Регулятор клеточного цикла p21wan: роль в онкоген-индуцированной трансформации и клеточном старении тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Романов, Василий Сергеевич

• Романов, Василий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романов, Василий Сергеевич

Список сокращений.

ГЛАВА 1. Введение

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

ГЛАВА 2. Обзор литературы

2.1. Клеточный цикл нормальных, трансформированных и стареющих клеток.

2.2. Циклин-киназные комплексы и ингибиторы циклин-зависимых киназ.

2.2.1. Циклин-киназные комплексы.

2.2.2. Ингибиторы циклин- зависимых киназ.

2.3. Маркеры клеточного старения.

2.4. Трансформирующее действие онкогенов ElAad5 и cHa-ras.

2.4.1. Влияние онкобелка El А на регуляцию событий клеточного цикла.

2.4.2. Функции белка Ras.

ГЛАВА 3. Материал и методы

3.1. Культивирование клеток.

3.2. Кривые клеточного роста.

3.3. Оценка эффективности клонирования.

3.4. Оценка способности клеток пролиферировать независимо от прикрепления к субстрату.

3.5. Проточная цитометрия.

3.6. Анализ количества белка.

3.7. Иммуноблоттинг.

3.8. Иммунопреципитация и in vitro анализ киназной активности.

3.9. Иммунофлуоресценция и цитохимия.

3.10. Выявление активности SA-p-Gal.

3.11. Анализ фрагментированной ДНК в апоптотирующих клетках.

3.12. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР.

3.13. Анализ миграции клеток по заполнению "раны" клеточного монослоя.

3.14. Анализ миграции и инвазии клеток через поры мембран камер Бойдена.

ГЛАВА 4. Результаты

4.1. Онкобелок Е1А, связываясь с p21Wafl, не препятствует его взаимодействию с циклин-киназными комплексами в £,7Лас/5/с//а-га^-трансформированных фибробластах.

4.2. Анализ клонов £/Ла^5/с#а-га.у-трансфицированных фибробластов на содержание введенных онкопродуктов и белков-регуляторов клеточного цикла.

4.3. р21ЧУай и становление трансформированного фенотипа Е1А/сНа-11а$-экспрессирующих фибробластов.

4.3.1. Скорость пролиферации клеток шЕКаз р21-/- зависит от их плотности.

4.3.2. р21тп вовлечен в дезорганизацию актинового цитоскелета Е1А/сНа-Иа$-трансформантов.

4.3.3. Дезорганизация актинового цитоскелета и уменьшение фосфорилирования кофилина коррелируют с цитоплазматической локализацией р21ХУаП в клетках шЕЯаз.

4.3.4. Роль р21ШаП в миграции и инвазии Е1 А/сНа-Ыаз-экспрессирующих фибробластов.

4.3.5. Эффективность клонирования на пластике и пролиферация в полужидком агаре Е1А/сНа-11а8-трансформантов зависят от р21^п.

4.3.6. Стрессорные воздействия на ЕТА/сЫа-Яаз-экспрессирующис МЕР не приводят к блоку клеточного цикла, но запускают апоптоз независимо от присутствия р21ШаП.

4.4. р21ШаП и активация клеточного старения Е1А/сНа-Каз-экспрессирующих фибробластов.

4.4.1. ИаВ блокирует прохождение шЕКаэ и шЕИаБ р21 -/- по клеточному циклу.

4.4.2. Длительное действие №В вызывает необратимый блок клеточного цикла в трансформантах щЕНав, но не шЕКав р21-/-.

4.4.3.Маркеры клеточного старения не выявляются в клетках шЕКаэ р21-/-.

4.4.4. Гипертрофия клеток тЕЫаз, индуцированная №В, осуществляется за счет р21У/аП-опосредованной активации тТСЖС1.

4.4.5. ШВ-индуцированное клеточное старение тЕИав сопровождается усилением адгезии клеток.

4.4.6. Миграция клеток тЕКав снижается при старении, а ингибитор киназного комплекса тТСЖС 1 рапамицин способен этому препятствовать.

4.4.7. В становление МаВ-индуцированного клеточного старения клеток тЕЯав вовлечена стресс-киназа ЛМК, но не р38.

ГЛАВА 5. Обсуждение.