. anthracis.//J. Bact-1961. Vol.83. P.1274-1280.

73. Beyer W., Glockner P., Otto J., Bohm R. A nested PCR method for the detection of Bac. Anthracis in environment samples collected from former tannery sites.//Microbiol. Res., 1995, 150,179-186.

74. Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology.- 8th ed. The Williams and Wilkins Co.- Baltimore. 1974. P. 529-550.

75. Bernet C, Carret M., de Barbeyrac B. Detection of Mycoplasma pneumoniae by Using the Polymerase chain Reaction.// J. clin. Microbiol. 1989. Vol. 27. № 11. P. 2492-2495.

76. Belak S., Ballagi-Pordany A. Experiences on the application of the polymerase chain reaction in diagnostic laboratory.//Mol.Cell.Probes, 1993, 7,241-248

77. Bhatnagar R.,Singh Y.,Leppla S.H.,Friedlander A.M. Calcium is Reguired for the Expression of Anthrax Lethal Toxin Activity in the Macrophage like Cell Line J 774 A 1.// Infect.Immun. 1989. Vol.57. P.2107-2114.

78. Bragg T.S., Robertson D.L. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factors gene (lef) from Bac.anthracis.// Gene, 1989, 81, p.343-346.

79. Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for the PCR detection of Bac. Anthracis.//Mol.Cell.Probes, 1998,12, 367-377

80. Carlton B.C., Smith V.W. Size Distribution of the Closed Circular Deoxyribonucleic Acid Molecules of Bacillus megaterium: Sedimentation Velocity and Electron Mikroscope Measurements. //J. Bact, 1974, Vol.117, P.1201-1209.

81. Carl M., Hawkins R., Coulson N., Sowe J., Titball W. Detection of spores of Bac. Anthracis using polymerase chain reaction.// J. Infect. Disease, 1992, 165, p. 1145-1148

82. Cataldi A., Labruyere F.//International Workshop on Anthrax.-Winchester, 1989. P.87.

83. Craescu-C.T, Barzu-O. Characterization of a Synthetic Caimodulin-Binding Peptide Derived from Bacillus-Anthracis Adenylate-Cyclase.// J. Biol. Chemistry, 1993, Vol 268, p. 1695-1701.

84. Drobnewski F. Bacillus and related species.// Clin. Microbiol. Rew., 1993, 6, p.324-338

85. Doganay-M, Aydin-N. Antimicrobial Susceptibility of Bacillus Anthracis.// Scand. J. Infect. Disease. 1991, Vol 23, p. 333-335

86. Eisenstein B. New molecular techniques for microbial epidemiology and the diagnosis of infectious diseases.//J. Infect. Dis., 1990,161, 595-602.

87. Ekwunife-FS, Singh-J, Taylor-KG, Doyle-RJ. Isolation and Purification of Cell-Wall Polysaccharide of Bacillus-Anthracis (Delta-Sterne).// FEMS Microb. Letters. 1991, Vol 82, p. 257-262

88. Ezeel J.W., Abshire T.G.//International Workshop on Anthrax. Winchester. 1988. P. 87-90.

89. Fish D.C., Mahlandt B.G., Dobbs J.P., Linkoln R.E. Purification and Properties of in vitro-produced Anthrax Toxin Components.// J. Bact. 1968. Vol.95. P.907-918.

90. Fitzgerald D., Morris R.E., Saelinger C.B. Essential Role of Calcium in Cellular Internalization of Pseudomonas Toxin.// Infect.Immunol. 1982.-Vol.35.P.715-720.

91. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through an acid-dependent process. //J.biol.Chem.1986. Vol.261. P.7123-7126.

92. Friedlander A.M., Bhatnagar R., Leppla S., Singh Y. //International Workshop on Anthrax. Winchester. 1989. P.51.

93. Friedlander A.M., Bhatnagar-R, Leppla-SH, Johnson-L, Singh-Y. Characterization of Macrophage Sensitivity and Resistance to Anthrax Lethal Toxin.// Infection Immunity. 1993, Vol. 61, p. 245-252.

94. Freer J.H. Virulence Mecchanism Bacterial Pathogenecity.// Washington-1988.-P.264-288. Antlirax. Winchester, 1989. P.43.

95. Guignot-J, Mock-M, Fouet-A. Atxa Activates the Transcription of Genes Harbored by Both Bacillus-Anthracis Virulence Plasmids.//FEMS Microb. Letters. 1997, Vol 147, p. 203-207

96. Green B.D., Battisty L., Koehler T.M. Demonstration of capsule plasmid in Bac. anthracis.// Infect, and Immun. 1985. Vol. 49. № 2. P. 291297.

97. Gryczan T.J., Dunau D. Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis. // Proc.nat.Acad.Sci.USA. 1978. Vol.7. P. 1428-1432.

98. Hawkins R., Coulson N., Lowe J. et al. Detection of spores of Bacillus anthracis using the Polimerase Chain Peaction // J. Infec. Diseases.-1992. Vol.165, №6. P. 1145.

99. Harrel L., Andersen G., Wilson K. Genetic variability of Bac.anthracis and related species.// J. Clin. Microbiol., 1995, 33, p. 1847-1850.

100. Henderson I., Duggleby C., Turnbull P. Differentiation of Bac.anthracis from other Bac.cereus group bacteria with the PCR.// Int. J. Syst. Bacterid., 1994, 44, p.99-105.

101. Hanna-PC, Kruskal-BA, Ezekowitz-RAB, Bloom-BR, Collier-RJ. Role of Macrophage Oxidative Burst in the Action of Anthrax Lethal Toxin.//Molecular Medicine. 1994, Vol 1, p. 7-18

102. Hoflack-L, Seurinck-J, Mahillon-J. Nucleotide-Sequence and Characterization of the Cryptic Bacillus-Thuringiensis Plasmid Pgi3 Reveal a New Family of Rolling Circle Replicons.//J. Bacteriol., 1997, Vol 179, p. 5000-5008

103. Haima P., Bron S., Venema G. The effect of restriction on shotgan cloning and plasmid stability in Bac. subtilis Marburg. // Molec. Gen. Genet. 1987. Vol.209. P. 335-342.

104. Haima P., Bron S., Venema G. Cloning plasmid in Bac.subtilis. // Molec. Gen.Genet. 1990. V.86. P. 63-69.

105. Hatt C., Ward M.E., Clarke I.N. Analysis of tlie entire nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamidia trachomatis serovar L 1. Evidence for involvement in DNA replication. // Nucl. Acid. Res. 1988. V.16. P.4053-4067.

106. Hector J.S.R., Johnson A.R. Determination of genome size of Pseudomonas aeroginosa by PFGE: analysis of restriction fragmens // NAR, 1990, Vol.18, P. 3171-3174.

107. Hoshino T., Ikeda T., Narushima H., Tomizuka N. The nucleotide seguence of pUB 110: some salient features in relation to replication and its regulation.//Plasmid. 1986. V.15. P.93-103.

108. Hutson R., Duggleby C. DNA probes for anthracis detection .//In: Proc. Int. Workshop on Anthrax, 1990, 27-28

109. Imanaka T., Fujii M., Aiba S. Isolation and characterization of antibiotic resistance plasmids from thermophilic bacilli and construction of deletion plasmids.//J.Bact. 1981. Vol.146. P. 1091-1097.

110. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and Expression of the Bac.anthracis Protective Antigen Gene in Bac. subtilis.//Infect, Immun. 1986. Vol.54. P.537-542.

111. Johns M., Harrington L., Titball R., Leslie D. Improved methods for the detection of Bac.anthracis spores by the polymerase chain reaction.// Lett. Appl. Microbiol., 1994, 18, 236-238

112. Koehler T„ Thome C. Bacillus subtilis (natto) Plasmid pLS 20 Mediates Interspecies Plasmid Transfer.//J.Baet.-1987. Vol.169. P.5271-5278.

113. Le Gegarat J.C., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occuring plasmids in Bacillus subtilis.// Mol.Gen.Genet. 1977. Vol.157. P.167-174.

114. Leighton T. First Int. Workshop on Molecular Biology of B.cereus, B.anthracia and B.thuringiensis.//Oslo, 23-25 May, 1997

115. Leppla S.H., Friedlander A.M., Singh Y.//International Workshop on Anthrax.-Winchester. 1989. P.49-50.

116. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: A bacterial adenylatecyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells.// Proc.nat.Acad. Sci.USA. 1982. Vol.79. P.3162-3166.

117. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin-dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties and interactions with eucaryotic cells. // Advanc. Cycl.Nucl.Prot. Phosphoryl.Res. 1984. Vol.17. P.189-198.

118. Leppla S.H. Purification and Characterization of Adenylyl Cyclase from Bacillus Anthracis.// Methods Enzymology, 1991, Vol 195, pp 153168

119. Liu-PYF, Ke-SC, Chen-SL. Use of Pulsed-Field Gel-Electrophoresis to Investigate a Pseudo-Outbreak of Bacillus-Cereus in a Pediatric Unit.// J. Clin. Microbiol., 1997, Vol 35, p. 1533-1535

120. Makino-S, Iinumaokada-Y, Maruyama-T, Ezaki-T, Sasakawa-C, Yoshikawa-M. Direct Detection of Bacillus Anthracis DNA in Animals by Polymerase Chain-Reaction.// J.Clin. Microb. 1993, Vol 31, p. 547-551

121. Maslow J., Mulligan M., Arbeit R. Molecular Epidemiology: Application of Contemporary Techniques to the Typing of Microorganisms.//Clin.Infectious Disease, 1993, 17,153-164

122. Maslow J., Slutsky M., Arbeit R. The application of pulsed field electrophoresis to Molecular Epidemiology.// In: Diagnostic molecular Microbiology. Washington, 1993, 563-572

123. Miksell P., Ivins B.E., Ristroph J.D. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis.// Infect. Immun. 1983. Vol. 39. P. 371-376.

124. Odendaal-MW, Pieterson-PM, Devos-V, Botha-AD. The Biochemical, Morphological and Virulence Profiles of Bacillus Anthracis Isolated in the Kruger National-Park.// Onder. J. Veter. Res., 1991, Vol 58, p. 21-26

125. Pallen M., Puckey L., Wren B. A rapid, simple method for detection PCR failure.// PCR Methods and Applic. 1992, 2, 91-92

126. Prevost G., Jaulhac B., Piemont Y. DNA fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis is more effective than ribotyping in distingquishing among methicilin-resistant Staph. Aureus isolates.// J. clin. Microbiol., 1992, 30, 967-973.

127. Projan S., Monod M., Narayanan C., Dubnau D. Replication Properties of pL M13, a Naturally Occurring Plasmid Found in Bacillus subtilis, and of its Close Relative pE5, a Plasmid Native to Staphylococcus aureus//J. Bact.1987. Vol. 169. P. 5131-5139.

128. Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bac.anthracis by multiplex PCR analysis of sequence on plasmids pXOl and pX02 and chromosomal DNA.// FEMS Microb. Lett, 1996,145, 9-16.

129. Reif T., Johns M., Pillai S., Carl M. Identification of Capsule-Forming Bac.anthracis spores with the PCR and Novel Dual-Probe Hybridization Format.// Appl.Envir.Microbiol. 1994,60, 1622-1625

130. Robertson D.L., Tippets M.T., Leppla S.H. Nucleotide sequence of the Bac.anthracis edema factor gene (cya):a calmodulin dependent adenylate cyclase.//Gene. 1989. V.73.P. 363-371.

131. Robertson D.L., Leppla S.L. Molecular cloning and expression in E.coli of the lethel factor gene of Bacillus anthracis. // Gene. 1986. Vol.44. P.71-78.

132. Robertson D., Bragg T.S. International Workshop on Anthrax. Winchester, 1989. P.88-89.

133. Rossen L., Norskow P., Holmstrem K., Rasmussen O. Inhibition of PCR by components food samples, microbial diagnostic assay and DNA extraction solutions.//J.Clin.Microbiol.,1992, 17, 37-45

134. Sjostedt A., Eriksson U., Ramisse V., Garrigue H. Detection of Bacillus Anthracis Spores in Soil by PCR././ FEMS Microb. Ecology. 1997, Vol 23, p. 159-168

135. Shlyakhov E., Rubinstein E. Evaluation of the Anthraxin Skin-Test for Diagnosis of Acute and Past Human Anthrax.// EUR J. Clin. Microb. & Infect. Disease. 1996, Vol 15, p. 242-245

136. Shishido K., Noguchi N., Kim C., Ando T. A restriction Map of Bacillus subtilis Tetracycline-Resistance Plasmid pNS 1981.// Plasmid.-1983. Vol. 10. P.224-234.

137. Stanley J.L., Smith H. Purification of factor I and recognition of a third factor of anthrax toxin.//J. gen.Microbiol. -1961. Vol.26.-P.49-66.

138. Tanaka T., Kochikawa T. Isolation and characterization of four types of plasmids from Bac. subtilis (Natto).//J.Bact. 1977. Vol.131. P.699-701.

139. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis.// Microbiology. 1985,-American Society for Microbiology. Washington D.C. P. 56-62.

140. Titball-RW, Turnbull-PCB, Hutson-RA. The Monitoring and Detection of Bacillus Anthracis in the Environment .// J. Appl. Bacterid., 1991, Vol 70, p. S9-S18

141. Tippets M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bac.anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin- dependent adenylate cyclase.//Bact. 1988. Vol.170. P.2263-2266.

142. Turnbull P.C.B., Hutson R., Ward M. Bac. anthracis but not always anthrax. // Abstr. Hyg. Trop. Dis. 1986. V. 61. P.R1-R13.

143. Uchida J., Sekizaki T., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bac. anthracis with a 60 MD plasmid //J. Gen. Microbiol.-1985. Vol. 131. P. 363-367.

144. Uchida I., Hornung J., Thorne C., Klimpel K., Leppla S. Cloning and Characterization of a Gene Whose Product Is a Transactivator of Anthrax Toxin Synthesis.// J.Bacteriology, 1993, Vol 175, p. 5329-5338

145. Uchida I., Makino S., Sekizaki T., Terakado N. Cross-Talk to the Genes for Bacillus Anthracis Capsule Synthesis by Atxa, the Gene Encoding the Transactivator of Anthrax Toxin Synthesis.// Molec. Microbiol., 1997, Vol 23, p. 1229-1240

146. Vodkin M.H., Leppla S.H. Cloning of the Protective Antigen Gene of Bacillus anthracis.//Cell. 1983. Vol.34. P. 693-697.

147. Walker J., Dougan G. DNA probes: a new role in diagnostic microbiology.//J.Appl.Bacteriol., 1990, 67, 229-238

148. Welkos S.L., Becker D., Friedlader A.,Trotter R. //Internatinal Workshop on Anthrax.- Winchester,1989. P.54-55.105

149. Welkos S.L., Lowe J., Vodkin M., Leppla S., Schmidt J. Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bac.anthracis. //Gene, 1990, 69, p.287-300.

150. Welkos S. Plasmid-Associated Virulence Factors of Nontoxigenic (PxOl-) Bacillus-Anthracis.// Microb. Pathogenesis, 1991, Vol 10, p. 183198.

151. Welkos S., Vietry N., Gibbs P. Non-toxigenic derivates of the Ames strain of Bac.anthracis are fully virulent for mice: role of the plasmid pX02 and chromosome in strain-dependent virulence.// Microb. Pathogenesis, 1993, 14, p.381-388.

152. Wilson I. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.//Appl. and Environ. Microbiol., 1997, 63, 3741-3751

153. Yoshimura K., Yamamoto O., Seki T., Oshima Y. Distribution of heterogeneous and homologous plasmids in genus Bacillus.// App. environm. Microbiol., 1983, Vol. 46, P. 1268-1275.

154. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

155. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ1. УТВЕРЖДАЮ1. Директор^ЩЩ^еринарной1. Хк"ОЛОГИИ1. Котляров 2000 г.

156. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ1. Покров 2000 г.

157. Д.В. Колбасов А.П. Конвисарев1. Н.С. Косяченко1. С.Ж. Цыбанов

158. Материалы по разработке * методических указаний рассмотрены и одобрены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ

159. Протокол № /С от ./:^:./С1.2000 г.

160. Ученый секретарь ^^¿ ¿й.^ В.Я.Савукова