Регуляция экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе крысы альфа-меланокортином и его аналогами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Дубынина, Елена Вячеславовна

  • Дубынина, Елена Вячеславовна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2009, МоскваМосква
  • Специальность ВАК РФ03.00.13
  • Количество страниц 145
Дубынина, Елена Вячеславовна. Регуляция экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе крысы альфа-меланокортином и его аналогами: дис. кандидат биологических наук: 03.00.13 - Физиология. Москва. 2009. 145 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дубынина, Елена Вячеславовна

список принятых сокращений. введение. цель рабо i ы. обзор литературы.

Характеристика пептидного семьиства меланокортинов

Локализация и синтез ме шнокортннов в мозге м /екопитающих

I'eijenmopbi к меланокортинам

Взаимодействие мечанокортинов с медиаторными системами ¡

Поотропные эффекты мечанокортинов

Иейропротекторные и нейротрофнческие эффекты мечанокортинов

Семакс - синтетический аналог АКТГ4 10 27 Гипотеза о реализации ноотропного и нейропротекторного воздействия мечанокортинов через регучяцшо экспрессии белков семейства неиротрофинов

Характеристика вилковси о семейства неиротрофинов

Рецепторы неиротрофинов

Нейротрофический фактор мозга (BDNF)

Функции BDNI в нервной системе

Структура и регучяция транскрипции гена bdnf

Характеристика транскрипционного фактора CREB

CREB-зависимая активация транскрипции

Функции CREB в нервной системе

Характеристика фактора нейрогенеза VEGF

Экспрессия VLGF и рецепторов к VEGF в нервной системе

Структура и регуляция транскрипции гена \egf

Рецепторы VEGF

Функции VEGF в нервной системе материалы и методы исследования.

Эксперименты на культурах астроциюв и нейронов гиппокампа крысы

МТТ тест на количество живых клеток

Иммуноцитохимическое окрашивание первичных кучьтур нейронов на [ílll-myoyiwi 67 Опредечение уровней i ¡РНК иссчедуе мых генов в кучътурах астроцитов и нейронов гиппокампа крысы методом ПЦР 68 Определение уровней бечка BDNF в ку ¡ьтурах нейронов гиппокампа крысы методом иммуноферментного анализа

Эксперименты на живо гных in vivo

Определение уровней CREB и pCREB в гиппокампе методом шшуноблоттинга

Определение уровней бечков BDNF и NGF в гиппокампе крысы методом иммуноферментного анализа

Принудительное плавание

Почучение плазмы крови крысы

Определение уровней АКТГи а-МСГв образцах плазмы крови с помогцъю иммуноферментного анализа

Статист истичьская оценка результа гов результаты и их обсуждение.

1 Влияние острого стресса, вызванного принудительным плаванш м, на уровни а-МСГ и АКТГ в плазме крови крысы

2 Влияние а-МСГ и Семакса на уровень pCREB в гиппокампе крысы in vivo

3 Влияние а-МСГ, Семакса и Меланотана II на уровгнь BDNF и NGF в гиппокампь крысы in vivo

4 Влияние а-МСГ и Сьмакса па уровень белка BDNr в первичнои культуре нейронов гиппокампа крысы

5 Вовлеченность MC4R в осуществление эффектов а-МСГ и Семакса в культуре пгиронов гиппокампа крысы

6 Влияние mfjiahokoptuhob на экспрессию мРНК BDNF в культуре астроцитов i иппокампа крысы , вовлеченность MC4R

7 Влияние а-МСГ на экспрессию мРНК VEGF в культуре астроцш ов гиппокампа крысы, роль MC4R

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Физиология», 03.00.13 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе крысы альфа-меланокортином и его аналогами»

Центральная нервная система (ЦНС) чрезвычайно сложна как на молекулярном и клеточном, так и на структурно-функциональном уровне организации. В число задач, решаемых ЦНС, входит управление движениями, сенсорными и гомеостатическими процессами, многогранными проявлениями высшей нервной деятельности. Успехи современной нейробиологии позволили накопить значительное количество информации о таких важнейших функциях ЦНС, как обучение и память. Однако их молекулярные основы остаются в значительной мере неясными. Основным свойством нервной системы, обеспечивающим эти процессы, является ее пластичность, изучение которой позволит лучше понять механизмы интеграции высших функций мозга. Все процессы, происходящие в нервной системе, направляются на молекулярном уровне целым комплексом веществ-регуляторов. Их поиск, определение способа и области их влияния на пластичность и регенерацию нервной системы является одной из основных задач нейробиологии.

Неотъемлемой частью современной жизни является такое явление, как стресс - неспецифическая реакция организма на экстремальное воздействие, физическое или психологическое, а также соответствующее данной реакции состояние нервной системы (или организма в целом). В 30-х годах прошлого века Ганс Селье создал концепцию общего адаптационного синдрома, и отметил, что умеренное воздействие повреждающего агента может повышать защитные функции организма в ответ на действие не только данного, но и любого другого повреждающего агента. Адаптации, вызванные стрессогенными условиями, касаются как физиологических, так и поведенческих реакций организма. К поведенческим адаптациям при стрессе в первую очередь относятся повышение уровня генерализованной активации организма ("агошаГ'), фокусировка внимания и улучшение памяти, а также стрессвызванная анальгезия. Однако при таких нарушениях, как 5 генетические заболевания, биогенные или абиогенные повреждения ЦНС, а также слишком резко и драматично меняющиеся внешние условия, центральная нервная система теряет свою способность к адаптации. Нарушения адаптационных функций лежат в основе множества патологических состояний ЦНС, среди которых депрессия, хронический стресс и психические заболевания. Так в гиппокампе - ключевой структуре для процессов обучения и памяти - в результате дистресса нарушаются многие процессы и, в частности, нейрогенез, что влечет за собой ухудшение когнитивных функций. Изучение физиологии стресса и связанных с ней молекулярных реакций, в частности в ЦНС, является важнейшей задачей современной биологии и медицины, поскольку только понимание механизмов возникновения заболеваний поможет найти по-настоящему действенные способы их лечения.

Еще Селье считал, что значительная часть стрессорной реакции опосредуется гормонами коры надпочечников глюкокортикоидами. К настоящему моменту хорошо известна основная последовательность стрессовых гормональных реакций (Ткачук, 1983): кортиколиберин (КРГ) гипоталамуса вызывает увеличение секреции АКТГ гипофизом, в свою очередь, АКТГ увеличивает секрецию в коре надпочечников глюкокортикоидов. Однако показано, что при стрессе наряду с АКТГ в крови увеличивается концентрация такого фрагмента АКТГ, как а-МСГ (амеланоцитстимулирующий гормон, а-меланокортин, а-меланотропин) — представителя пептидного семейства меланокортинов (Carr et al., 1990;

Khorram et al., 1985). Роль этого соединения в осуществлении стрессорных реакций организма до конца не выяснена и представляется крайне интересной в свете ряда его функциональных особенностей. Пептиды семейства меланокортинов (МК) способны вызывать нейропротекторные эффекты и регенерацию нервной ткани (Joosten et al., 1999; Strand et al.,

1993). Кроме того, в многочисленных исследованиях у МК была выявлена способность стимулировать внимание, обучение и формирование памяти (De 6

Wied and Jolies, 1982; Stratton and Kastin, 1975). Таким образом, эти пептиды обладают одновременно нейропротекторными и ноотропными свойствами. Однако механизмы их действия на нервную систему до сих пор во многом остаются неясными. Одним из возможных механизмов действия меланокортинов является влияние на уровни экспрессии в ЦНС нейротрофических факторов - мощных регуляторов, как выживания и дифференцировки нейронов, так и когнитивных функций (Bibel and Barde, 2000; Zachary, 2005). Для таких важнейших нейротрофических факторов, как BDNF и VEGF показано, что их экспрессия находится под контролем транскрипционного фактора CREB (Greer and Greenberg, 2008; Jeon et al., 2007), активация которого, в частности в гиппокампе, тесно связана с процессами обучения и памяти (Lonze and Ginty, 2002).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью представляемой работы являлось изучение механизмов нейропротекторных и когнитивных эффектов альфа-меланокортина и его аналогов, включая исследование влияния данных соединений на экспрессию в гиппокампе крысы ряда нейротрофических факторов.

Основные задачи исследования состояли в следующем:

• Изучить изменения уровня а-МСГ в плазме крови крысы в условиях острого стресса, вызванного принудительным плаванием

• Изучить влияние а-МСГ на уровень активации транскрипционного фактора CREB в гиппокампе крысы

• Изучить влияние меланокортинов на уровни нейротрофинов (BDNF и NGF) в гиппокампе крысы in vivo

• Изучить влияние меланокортинов на уровни экспрессии нейротрофических факторов BDNF и VEGF в клетках гиппокампа крысы in vitro

• Оценить вовлеченность MC4R в осуществление эффектов представителей семейства меланокортинов на уровни BDNF и VEGF в клетках гиппокампа крысы in vitro

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Характеристика пептидного семейства мелапокортинов.

Меланокортины (МК) представляют собой класс эндогенных пептидных регуляторов, образующихся из 31-36-кДа белка-предшественника проопиомеланокортина (ПОМК, РОМС). Посттрансляционная модификация ПОМК, заключающаяся в его протеолитическом расщеплении, приводит к образованию ряда биоактивных пептидов, среди которых выделяют эндогенные опиоиды (a-, ß-, у-эндорфины), ß-липотропный гормон (ß-LPH), АКТГ и семейство пептидов, в которое входят а-, ß- и у-меланоцитстимулирующие гормоны, названное семейством меланотропипов в связи с их способностью стимулировать образование пигмента.

Процессинг ПОМК (см рис.1) происходит тканеспецифичным образом, в результате действия двух протеолитических ферментов, относящихся к классу сериновых протеаз, проконвертаз 1/3 и 2 (PC 1/3 и РС2). Под действием проконвертазы 1/3 образуются pro АКТГ и ß-LPH. Дальнейшее расщепление ргоАКТГ приводит к образованию N-концевого проопиокортина (N-POC), JP (joining peptide) и собственно АКТГ. Проконвертаза 2 способна расщеплять АКТГ1.39 на АКТГМ7 и CLIP (1corticotrophin-like intermediate lobe peptide). Карбоксипептидаза Е (CPE) и РАМ (peptidyl a-amidating топоохуgenäse) способствуют образованию деацетилированной формы da-a-МСГ, которая превращается в a-МСГ в ходе ацетилирования N-конца под действием N-ацетилтрансферазы (N-AT). РС2 также расщепляет ß-липотропный гормон на y-LPH и ß-эндорфин. У человека из y-LPH образуется ß-МСГ (Bicknell, 2008; Pritchard and White, 2007).

РС1-3

I Рго-АСТН I I ttL^H |

J^PCTS

I I QhD

Л pc 1:3 ггаюфнз

H-POC I [jp~j

J хЛ^РС2 ЛPC2

I 7«SH I [ ДСТН 1.17 11 t:i IP I I т-LPH

КЭ < гипоталамус, кожа, [ илЛ^н | f |lMin | промежуточная —доля ггагафюа .

УuMSH|

РС2

Рисунок 1. Процессинг проопиомеланокортина (Pritchard and White, 2007).

N-концевые фрагменты АКТГ, представляющие первые 13 аминокислот последовательности АКТГ, лишены способности стимулировать адренокортикальную секрецию. Последовательность АКТГыз соответствует а-меланоцитстимулирующему гормону (а-МСГ), структура которого идентична для всех позвоночных, в отличие от [3- и у-МСГ. Пептиды с аминокислотными последовательностями, входящими в последовательность АКТГ, в том числе и а-МСГ, получили название меланокортины. К меланокортинам часто относят и их аналоги (Antonawich et al., 1994; Hoi et al., 1994), содержащие замены в природной аминокислотной последовательности, модифицированные и D-аминокислоты, в связи с чем представляется справедливым включение в это семейство и пептида Семакс. а-МСГ изначально был известен как соединение, стимулирующее синтез меланинов и увеличение размеров и количества пигментных клеток в кожных покровах. Следует отметить, что короткие представители меланокортинов, включая аналоги, лишены не только способности стимулировать адренокортикальную секрецию, но и пигментстимулирующей способности, то есть активности меланокортинов большей частью проявляются в отношении нервной системы. Тем не менее, исторически сложившееся название меланокортины будет употребляться и далее в смысле семейства пептидов, входящих в аминокислотную последовательность АКТГ (рис. 2).

АКТГ а-МСГ

АКТГ(4-10)

АКТГ(4-7)

Семакс

Ser-Tyr-Ser Ser-Tyr-Ser

Mot-Glu-His-Phc-Arg-Trp-Gly Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly Met-Glu-His-Phe Met-Clu-His-Phe-Pro-Gly-Prc

Lys-Pro-Val-.+26 а.к.

Lys-Pro-Val

•Lys-Pro

Рисунок 2. Структура меланокортинов.

Еще в 70-е годы прошлого столетия голландский исследователь Дэвид де Вид (De Wied et al., 1975) установил, что АКТГ не только усиливает синтез гормонов в клетках коры надпочечников, но и непосредственно влияет на мозг экспериментальных животных, стимулируя внимание и память. Дальнейшие исследования показали, что таким ноотропным действием обладает не только целая молекула гормона, но и его фрагменты. Наиболее эффективным из них оказался пептид из семи аминокислот, АКТГ4. ю, занимающий в молекуле положение с 4-го по 10-е, а самый короткий фрагмент, сохраняющий активность целой молекулы гормона, - пептид АКТГ4.7. Выяснилось, что меланокортины ускоряют восстановление поврежденных нервов и созревание нервно-мышечной системы, а также оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; влияют па болевую чувствительность; регулируют работу сердечно-сосудистой системы; моделируют половое поведение; обладают антиопиоидной активностью; снижают потребление пищи и массу тела.

В дальнейшем было обнаружено, что и ПОМК, и АКТГ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге (Oliver and Porter, 1978). Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга (Civelli et al., 1982). Эти данные позволили прийти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но может сама продуцировать их.

Локализация и синтез меланокортинов в мозге млекопитающих.

В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется лишь начиная с 15 - 16-го дня эмбрионального развития. Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21 - 29 день постнатального развития (Khachaturian et al., 1983).

Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ4ю.

АКТГ4ю был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ4.10 возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга, в нем АКТГ4.10 обнаруживается как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ4.ю обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга (Antonawich et al., 1994). Вопрос о происхождении АКТГ4ю практически не освещен в доступной литературе; по-видимому, постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и сходное распределение этих пептидов в мозге.

Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ4.10 в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ4.ю в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии центральной нервной системы, а появление АКТГ4ю в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ4.10 в процессах регенерации ЦНС.

В разных отделах мозга взрослой крысы концентрация а-МСГ существенно различается. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса — в аркуатном ядре (Eslcay et al., 1979b). Учитывая, что это ядро дает проекции в другие отделы мозга, можно предположить, что именно оно является для них источником а-МСГ. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга (Eskay et al., 1979b; Eskay et al., 1979a). В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а кроме того - в черной субстанции (Arai et al., 1986). Интересно, что у больных, страдающих болезнью Альцгеймера, концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена.

С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе (Brownstein, 1980). В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза предшественника меланокортинов в гипоталамусе были получены дополнительные свидетельства - удаление части ПОМК-синтезирующих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРНК для ПОМК в гипоталамусе (Zhou et al., 2001). ПОМК или мРНК для ПОМК были обнаружены и в других отделах головного мозга: гиппокампе, амигдале, дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге (Civelli, 1983; Tranchand-Bunel, 1987). а-МСГ продуцируется не только в ЦНС. Было показано, что уровень а-МСГ в коже ряда грызунов сравним с уровнем этого пептида в отделах

13 головного мозга, не связанных с гипоталамусом (Thody et al., 1983), а ежедневная внутривенная инъекция меченного а-МСГ не привела к увеличению уровня а-МСГ в коже. Таким образом, было предположено, что а-МСГ продуцируется непосредственно в коже. Высокая его концентрация была выявлена в меланоцитах и клетках Лангерганса (Wakamatsu et al., 1997), а также в кератиноцитах (Rousseau et al., 2007).

Рецепторы к меланокортинам.

Меланокортиновые рецепторы (MCR) были выделены и клонированы в 1992-1994 годах. Они принадлежат к семейству рецепторов, связанных с G-белками, и представляют собой семидоменные трансмембранные белки. В отличие от других рецепторов, связанных с G-белками, MCR имеют в своей структуре короткую вторую экстрацеллюлярную петлю, интрацеллюлярпые домены на С-конце и короткий экстрацеллюлярный N-концевой домен (Starowicz and Przewlocka, 2003). Существует 5 типов МС рецепторов: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R (Mountjoy et al., 1992; Gantz et al., 1993; Chhajlani et al., 1993). Все 5 типов MCR схожи по строению: на N-конце расположен участок, способный к N-гликозилировапию, а также цистеиновый остаток на С-конце, который является потенциальным сайтом для ацетилирования жирных кислот. Меланокортиновые рецепторы содержат в своей структуре участки, узнаваемые протеинкиназой С и протеинкиназой A (Mountjoy et al., 1992), что указывает на возможность фосфорилирования. Подтипы рецепторов различаются по аминокислотному составу. Наиболее схожи МС4 и МС5 рецепторы - их структуры одинаковы на 60%. Аминокислотный состав MC1R и MC3R совпадает на 45%, а состав MC2R и MC4R - лишь на 38% (Schioth et al., 1998).

МСГ (а- и Р") обладает высокой афинностыо ко всем видам MCR, за исключением рецепторов 2 типа. MC2R селективны к АКТГ (Starowicz and Przewlocka, 2003).

Гены MC1R были клонированы впервые из клеток меланомы мыши и из культуры клеток человеческих меланоцитов (Chhajlani et al., 1993; Schioth et al., 1998). Из всех клонированных MC рецепторов MC1R обладали наиболее высокой аффинностью к а-МСГ (Mountjoy, 1994), который является физиологическим регулятором быстрого изменения цвета у низших позвоночных, включая рыб, амфибий и рептилий; а также стимулирует меланогенез в меланоцитах млекопитающих (Sawyer et al., 1980). MC1R были найдены во многих периферических тканях, а также в ЦНС (Hartmeyer et al., 1997; Wikberg, 1999). MCI рецепторы контролируют способность меланоцитов выделять пигмент меланин. Опыты показали, что активация рецепторов приводит к увеличению черно-коричневой пигментации животных, а уменьшение рецепторной активности к увеличению красно-желтой пигментации (Wikberg et al., 2000).

MC2R главным образом экспрессируется в пучковой зоне (сайт глюкокортикоидной продукции) и клубочковой зоне (сайт минералкортикоидной продукции) коры надпочечноков (Chhajlani et al., 1993). MC2R опосредуют стероидные эффекты АКТГ (Xia and Wikberg, 1996). Кроме того, мРНК MC2R экспрессируется в коже человека (Slominski et al., 1996). Экспрессия MC2R была также обнаружена в белой жировой ткани грызунов (но не человека). Было высказано предположение, что MC2R, экспрессируемые в адипоцитах различных млекопитающих, опосредуют липолитическую активность АКТГ (Boston and Cone, 1996). Мутации гена, кодирующего МС2 рецепторы, которые вызывают ослабление рецепторных функций, приводят к наследственной глюкокортикоидной недостаточности (Elias et al., 1999). Однако иногда этот синдром проявляется у людей с нормальным МС2-геном, что говорит о существовании других нарушений, приводящих к этому заболеванию.

Меланокортиновые рецепторы 3 типа обладают наибольшей афинностью к а-МСГ, Р-МСГ, у-МСГ и АКТГ . На периферии экспрессия

MC3R показана во многих органах и тканях (Chhajlani et al., 1993; Gantz et

15 al., 1993). Экспрессия MC3R также широко представлена в ЦНС: в гипоталамусе, таламусе, гиппокампе, передней миндалине и коре. Такое распределение MC3R указывает на возможную роль этого рецептора в реализации кардиоваскулярных эффектов МК и контроле над пищевым поведением (Low et al., 1994). Высокая плотность MC3R также показана в вентромедиальных ядрах гипоталамуса, включая аркуатное ядро, в заднем гипоталамусе и прозрачной перегородке. На основании большого количества этих рецепторов в клетках аркуатного ядра, которое известно, как место продукции ПОМК (см. выше), было высказано предположение о том, что MC3R функционируют как ауторецепторы и контролируют выброс меланокортинов из ПОМК-содержащих нейронов (Wikberg et al., 2000). Установлено, что в течение онтогенеза крыс экспрессия МСЗ рецепторов в ЦНС подвергается изменениям: при рождении экспрессия довольно низкая, затем она возрастает в течение 21 дня и далее остается неизменной (Xia and Wikberg, 1997). Существует предположение об участии этих рецепторов в контроле полового поведения (Wikberg et al., 2000). Изучение мутаций гена данного рецептора не выявило его функций, поскольку мутации не были связаны с фенотипическими характеристиками (Li et al., 2000).

МС4 рецепторы также являются нейрональными меланокортиновыми рецепторами. Детальное изучение их распределения в органах человека продемонстрировало низкий уровень MC4R на периферии. При этом экспрессия MC4R, также как MC3R, широко распространена в ЦНС: в стволе мозга, в промежуточном мозге и в коре. Распространение MC4R в этих отделах мозга свидетельствует об их возможном участии в регуляции вегетативных и нейроэндокринных функций. MC4R экспрессируются также в спинном мозге (Mountjoy and Wong, 1997). МС4 рецепторы появляются в эмбриональном мозге крыс на 18 день - задолго до MC3R (Kistler-Heer et al.,

1998). Активная экспрессия во время пренатального развития, вероятно, говорит о возможном участии MC4R в развитии нервной системы (Wikberg et al., 2000). Важной функцией МС4 рецепторов является контроль веса тела

16 и регуляция пищевого поведения (Wikberg, 1999). Однако центральные МС4 рецепторы могут быть также вовлечены в регуляцию других эффектов МСГ-пептидов. В частности, есть предположения, что чрезмерный грумминг и некоторые виды стереотипического поведения (синдром потягивания-зевания), вызванные введением АКТГ и а-МСГ, осуществляются именно через МС4 рецепторы (Wikberg et al., 2000).

Последними из меланокортиновых рецепторов были клонированы гены MC5R. Этот рецептор присутствует практически во всех тканях, но уровень его экспрессии в целом довольно низкий (Gantz et al., 1993). Относительно активно MC5R мРНК экспрессируется в экзокринных железах, таких как слезные, семенные, препунциальные, сальные железы и простата (van der Kraan et al., 1998). MC5R представлены и в некоторых областях мозга, включая гипофиз, обонятельную луковицу, черную субстанцию и стриатум (Griffon et al., 1994). Экспрессия мРНК обнаружена в адипоцитах мышей, но на более низком уровне, чем мРНК MC2R. Функции MC5R до сих пор до конца не изучены, известно что их активация опосредует слабую липолитическую активность а-МСГ в адипоцитах некоторых видов грызунов (Boston and Cone, 1996). У животных с дисфункцией MC5R была понижена продукция сальных желез, что приводило к затруднению отталкивания воды мехом и нарушению терморегуляции (Chen et al., 1997).

Связываясь с рецептором, меланокортины активируют ряд сигнальных каскадов (рис. 3). Все формы MCR функционально связаны с аденилатциклазой и осуществляют свое действие, в первую очередь, через активацию цАМФ-зависимого сигнального пути. Уровень цАМФ возрастает довольно быстро, достигая максимума уже через 15 минут. Посредством активации фосфолипазы С меланокортины приводят к увеличению концентрации и других вторичных мессенджеров (фосфоинозитидов и Са~ ).

Помимо высвобождения кальция из внутриклеточных депо под действием

1Р3, уровень Са2+ возрастает и из-за его поступления через кальциевые каналы L и Т-типа. Са2+ и цАМФ взаимодействуют с CaRE и CRE

17 элементами, которые находятся в области промоторов генов транскрипционных факторов (Fos, Jun). Наконец, меланокортины способны активировать гуанилатциклазу, повышая уровень цГМФ, причем в гораздо меньших концентрациях, чем это необходимо при стимуляции аденилатциклазы (Hol et al., 1994). Также получены данные о запуске меланокортинами Jak/STAT (Buggy, 1998) и МАРК (Daniels et al., 2003) сигнальных путей. синтез кортикостерондов образование меланина рост нейритов регенерация нервов выживаемость нейронов

IP, aq gg i —► cgmp экспрессия геноп cAMP

Рисунок 3. Сигнальные каскады, индуцируемые меланокортинами. MC - меланокортины, MCR - меланокортиновый рецептор, G - G белок, АС - аденилатциклаза, PLC - фосфолипаза С, 1Р3 - инозитолтрифосфат, DAG -диацилглицерол, СаМ - кальмодулин, GC — гуанилатциклаза, РКС -протеинкиназа С, РКА - протеинкиназа А.

Таким образом, связываясь с различными типами рецепторов, меланокортины выполняют широчайший спектр функций в различных органах и тканях. Они обладают стероидогенной, липолитической и иммуномодулирующей активностью, влияют на пищевое поведение, груминг, восприятие боли и процессы терморегуляции, участвуют в контроле кардиоваскулярных функций, а так же непосредственно влияют на внимание и память. В настоящем обзоре остановимся подробнее на роли МК в нервной системе, а точнее — ноотропных, нейротрофических и нейропротекторных свойствах МСГ-пептидов.

Взаимодействие меланокортинов с медиаторными системами.

Меланокортины воздействуют на метаболизм многих нейромедиаторов. Показано влияние этих пептидов на синтез, освобождение, обратный захват и обмен таких медиаторов, как дофамин, норадреналин, ацетилхолин, серотонин и ГАМК (Pranzatelli, 1994).

Проведены исследования способности АКТГ/МСГ-подобных пептидов связываться с различными рецепторами. Было показано, что АКТГ1.39 в микромолярных концентрациях взаимодействует in vitro с дофаминовыми (Florijn et al., 1991), опиатными (Snell and Snell, 1982), холиновыми Ml (Florijn et al., 1991), серотониновыми 5-HT1A, 5-HT1B (Florijn et al., 1991), и глютаматными (Trifiletti and Pranzatelli, 1992) рецепторами. АКТГ не связывается с бензодиазепиновыми, ГАМК-А, гистаминовыми HI (Florijn-et al., 1991), а-адренергическими (Duman et al., 1994) и мускариновыми M2 рецепторами. Обычно большей активностью обладают АКТГ^зд и фрагменты большей длины, а короткие фрагменты менее активны (Snell and Snell, 1982). Однако это верно не во всех случаях - АКТГ7.16 активнее, чем АКТГ(1-24) взаимодействует с дофаминовыми D2 рецепторами (Florijn et al., 1991) и опиатными рецепторами (Terenius, 1975). Таким образом, не существует прямой зависимости между длиной аминокислотной цепи и способностью связываться с рецепторами.

Меланокортины способны изменять активность ферментов, участвующих в биосинтезе медиаторов. Так, было показано, что однократное введение АКТГ4.7 увеличивает активность ацетилхолинэстеразы головного мозга крыс (Алексидзе et al., 1983). Аналог АКТГ4.9 НОЕ 427 через 30 мин после введения вызывает снижение уровня ацетилхолина и повышение уровня ацетилхолинтрансферазы и цГМФ в мозге (Wiemer et al., 1988). Вероятно, МК активируют метаболизм ацетилхолина.

Было показано, что введение АКТГ4.10 увеличивает количество дофамина в переднем мозге (Lichtensteiger et al., 1978). При в/ж введении АКТГ1.24 в течение часа наблюдается повышение концентрации дофамина в области хвостатого ядра, что сопровождается интенсивным грумингом (Florijn et al., 1993). Предполагается, что такие эффекты меланокортинов, как влияние на пищевое поведение, синдром потягивания-зевания и груминг связаны с дофаминовой системой (Ferrari and Giuliani, 1997). Введение галоперидола - блокатора дофаминовых рецепторов - ослабляет интенсивный груминг, вызванный МК. Кроме того, инъекции агонистов MCR в прилежащее ядро приводит к увеличению стереотипного поведения, что сопровождается активацией дофаминергической системы (Spruijt, 1992; Florijn et al., 1993). В экспериментах in vitro а-МСГ увеличивал продукцию цАМФ путем взаимодействия с D1 рецепторами (Cremer et al., 1998). Кроме того в/ж введение в течение 2-х недель агониста МС рецепторов меланотана II приводит к изменению связываемости D1 и D2 рецепторов. Афинность D1 рецепторов увеличивалась в прилежащем ядре, бледном шаре, но снижалась в ретикулярной части черной субстанции. Афинность D2 рецепторов снижалась в бледном шаре и увеличивалась в околоводопроводном сером веществе, компактной части черной субстанции и в области вентральной покрышки (Lindblom et al., 2002).

При инъекции фрагментов АКТГ увеличивается скорость обмена норадреналина, изменяется его содержание в определенных участках мозга снижается в вентромедиальных ядрах гипоталамуса, в аркуатном ядре и

20 увеличивает в голубом пятне (Felcete et al., 1978). Кроме того, было показано, что введение АКТГ после обучения животных в тесте выработки условного рефлекса избегания тока слабой интенсивности приводила к снижению содержания норадреналина в мозге на 20-40% (измерения проводились через 10 минут после сеанса обучения). Уровень норадреналина возвращался к контрольному через 30 минут (Gold and McGaugh, 1978). На основании этих данных было высказано предположение о том, что одним из действий АКТГ-подобных пептидов на ЦНС может быть увеличение освобождения норадреналина в ответ на внешние воздействия (Gold and Delanoy, 1981).

Было показано, что введение аналогов АКТГ вызывает усиление метаболизма серотонина в среднем мозге и медулле (Гецова et al., 1988) . В стволе мозга АКТГ-содержащие волокна локализованы в ядрах шва, которые содержат серотонин (Romagnano and Joseph, 1983). Ствол вовлечен в передачу болевой чувствительности и предполагают, что рецепторы серотонина могут опосредовать анальгезию, вызванную АКТГ (Wu et al., 1999). Кроме того, был выявлен антиамнестический эффект АКТГ (Ramaekers et al., 1978), по видимому, связанный с серотонинергической системой гиппокампа и для реализации этого эффекта необходима была последовательность АКТГ4.10.

Данные о взаимодействии меланокортинов с ГАМК-ергической системой достаточно малочисленны. Показано, что уровень циркулирующего в крови АКТГ влияет на связываемость ГАМК рецепторов. Так, системное введение АКТГ1.39 и АКТГ4.ю приводило к увеличению связываемости ГАМК рецепторов в среднем мозге и стриатуме (Kendall et al., 1982). В исследованиях in vitro показано, что АКТГ4.ю и АКТГ^ дозозависимо предотвращают связывание глютамата и мусцимола с ГАМК-А рецепторами. Авторы предполагают, что АКТГ и его фрагменты могут работать как антиконвульсанты (Ito et al., 1988).

Большой интерес исследователей вызывает вопрос о возможном взаимодействии меланокортинов с опиоидной системой мозга. В пользу

21 такого взаимодействия может свидетельствовать то, что а-МСГ и ß-эндорфин образуются из одного предшественника (ПОМК), хранятся в одних и тех же синаптических визикулах, одновременно выделяются в ответ на стрессорное воздействие (Adan and Gispen, 2000). Эти пептиды также взаимодействуют на рецепторном уровне. Показано, что АКТГ и его N-концевые фрагменты обладают сродством к опиоидным рецепторам in vitro (Gispen et al., 1976). АКТГ 24 является конкурентным ингибитором опиоидных рецепторов и дозозависимо вытесняет из рецепторов ß-эпдорфин (Hendrie, 1988). Исследование взаимодействия меланокортинов и опиоидов in vivo позволили высказать предположение о том, что эти пептиды являются антагонистами в ЦНС. Известно, что ß-эндорфин вызывает выралсенную анальгезию, каталепсию и ингибирует половое поведение животных. Все эти эффекты блокируются налоксоном. АКТГ во многих тестах оказывает действие, противоположное ß-эндорфину, — вызывает гиперальгезию при центральном введении, стимулирует половое поведение, ингибирует стериотипическое поведение мышей, вызванное введением морфина. При этом налоксон ингибирует интенсивный груминг, вызванный введением МК (Fratta et al., 1981); (Adan and Gispen, 1997).

Множественность эффектов МК может свидетельствовать о модулирующем влиянии пептидов этого класса на нейротрансмиссию. Анатомические связи ПОМК-содержащих нейронов с различными участками мозга, связанными с разными нейромедиаторами, обеспечивает возможность МК функционировать в качестве нейромодуляторов (Pranzatelli, 1994).

Ноотропные эффекты меланокортинов.

Первые сведения о действии АКТГ на память появились в середине 50-х годов. Было показано, что удаление передней доли гипофиза, где вырабатывается АКТГ, приводит к нарушению выработки условных рефлексов у экспериментальных животных (MURPHY and Miller,

1955) . Введение АКТГ нормализовало процесс обучения гипофизэктомированных животных (De Wied et al., 1975). Затем было обнаружено, что АКТГ ускоряет обучение и у интактных животных (Bohus and Endroczi, 1965). На основании многочисленных исследований было сделано заключение, что АКТГ обладает ноотропной активностью. Ноотропные эффекты кортикотропина не зависят от гормонального действия, а являются результатом его прямого влияния на центральную нервную систему, так как было показано, что аналогичным действием на обучение обладают а- и ß-МСГ , хотя они содержат лишь часть аминокислотной последовательности АКТГ и проявляют низкую кортикотропную активность (De Wied, 1969).

Показано, что введение антител к АКТГ приводит к ускорению угашения ранее выработанного рефлекса активного избегания и нарушает воспроизведение рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Эти результаты свидетельствуют о физиологической роли эндогенных МК в процессах обучения (De Wied and Jolies, 1982).

В настоящее время в литературе представлено большое количество данных по влиянию АКТГ и а-МСГ на выработку условных рефлексов. При этом в случае использования моделей обучения с отрицательным (болевым) подкреплением результаты неоднозначны. В одних работах показано, что у интактных животных эти гормоны улучшают выработку рефлексов с болевым подкреплением (Van Wimersma Greidanus et al., 1981), в других - не обнаружено влияние АКТГ на способность животных к избеганию болевого раздражителя (Kelsey, 1975). Авторы предполагают, что неоднозначность эффектов АКТГ при обучении животных в тестах с отрицательным подкреплением может быть связана с различным уровнем эндогенного АКТГ, в значительной степени зависящего от условий эксперимента. Исследования влияния АКТГ и а-МСГ на выработку рефлексов с положительным (пищевым, питьевым) подкреплением демонстрируют заметный улучшающий эффект (Stratton and Kastin, 1975).

В литературе также встречается множество данных о положительном действии АКТГ и а-МСГ на сохранение и угашение предварительно выработанных рефлексов. Торможение угашения под действием этих гормонов наблюдалось в самых различных модификациях опытов: в тестах активного (Nyakas and Endroczi, 1980) и пассивного (Dempsey et al., 1975); (Wiegant and Gispen, 1977) избегания удара током, в тестах с пищевым (Gray, 1971) и половым (Bohus et al., 1968) подкреплением, в тестах, основанных на вкусовом отвращении (Smotherman and Levine, 1978). Эти и другие исследования показали, что способностью ускорять обучение животных и улучшать сохранение выработанных навыков обладают также и фрагменты АКТГ и МСГ, заведомо лишенные гормональной активности.

Было показано, что АКТГ^ю и АКТГ4.10 влияют на обучение гипофизэктомированных животных также хорошо, как и АКТГ^ (De Wied, 1969), а АКТГ4.10 положительно влияет и на выработку условных рефлексов у интактных животных (Greven and De, 1973); (Flood et al., 1976), (Bohus and De, 1966). Фрагменты АКТГ47 и АКТГ5.ю также ускоряют выработку условных рефлексов (Виноградов et al. , 1980). Причем более активным из исследованных пептидов является АКТГ4.7. Фрагмент АКТГ4.ю положительно влияет на выработку навыков, основанных на положительном подкреплении (Вознесенская and Полетаева, 1984), в частности, ускоряют обучение в тесте Т-образный лабиринт (Ашмарин et al., 1978).

Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов.

Нейротрофические эффекты меланокортинов были' продемонстирированы во многих экспериментах in vitro и in vivo. Исследования in vitro показали, что МК влияют на нервные клетки в культуре: эффекты этих пептидов включают в себя повышение выживаемости нейронов, увеличение прорастания отростков, усиление синтеза белка и др. (Strand, 1999). Эксперименты показали, что а-МСГ стимулирует прорастание отростков в клетках нейробластомы линии Neuro2A. При этом введение антагониста MC4R (D-Apr8 АКТГ4.10) ингибирует стимулирующее действие пептида (Adan et al., 1996). Также показано, что а-МСГ увеличивает прорастание отростков в культурах нейронов спинного мозга (Van der Neut et al., 1988). Аналоги фрагментов АКТГ ORG 2766 и BIM 22015 также ускоряют прорастание отростков в культуре клеток спинного мозга в отсутствие фактора роста нервов (NGF), при этом эффекты пептидов были соспоставимы с эффектами самого NGF (Strand et al., 1993). Литературные данные также указывают на то, что МК оказывают влияние на рост и дифференцировку нейронов ЦНС в культуре клеток. Обработка культуры церебральных нейронов цыпленка AKTTi24 приводит к увеличению клеточного метаболизма и стимулирует прорастание отростков (Daval et al., 1983). Введение АКТГ4ю и AKTTi24 в культуру клеток мозга, полученных из эмбрионов крысы, приводит к увеличению плотности нейрональных сетей и количества нейронных связей (RichterLandsberg and Jastorff, 1986).

Меланокортины ускоряют регенерацию аксонов после повреждения периферических нервных волокон и стимулируют прорастание отростков в нейронах ЦНС. В случае повреждения периферических нервов и при ряде патологий МК являются эффективными ростовыми факторами, ускоряющими и улучшающими регенерацию нервов и мышечную реиннервацию (Strand et al., 1993). Морфологические исследования показали, что введение МК приводит к возрастанию числа регенирирующих аксонов, улучшает образование концевых пластинок и увеличивает количество реиннервированных моторных единиц, то есть МК воздействуют на весь комплекс реиннервации мышечных волокон, как NGF (Strand et al., 1993). а-МСГ оказывает стимулирующее влияние in vivo на прорастание отростков нейронов спинного мозга после травмы. У животных, получавших а-МСГ, ускорялось также функциональное восстановление. В

25 экспериментальной модели травмы спинного мозга у взрослых крыс, присутствие а-МСГ в коллагеновом матриксе, заполняющем место повреждения, вызывало прорастание внутрь него регенерирующих волокон (Joosten et al., 1999). МК облегчают восстановление как сенсорных, так и моторных функций после повреждения или перерезки периферических нервов у крыс (Edwards et al., 1984). Введение синтетического антагониста а-МСГ, (D-Trp7, Ala8, D-PhelO) а-МСГбц , в течение первых 10 дней после повреждения седалищного нерва крысы приводило к значительному замедлению восстановления функций организма. По мнению авторов, это свидетельствует о том, что эндогенные МК участвуют в регенерации нервной ткани и стимулируют рост периферических нервных волокон (Plantinga et al., 1995).

АКТГ/МСГ-подобные пептиды также способны оказывать положительное действие на восстановление функций организма при повреждениях центральной нервной системы, вызванных как перерезками в различных регионах мозга, так и введением нейротоксинов. Периферическое введение аналога AKTIVю BIM 22015 способствовало востановлению когнитивных функций у животных с повреждением фронтальной коры

Antonawich et al., 1994). Нейропротекторное действие меланокортинов было показано на животных с нарушением дофаминергической системы. После повреждения черной субстанции мозга инъекцией 6-OHDA у крыс наблюдались признаки, характерные для болезни Паркипсона (нарушения поведения и расстройства моторных функций). Восстановление всех этих функций значительно ускорялось при введении аналога АКТГ4.9 - ORG 2766 .

У животных, получавших пептид, отмечено ускорение восстановления поведенческих, морфологических и биохимических показателей по сравнению с контрольной группой (Strand et al., 1993). Кроме того, исследования показали, что у крыс, которым вводили ORG 2766, наблюдается увеличение содержания дофамина по сравнению с контролем

Antonawich et al., 1994). По мнению авторов, в основе функционального

26 восстановления после повреждения структур ЦНС могут лежать различные механизмы. С одной стороны, эти механизмы могут включать в себя защиту нейронов от дальнейшего разрушения, иннициацию синаптогенеза или пролиферации новых нейронов. С другой стороны, функциональное восстновление может происходить за счет компенсаторных процессов, таких как изменение плотности рецепторов, коллатеральный спрутинг, изменение скорости обмена медиаторов или их высвобождение неповрежденными нейронами (Antonawich et al., 1994).

В пользу участия эндогенных МК в процессах восстановления периферической нервной системы свидетельствует то, что после двусторонней перерезки периферических нервов возрастает уровень АКТГ4.ю в мотонейронах обоих вентральных рогов (Lee et al., 1994). Восстановление центральных нейронов при действии МК, вероятно, осуществляется за счет нейропротекторного действия пептидов, так как МК наиболее эффективны при введении сразу после повреждения нервной системы (Attella et al., 1992). Нейротрофическое действие меланокортинов, возможно, осуществляется через МСЗ, МС4 и МС5 типы рецепторов, которые экспрессируются в нервной ткани. Более того, короткий пептидный фрагмент АКТГ4.10, который узнается этими типами рецепторов, вызывает регенерацию нервных отростков in vivo (Bijlsma et al., 1983) и in vitro (Van der Neut et al., 1988). Положительные эффекты МК на повреждение нервного волокна имеют дозозависимый характер и более выражены при введении в короткий период после повреждения (Edwards et al., 1984). Наиболее действенными пептидами являются а-МСГ и аналог АКТГ4.9 ORG 2766 (De Wied, 1990).

Семакс — синтетический аналог АКТГ^ю.

В Институте молекулярной генетики РАН синтезирован пептид, имеющий структуру Met-GIu-His-Phe-Pro-GIy-Pro. Эта последовательность была выбрана для создания лекарственного препарата и получила название "Семакс" (семь аминокислот). Были проведены подробные исследования

27 влияния Семакса на функции центральной нервной системы животных, определены оптимальные дозы и сроки введения препарата, эффективность Семакса при различных способах введения, его влияние на обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя (АБЬтапп еИ а1., 1995).

В результате этих исследований были сделаны следующие выводы:

- введение Семакса ускоряет обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя; длительность эффектов Семакса значительно превышает длительность эффектов природного фрагмента АКТГ(4-10);

- увеличение дозы Семакса не приводит к реверсии его эффектов;

- интраназальное введение Семакса улучшает обучение животных также эффективно, как и внутрибрюшинное;

- введение Семакса повышает устойчивость животных к условиям гипобарической гипоксии;

- введение Семакса способствует уменьшению тяжести клинических проявлений экспериментального ишемического инсульта у животных;

- введение Семакса способствует восстановлению мнестических функций мозга в постреанимационном периоде.

Была исследована эффективность использования Семакса в качестве нейропротекторного средства в остром периоде полушарного ишемического инсульта (Гусев и др., 1997) Семакс оказывает выраженное нейропротекторное действие, основными компонентами которого являются торможение глиальных реакций воспаления, улучшение трофического обеспечения мозга, торможение синтеза оксида азота, и других реакций оксидантного стресса, а также иммуномодуляция (Скворцова и др., 1999).

Было показано (Эо1о1;оу е! а1., 2006Ь), что связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы зависимо от времени, специфично и обратимо, что отвечает основным критериям лиганд-рецепторного взаимодействия. Известно, что передача

28 сигнала от меланокортиновых рецепторов внутрь клетки происходит через соответствующие О-белки и регуляция аффинности рецепторов осуществляется внеклеточными ионами кальция. Специфическое связывание Семакса также зависит от присутствия в инкубационной среде ионов кальция (БоЬШу е! а1., 2006Ь). Вопрос о принадлежности его связывающих центров к известным меланокортиновым рецепторам требует дальнейшего исследования.

Гипотеза о реализации ноотропного и нейропротекторного воздействия меланокортинов через регуляцию экспрессии белков семейства нейротрофинов.

Меланокортины оказывают нейротрофическое влияние при повреждениях периферической нервной системы, следовательно, пептиды этого класа можно рассматривать как ростовые факторы (Бе \\^ес1, 1990). Восстановление центральных нейронов при действии МК, вероятно, осуществляет за счет нейропротекторного действия пептидов, так как МК наиболее эффективны при введении сразу после повреждения нервной системы (АИеПа й а1., 1992).

Показано что Семакс при его однократном введении в концентрациях 10"7М и 10"5М в культуру клеток нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы в день посева в 1.5 раза по сравнению с контролем увеличивает количество холинергических нейронов через 7 дней после посева. (Опуепшкоу е! а1., 2008). По мнению авторов, способность Семакса увеличивать выживаемость, по меньшей мере, холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга ставит вопрос о том, обусловлено ли нейропротекторное действие регуляцией Семаксом синтеза внеклеточных факторов выживаемости нейронов, либо ингибированием Семаксом влияния повреждающих нейроны внеклеточных факторов, либо прямым действием Семакса на внутриклеточные системы регуляции выживания/гибели клеток.

Исследования показали, что увеличение продукции цАМФ в нейрональных культурах стимулирует рост нейритов, в экспериментах in vivo также было показано, что увеличение продукции цАМФ ускоряет функциональное восстановление после повреждения периферических нервов (Cai et al., 2001). Все это свидетельствует о важной роли этого вторичного посредника в нейротрофических процессах. Известно, что рецепторы МК сопряжены с аденилатциклазой и эти пептиды вызывают увеличение продукции цАМФ в клетке. В свою очередь, цАМФ способен опосредовать экспрессию ряда белковых факторов, способствующих выживанию и регенерации нейронов.

С учетом известных клинических и физиологических эффектов меланокортинов, включающих как нейропротекторное, так и ноотропное действие, было высказано предположение, что они способны регулировать в клетках мозга экспрессию белковых нейротрофических факторов, возможно, семейства нейротрофинов. На культурах глиальных клеток базальных ядер переднего мозга крысы было показано (Dolotov et al., 2006b), что Семакс увеличивает экспрессию BDNF (см. ниже) и NGF (см. ниже) мРНК по сравнению с контролем в 8 раз и в 5 раз соответственно.

В связи с выдвинутой гипотезой о возможном участии нейротрофинов в осуществлении действия меланокортинов, в частности Семакса, на ЦНС, и имеющимися свидетельствами о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов в головном мозге крысы (Dolotov et al., 2006b), представляется необходимым в обзоре литературы отразить существующие в настоящее время данные об этом белковом семействе.

Характеристика белкового семейства нейротрофинов.

Нейротрофины — семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами и клетками нейроглии, и способствуют дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов.

На данный момент в семействе нейротрофинов принято выделять следующих представителей:

• фактор роста нервов, nerve growth factor, NGF (впервые описан в 1953 г.) (Levi-Montalcini, 1987);

• нейротрофический фактор, полученный из мозга, brain-derived neurotrophic factor, BDNF (Leibrock et al., 1989)

• нейротрофин-3, neurotrophin-3, NT-3 (Ernfors et al., 1990)

• нейротрофин-4/5, neurotrophin-4/5, NT-4/5 (Hallbook et al., 1991)

• нейротрофин-6, neurotrophin-6, NT-6 (Gotz et al., 1994)

• нейротрофин-7, neurotrophin-7, NT-7 (Nilsson et al., 1998)

Роль нейротрофинов в центральной и периферической нервных системах чрезвычайно важна и многообразна. Обобщая, можно выделить следующие основные функции.

• Во время эмбрионального развития нейротрофины способствуют выживанию нейронов;

• При развитии нервной системы с помощью нейротрофинов регулируется выживаемость нейронов (то есть в живых остаются только нейроны, получавшие достаточно нейротрофинов от клеток-мишеней, а «лишние» погибают);

• Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку;

• Под действием нейротрофинов происходит рост и ветвление дендритов (арборизация), и рост аксонов (спрутипг);

• В зрелой нервной системе нейротрофины участвуют в обеспечении пластичности, регулируя как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование (LTP). Гены, кодирующие нейротрофины, были обнаружены только у позвоночных (Gotz and Schartl, 1994). Последовательность зрелой формы человеческого BDNF (hBDNF) аналогична последовательностям найденным у свиньи, крысы и мыши (Rosenthal et al., 1991). Зрелая форма hBDNF имеет около 50% гомологии со зрелыми человеческими NGF, NT-3 и NT-4/5.

Трехмерная структура нейротрофинов содержит две пары антипараллельных ß-слоев и три дисульфидных мостика (McDonald and Hendrickson, 1993). Вариабельные домены определяют специфичность отдельных членов семейства. Зрелые активные формы нейротрофинов представляют собой стабильные нековалентно связанные гомодимеры с молекулярной массой около 28кД (McDonald and Blundell, 1991).

Рецепторы нейротрофинов.

Действие нейротрофинов реализуется через два типа трансмембранных рецепторов: Trie и р75 (рис. 4). Такая двойственная система позволяет передавать весьма разнообразные сигналы. Так, сигнал клеточной смерти реализуется через р75, а сигнал клеточного выживания - через Trk-рецептор.

Trie (tyrosin receptor kinase)-рецепторы принадлежат к семейству рецепторных тирозинкиназ. У млекопитающих открыто 3 типа Trlc-рецепторов: TrkA, TrkB и TrlcC. Предпочтительным лигандом для TrkA является NGF; для TrlcB -BDNF и NT4/5, а для TrkC - NT3. Эта специфика не является абсолютной. Например, NT3 может также связываться с TrkA и TrkB. Внутриклеточные тирозинкиназные домены весьма консервативны: около 80% аминокислот совпадает. Внеклеточные домены различаются сильнее (совпадает лишь около 30% аминокислот). У беспозвоночных не обнаружены молекулы нейротрофинов. Однако у некоторых видов (например, у моллюска Lymnaea stagnalis) выявлены ортологи Trlc-рецепторов (Bibel and Barde, 2000).

Связывание нейротрофинов с Trk-рецепторами приводит к фосфорилированию тирозинкиназных доменов и активации процессов, предотвращающих программируемую клеточную смерть и запускающих дифференцировку нейронов. proNGF proNT-3 proBDNF p to NT-4

NGF

1-nt-i

BDNF 1

NT—1

-¿jrat*. заде tyrosine ki L1.1SC p75NTR TrkA

TikC

Ti к li

Рисунок 4. Рецепторы нейротрофинов. (Reichardt, 2006). CI, С2 - цистеиновые кластеры, LRR1-3 - лейцин-богатые повторы, Igl, Tg2 -иммуноглобулинподобные домены, CR1-4 - обогащенные цистеином мотивы.

Следствием лиганд-зависимой димеризации тирозинкиназ является фосфорилирование определенных остатков тирозина, расположенных в так называемой активационной петле тирозинкиназного домена. При этом рецептор переходит в открытую конформацию, что обеспечивает возможность трансфосфорилирования и доступ субстрата к киназе. Фосфорилированные остатки тирозина Trk-рецептора выступают, как сайты связывания для молекул вторичных посредников и находятся в примембранной области на С-конце тирозинкиназного домена. Связывание Trk-рецепторов с лигандом запускает такие ферментативные каскады как Ras/Raf/MEK/MAPK путь, PI3K/Akt путь и PLC-зависимый путь (Bibel and Barde, 2000). К настоящему времени полностью не ясно, как именно нейротрофины регулируют транскрипцию тех или иных генов. Очевидно, что и CREB, и c-fos вовлечены в процессы, которые следуют за связыванием молекулы нейротрофина с Trk рецептором (Finlcbeiner et al., 1997).

Для всех трех типов Trk рецепторов описаны сплайсированные формы. Неполными могут быть как экстраклеточный, так и тирозинкиназный домены. Вариации в экстраклеточном домене оказывают влияние на лиганд-специфичность. Сплайсированные формы TrkC, и особенно TrkB, лишенные тирозинкиназного домена — так называемые укороченные формы - активно экспрессируются в зрелом мозге (Fryer et al., 1996). Укороченные формы рецепторов часто экспрессируются в ненейрональных клетках, где не происходит экспрессии полных форм TrkB (Klein et al., 1990). С помощью укороченных рецепторов происходит интернализация BDNF и ограничение его активности (Biffo et al., 1995). Существуют убедительные доказательства, что укороченные формы Trk рецепторов играют важную роль в отрицательной регуляции действия нейротрофинов (Eide et al., 1996).

Все нейротрофины могут взаимодействовать с р75-рецепторами. Аффинность связывания составляет ~10"9 М. Это меньше, чем характерно для связывания нейротрофинов с нейронами (в среднем около 10"11 М). р75-рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью и принадлежат к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) (Rodriguez-Tebar et al., 1990). Они модулируют функции Trk-рецепторов, повышая аффинность TrlcA к NGF (Mahadeo et al., 1994), снижая аффинность TrkB к BDNF и NT-4/5 и при этом существенно не влияя на связывание NT-3 с TrkC (Vesa et al., 2000). Кроме того, р75 выполняет ряд функций без участия Trk. Это такие функции, как ретроградный транспорт нейротрофинов (Curtis et al., 1995), влияние на миграцию шванновских клеток (Anton et al., 1994), активация транскрипционных факторов (Carter et al., 1996). В присутствие NGF этот рецептор способен как запускать программированную клеточную гибель, так и защищать клетки от апоптоза (Frade et al., 1996).

Нейротрофический фактор мозга (ВОИР).

В связи с тем, что такой представитель семейства нейротрофинов, как В ОКР, является ключевым соединением для нашего исследования, представляется целесообразным подробнее рассмотреть его геномную организацию, регуляцию экспрессии и функциональные особенности.

Рисунок 5. Образование и процессинг BDNF в центральной нервной системе (Barker, 2009). proBDNF может расщепляться фурином в эндоплазматическом ретикулуме (1), проконвертазами в секреторных везикулах (2). Во внеклеточном матриксе протеолиз proBDNF происходит при участии плазмина (3), кроме того, proBDNF может связываться с рецептором р75 (4), подвергаться эндоцитозу и расщепляться до BDNF, активируя TrkB внутри эндосом (5) или на поверхности клетки (6).

BDNF синтезируется в виде предшественника (proBDNF) с молекулярной массой 32 кДа, который гликозилирован и сульфатирован в области продомена (негликозилированная форма имеет молекулярную массу 28 кДа) и посттрансляционно расщепляется в аппарате Гольджи или секреторных везикулах с образованием зрелой формы белка (13511 Да). Шесть цистеиновых остатков образуют три дисульфидные связи. Изоэлектрическая точка белка лежит в основной области (р! 9-!0). В

35 растворе BDNF находится в виде нековалентно связанных димеров (Mowla et al., 2001).

ProBDNF накапливается в везикулах и высвобождается при деполяризации пресинаптической мембраны (Wu et al., 2004) (рис. 5). Ряд исследователей утверждают, что proBDNF образуется в больших количествах только в ходе эмбрионального развития и является короткоживущим интермедиатом, превращаясь в зрелую форму белка еще внутри клетки (Matsumoto et al., 2008). По мнению других, proBDNF эффективно экспрессируется и активно секретируется клетками, как в перинатальный период, так и в ходе постнатального развития (Yang et al., 2009).

Функции BDNF в нервной системе.

Одна из наиболее активно изучаемых функций нейротрофинов - их способность увеличивать жизнеспособность нейронов. BDNF был охарактеризован как фактор, предотвращающий апоптоз сенсорных нейронов, (Barde et al., 1982). У мышей с мутацией по trkB была отмечена постнатальная гибель нейронов гиппокампа и коры больших полушарий (Minichiello and Klein, 1996). Также, у bdnf У мышей наблюдалось нарушение формирования мозжечка и уменьшение в нем количества нейронов (Schwartz et al., 1997). Рассечение зрительного нерва приводит к гибели практически всех ганглиозных клеток сетчатки глаза, однако при введении BDNF большинство клеток выживает (Sawai et al., 1996). BDNF введенный в больших концентрациях (10-100 мг/л) вскоре после повреждения спинного мозга, ослабляет нарушение гематоэнцефалического барьера, препятствует образованию отека, снижает степень повреждения нейронов и глиальных клеток (Sharma, 2005).

Доказательства того, что BDNF регулирует ветвление аксонов во время развития ЦНС, были получены в работах на головастиках Xenopus. Введение BDNF в область верхних холмиков четверохолмия увеличивало арборизацию ганглиозных аксональных терминалей, а блокирование эндогенного BDNF имело противоположный эффект (Cohen-Cory and Fraser, 1995; Cohen-Cory, 1999).

Роль BDNF в процессах обучения и формирования памяти включает как кратковременные изменения электрических свойств нейронов, так и долговременные структурные изменения в синапсах.

BDNF способен модулировать количество синапсов и эффективность синаптической передачи. У мышей с повышенной экспрессией BDNF в симпатических нейронах наблюдалось увеличение количества синапсов, а у нокаутных по bdnf животных - уменьшение (Causing et al., 1997). В гиппокампах мышей, нокаутных по trkB, было отмечено уменьшение количества синаптических контактов, а также изменения в пресинаптической терминали, например, уменьшение количества везикул и снижение уровня экспрессии синаптических белков, ответственных за экзоцитоз везикул и выброс медиаторов (Martinez et al., 1998). С вышесказанным согласуются данные о снижении количества синаптических везикул в нервных окончаниях гиппокампальных клеток bdnf У животных. На синаптосомах, выделенных из гиппокампов нокаутных животных, было показано снижение уровня белков, ответственных за формирование везикул. Введение экзогенного BDNF компенсировало этот дефицит (Pozzo-Miller et al., 1999). По мнению авторов, эти результаты позволяют предполагать, что BDNF участвует в мобилизации и/или докинге синаптических везикул в пресинаптической терминали.

Первые данные о том, что BDNF способен быстро модулировать нейротрансмиссию, были получены в эксперименте in vitro на диссоциированных клетках эмбрионов Xenopus laevi: он увеличивал выброс ацетилхолина в течение нескольких минут после аппликации (Lohof et al., 1993). Более поздние исследования подтвердили эти данные (Schuman, 1999). Кроме того, было выяснено, что усиление нейротрансмиссии под действием BDNF опосредуется, в том числе, и через фосфорилирование синапсинов (Jovanovic et al., 2000).

Нейротрофический фактор мозга способен деполяризовать нейроны путем активации TrkB так же быстро, как это делает глутамат. BDNF резко усиливает глутаматергическую синаптическую передачу путем увеличения степени фосфорилирования одной из субъединиц NMDA рецептора и способствует высвобождению ацетилхолина. Введение антисмысловых олигонуклеотидов или антител к BDNF вызывает нарушение пространственного обучения (Yamada et al., 2002; Lipsky and Marini, 2007).

Нейроны животных, транскрипционный фактор CREB которых не способен связаться с соответствующей областью промотора гена BDNF, имеют гораздо меньше тормозных синапсов. На основании чего было выдвинуто предположение о влиянии стимул-специфичной экспрессии BDNF на установление правильных контактов между нейронами и изменение баланса между возбуждением и торможением в коре (Hong et al., 2008).

Было показано, что введение экзогенного BDNF в культуру нейронов гиппокампа в концентрации 100 нг/мл приводит к формированию устойчивых синаптических контактов (Taniguchi et al., 2006).

Множество исследований посвящено влиянию нейротрофинов, и в частности, BDNF, на долговременную потенциацию (LTP). Феномен LTP тесно связан с экспрессией генов и синтезом белков. Есть ряд доказательств того, что в процесс синаптической консолидации (путем регуляции локального синтеза белка) вовлечена система BDNF/TrkB (Soûle et al., 2006). На срезах гиппокампов, полученных из мозга bdnf'A мышей, было показано нарушение LTP в коллатералях Шафера, которое компенсировалось при добавлении BDNF (Korte et al., 1995). Кроме того, острое введение блокаторов BDNF или постнатальное селективное удаление TrkB также приводило к нарушениям LTP в гиппокампе (Minichiello et al., 1998). К тому же, со временем увеличивалась неполноценность этих животных с точки зрения пространственного обучения. В поведенческих тестах мыши вели себя так же, как животные с поврежденным гиппокампом (Minichiello et al., 1998).

Еще одним интересным подходом является изучение bdnf+l~ животных. Молодые взрослые особи, у которых индукция LTP находится в пределах нормы, показали пониженную обучаемость (Linnarsson et al., 1997). Продолжительность жизни у таких животных нормальная, однако у них развивается повышенная агрессивность и гиперфагия, сопровождаемая увеличением веса в возрасте ранней зрелости (Lyons et al., 1999; Kernie et al., 2000). Эти симптомы напоминают таковые при дисфункции серотонинергической системы, при этом известно, что BDNF оказывает трофический эффект па серотонинергические нейроны (Mamounas et al., 2000). Интересно, что повышенная агрессивность может быть скорректирована с помощью селективного ингибирования обратного захвата серотонина. К тому же, у bdnf+,~ животных уровень серотонина и плотность серотонинергических аксонов снижаются. Изменения в экспрессии нескольких типов серотониновых рецепторов были отмечены в коре головного мозга, гиппокампе и гипоталамусе. Введение BDNF приводило к потере 30% веса тела в течение 16 дней, что коррелировало с уменьшением размеров адипоцитов. Спустя 90 дней после окончания эксперимента, мыши восттанавливали свой исходный вес (Lyons et al., 1999).

Не так давно было исследовано расположение BDNF- и TrkB-содержащих структур в клетках центрального ядра амигдалы и аксонах корковых входов. Было показано, что в дендритах нейронов амигдалы в значительном количестве присутствуют BDNF и pro-BDNF, а также, в меньшем количестве, TrkB. В аксонах корковых нейронов BDNF зафиксирован не был, но была обнаружена значительная концентрация TrkB-рецепторов. Авторы предполагают, что взаимодействие нейротрофин-содержащих терминалей центрального ядра амигдалы с различными корковыми входами может играть важную роль в ассоциативном обучении. (Agassandian et al., 2006)

Структура и регуляция транскрипции гена bdnf.

Ген bdnf (рис. 6) состоит из восьми 5'-нетранслируемых экзонов и одного З'-концевого экзона, кодирующего белок, и транскрибируется с нескольких промоторов, расположенных левее З'-некодирующих экзонов, что приводит к образованию гетерогенной популяции мРНК. BDNF-транскрипты содержат один из восьми 5'-экзонов, который сплайсирован с 3'-кодирующим экзоном. Все сплайс-донорные и сплайс-акцепторные сайты в местах сочленения экзонов и интронов весьма консервативны. Гомология 5'-экзонов человека и грызунов колеблется от 45% до 95%, составляя 95, 93, 62, 91, 86 и 45 процентов соответственно для I, II, III, IV, VI и VII экзонов. В результате альтернативного сплайсинга образуются транскрипты, которые отличаются только З'-экзоном и являются специфичными для определенных тканей и различных областей мозга.

G S

-dWZZb

17 4h S

О 6 Vh О 5 чй

О 3 ktl О ■) kb

27 kb

4h в 4. payiA-, V,

D— в

11 к»

11 Stift в.* |вд* 16«. S I | -СШ-ПШ-И-/MZHHH3-GQ—//—&Ч

О 6 кь о «ь а г kh 0 3kb OinbD«*h 0 3 ко О 3 кь

•ignak . V

EU

BDNF VHI

GDNF IXA

Рисунок 6. Экзон-интронная структура гена BDNF (Aid et al.( 2007). A - структура гена BDNF крысы, описанная (Timmusk et al., 1993). В - структура гена BDNF крысы, описанная (Aid et al., 2007).

Каждый из 11 вариантов, полученных в ходе альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3' области IX экзона. Неясно как происходит сплайсинг внутри II экзона в гене BDNF крысы, вероятно, используются альтернативные сплайс-донорные сайты (А, В, С) в этом экзоне, что приводит к образованию трех различных транскриптов.

Транскрипты, включающие I и III - VIII экзоны были обнаружены как в различных отделах мозга, так и в ненейрональных тканях, таких как семенники, легкие, сердце, тимус, печень и селезенка. мРИК несущая II экзон, представлена сплайс-вариантами А, В, С в мозге и не обнаружена в периферических тканях. (Aid et al., 2007).

Рисунок 7. Комплекс транскрипционных факторов IV промотора BDNF в репрессированном и активированном состояниях (Greer and Greenberg, 2008).

В настоящий момент охарактеризовано несколько транскрипционных факторов, под контролем которых находятся промоторы гена BDNF. К таким факторам относятся CREB (с AMP-responsive element binding protein), USF1/2 (:upstream stimulatory factors 1/2), CaRP (calcium-responsive transcription

- Ca2+ Ca2+ factor), MeCP2 {methyl-cytosine binding protein), MEF2 (myocyte enhancer factor 2) и Npas4 {neuronal PAS domain-containing protein 4).

Промоторы I и IV являются наиболее чувствительными к нейрональной активации, причем последний остается наиболее хорошо изученным и охарактеризованным. В отсутствии стимулов, IV промотор BDNF репрессирован и связан, по крайней мере, с четырьмя из вышеперечисленных транскрипционных факторов (CREB, USF1/2, МеСР2 и MEF2).

После активации Са2+-зависимого сигнального пути под действием иейромедиатора (Shieh et al., 1998; Tao et al., 1998) репрессорный транскрипционный комплекс преобразуется в активаторный и запускает транскрипцию BDNF (рис. 7). Для полной активации транскрипции гистоны должны перейти из метилированного состояния в ацетилированное. Деметилирование гистонов в области IV промотора осуществляет гистондеметилаза JARID1C/SMCX. Повышение концентрации Са~ в ядре приводит к диссоциации MEF2 от гистондеацетилазы (HDAC). Это становится возможным благодаря дефосфорилированию MEF2 кальцинеурином и фосфорилированию HDAC4 CaMKII. В это же время происходит фосфорилирование CREB и его ассоциация с коактиватором СВР (CREB-binding protein). Последний обладает гистонацетилтрансферазной активностью и способностью собирать компоненты комплекса РНК полимеразы II. Все эти события происходят в течение ~5 минут после высвобождения иейромедиатора в синаптическую щель. Через ~15-30 минут ядерная форма CaMKII фосфорилирует МеСР2, вызывая диссоциацию репрессорного комплекса, состоящего из Sin3/ HDAC и метилтрансферазы, от IV промотора BDNF, что приводит к активации транскрипции. В это же время с областью промотора IV экзона связывается следующий транскрипционный фактор - Npas4, поддерживающий активацию транскрипции (Greer and Greenberg, 2008).

Очевидно, что такой сложный механизм регуляции транскрипции обеспечивает образование строго определенного количества BDNF в

42 надлежащем месте, за ограниченный временной интервал. Многообразие транскрипционных факторов позволяет по-разному отвечать на различную частоту стимуляции и уровень Са" в ядре и цитоплазме. Возможно, различные типы клеток экспрессируют и используют только некоторые транскрипционные факторы в определенных комбинациях.

Из всего множества факторов регуляции транскрипции, влияющих на экспрессию BDNF, в данном обзоре рассмотрим подробнее такой широко распространенный белок, как CREB.

Характеристика транскрипционного фактора CREB.

Белок CREB {cyclic AMP response element-binding protein) — один из наиболее хорошо изученных и важных транскрипционных факторов. К настоящему времени накоплено достаточно большое количество экспериментальных данных, позволяющих утверждать, что CREB-зависимая экспрессия генов играет важнейшую роль в развитии и функционировании нервной системы. В связи с тем, что транскрипция генов нейротрофинов, в частности BDNF, находится под контролем CREB, представляется целесообразным уделить внимание этому транскрипционному фактору.

CREB принадлежит к так называемому bZIP надсемейству транскрипционных факторов, характерной особенностью строения которых является наличие в С-концевой части молекулы домена, регулирующего связывание с ДНК, и лейциновая застежка, обеспечивающая димеризацию.

Несмотря на наличие экспрессии CREB в различных тканях, особенно важна его роль в функционировании нервной системы. К изменению уровня активации CREB в нервной системе приводят такие разнообразные внешние воздействия на организм, как обучение, новизна стимула, физическая нагрузка, боль, воспаления, травмы, гипоксия, гипогликемия и др. CREBзависимая экспрессия генов играет значительную роль как для развивающейся, так и для взрослой нервной системы. Она активируется под действием нейромедиаторов и факторов роста и участвует в регуляции таких

43 процессов, как рост, дифференцировка, выживаемость нейронов, циркадные ритмы. Особенно важным и интересным моментом является регуляция синаптической пластичности — основы основ обучения и памяти.

В 1986 году в промоторе соматостатина была обнаружена последовательность из восьми пар нуклеотидов (TGACGTCA3-5), ответственная за активацию гена в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ (Montminy et al., 1986). Данная последовательность получила название CRE {cyclic AMP response element), и позже была обнаружена и в промоторах других генов. В 1987 году в ядерных экстрактах клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 с помощью CRE-афинной колонки был обнаружен фосфопротеин массой 43 кДа, связывающийся с CRE последовательностью и названный CREB (Montminy and Bilezikjian, 1987). В 1988 году была клонирована и секвенирована ДНК, кодирующая CREB (Hoeffler et al., 1988). А в начале 90х гг. прошлого века были обнаружены несколько изоформ CREB, образующихся при альтернативном сплайсинге, в частности альфа и дельта изоформы. Со временем были описаны и другие транскрипционные факторы похожей структуры, в совокупности образовавшие семейство белков CREB. Кроме обнаруженного первым CREB1 к нему относятся такие белки, как CREM (cAMP response element modulator) и ATF1 {activating transcription factor 1). В настоящем обзоре основное внимание будет направлено на строение и функции наиболее исследованного представителя семейства CREB - белка CREB1 (далее - CREB).

На С-конце белка CREB расположен богатый лизином и аргинином основной домен, отвечающий за связывание с ДНК и лейциновая застежка (bZIP), обеспечивающая димеризацию. В центре расположен 60-ти аминокислотный индуцируемый киназой домен KID - {kinase-inducible domain), который содержит участки фосфорилирования. KID фланкирован гидрофобными богатыми глутамином участками, обозначенными Q1 и Q2 (Mayr and Montminy, 2001).

CREB-зависимая активация транскрипции.

Инициация транскрипции посредством CREB в ответ на увеличение концентрации цАМФ начинается с активации CREB путем фосфорилирования по Ser-133. Опосредовать это фосфорилирование могут такие ферменты, как протеин киназа A (Gonzalez and Montminy, 1989), различные типы кальмодулин киназ (Lonze and Ginty, 2002), серин-треонин киназы семейства Akt (Yano et al., 2005), ERK (в частности, МАРК) (Patapoutian and Reichardt, 2001; Sweatt, 2001)и другие. Степень фосфорилирования CREB коррелирует с интенсивностью стимула и с уровнем экспрессии гена-мишени. Дефосфорилирование Serl33 CREB фосфатазами приводит к потере транскрипционной активности (Lonze and Ginty, 2002).

Рисунок 8. Связывание pCREB с ДНК и образование СКЕВ-СВР комплекса.

Фосфорилированный CREB связывается в виде димера с консервативной последовательностью ДНК - CRE (ТОАССТСА1 (рис. 8). Происходит ли димеризация до или после связывания к настоящему времени остается невыясненым. За связывание с ДНК отвечает Ь71Р домен CREB. Кроме того, в образовании связи принимает участие ион магния в гидратной оболочке. По-видимому, он необходим для стабилизации связи, так как мутация по Lys304 (замена на аланин), который и обеспечивает связь CREB с ионом магния, приводит к серьезным нарушениям связывания CREB с ДНК (Craig et al., 2001). Таким образом, способность магния усиливать ДНК-связывающую активность CREB может стимулировать биологический механизм, посредством которого «заполненность» CRE-сайта может модулировать ответ на клеточные сигналы. Однако остается невыясненным, изменяется ли внутриядерная концентрация магния в ответ на биологически значимые стимулы.

CRE-последовательность была изначально зарегистрирована как палиндром, состоящий из восьми пар оснований (TGACGTCA), позднее CRE была выделена в виде молекулы, содержащей половину этой последовательности (CGTCA). CGTCA-молекулы значительно менее активны в отношении связывания pCREB. В литературе описано около 100 генов, содержащих функциональную CRE-последовательность (Mayr and Montminy, 2001). Из них примерно половина содержит полный палиндром, а остальные - полу последовательность. Интересно, что замена Lys304 на аланин серьезно нарушает связывание CREB с полным палиндромом CRE, но практически не влияет на связывание с полупоследовательностью. К настоящему времени нет окончательного мнения по поводу того, регулирует ли цАМФ связывание CREB с ДНК. Исследования связывания in vitro показали, что фосфорилирование CREB по Serl33 не влияет на сродство CREB к полному CRE-палиндрому, однако наблюдается стимуляция связывания с полупоследовательностыо (Nichols et al., 1992). Считается, что связывание CREB и CRE регулируется с помощью метилирования ДНК. Полная CRE-последовательность (TGACGTCA) содержит центральный CpG динуклеотид, и метилирование по этому сайту блокирует связывание с CREB in vitro (Iguchi-Ariga and Schaffner, 1989). В связи с недостатком CpG динуклеотидов в человеческом геноме, реальное число CRE-палиндромов

4710) примерно в 10 раз меньше предсказанного (50000) (Mayr and Montminy, 2001).

Однако, самого по себе связывания CREB с мишенью недостаточно для инициации транскрипции генов. Чтобы она произошла, необходимо чтобы с CRJEB связался коактиватор, который выполнит роль посредника между CREB и РНК-полимеразным комплексом (рис. 8). Роль коактиватора выполняет CREB-связывающий белок СВР (CREB-binding protein) и его гомолог Р300 (Kwok et al., 1994; Nichols et al., 1992). Эти белки не взаимодействуют с ДНК, но взаимодействуют с активаторами транскрипции, в данном случае с CREB. За связывание с СВР отвечает KID-домен CREB.

После фосфорилирования по Serl33 KID формирует пространственную структуру из двух перпендикулярных друг другу спиралей: А и В. Спираль В обладает амфипатическими свойствами и обеспечивает взаимодействие с СВР. Serl33 находится на ее N-конце и образует ионную связь с Lys662 и водородную связь с Туг668 белка СВР (Mayr and Montminy, 2001).

Таким образом, pCREB оказывается связан с ДНК и, через СВР - с транскрипционным комплексом, а конкретно — с РНК-полимеразой II (через РНК-геликазу А) (рис. 9). Необходимо также отметить, что СВР способен ацетилировать гистоны, тем самым способствуя подготовке хроматина к транскрипции.

Кроме того, (^2-домен CREB способен связываться с компонентом TAF130 (Saluja et al., 1998) транскрипционного фактора TFIID, связывающегося с областью промотора ТАТА-box, служащей для определения стартовой точки транскрипции. TFIID связывается с TFIIB — транскрипционным фактором, отвечающим за связывание с РНК-полимеразой II. (^2-домен CREB также связывается с TFIIB.

Было показано, что (^2-домен способен вызывать сборку комплекса РНК-полимеразы II in vitro, тем самым обеспечивая фоновый уровень транскрипции CREB-зависимых генов (без образования CREB-CBP комплекса) (Kim et al., 2000).

Подавление активности 02 может являться важным фактором в развитии полиглутамин-вызванных расстройств. Некоторые нейродегенеративные заболевания, в том числе хорея Хантингтона, вызваны увеличением числа САв-повторов, кодирующих полиглутаминовые участки. Было показано, что эти участки связываются с ТАР130, подавляя СЯЕВ-зависимую транскрипцию (8Ь1ШоЬа1а е1 а1., 2000).

Активность СПЕВ играет важную роль в предотвращении апоптоза: полиглутаминовые участки индуцируют клеточную смерть, но этот эффект может быть устранен сверхэкспрессией ТАР 130 в поврежденных клетках (8Ыто1Ша & а!., 2000).

Рисунок 9. Структура транскрипционного комплекса при CREB-зависимой транскрипции,

KID, Q2 - домены CREB; СВР - (CREB-binding protein) - коактиватор транскрипции; TFIID - транскрипционный фактор, связывающийся с TATA-box\ TAFI30 (TBP-associated factor 130), TBP (TATA binding protein) -структурные компоненты TFIID; TFIIB - транскрипционный фактор, привлекающий РНК-полимеразу II

Кроме Ser 133 KID-домен CREB содержит и другие сайты фосфорилирования: Ser 142 и Ser 143. Фосфорилирование по этим сайтам

48 приводит к разрыву связи pCREB с СВР. Вероятно, подобное взаимодействие необходимо для более тонкой регуляции CREB-зависимой активации транскрипции. Для этой же цели, скорее всего, необходимы и модификации СВР. Было показано, что CaMKIV может фосфорилировать СВР по Ser301, что стабилизирует CREB-CBP связь. Метилирование аргининовых остатков в ответственном за связывание с CREB-домене СВР приводит к разрыву связи с pCREB (Lonze and Ginty, 2002).

Вышеописанный сложный механизм регуляции активации CREB-зависимой транскрипции совершенно необходим, поскольку CRE-последовательность в своем промоторе содержат более сотни генов. Соответствующие белки выполняют самые разнообразные функции: участвуют в регуляции метаболизма, транскрипции, клеточного цикла, иммунного ответа; выполняют сигнальные, транспортные и структурные функции. Гены многих нейромедиаторов и факторов роста также являются CREB-зависимыми. Например, зависима от CREB экспрессия таких белков, как цитохром С, пируват карбоксилаза, Вс1-2, инсулин, нейротрофический фактор мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), интерлейкины 2 и 6, Na+, К+-АТФаза, аквапорин 2, фибронектин и многие другие (Lonze and Ginty, 2002).

Функции CREB в нервной системе.

CREB-зависимая экспрессия генов важна как для развивающейся, так и для взрослой нервной системы. Она активируется под действием нейромедиаторов и факторов роста и участвует в регуляции таких важнейших процессов, как рост, дифференцировка, выживаемость нейронов, циркадные ритмы, а так же синаптической пластичности - основы основ обучения и памяти.

Было показано, что белки семейства CREB необходимы для выживания нейронов различных подтипов in vitro (Bonni et al., 1999). Исследования с использованием нокаутных мышей подтвердили эти результаты и продемонстрировали вовлеченность CREB в выживаемость сенсорных нейронов ганглиев заднего корешка спинного мозга in vivo и симпатических нейронов in vitro (Lonze et al., 2002). Ингибирование активности CREB индуцирует апоптоз в симпатических нейронах (Riccio et al., 1999), в то время как сверхэкспрессия CREB предотвращает апоптоз, вызванный окадаиновой кислотой (Walton et al., 1999). Существует гипотеза, что положительное влияние CREB на выживаемость нейронов опосредуется регуляцией транскрипции антиапоптотического фактора bcl-2 (Riccio et al., 1999). Эксперименты на нокаутных мышах показали, что рост нейритов также зависим от CREB, как in vitro (Lonze and Ginty, 2002), так и in vivo (Teng and Tang, 2006).

Активация CREB происходит не только в ответ на сигналы роста и выживания, но и в ответ на негативные стимулы (Deak et al., 1998). Фосфорилирование CREB в нейронах происходит в ответ на гипоксию и окислительный стресс. Получено достаточно большое количество доказательств нейропротекторных свойств CREB. Так ишемия вызывает вызывает фосфорилирование CREB в гиппокампе крысы. Оно кратковременно в нейронах CAI и пролонгировано в зубчатой извилине (Ни et al., 1999). При этом нейроны CAI значительно больше страдают от ишемии, чем нейроны зубчатой извилины. Кроме того показано, что введение CRE-связывающих олигодезоксинуклеотидов, предотвращающих активацию CREB-зависимой транскрипции генов, усиливает негативное действие цитотоксических стимулов (Mabuchi et al., 2001).

Известно, что синтез белков необходим для формирования долговременной памяти. Было показано, что долговременная нейрональная пластичность включает инициируемую стимулом активацию протеинкиназ, которые, в свою очередь активируют (фосфорилируют) конститутивные факторы транскрипции, и, в частности, CREB. CREB затем активирует как индуцируемые факторы транскрипции (напр., c-Fos, zif268), так и гены позднего ответа (напр., Arc), которые могут изменять эффективность

50 синаптической передачи (Colombo, 2004). Индуцируемые факторы транскрипции инициируют экспрессию генов позднего ответа, кодирующих рецепторы, синапсины и другие структурные белки. Предполагают, что прежде всего продукты CREB-зависимых генов модифицируют самый активный синапс и происходит образование новой связи. Другие активные синапсы также могут быть модифицированы, но уже в меньшей степени. Те синапсы, через которые сигнал не идет, остаются без изменений (Frey and Morris, 1997).

Итак, CREB-зависимая экспрессия генов играет важную роль в синаптической пластичности и, в частности, ее принято связывать с долговременной памятью, как у беспозвоночных, так и у млекопитающих.

Среди экспериментов на беспозвоночных животных, в первую очередь следует упомянуть эксперименты Кендела с сотр. на аплизии (Kandel, 2001). В его лаборатории было показано, что CREB активирует синтез белков, необходимых для долговременной фасилитации - клеточной модели памяти у апплизии. Кроме того, в экстрактах полученных из центральной нервной системы аплизии, а также из сенсорных нейронов, были обнаружены белки, похожие на CREB млекопитающих, которые специфически связывались с CRE последовательностью млекопитающих. Микроинъекции CRE последовательности в ядра сенсорных нейронов блокировали долговременное увеличение проводимости синапсов. Полученные данные позволяют предполагать, что CREB-подобные активаторы транскрипции являются важным звеном формирования долговременной памяти у этих моллюсков (Dash et al., 1990).

Кроме аплизии важным объектом исследований среди беспозвоночных стала Drosophila melanogaster. У A-CREB мутантов (Ser 133 замещен Ala) блокирован процесс консолидации памяти и они не способны к обонятельному обучению. Напротив, при повышенной экспрессии CREB наблюдается улучшение обучения (Mayr and Montminy, 2001).

У позвоночных также найдено множество подтверждений того, что CREB-зависимая экспрессия генов играет заметную роль в регуляции обучения и памяти. Исследования в таких тестах, как водный лабиринт, обстановочный рефлекс страха, пространственное обучение и социально-обусловленное предпочтение пищи показали, что у мышей с дефектными а-и ô-изоформами CREB наблюдаются глубокие нарушения долговременной памяти. При этом кратковременная память (30-60 минут) остается в норме (Kogan et al., 1997).

Долговременная потенциация играет ключевую роль в процессах формирования памяти. На срезах гиппокампа CREB-мутантных мышей LTP падает до базового уровня через 90 минут после тетанической стимуляции, в то время как в норме этот период составляет несколько часов (Bourtchuladze et al., 1994).

Введение комплементарных олигодезоксинуклеотидов, направленных против CREB мРНК не приводило к изменениям кратковременной (4 часа) памяти крыс при обучении в водном лабиринте, однако долговременная память (48 часов) оказалась нарушенной. Введение тех же олигодезоксинуклеотидов через 24 часа после тренинга не приводило к изменениям консолидации долговременной памяти (Guzowski and McGaugh, 1997).

Был проведен эксперимент для выяснения вопроса: связан ли дефицит пространственной памяти у старых мышей с изменениями уровня фосфорилирования CREB в гиппокампе. На 5 — 6-месячных (молодых) и 23 -24-месячных (старых) мышах проводили тесты в водном лабиринте, направленные на изучение пространственной памяти. Через определенные промежутки времени после обучения определяли иммуноцитохимически уровни pCREB и общего CREB. У молодых мышей уровень pCREB в области CAI и зубчатой извилине увеличивался через 15 и 60 мин после обучения. Напротив, у старых мышей уровень pCREB в тех же структурах снижался через 15 мин после обучения при одинаковых уровнях тотального CREB как у старых, так и молодых животных (Porte et al., 2007).

Со снижением уровня активации (фосфорилирования) CREB в гиппокампе крыс связано возрастное ухудшение результатов в таких тестах, как формировании обстановочного рефлекса страха (Kudo et al., 2005) и социально-обоснованное пищевое предпочтение (Countryman and Gold, 2007).

Показано (Brightwell et al., 2005), что замена Serl33 на Ala (делающая невозможным фосфорилирование CREB по этому сайту) приводила к нарушению долговременной памяти (через 11 дней после обучения) у крыс в тесте на социальное пищевое предпочтение. При этом кратковременная память (тестирование сразу после обучения) оставалась в норме.

Были проведены исследования (Colombo et al., 2003), в которых крысы могли решить задачу в радиальном лабиринте с пищевым подкреплением с помощью гиппокамп-зависимой стратегии места (т.н. /?/ясе-стратегии) или неостриатум-зависимой стратегии ответа (т.н. response-стратегии). Измеряли уровень фосфорилирования CREB в гиппокампе и дорзальном неостриатуме. Активация CREB немедленно после тренинга была обнаружена в обеих структурах, что, по мнению авторов, говорит о том, что фосфорилирование CREB инициируется обучением, но не является специфичным для одной структуры мозга, ассоциируемой с памятью при каждой из стратегий. Однако через 1 час после тренинга уровень pCREB был повышен в гиппокампе у крыс, выбравших стратегию места, и в неостриатуме у крыс, выбравших стратегию ответа.

Таким образом, к настоящему времени накоплено достаточно большое количество экспериментальных данных, позволяющих утверждать, что

CREB-зависимая экспрессия генов играет важнейшую роль в развитии и функционировании нервной системы. Такие ключевые процессы центральной нервной системы, как обучение и память, по всей видимости, являются зависимыми от уровня активации транскрипционного фактора

53

CREB. Несмотря на то, что механизмы фосфорилирования CREB и активации CREB-зависимой транскрипции уже достаточно хорошо изучены, необходимы дальнейшие исследования как на молекулярном, так и на поведенческом уровне для более глубокого понимания значения этого транскрипционного фактора в функционировании нервной системы

Как было сказано выше, CREB-зависимой является экспрессия многих важных для развития и функционирования нервной системы генов. В частности рассмотренного ранее BDNF, а также VEGF, известного в числе прочего как активатор нейрогенеза во взрослом мозге и нейропротектор.

Характеристика фактора нейрогенеза VEGF.

VEGF (■vascular endothelial growth factor) — фактор роста сосудистого эндотелия, был обнаружен в 1989 году как гепаринсвязывающий ангиогенный фактор роста, обладающий высокой специфичностью по отношению к клеткам эндотелия (Gospodarowicz et al., 1989; Ferrara and Henzel, 1989). Фактором сосудистой проницаемости - VPF (Vascular Permeability Factor) - был назван белок, активирующий выход белков из русла кровеносных сосудов, ассоциированных с опухолями (Senger et al., 1983). Позднее было установлено, что оба этих фактора кодируются одним геном VEGF, и что различные изоформы VEGF образуются посредством альтернативного сплайсинга, а затем переходят в активную форму путем образования дисульфид-связанных гомодимеров. (Keck et al., 1989; Leung et al., 1989; Tischer et al., 1989).

Экспрессия VEGF и рецепторов к VEGF в нервной системе.

Во время эмбриогенеза мыши VEGF может быть обнаружен начиная с

7 дня эмбрионального развития вне эмбриона и в эмбриональной эндодерме, а к 9 дню он на высоком уровне присутствует в трофобласте, окружающем эмбрион, а также в эмбриональном миокарде, эндодерме кишечника, эмбриональной мезенхиме и амниотической эктодерме. На более поздних стадиях развития наблюдается экспрессия мРНК VEGF во многих отделах

54 развивающейся ЦНС (Breier et al., 1995; Dumont et al., 1995; Millauer et al., 1993). На ранних стадиях развития мозга крысы в нейронах коры наблюдается повышенная экспрессия VEGF, позже она снижается до базального уровня, однако усиливается в зрелых глиальных клетках расположенных поблизости от сосудов. При этом гипоксия приводит к восстановлению нейрональной и увеличению глиальной экспрессии VEGF. У взрослых организмов экспрессия VEGF и VEGFR прекращается в большинстве тканей и наблюдается лишь в некоторых отделах мозга, например в хориодном сплетении, area postrema, гранулярных клетках мозжечка, гиппокампе (Millauer et al., 1993; Monacci et al., 1993; Mountjoy and Wong, 1997); а также в сильно васкуляризированных участках ЦНС, таких как клетки аденогипофиза (Ferrara et al., 1992; Stone et al., 1995).

Структура и регуляция транскрипции гена vegf.

Ген vegf состоит из 8 экзоиов. В результате альтернативного сплайсинга могут образовываться несколько вариантов мРНК, кодирующей изоформы VEGF длиной в 121, 145, 165, 183, 189 и 206 аминокислотных остатков (Robinson and Stringer, 2001) (рис. 10).

ATG TGA TOA

I 2 3 4 5 63 6Ь 7» 7b / 8а / Sb t>SS OSS

Proximal Spl ICC Site VEO F,,, ANGIOGENIC

Рисунок 10. Геномная организация VEGF и его основные изоформы (Ladomery et al.,2007)

Все эти транскрипты содержат экзоны с 1 по 5, кодирующие сигнальную последовательность, и участок связывания с рецептором; а также экзон 8, от структуры которого зависит ангиогенные или антиангиогенные свойства будет проявлять молекула (Bates et al., 2002; Ferrara, 2004) (рис. 10). Исключением из правила является недавно обнаруженный VEGF111, который не содержит 5 экзона и образуется в клетках только под действием генотоксических агентов, таких как радиоактивное излучение (Mineur et al., 2007). В остальном же разнообразие изоформ VEGF определяется альтернативным сплайсингом экзонов 6 и 7. Экзон 6 кодирует гепарин-связывающий домен, а экзон 7 - домен, обеспечивающий регуляцию связывания с нейропилином-1 (NP-1) и гепарииом. Наиболее распространенная изоформа VEGFI65, а также VEGFm секретируются в виде ковалентно связанных гомодимеров, стабилизация которых осуществляется за счет формирования дисульфидных связей между остатками цистеина. Более длинные изоформы - VEGFi89 и VEGF2o6 являются слаборастворимыми и располагаются во внеклеточном матриксе (Zachary, 2005). У грызунов все изоформы VEGF содержат на 1 аминокислотный остаток меньше, чем у человека (VEGFi64, VEGF120 и т.д.) (Dore-Duffy et al., 2007).

Регуляция экспрессии VEGF контролируется на нескольких уровнях, включающих активацию транскрипции, стабильность мРНК, обеспечиваемую связыванием регуляторных белков с З'-нетранслируемой областью (Claffey et al., 1998; Levy et al., 1998; Onesto et al., 2004; Shih and Claffey, 1999), а также трансляцию мРНК с использованием 1RES (internal ribosome entry site) последовательностей, расположенных в 5'-нетранслируемой области (Huez et al., 1998; Stein et al., 1998). Экспрессия VEGF индуцируется множеством внешних факторов. Наиболее хорошо описанным из них является гипоксия. Индуцированная гипоксией экспрессия VEGF является как причиной формирования сосудов во время эмбрионального развития, так и образования опухолей.

PRE ERE AP-1 HIF STAT3 PRE CRE LXR Sp1/AP-2/Egr ДР-1 PRE

PRE: -1865M860; -716/-711: +679/+ 684

ERE: -1525/-1514

AP-1: -1168M015; +418/+425

0V) HIF-1: -Э75/-9Б8

STAT3: -848/-B40 ф CRE: -ЗЭ9/-388 pjj LXR: -ЗМШ2

Sp1,3: -238Л233; -94/-8Э; -84Л79; -73/-68; -57/-52 АР-2: '791-72

Egr-1: -77/-70

Рисунок 11. Структура промотора гена VEGF. Жирной стрелкой обозначен стандартный промотор, тонкой - криптический промотор. PRE(progesterone responsible element) и ERE (estrogen responsible element) - сайты связывания прогестерона и эстрогена; AP-l(activation protein-1) и АР-2 - сайты связывания факторов транскрипции АР-1 и АР-2; HIF (hypoxia inducible factor) - фактор, связывающийся в виде гетеродимера HIF-ip/HIF-la с нуклеотидной последовательностью HRE (hypoxia responsible element)-, STAT-3 (signal transducer and activator of transcription 3) - сайт связывания фактора транскрипции STAT-3; CRE (cAMP responsible element) -сайт связывания CREB; LXR (liver X receptor) - сайт связывния X рецепторов печени; Spl ,3 - сайты связывания белков семейства Sp; Egr-1 (early growth response) - сайт связывания фактора транскрипции Egr-1. По (Pages and Pouyssegur, 2005)c изменениями.

Промоторы гена vegf у различных видов обладают высокой гомологией, в частности, содержат сайты связывания для Spl/Sp3, АР-2, Egr-l, STAT-3, и H1F-1 (рис. 11) и не содержат ТАТА-бох, У мышей описан дополнительный консенсусный сайт NF-kB между -90 и -185 нуклеотидами (Shima et al., 1996), однако его функциональная активность до сих пор не подтверждена. В 1998 году Акири и коллеги описали криптический промотор, ранее описанный как часть 5'-декодируемой области мРНК VEGF (Akin et al., 1998). Было показано, что данный промотор активируется независимо от классического промотора. Одной из основных особенностей является его нечувствительность к гипоксии. Регуляторная область гена vegf содержит множество сайтов связывания для различных факторов транскрипции (рис. 11). Основными каскадами, регулирующими транскрипцию VEGF, являются Ras/Raf/MEK/Erk и PI3K/Akt (Pages and Pouyssegur, 2005).

Рецепторы VEGF.

Биологические функции VEGF реализуются через тирозинкиназные рецепторы VEGFR2 и VEGFR1 (Ferrara et al., 2003; Neufeld ct al., 1999; Zachary, 2003). Кроме того, некоторые изоформы VEGF связываются с нейропилинами, нетирозинкиназными трансмембранными рецепторами.

Многие исследования показали, что эффекты VEGF обусловлены его взаимодействием с рецепторами VEGFR2, что подтверждается данными по экспрессии VEGFR2 (Jin et al., 2002; Jin et al., 2000a; Sondell et al., 1999a; Sondell et al., 1999b; Sondell et al., 2000), недостаточным эффектом от лигандов других рецепторов VEGF (Jin et al., 2000b) и эффектом действия ингибиторов VEGFR2 (Jin et al., 2002; Matsuzaki et al., 2001; Ogunshola et al., 2002; Sondell et al., 2000; Wick et al., 2002). Однако, было показано, что экспрессия VEGFR1 (но не VEGFR2) в мембранах нейронов гиппокампа коррелирует со способностью VEGF ингибировать выход калия из клетки (Xu et al., 2003b), таким образом, некоторые эффекты VEGF в нейронах могут быть VEGFR2 независимыми.

Недавние исследования позволяют предположить, что нейропилин-1 (NP1) является ключевым медиатором, обеспечивающим антихеморепеллентный эффект VEGFi65 (Cheng et al., 2004). Интересно, что специфический ингибитор VEGFR2, SU5614 не влияет на антихеморепеллентный эффект VEGF, в то время как специфический пептидный антагонист VEGF связывающийся с нейропилином 1, способствует коллапсу роста нейритов (Cheng et al., 2004). Эти открытия позволяют предположить, что NP1 может играть специфическую роль в регулировании нейротрофических эффектов VEGF в нейронах ганглиев задних корешков спинного мозга независимо от VEGFR1 и VEGFR2.

Функции VEGF в нервной системе.

Экспрессия VEGF как в периферической, так и в центральной нервной системе, как в нейронах, так и в глиальных клетках важна для определения основных направлений тканеобразования в развивающейся нервной системе. Уровень экспрессии VEGF высок в нервных клетках-предшественниках в желудочковой зоне развивающегося мозга, что является ключевым сигналом, организующим васкуляризацию нейроэктодермы (Carmeliet, 2003). Важность VEGF в развитии головного мозга демонстрирует тот факт, что его инактивация в нервной трубке мыши вызывает массовый апопотоз нейронов (Raab et al., 2004). Данный результат подтверждает, что VEGF играет существенную роль в ангиогенезе головного мозга и, прямо или косвенно, в генерации сигналов, обеспечивающих выживание нейронов.

Исследования, проведенные на позвоночных животных, у которых нейрогенез продолжается во взрослом мозге, показали, что клетки эндотелия играют существенную роль, создавая микроокружение, активирующее пролиферацию стволовых нервных клеток. В субгранулярной зоне гиппокампа, области, где нейрогенез происходит в течение всей жизни, делящиеся предшественники нейронов сконцентрированны в плотные кластеры вокруг кровеносных сосудов, а нейрогенез тесно связан с ангиогеиезом (Palmer et al., 2000). У взрослых певчих птиц, тестостерон индуцирует нейрогенез в высших голосовых центрах и пролиферацию клеток эндотелия путем увеличения уровня VEGF и VEGFR2, что стимулирует ангиогенный ответ, приводящий к повышенной продукции BDNF во вновь сформированных сосудах. BDNF, в свою очередь, способен поддерживать дальнейшую нейрональную дифференцировку (Louissaint, Jr. et al., 2002).

VEGF, действуя через VEGFR2, стимулирует миграцию, выживание и пролиферацию нервных клеток-предшественников (Bagnard et al., 2001; Schanzer et al., 2004; Zhang et al., 2003). Однако остается неясным, что имеет большее значение: непосредственное действие VEGF на стволовые нервные клетки или непрямое действие пролиферации клеток эндотелия, индуцируемое VEGF. Стволовые нервные клетки преимущественно локализованы в зонах смежных с кровеносными сосудами (Louissaint, Jr. et al., 2002; Palmer et al., 2000; Wurmser et al., 2004), и взаимодействие между клетками этих типов является существенным для сохранения способности стволовых нервных клеток к самообновлению, а прекращение данного взаимодействия является стимулом к нейрональной дифференцировке (Shen et al., 2004).

У нематоды Caenorhabditis elegans были обнаружены четыре VEGF-рецептора, VEK(vascular endothelial growth factor receptor related) 1, 2, 3 и 4. При этом у С.elegans отсутствует сосудистая система и форменные элементы крови. VERbi локализованы в клетках нейронального происхождения, что позволяет предположить их участие в нейрогенезе (Popovici et al., 2002). VEGF- и VEGFR- подобные белки экспрессируются в трубчатых структурах гастроваскулярной системы медузы Podocoryne carnea (Seipel et al., 2004), a также в ее эндодерме. Таким образом, VEGF- и VEGFR- подобные молекулы важны для развития нейронов уже у беспозвоночных организмов, однако они также могут играть более общую роль в клеточной миграции и формировании трубчатых структур, что эволюционно предшествовало формированию сосудистой системы.

Было показано прямое действие VEGF на нервные и глиальные клетки.

VEGF стимулирует некоторые нейрогенные, нейропротекторные и нейротрофические процессы, такие как пролиферация астроцитов (Silverman et al., 1999), шванновских клеток (Sondell et al., 1999b), микроглии

Forstreuter et al., 2002) и нейронов коры (Jin et al., 2002; Zhu et al., 2003), защита гипокампальных, кортикальных, дофаминергических и

60 периферических сенсорных нейронов, астроцитов а таюке некоторых линий нервных клеток от клеточной смерти, индуцированной гипоксией, лишением сыворотки или добавлением цитотоксических препаратов (Bartholdi et al., 1997; Jin et al., 2002; Qiu et al., 2003; Silverman et al., 1999; Sinor et al., 1998; Sondell et al., 1999b).

Внутрижелудочковое введение VEGF также стимулирует пролиферацию нервных клеток в субвентрикулярной зоне и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа (Jin et al., 2002). VEGF, связываясь с VEGFR2, стимулирует рост, выживание и хемотаксис клеток-предшественников в тех участках мозга, где происходит спонтанный нейрогенез, таких как гиппокамп, обонятельные луковицы и субвентрикулярная зона. В то же время VEGF, VEGFR1, NP1 и NP2 экспрессируются в пейрональных стволовых клетках и экзогенный VEGF увеличивает выживание этих клеток в бескислородных условиях(Маигег et al., 2003).

Фокальная ишемия мозга у крыс вызывает увеличение уровня экспрессии VEGF, VEGFR1 и VEGFR2 (Hayashi et al., 1997; Jin et al., 2000b;

Lennmyr et al., 1998; Plate et al., 1999), необходимых для неоваскуляризации, следующей за ишемией (Marti et al., 2000). VEGF способен как воздействовать на восстановление сосудов, так и оказывать прямое нейропротекторное действие, и отдельно оценить вклад каждого из этих эффектов в общую картину представляется трудновыполнимым. Однако эксперименты на трансгенных мышах, сверхэкспрессирующих VEGF показали, что вероятнее всего нейропротекторные свойства VEGF (а именно

- ингибирование апоптоза, в частности, активности каспазы-3) играют большую роль в восстановлении после ишемического повреждения, нежели васкуляризация (Wang et al., 2005). Ингибирование VEGF приводит к увеличению площади зоны ишемического поражения (Lennmyr et al., 1998) и ослаблению процессов восстановления после повреждения (Krum and

Khaibullina, 2003). На различных моделях ишемии у животных показано, что

61

VEGF ослабляет такие посттравматические симптомы, как отек мозга, повышенная проницаемость ГЭБ и повреждение тканей (van et al., 1999; Zhang et al., 2000). Интересно, что важное значение имеет временной интервал между ишемическим поражением и введением препарата. Так внутривенное введение VEGF через 48 часов после ишемии усиливало ангиогенез и заметно улучшало восстановление нервной ткани, в то же время раннее (через 1 час) введение VEGF приводило к увеличению проницаемости ГЭБ, геморрогических трансформаций и ишемических повреждений (Zhang et al., 2000). Описана способность VEGF стимулировать восстановление спинного мозга после повреждения (Facchiano et al., 2002; Widenfalk et al., 2003). В клетках поврежденного участка возрастает уровень экспрессии VEGF и его рецепторов (Krum and Rosenstein, 1998; Skold et al., 2000; Vaquero et al., 1999).

Интересно, что VEGF стимулирует повышение экспрессии VEGFR2 в культуре нейрональных стволовых клеток крысы, при этом эффект блокируется при ингибировании киназной активности VEGFR2 (Schanzer et al., 2004). Активация VEGFR2 оказывала нейропротекторное действие на нейроны гиппокампа в случае глутамат-индуцируемой гибели через PI3K/Akt и MEK/ERK пути (Matsuzaki et al., 2001), а нейропротекторный эффект VEGF в случае гранулярных нейронов мозжечка опосредовался PI3K/Akt путем и не зависел от активации ERK (Wick et al., 2002). В клетках линии FIN33, созданной путем слияния нейронов гиппокампа мыши и клеток нейробластомы, VEGF обеспечивал выживание через VEGFR2 рецепторы и PI3K/Akt путь (Jin et al., 2000b). Существуют доказательства участия PBK/Akt-независимых путей активации механизма выживания с помощью VEGF. В частности, VEGF обеспечивает выживание эмбриональных нейронов коры при гипоксии путем подавление активности каспазы 3 (Jin et al., 2001), в это же время выживание гиппокампальных нейронов в случае гипоксии или действия метил-Б-аспартата, индуцируемое VEGF, не включает ни PI3K путь, ни ингибирование активации каспаз (Svensson et al., 2002).

Нейропролиферативные эффекты VEGF в нейронах эмбриональной коры обеспечиваются такими посредниками, как MEK/ERK, PLC и PI3K, а также повышенной экспрессией некоторых ключевых компонентов переключения Gj/S в клеточном цикле, таких как циклины A, D1 и Е, CD25 и PCNA {proliferative cell nuclear agent) (Zhu et al., 2003). В нейронах задних корешков спинного мозга и верхнего шейного ганглия рост аксонов ингибировался путем добавления PD98059, ингибитора MEK/ERK пути (Sondell et al., 1999а).

Таким образом, неоднократно показано, что пептиды семейства меланокортинов способны оказывать нейропротекторные, и нейротрофические эффекты, а также стимулировать внимание, обучение и формирование памяти. Однако механизмы их действия на нервную систему до сих пор во многом остаются неясными. Одним из возможных путей действия меланокортинов является влияние на уровни экспрессии в ЦНС нейротрофических факторов - мощных регуляторов, как выживания и дифференцировки нейронов, так и когнитивных функций. Изучение механизмов действия МК на нервную систему представляется крайне важным с точки зрения обнаружения перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов, в том числе обусловленных таким негативным, и в то же время широко распространенным в современной жизни, воздействием на организм, как дистресс, в частности, для поиска новых ноотропных и нейропротекторных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на культурах астроцитов и нейронов гиппокампа крысы.

Культура астроцитов гиппокампа крысы. Первичную культуру клеток астроцитов получали согласно стандартной методике (Cole and de Vellis, 1989). Крыс линии Sprague-Dowly возраста 1-3 дня подвергали эвтаназии с помощью углекислотной асфиксии (5 мин) и помещали на 1 мин в 80% водный раствор этанола. Далее все операции проводили в асептических условиях на льду. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса («ПанЭко», Россия) и далее выделяли гиппокамп, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия) и переносили в HEPES-содержащую культуральную среду DMEM/F-12 («Sigma-Aldrich», США, Cat # D-2906) с 20% эмбриональной сыворотки коровы (HyClone, США) и 2 мМ L-глютамина. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически. Суспензию клеток центрифугировали (4 мин, 200g), осадок ресуспендировали в необходимом количестве среды того же состава. Проводили подсчет клеток в гемацитометре (камера Горяева) и высевали плотностью 200 тыс. клеток/см на обработанные поли-Ь-лизином (MP Biomedicals Inc., США) полистироловые чашки Петри (d=T00 мм, Greiner Bio-One Int., ФРГ) и культивировали при 37°С в среде DMEM/F-12, дополнительно содержащей 10% эмбриональной сыворотки коровы (HyClone, США), 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамина, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерона, 100 нМ путресцина, 30 нМ селенита натрия.

Смену культуральной среды производили 1 раз в 3 - 4 дня. Пересев клеток проводили в соотношении 1:3 после достижения клеточного монослоя. Из чашек Петри удаляли среду и промывали монослой раствором Версена (0,02 % ЭДТА). В каждую чашку добавляли по 4 мл раствора трипсина (0,25%)(Sigma, США) для отделения клеток от субстрата. Клетки инкубировали в С02 инкубаторе при 37°С 10-15 мин. По достижении нужной степени диссоциации добавляли в каждую чашку по 1 мл эмбриональной сыворотки коровы для инактивации трипсина. Содержимое переносили в пробирку и суспензию клеток центрифугировали (4 мин, 200g). Осадок ресуспендировали в среде с сывороткой. Клетки засевали на обработанные поли-Ь-лизином чашки Петри.

Начиная со второго пересева использовали вышеуказанную культуральную среду, содержащую 5% эмбриональной сыворотки коровы и 10% лошадиной сыворотки (HyClone, США).

Для экспериментов использовали полученные после третьего пересева клетки. Клетки высевали плотностью 100 тыс./см на обработанные поли-Ь-лизином 6-луночные полистироловые культуральные планшеты (Nunclon, Дания) в вышеуказанной культуральной среде в объеме 5 мл. После достижения клетками монослоя культуральную среду заменяли на бессывороточную (вышеуказанная среда без сыворотки). После 48 ч инкубации в культуральную среду вводили растворы тестируемых соединений.

Культура нейронов гиппокампа крысы. Крыс линии Sprague-Dowly на

17 дне беременности подвергали эвтаназии в атмосфере СОг (5 мин), и помещали на 1 минуту в 80% этанол. Далее все операции проводили в асептических условиях на льду. В экспериментах использовали культуральную среду DMEM/F-12 («Sigma-Aldrich», США, Cat # D-2906) с комплексом добавок (6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамина, 25 мг/л инсулина,

100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерона, 100 нМ путресцина, 30 нМ селенита натрия). Вскрывали брюшную полость крысы, извлеченных эмбрионов декапитировали, мозг помещали в культуральную среду содержащую 20% эмбриональной сыворотки коровы, выделяли гиппокамп, освобождая его от оболочек и кровеносных сосудов. Гиппокампы помещали в пробирку с культуральной средой, содержащей 20% эмбриональной сыворотки коровы, ткань механически диссоциировали на отдельные клетки.

Суспензию клеток центрифугировали (4 мин, 200g), осадок

65 ресуспендировали в необходимом количестве среды без сыворотки. Проводили подсчет клеток в гемацитометре (камера Горяева) и высевали плотностью 560 тыс. клеток/см" на обработанные поли-Ь-лизином 96-луночные планшеты. Культивирование клеток проводили в С02 инкубаторе при

37 °С в объеме 100 мкл на лунку в течение недели.

Проведение эксперимента. В ходе эксперимента в соответствующие лунки планшета с культурой нейронов или астроцитов вносили растворы тестируемых соединений: а-МСГ (Sigma, США) и Семакса (синтезирован в ИМГ РАН) в объеме 10 мкл на лунку (нейроны) или 50 мкл на лунку (астроциты) до указанных конечных концентраций, Shu9119 (Sigma, США) и HS028 (Sigma, США) в объеме 1 мкл на лунку (нейроны) или 5 мкл на лунку (астроциты) до концентрации 10~9 моль/л. В качестве контроля вводили равный объем PBS. Планшет помещали в С02 инкубатор, 37 °С. Через указанные промежутки времени отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным (4°С) PBS и вносили в лунки экстракционный буфер (в случае последующего выделения белка) или PeqGold TriFast (PeqLab, Германия) (в случае последующего выделения РНК).

МТТ-тест на количество живых клеток.

В лунки 96-луночного культурального планшета с клетками вносили МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н тетразолиум бромид) до конечной концентрации 0,5мг/мл. Инкубировали 3 часа при 37° С. Отбирали из лунок культуральную среду и вносили по 25 мкл DMSO на лунку. Инкубировали 20 мин при комнатной температуре на шейкере. Оптическую плотность в лунках определяли с использованием планшетного спектрофотометра Metertech £960 при длине волны 600 нм. Митохондриальные дегидрогеназы конвертируют водорастворимый МТТ в формазан, который образует внутри клеток сине-фиолетовые кристаллы. DMSO переводит формазан в раствор.

Иммуноцитохимическое окрашивание первичных культур нейронов на (iIII-тубул ин.

Из лунок 96-луночного планшета с клетками отбирали среду, промывали клетки однократно раствором PBS (250 мкл на лунку). Клетки 30 мин при комнатной температуре фиксировали 4% параформальдегидом (250 мкл на лунку) и 3-4 раза отмывали раствором PBS. Затем в лунки культурального планшета вносили по 250 мкл раствора PBS, содержащего 0,1% Тритон Х100 и 5% лошадиной сыворотки и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После инкубации раствор отбирали и наносили первые антитела (анти-рШ-тубулин (Abeam, США), разведение 1:2000) в растворе PBS содержащем 0,1% Тритон XI00 и 5% лошадиной сыворотки по 250 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при +4°С.

Рисунок 12. Первичная культура нейронов (ув. х400). Желтый цвет -окрашивание на pill тубулин, синий цвет - окрашивание ядер клеток (DAPI).

После инкубации клетки 2 раза отмывали раствором PBS и наносили 2-ые антитела (anti-mouse Alexa-sss conjugate (Invitrogen, США), разведение 1:1000) в растворе PBS содержащем 0,1% Тритон Х100 и 5% лошадиной сыворотки по 250 мкл на лунку. Инкубировали 1,5-2 часа при комнатной температуре, затем отмывали 2 раза раствором PBS. Вносили в лунки по 250 мкл раствора DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (1 мкг/мл)в PBS, инкубировали 1 мин. Отбирали раствор DAPI, вносили в лунки PBS и визуализировали полученную окраску при помощи флуоресцентного микроскопа.

Определение уровней мРНК исследуемых генов в культурах астроцитов и нейронов гиппокампа крысы методом ПЦР.

Выделение РНК. Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции с использованием реактива РедОоШ ТпРаэ! (Ре4ЬаЬ, Германия), следуя методике и рекомендациям производителя.

По истечении времени инкубации с тестируемыми соединениями, из лунок планшетов отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным (4°С) РВ8, помещали планшет на лед и, не допуская подсыхания клеток, быстро добавляли в каждую лунку лизирующий раствор РедОоМ ТпБаБ! (Ре4ЬаЬ, Германия), по 750 мкл на лунку 6-ти луночного планшета (астроциты) и по 150 мкл на лунку 96-ти луночного планшета (нейроны) и выдерживали 3-5 мин при комнатной температуре, периодически покачивая, после чего переносили лизат в микропробирки "эппендорф". В случае нейронов в одну пробирку переносили лизат из 6 лунок, чтобы получить необходимое для дальнейшего исследования количество РЕК.

В пробирки с лизатом добавляли 1/5 объема хлороформа, тщательно перемешивали на вортексе в течение 1 мин, затем инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали в течение 15 мин при 16000 g.

Не задевая промежуточной фазы, переносили верхнюю (водную) фазу в новую пробирку, добавляли равный объем изопропанола, перемешивали на вортексе (10-15 сек), оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 15 мин при 16000 g.

Аккуратно отбирали супернатант, не задевая осадок РНК, добавляли в пробирки по 1 мл 80% этанола (4 °С), перемешивали на вортексе (10-15 сек) и центрифугировали в течение 15 мин при 16000 g. Описанным образом образцы трижды отмывали 80%> этанолом.

Осторожно, не захватывая осадок, полностью, отбирали супернатант. Осадок подсушивали при комнатной температуре до полного испарения жидкости. Добавляли в пробирки по 25 мкл воды МИН Перемешивали на вортексе и инкубировали 5 мин при 60 °С для растворения РНК. Дальнейшие манипуляции с образцами РНК производили на тающем льду.

Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм (А260 равное 1 соответствует 40 мкг РНК). Степень чистоты полученной РНК определяли исходя из соотношения А260/А280 (использовали образцы с соотношением А260/А280 >1,6). Полученные образцы РНК хранили при -80 иС.

Обработка проб ДНКазой I. В работе использовали реактивы фирмы «Fermentas»(Литва). В пробирке смешивали водный раствор РНК (1 мкг), 1 мкл буфера для ДНКазы I до конечной концентрации ЮмМ Трис-HCl, pH 7.5 / 25°С, 2.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ СаСЬ и доводили общий объем реакционной смеси до 9 мкл водой Milli-Q.

Добавляли в пробирку 1 мкл ДНКазы I (1ед/мкл), перемешивали, осаждали капли кратковременным центрифугированием и инкубировали 30 мин при температуре 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 25 мМ ЭДТА и прогреванием смеси в течение 10 мин при температуре 70 °С.

Обратная транскрипция (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Обратную транскрипцию проводили с использованием набора фирмы

Силекс" (Россия) согласно протоколу и рекомендациям производителя.

Отбирали по 0,25 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в

25 мкл смеси, содержащей 1мкл случайных гексапраймеров (0,5 мкг/мл), 100 ед Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV)-o6paTtioñ транскриптазы, 4 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (1,5 мМ) и 2,5 мкл буфера (700 шМ Трис-HCl, pH 8,3, 166 mM (NH4)2S04, 75 тМ MgCl2). После инкубации

10 мин при 70°С, образцы кДНК хранили при -20°С.

Оценку уровней мРНК исследуемых генов проводили методом полуколичественной ПЦР с использованием набора реагентов фирмы

Силекс" (Россия) в амплификаторе "Терцик" (ДНК-Технология, Россия). В пробирку вносили 13 мкл воды Milli Q, соответствующее количество 10х буфера для PIotTaq-полимеразы до конечной концентрации 70 мМ Трис-НС1,

69 рН 8,3 / 25 °С, 16,6 мМ (N114)2804, 25 мМ М%С\2 до конечной концентрации 2,5 мМ, 2,5 мМ смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов до конечной концентрации 250 мкМ, прямые и обратные праймеры (Евроген, Россия; Табл. 2) до конечной концентрации 0,4 мкМ, 0,5 мкл Но^1^-полимеразы (5 ед./мкл) и 2 мкл кДНК образца. Для предотвращения испарения реакционной смеси поверх нее наслаивали 30 мкл минерального масла. Для проверки на наличие в пробах геномной ДНК при проведении обратной транскрипции (см. выше) ставили негативную пробу — в нее вносили все те же компоненты, кроме М-МЬУ—обратной транскриптазы, которую заменяли на эквивалентный объем воды.

ПЦР проводили согласно следующей схеме (Табл. 1):

Таблица 1. Условия проведения амплификации режим температура время число циклов начальная денатурация 50 °С 2 мин 1

95 °С 5 мин 1 денатурация 95 °С 45 сек 29-39 отжиг праймеров 64-68 °С 1 мин элонгация 72 °С 1 мин завершающая элонгация 72 °С 10 мин 1

Для каждой использованной пары праймеров были предварительно подобраны условия ПЦР: оптимальная температура отжига праймеров (при которой продукт виден наиболее четко) и оптимальное количество циклов амплификации (соответствующее экспоненциальному росту кривой амплификации) (см. Табл. 2). В обязательном порядке контролировали, что не произошло выхода кривой амплификации на плато. Для этого вместе с исследуемыми пробами ставили несколько проб с последовательными разведениями смеси кДНК этих проб - калибровочные кривые.

Таблица 2. Последовательности использованных в работе праймеров и условия ПЦР. ген последовательности праймеров (прямой и обратный) длина продукта число циклов температура отжига gapdh 5'-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3' 5'-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3' 376 пн 29 66 °С bdnf 5'-CACAGCGGCAGATAAAAAGA-3' 5'-CGGCAACAAACCACAAGATT-3' 527 пн 39 64 °С mc4r 54AGTCTCTGGGGAAGGGGCA-3' 5'-CAACTGATGATGATCCCGAC-3' 422 пн 38 64 °С vegf 5-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3' 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3' 567 пн 495 пн 435 пн 363 пн 36 68 °С

Для разделения продуктов амплификации проводили электрофорез в 40 мкМ Трис-ацетатном буфере (ТАЕ). Навеску агарозы, соответствующую 2 % гелю заливали буфером ТАЕ и растворяли при нагревании в СВЧ-печи. После полного растворения агарозы и остывания раствора до 60-70°С добавляли раствор бромистого этидия до конечной концентрации 1 мкг/мл и заливали гель в гелевую рамку. После застывания гель переносили в электрофорезную камеру, наполненную буфером ТАЕ. В лунки вносили по 10 мкл полученной после ПЦР смеси и 0,5 мкл маркеров длин фрагментов ДНК. К образцу предварительно добавляли загружающий буфер до конечной концентрации 10 мМ Tris рН 7,6, 10 % глицерин, 10 мМ ЭДТА, 0,005 % бромфеноловый синий. Использовали следующие маркеры длин фрагментов: pUC 19 ДНК / Msp I в концентрации 0,5 мкг/мкл (501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 26 п.н., фрагменты 34 и 26 обычно на геле не видны) и маркер длин фрагментов 1000 - 100 п.н. в концентрации 0.5 мкг/мкл (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.). Условия проведения электрофореза: 100 В, 300 шА, 40 мин.

С помощью системы ВioDocAnalyze ("Biometra", Германия) и

71 программы Alpha Imager определяли интенсивность свечения продукта амплификации (выражаемую в относительной оптической плотности полосы) в ультрафиолетовом свете. Используя программу Alpha Imager, получали зависимость относительной оптической плотности от относительной концентрации продукта, определяли относительную концентрацию в исследуемом образце с последующей нормализацией по GAPDH.

Определение уровней белка BDNF в культурах нейронов гиппокампа крысы методом иммуноферментного анализа.

По истечении времени инкубации с тестируемыми соединениями, из лунок планшетов отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным (4°С) PBS, помещали планшет на лед и, не допуская подсыхания клеток, быстро вносили в каждую лунку по 150 мкл модифицированного экстракционного буфера следующего состава: 100 мМ PIPES (рН 7,0), 500 мМ NaCl, 0,2% Triton Х-100, 0,1% NaN3, 2% BSA, 2мМ ЭДТА, 200 мкМ PMSF, 10 мкМ леупептин, 0.3 мкМ апротинин, 1 мкМ пепстатин, 0,5 мМ ванадат натрия (Pollock et al., 2001). Нами было проведено сравнение уровней экстракции BDNF при использовании вышеописанного модифицированного экстракционного буфера и экстракционного буфера, рекомендованного производителем (Promega) для определения BDNF (137 мМ NaCl, 20 мМ Tris-НС1, рН 8,0, 1% NP40, 10% глицерина, 200 мкМ PMSF, 10 мкМ леупептина, 0,3 мкМ апротинина, 1 мкМ пепстатина, 0,5 мМ ванадата натрия). При использовании модифицированного буфера экстракция BDNF проходила почти в 10 раз эффективнее, в связи с этим в дальнейших экспериментах нами использовался модифицированный экстракционный буфер.

После 4-х кратного замораживания (-70°С) - оттаивания (25°С) планшет выдерживали на шейкере в течение 1 часа (4°С), а затем помещали на тающий лед. После пипетирования содержимого каждой лунки, образцы переносили в микропробирки "эппендорф". Центрифугировали 120 мин при 16000 g. Супернатант переносили в новые пробирки и исследовали методом иммуноферментного анализа с использованием набора «BDNF Ешах» ImmunoAssay System (Promega, USA) и автоматического промывателя планшетов ПП2 428 (Иммедтех, Россия), следуя рекомендациям производителя.

В лунки 96-ти луночного планшета (Nunc-Immuno MaxiSorp, Nunclon, Дания) вносили по 100 мкл раствора моноклональных антител против BDNF (до конечной концентрации 1 мкг/мл) в карбонатном буфере (0,025 М NaHCOS, 0,025 М Na2C03, рН 9,7). Инкубировали в течение ночи при + 4°С. По окончании инкубации раствор удаляли однократным промыванием лунок планшета раствором TBST (20 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,05 об.% Tween 20). Для блокировки неспецифической сорбции в лунки планшета добавляли по 200 мкл буфера «Block&Sample», входящего в состав набора, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего однократно промывали раствором ТВ ST.

В лунки планшета с преадсорбированными антителами подложки вносили по 100 мкл исследуемого образца (разведение 1:3 в буфере «Block&Sample») или стандартных разведений антигена (от 0 до 500 пг/мл). Инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 3 часов, после чего пятикратно промывали TBST. Добавляли в каждую лунку по 100 мкл раствора вторых антител (поликлональные антитела против BDNF, конечная концентрация 1 мкг/мл), инкубировали в течение ночи при + 4°С, после чего пятикратно промывали TBST. Вносили по 100 мкл раствора антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, инкубировали 1,5 часа на шейкере при комнатной температуре, после чего пятикратно промывали раствором TBST. Вносили в лунки по 100 мкл раствора хромогенного субстрата (тетраметилбензидин) и инкубировали 10 мин на шейкере при комнатной температуре до развития голубой окраски. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 N соляной кислоты. Оптическую плотность в лунках определяли с использованием планшетного спектрофотометра Metertech £960 при длине волны 450 нм. Исходя из

73 прямой пропорциональности между величиной оптической плотности и концентрацией BDNF в стандартных образцах, вычисляли концентрацию BDNF в исследуемых образцах.

Эксперименты на животных in vivo.

Животные. В экспериментах использовали самцов крыс линии Wistar массой 250-300 г, полученных из питомника лабораторных животных "Пущино". Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение — в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стрессирования животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Для всех крыс была проведена 21-дневная адаптация к условиям эксперимента (ежедневный хэндлинг в течение 1-2 минут).

Проведение эксперимента. а-МСГ (Sigma, США), Семакс и Меланотан II (Sigma, США) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг, 50 мкг/кг и 60 мкг/кг массы тела животного соответственно. Контрольным животным вводили эквивалентный объем 0,9% хлорида натрия. Через указанные промежутки времени крыс декапитировали, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань замораживали на сухом льду и хранили при -70°С.

Определение уровней CREB и pCREB в гиппокампе методом иммуноблоттинга.

Для получения белковых экстрактов ткань взвешивали, помещали в раствор, содержащий 50 мМ ТрисНО (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 1% Нонидет

Р40 (NP40), 1 мМ PMSF, 1 мМ апротинина, 20 мкМ леупептина, 0,1 мМ ванадата натрия и гомогенизировали при 4°С с помощью политрона (Tissue

Tearor™ Biospec products, Inc). Гомогенаты центрифугировали 30 мин при

74

4°С при 16000g, переносили супернатант в новые пробирки и хранили при -70 °С.

Количественное определение белка методом Лоури. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури . Калибровочные (концентрация белка 0-100 мг/мл) и определяемые пробы наносились на 96-луночные планшеты в объеме 80 мкл, после чего в каждую лунку добавлялось по 80 мкл четырехкомпонентной смеси (раствор 0,1% CuS04 х 5Н20, 0,2% Са,Ыа-тартрат х 4 Н20, 10% Na2C03 (компонент 1), 10% SDS (компонент 2), 0,8 M NaOH (компонент 3), дистиллированная вода (компонент 4), смешанные в равных объемах). После инкубации 20 мин при комнатной температуре добавлялось по 40 мкл реактива Фолина, разведенного в 5 раз дистиллированной водой. После каждой стадии пробы тщательно перемешивались. Не менее чем через 90 мин инкубации при комнатной температуре с использованием планшетного спектрофотометра Metertech Z960 измерялась оптическая плотность при 490 нм. По полученным данным строили калибровочную кривую, в линейном интервале 20-80 мг/мл которой рассчитывалось количество белка в изучаемой пробе. Для измерения уровней pCREB и тотального CREB количество белка в пробах уравнивали, добавляя необходимое количество вышеописанного буфера.

Western-иммуноблоттинг. Оценку уровня pCREB и тотального CREB в гиппокампе крысы проводили при помощи Western-иммуноблоттинга.

Проводили электрофорез белков в системе Лэммли в 5% (концентрирующем) и 12% (разделяющем) полиакриламидном геле. Для приготовления

разделяющего геля использовали 30% смесь акриламида (АА, 29,2%) и бисакриламида(бис-АА, 0,8%) которую разбавляли 1,5 M Трис-HCl буфером (рН

8,8) и дистиллированной водой до конечной концентрации Трис-HCl 375 мМ.

В смесь также добавляли 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 0,1% APS персульфат аммония) и 0,1% TEMED (Н,Ы,>Г,>Г-тетраметидэтилендиамин).

Для приготовления концентрирующего геля 30% смесь АА и бис-АА

75 разводили до 5% 0,5 М Трис-HCl буфером (pH 6,8) и дистиллированной водой до конечной концентрации Трис-HCl 125 мМ. В смесь также добавляли 0,1% SDS, 0,1% APS и 0,1% TEMED. В работе использовали стекла 8x10см со спейсерами толщиной 0,75 мм. Образцы белковых экстрактов смешивали с буфером, содержащим 0,125 М Трис-HCl (pH 6,8), 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 0,005% бромфенолового синего и 10% ß-меркаптоэтапола, кипятили 5 мин на водяной бане, остужали на тающем льду, осаждали капли кратковременным центрифугированием и вносили образцы в лунки геля. Для проведения электрофореза использовали Трис-глициновый электродный буфер, содержащий 25мМ Трис-HCl, 192мМ глицин, 0,1% SDS (pH 8,3). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 50 В в течение 19 часов.

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещали в кювету, заполненную буфером для электрофоретического переноса (37мМ Трис-HCl, 287мМ глицин, 22,5 % этанол). В другой кювете, заполненной буфером, собирали кассету для переноса по следующей схеме: 3 листа бумаги Whatman 3 ММ, предварительно активированная в метаноле PVDF-мембрана, гель, а затем еще три листа бумаги Whatman. Полученный сэндвич зажимали в кассете и помещали между электродами камеры для переноса, заполненной вышеуказанным буфером, так, чтобы мембрана была обращена к аноду. Электроперенос осуществляли при +4 °С и постоянном токе силой 500 мА в течение часа. Качество переноса оценивали окрашиванием мембраны 0,5% раствором Ponceau С, приготовленном на 1% уксусной кислоте. PVDF-мембрану отмывали буфером TBS (20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,6) до полного исчезновения окраски и инкубировали в течение 1 часа на шейкере при комнатной температуре в буфере TBS, содержащем 3% БСА.

Далее мембрану обрабатывали моноклональными антителами, (Mouse anti-CREB monoclonal antibodies(Chemicon, США), разведение 1:5000 в буфере TBS; Mouse anti-phospho-CREB (Ser 133) monoclonal

76 antibodies(Upstate, США), разведение 1:3000 в буфере TBS в течение ночи на шейкере при температуре 4°С.

По окончании инкубации мембрану промывали буфером TBS, переносили в раствор, содержащий конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к иммуноглобулинам мыши (ИМТЕК, Россия) в разведении 1:10000 и инкубировали в течение 2 часов на шейкере при комнатной температуре. По окончании инкубации мембрану промывали буфером TBS.

Далее мембрану 1 мин инкубировали в свежеприготовленном растворе, содержащем люминол (ECL, Amersham Bioscinces, США). Мембрану заворачивали в пленку SaranWrap и помещали в фотокассету.

Обработанную вышеописанным образом мембрану 10-20 мин выдерживали с синечувствительной рентгеновской пленкой Retina ХВМ, которую затем проявляли. Проявленную пленку сканировали. Результаты обрабатывались с помощью программы Alpha Imager (оценка относительной оптической плотности) и Sigma Plot (математические вычисления и построение графиков).

Определение уровней белков BDNF и NGF в гиппокампе крысы методом иммуноферментного анализа.

Гомогенизацию образцов ткани проводили на льду в полистирольных пробирках. Образцы взвешивали, помещали в пробирки и, из расчета на вес (20 мкл буфера на 1 мг ткани), добавляли модифицированный экстракционный буфер (Pollock et al., 2001) (100 мМ PIPES, pH 7,0, 500 мМ NaCl, 0,2% Triton X-100, 0,1% NaN3, 2% BSA, 2 мМ Ыа2-ЭДТА, 200 мкМ PMSF, 10 мкМ леупептина, 0,3 мкМ апротинина, 1 мкМ пепстатина, 0,5 мМ ванадата натрия). Образцы ткани измельчали с помощью пипетирования, затем гомогенизировали политроном (Tissue Tearor™ Biospec products, Inc). Полученные гомогенаты переносили в микропробирки «эппендорф», разбавляли экстракционным буфером в 5 раз, центрифугировали 1 час (16000 g, 4°C), супернатант переносили в новые пробирки, повторно центрифугировали 1 час (16000 g, 4°С) и вновь переносили супернатант в новые пробирки. Полученные экстракты хранили при -70 °С.

Определение уровня BDNF в полученных экстрактах проводили с использованием набора «BDNF Emax» ImmunoAssay System (Promega, США) и автоматического промывателя планшетов 11112 428 (Иммедтех, Россия) по вышеописанной методике (см. раздел «определение уровня белка BDNF в культурах нейронов гиппокампа крысы методом иммуноферментного анализа»).

Для определения уровня NGF в полученных экстрактах иммуноферментный анализ проводили с использованием набора "NGF Emax" ImmunoAssay System (Promega, США) и автоматического промывателя планшетов 11112 428 (Иммедтех, Россия) по методике, аналогичной вышеописанной для BDNF со следующими отличиями. В лунки 96-ти луночного планшета (Nunc-Immuno MaxiSorp, Nunclon, Дания) вносили по 100 мкл раствора поликлональных антител против NGF (до конечной концентрации 1 мкг/мл) в карбонатном буфере. В качестве вторых антител использовали моноклональные антитела крысы против NGF. В связи с тем, что наши образцы были получены из тканей головного мозга крысы, существовала вероятность неспецифического связывания конъюгированных с пероксидазой антител к иммуноглобулинам крысы. Для контроля такого неспецифического связывания в некоторые лунки мы не вносили поликлональные антитела против NGF, все дальнейшие манипуляции (в том числе и внесение белковых экстрактов гиппокампа) с ними проводили наравне с остальными лунками. Интенсивность окраски в этих лунках была сравнима с нулевой точкой «стандартов».

Принудительное плавание.

Для моделирования острого стресса использовался метод Порсолта (Porsolt et al., 1977) с модификациями. Животных помещали в пластиковый бак, наполненный водой. Температура воды составляла 24-25°С, уровень жидкости в баке - 40 см, тотальная глубина бака — 60 см. Воду в баке меняли после каждого животного. Температура в помещении составляла 23-24 °С.

В эксперименте были использованы 33 самца. В качестве дополнительного контроля к группам, подвергнутым принудительному плаванию, были взяты группы животных, помещенных на соответствующее количество времени в сухой пластиковый бак, аналогичный тем бакам, в которых проводилось принудительное плавание. Было выделено 10 экспериментальных групп:

1. Интактные крысы, с которыми не были проведены никакие манипуляции, кроме ежедневного хэндлинга

2. Крысы, плававшие в течение 5 мин

3. Крысы, плававшие в течение 15 мин и декапитированные непосредственно после плавания

4. Крысы, плававшие в течение 15 мин и декапитированные через 15 мин после плавания

5. Крысы, плававшие 15 мин и декапитированные через 90 мин после плавания

6. Крысы, плававшие 15 мин и декапитированные через 24 часа после плавания

7. Контрольные крысы, помещенные в сухой бак на 5 мин

8. Контрольные крысы, помещенные в сухой бак на 15 мин и декапитированные немедленно после извлечения из бака

9. Контрольные крысы, помещенные в сухой бак на 15 мин и декапитированные через 15 мин после извлечения из бака

10. Контрольные крысы, помещенные в сухой бак на 15 мин и декапитированные через 24 часа после извлечения из бака

И контрольных, и опытных животных в течение 1 мин вытирали бумажным полотенцем. Животных декапитировали, кровь собирали для последующего получения плазмы.

Получение плазмы крови крысы.

Кровь (2-5 мл) собирали в находящиеся во льду полипропиленовые пробирки, содержащие 0,5 мл цитратного буфера - ACD (25 г/л двуводного цитрата натрия, 14 г/л лимонной кислоты, 20 г/л D-глюкозы, 0.2 мМ PMSF, 10 мкг/л леупептина) и аккуратно перемешивали переворачиванием пробирки. Измеряли полученный объем крови, дополнительно добавляли холодный буфер ACD до соотношения кровь:буфер ACD 6:1 и переносили в охлажденные микропробирки "эппендорф" (объем 1,7 мл) и центрифугировали 20 мин при 6000 g при 4°С. Супернатант переносили в новые микропробирки "эппендорф", замораживали и хранили при Перед замораживанием плазму визуально проверяли на отсутствие клеток крови с использованием гемацитометра (камера Горяева).

Определение уровней АКТГ и а-МСГ в образцах плазмы крови с помощью иммуноферментного анализа.

Определение уровней АКТГ и а-МСГ в образцах плазмы крови проводили с использованием наборов "АСТН" и "Alpha-Melanocyte Stimulating Hormone" (Phoenix Pharmaceuticals, США) и автоматического промывателя планшетов ПП2 428 (Иммедтех, Россия) по следующей модифицированной методике.

На 96-луночные полистирольные планшеты Nunc-Immuno MaxiSorp (Nunclon, Дания) наносили поликлональные антитела овцы против иммуноглобулинов кролика (конечная концентрация 400 пг/мл; 50 мкл/лунку) в карбонатном буфере (0,025 М NaHC03, 0,025 М Na2C03, рН 9,7) и инкубировали 24 часа при 4°С. Буфером TBST (20 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,05 об.% Tween-20) двукратно отмывали не сорбировавшиеся антитела, далее проводили блокировку неспецифической сорбции в течение 1 часа при комнатной температуре буфером "Bloclc&Sample" производителя набора (100 мкл/лунку). Затем в лунки наносили по 25 мкл образцов плазмы, в 2,5 раза разбавленных в буфере "Bloclc&Sample", и стандартных количеств белка (АКТГ или а-МСГ) в диапазоне концентраций 0-25 нг/мл и 0 — 100 нг/мл, соответственно. Далее в лунки вносили 12,5 мкл биотинилированного АКТГ или а-МСГ и 12,5 мкл кроличьих моноклональных антител к определяемому пептиду (АКТГ или а-МСГ). В качестве отрицательного контроля использовали лунки, в которые вместо моноклональных антител к пептиду добавляли эквивалентное количество буфера "Block&Sample". После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре проводили пятикратную отмывку лунок буфером TBST и вносили в лунки стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (разбавление 1:1 ООО, 50 мкл/лунку).

После инкубации в течение 1 часа лунки пятикратно отмывали TBST и инкубировали с 50 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМВ) в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением равного объема 1 N HCl и с помощью планшетного спектрофотометра Metertech Е960 измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм в лунках, соответствующих калибровке по АКТГ или а-МСГ и определяемым образцам. Исходя из обратной пропорциональности между величиной оптической плотности и концентрацией АКТГ или а-МСГ в стандартах, вычисляли концентрацию АКТГ или а-МСГ в определяемых образцах.

Статистистическая оценка результатов.

Результаты обрабатывались с помощью программ Jandel Scientific SigmaPlot и "STATISTICA for Windows" (версия 6.01). Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью непараметрических критериев (тест Манна-Уитни) и дисперсионного анализа (one-way ANOVA). На графиках представлены средние значения групп с учетом стандартной ошибки среднего (Mean+SEM), п — объемы групп. Обозначения уровней значимости различий групповых средних: * - р<0.05, ** - р<0.01.

В случае определения уровня АКТГ и а-МСГ в плазме крови крыс: * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - обозначения уровней значимости различий групповых средних принудительно плававших животных и интактного контроля, # - р<0.05, ## - р<0.01, ### - р<0.001 - обозначения уровней значимости различий групповых средних принудительно плававших животных и животных из соответствующей контрольной группы. Корреляция между групповыми средними в пределах одной выборки оценивалась с помощью непараметрических критериев (подсчет коэффициента Спирмана и коэффициента Кендалла).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ а-МСГ обнаружен в различных отделах головного мозга. Показана его способность оказывать нейропротекторное нейротрофическое воздействие, а также влиять на когнитивные функции экспериментальных животных. С другой стороны показано, что при стрессе уровень а-МСГ в крови и тканях головного мозга изменяется. К настящему моменту остается до конца не ясным, какова роль меланокортинов в развитии стрессорной реакции, однако накоплен ряд доказательств в пользу тесной связи а-МСГ с адаптацией организма к стрессирующему фактору. а-МСГ соответствует фрагменту 1-13 одного из наиболее изученных гормонов стресса — АКТГ. Секреция а-МСГ и других меланокортинов увеличивается под действием стресса. КРГ, действуя на меланотрофы, стимулирует секрецию а-МСГ в ответ на стрессирующий сигнал (van den Burg et al., 2005). В промежуточной доле гипофиза секрецию а-МСГ стимулируют Р-адренергические агонисты, в то время как дофамин ингибирует выброс производных ПОМК (Vermes et al., 1980). Введение антагониста дофамина - галоперидола вызывает увеличение содержания производных ПОМК в промежуточной доле гипофиза и стимулирует их освобождение (Hollt et al., 1982). Кроме того, стресс-индуцируемая секреция а-МСГ может опосредоваться действием тиреотропного гормона (Rotllant et al., 2000).

Иммобилизационный стресс у крыс приводит к повышению уровня а-МСГ в плазме крови, а также в промежуточной и задней долях гипофиза, при этом уровень его в срединном возвышении гипоталамуса значительно снижается (Khorram et al., 1985). Было показано, что при помещении крыс на 30 минут в тесные клетки, уровень а-МСГ в плазме крови растет и достигает своего максимума через 20-30 минут после предъявления стрессирующего стимула, в то время как в клетках гипофиза значительно уменьшается количество секреторных гранул, содержащих а-МСГ (Carr et al., 1990). Под действием хронического стресса (помещение в клетку залитую водой до уровня 1,5 см на 5 дней) у крыс было показано повышение уровня ПОМК мРНК в промежуточной доле гипофиза. Также при использовании данной модели стресса повышается уровень а-МСГ в крови. При дальнейшем воздействии стресса уровень а-МСГ падает, идет угнетение активности меланотрофов и уменьшение количества окончаний дофаминергических нейронов в промежуточной доле гипофиза, что позволяет сделать предположение о том, что хронический стресс подавляет высвобождение дофамина из отростков клеток гипоталамуса, что приводит к повышенной экспрессии а-МСГ меланотрофами. Более длительная гиперактивация эндокринных клеток приводит к их дегенерации (Ogawa et al., 2009).

Интересно, что при формировании условного рефлекса избегания, а также в условиях неизбегаемого удара электрическим током, уровень а-МСГ в цереброспинальной жидкости не изменяется, при этом значительно повышается его уровень в крови, что позволяет предположить наличие различных систем секреции а-МСГ в цереброспинальной жидкости и в крови (Van Wimersma Greidanus et al., 1981).

К настоящему моменту не было исследовано, как влияет на уровень а-МСГ в плазме крови крысы принудительное плавание - широко используемая модель стресса, для которой описано изменение нейрохимических, физиологических и поведенческих реакций организма (De Pablo et al., 1989); (West, 1990); (Kirby et al., 1995); (Rueter and Jacobs, 1996); (Adell et al., 1997); (Gesing et al., 2001).

Похожие диссертационные работы по специальности «Физиология», 03.00.13 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Физиология», Дубынина, Елена Вячеславовна

выводы

1. Острый стресс, вызванный принудительным плаванием, приводит к увеличению уровня а-МСГ в плазме крови крысы, положительно коррелирующему с увеличением уровня АКТГ.

2. а-МСГ и Семакс при внутрибрюшинном введении увеличивают уровень активации транскрипционного фактора CREB и уровень нейротрофина BDNF в гиппокампе крысы.

3. а-МСГ и Семакс увеличивают уровни мРНК и белка BDNF в клетках гиппокампа крысы in vitro.

4. а-МСГ увеличивает уровень мРГПС ростового фактора VEGF в астроцитах гиппокампа крысы in vitro.

5. Синтетический агонист меланокортиновых рецепторов третьего и четвертого подтипов Меланотан II при внутрибрюшинном введении увеличивает уровень BDNF в гиппокампе крысы.

6. Селективный антагонист меланокортиновых рецепторов четвертого подтипа HS028 предотвращает вызванную исследованными меланокортинами стимуляцию экспрессии BDNF и VEGF в клетках гиппокампа крысы in vitro.

7. Полученные данные указывают на возможность осуществления нейропротекторных и когнитивных функций а-МСГ и его аналогов путем стимуляции продукции в клетках гиппокампа ряда ростовых/нейротрофических факторов, а также на вовлеченность меланокортиновых рецепторов четвертого подтипа MC4R в реализацию обнаруженных эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее было показано, что синтетический аналог меланокортинов Семакс увеличивает экспрессию мРНК BDNF в первичных культурах глиальных клеток базальных ядер переднего мозга крысы, и экспрессию BDNF в гиппокампе крысы in vivo на уровне мРНК и белка. В представляемой работе было впервые показано, что эндогенный меланокортин а-МСГ также способен оказывать влияние на экспрессию BDNF в гиппокампе крысы in vivo, и получены данные в пользу участия транскрипционного фактора CREB в осуществлении этого влияния. Впервые изучено изменение уровня BDNF в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы, а также изменение уровня нейротрофических факторов BDNF и VEGF в первичной культуре астроцитов гиппокампа крысы под действием представителей семейства МК.

Таким образом, показано, что как природный меланокортин а-МСГ, так и синтетический аналог МК Семакс способны увеличивать уровень BDNF в клетках гиппокампа крысы в моделях in vitro и in vivo. Кроме того, выявлена способность а-МСГ стимулировать экспрессию ростового фактора с широким спектром действия, включающем нейротрофические эффекты, -VEGF - в астроцитах гиппокампа крысы in vitro. При этом получены данные о вовлеченности меланокортиновых рецепторов четвертого подтипа MC4R в осуществление этих эффектов.

Представленные в работе данные указывают на возможность реализации нейропротекторных и когнитивных эффектов а-МСГ путем стимуляции продукции в клетках мозга ростовых/нейротрофических факторов. В совокупности, они расширяют представление о механизмах действия представителей пептидного семейства меланокортинов и их функциях в организме.

Полученные данные представляют научно-практический интерес в связи с тем, что регуляция экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в мозге рассматривается как один из перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов, в том числе обусловленных таким негативным, и в то же время широко распространенным в современной жизни, воздействием па организм, как дистресс. Известные к настоящему времени соединения, которые могут рассматриваться как кандидаты на роль регуляторов экспрессии нейротрофинов в мозге, например, антидепрессанты, обладают негативными побочными эффектами, что ограничивает их применение. Данные о влиянии МК на экспрессию нейротрофических факторов в мозге крысы позволяют предложить возможный механизм наблюдаемых ноотропных и нейропротекторных эффектов этих соединений, в частности клинически применяемого пептида Семакс, что может найти применение при разработке новых пептидных фармакологических средств. Кроме того, полученные данные о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов могут предоставить дополнительную информацию для дальнейших клинических исследований лекарственного препарата "Семакс" в целях расширения спектра показаний и противопоказаний его применения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дубынина, Елена Вячеславовна, 2009 год

1. Алексидзе, Н. Г., Балавадзе, М. В., Пономарева-Степная, М. А., Незовибатько, В. Н., Алфеева, Л. Ю., and Микадзе, Н. Ш. (1983) БЭБиМ 96, 24-26.

2. Ашмарин, И. П., Каменский, A. A., and Шелехов, С. Л. (1978) ДАН СССР 240(5), 12451247.

3. Виноградов, В. М., Медведев, В. И., Гречко, А. Т., Бахарев, В. Д., and Пономарева-Степная, М. А. (1980) Физиол. Жури. СССР. 66, 415-419.

4. Вознесенская, В. В. and Полетаева, И. И. (1984) Журн. ВИД 34, 32-37.

5. Гсцова, В. М., Орлова, Н. В., Фоломкина, A. A., and Незовибатько, В. Н. (1988) Ж. ВИД 38(6), 1041-1047.

6. Гусев, Е. И., Скворцова, В. И., Журавлева, Е. Ю., Андреева, Л. А., Незавибатько, В. Н., Гривенников, И. A., and Мясоедов, Н. Ф. (1999) Бюлл. 1. Патент № 2124365.

7. Гусев, Е. И., Скворцова, В. И., Мясоедов, Н. Ф., Незавибатько, В. Н., Журавлева, Е. Ю., and Ваничкин, А. В. (1997) Журнал неврологии и психиатрии. 97, 26-34.

8. Долотов, О. В., Середнина, Т. С., Левицкая, Н. Г., Каменский, А. А., Андреева, Л. А., Алфеева, Л. Ю., Нагаев, И. Ю., Золотарев, Ю. А., Гривенников, И. А., Энгеле, Ю., and Мясоедов, Н. Ф. (2003) Доклады Академии Наук 391, 131-134.

9. Скворцова, В. И., Насонов, Е. Л., Журавлева, Е. Ю., Гривенников, И. А., Арсеньсва, Е. Л., Суханов, И. И., Мясоедов, Ii. Ф., and Гусев, Е. И. (1999) Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. 99, 27.

10. Ткачук, В. А. (1983) Введение g молекулярную эндокринологию Изд-во МГУ., Москва.

11. Фирстова, Ю. Ю., Долотов, О. В., Копдрахин, Е. А., Дубинина, Е. В., Гривенников, И. A., and Ковалев, Г. И. (2009) Экспер. и клин, фармакол. В печати.

12. Яковлева, Е. В., Кузенков, В. С., Федоров, В. Н., Скворцова, В. И., Кошелев, В. Б., Гусев, Е. И., and Ашмарин, И. П. (1999) Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 127, 172-174.

13. Adán, R. A. and Gispen, W. H. (1997) Peptides 18, 1279-1287.

14. Adán, R. A. and Gispen, W. H. (2000) Eur. J. Pharmacol. 405, 13-24.

15. Adán, R. A., van der Kraan, M., Doornbos, R. P., Bar, P. R., Burbach, J. P., and Gispen, W. H. (1996) Brain Res. Mol. Brain Res. 36, 37-44.

16. Adell, A., Casanovas, J. M., and Artigas, F. (1997) Neuropharmacology 36, 735-741.

17. Agassandian, К., Gedncy, M., and Cassell, M. D. (2006) Brain Res. 1076, 78-86.

18. Aid, T., Kazantseva, A., Piirsoo, M., Palm, K., and Timmusk, T. (2007) J. Neurosci. Res. 85, 525-535.

19. Akiri, G., Nahari, D., Finkelstein, Y., Le, S. Y., Elroy-Stein, О., and Levi, В. Z. (1998) Oncogene 17, 227-236.

20. Alonso, M., Vianna, M. R., Depino, A. M., Mello e Souza, Pereira, P., Szapiro, G., Viola, H., Pitossi, F., Izquierdo, I., and Medina, J. H. (2002) Hippocampus 12, 551-560.

21. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., and Matthew, W. D. (1994) Proc. Nail. Acad. Sei. U. S. A 91, 2795-2799.

22. Antonawich, F. J., Azmitia, E. C., Kramer, H. K., and Strand, F. L. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sei. 739, 60-73.

23. Arai, H., Moroji, T., Kosaka, K., and Iizuka, R. (1986) Brain Res. 377, 305-310.

24. Ashmarin, I. P., Nezavibatko, V. N., Levitskaya, N. G., Koshelev, V. B., and Kamensky, A. A. (1995) Neurosci. Res. Commun. 16, 105-112.

25. Attella, M. J., Hoffman, S. W., Pilotte, M. P., and Stein, D. G. (1992) Behav. Neural Biol. 57, 157-166.

26. Bagnard, D., Vaillant, C., Khuth, S. T., Dufay, N., Lohrum, M., Puschel, A. W., Belin, M. F., Bolz, J., and Thomasset, N. (2001) J. Neurosci. 21, 3332-3341.

27. Baker, R. A., Herkenham, M., and Brady, L. S. (1996) J. Neuroendocrinal. 8, 337-343.

28. Barde, Y. A., Edgar, D., and Thoenen, FI. (1982) EMBO J. 1, 549-553.

29. Barker, P. A. (2009) Nat. Neurosci. 12, 105-106.

30. Bartholdi, D., Rubin, B. P., and Schwab, M. E. (1997) Eur. J. Neurosci. 9, 2549-2560.

31. Bates, D. O., Cui, T. G., Doughty, J. M., Winkler, M., Sugiono, M., Shields, J. D., Peat, D., Gillatt, D., and Harper, S. J. (2002) Cancer Res. 62, 4123-4131.

32. Bayatti, N., Hermann, FL, Lutz, B., and Behl, C. (2005) Endocrinology 146, 1205-1213.

33. Bayatti, N., Zschocke, J., and Behl, C. (2003) Endocrinology 144, 4051-4060.

34. Beylin, A. V. and Shors, T. J. (1998) Behav. Neurosci. 112, 1327-1338.

35. Bibel, M. and Barde, Y. A. (2000) Genes Dev. 14, 2919-2937.

36. Bicknell, A. B. (2008) J. Neuro endo crinol. 20, 692-699.

37. Biffo, S., Offenhauser, N., Carter, B. D., and Barde, Y. A. (1995) Development 121, 24612470.

38. Bijlsma, W. A., Schotman, P., Jennekens, F. G., Gispen, W. H., and De, W. D. (1983) Eur. J. Pharmacol. 92, 231-236.

39. Bilang-Bleuel, A., Rech, J., De, C. S., Holsboer, F., and Reul, J. M. (2002) Eur. J. Neurosci. 15, 1048-1060.

40. Bohus, B. and De, W. D. (1966) Science 153, 318-320.

41. Bohus, B. and Endroczi, E. (1965) Acta Physiol Acad. Sei. Hung. 28, 125-131.

42. Bohus, B., Nyakas, C., and Endroczi, E. (1968) Int. J. Neuropharmacol. 7, 307-314.

43. Bonni, A., Brunei, A., West, A. E., Datta, S. R., Takasu, M. A., and Greenberg, M. E. (1999) Science 286, 1358-1362.

44. Boston, B. A. and Cone, R. D. (1996) Endocrinology 137, 2043-2050.

45. Bourtchuladze, R., Frenguelli, B., Blendy, J., Cioffi, D., Schutz, G., and Silva, A. J. (1994) Cell 79, 59-68.

46. Breier, G., Clauss, M., and Risau, W. (1995) Dev. Dyn. 204, 228-239.

47. Brightwell, J. J., Smith, C. A., Countryman, R. A., Neve, R. L., and Colombo, P. J. (2005) Learn. Mem. 12, 12-17.

48. Brownstein, M. J. (1980) Adv. Biochem. Psychopharmacol. 21, 365-371.

49. Buggy, J. J. (1998) Biochem. J. 331 (Pt 1), 211-216.

50. Cai, D., Qiu, J., Cao, Z„ McAtee, M., Bregman, B. S., and Filbin, M. T. (2001) J. Neurosci. 21, 4731-4739.

51. Carmelict, P. (2003) Nat. Rev. Genet. 4, 710-720.

52. Carmeliet, P. and Storkebaum, E. (2002) Semin. Cell Dev. Biol. 13, 39-53.

53. Carr, J. A., Saland, L. C., Samora, A., Desai, S., and Benevidez, S. (1990) Cell Tissue Res. 261, 589-593.

54. Carter, B. D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B., Offenhauser, N., Bohm-Matthaei, R., Baeuerle, P. A., and Barde, Y. A. (1996) Science 272, 542-545.

55. Causing, C. G., Gloster, A., Aloyz, R., Bamji, S. X., Chang, E., Fawcett, J., Kuchel, G., and Miller, F. D. (1997) Neuron 18, 257-267.

56. Chaki, S., Hirota, S., Funakoshi, T., Suzuki, Y., Suetakc, S., Okubo, T., Ishii, T., Nakazato, A., and Okuyama, S. (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther. 304, 818-826.

57. Chen, W., Kelly, M. A., Opitz-Araya, X., Thomas, R. E., Low, M. J., and Cone, R. D. (1997) Cell 91, 789-798.

58. Chen, Y., Fenoglio, K. A., Dube, C. M., Grigoriadis, D. E., and Baram, T. Z. (2006) Mol. Psychiatry 11, 992-1002.

59. Cheng, L., Jia, H., Lohr, M., Bagherzadeh, A., Holmes, D. I., Selwood, D., and Zachary, I. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30654-30661.

60. Chhajlani, V., Muceniece, R., and Wikberg, J. E. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 866-873.

61. Civelli, 0., Birnberg, N., and Herbert, E. (1982)7. Biol. Chem. 257, 6783-6787.

62. Claffey, K. P., Shih, S. C., Mullen, A., Dziennis, S., Cusick, J. L., Abrams, K. R., Lee, S. W., and Detmar, M. (1998) Mol Biol Cell 9, 469-481.

63. Cohen-Cory, S. (1999) J. Neurosci. 19, 9996-10003.

64. Cohen-Cory, S. and Fraser, S. E. (1995) Nature 378, 192-196.

65. Cole, R. and de Vellis, J. (1989) in A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System (Shahar, A. and de Vellis, J., Eds.) pp 121-133, Wiley Liss, New York.

66. Colombo, P. J. (2004) Neurobiol. Learn. Mem. 82, 268-277.

67. Colombo, P. J., Brightwell, J. J., and Countryman, R. A. (2003) J. Neurosci. 23, 3547-3554.

68. Countryman, R. A. and Gold, P. E. (2007) Learn. Mem. 14, 350-358.

69. Craig, J. C., Schumacher, M. A., Mansoor, S. E., Farrens, D. L., Brennan, R. G., and Goodman, R. H. (2001) J. Biol. Chem 276, 11719-11728.

70. Cremer, M. C., de Barioglio, S. R., and Celis, M. E. (1998) Peptides 19, 383-388.

71. Cronin, A. S., Horan, T. L., Spergel, D. J., Brooks, A. N., Hastings, M. H., and Ebling, F. J. (2004) Eur. J. Neurosci. 20, 338-344.

72. Curtis, R., Adryan, K. M., Stark, J. L., Park, J. S., Compton, D. L., Weskamp, G., Huber, L. J., Chao, M. V., Jaenisch, R., Lee, K. F., and . (1995) Neuron 14, 1201-1211.

73. Daniels, D., Patten, C. S., Roth, J. D., Yce, D. K., and Fluharty, S. J. (2003) Brain Res. 986, 1-11.

74. Dash, P. IC., Hochner, B., and Kandel, E. R. (1990) Nature 345, 718-721.

75. Daval, J. L., Louis, J. C., Gerard, M. J., and Vincendon, G. (1983) Neurosci. Lett. 36, 299304.

76. De Kloet, E. R„ De, K. S., Schild, V., and Veldhuis, H. D. (1988) Neuroendocrinology 47, 109-115.

77. De Pablo, J. M„ Parra, A., Segovia, S., and Guillamon, A. (1989) Physiol Behav. 46, 229-231.

78. De Wied, D. (1969) in Frontiers in Neuroendocrinology pp 97-140.

79. De Wied, D. (1990) Acta Neurobiol. Exp. (Wars. ) 50, 353-366.

80. De Wied, D. (1993) Ann. N. Y. Acad. Sei. 680, 20-28.

81. De Wied, D. and Jolles, J. (1982) Physiol Rev. 62, 976-1059.

82. De Wied, D., Witter, A., and Greven, H. M. (1975) Biochem. Pharmacol. 24, 1463-1468.

83. Deak, M., Clifton, A. D., Lucocq, L. M., and Alessi, D. R. (1998) EMBO J. 17, 4426-4441.

84. Delbende, C., Jegou, S., Tranchand-Bunel, D., Leroux, P., Tonon, M. C., Mocaer, E., Pelletier, G., and Vaudry, H. (1985) Rev. Neurol. (Paris) 141, 429-439.

85. Dempsey, G. L., Kastin, A. I., and Schally, A. V. (1975) Horm. Behav. 3, 333-337.

86. Dolotov, O. V., Karpenko, E. A., Seredenina, T. S., Inozemtseva, L. S., Levitskaya, N. G., Zolotarev, Y. A., Kamensky, A. A., Grivennikov, I. A., Engele, J., and Myasoedov, N. F. (2006b) J. Neurochem. 97 Suppl 1, 82-86.

87. Dore-Duffy, P., Wang, X., Mehedi, A., Kreipke, C. W., and Rafols, J. A. (2007) Neurol. Res. 29, 395-403.

88. Duman, R. S., Fishman, P. H„ and Tallman, J. F. (1994) J. Recept. Res. 14, 1-10.

89. Duman, R. S., Heninger, G. R., andNestler, E. J. (1997) Arch. Gen. Psychiatry 54, 597-606.

90. Dumont, D. J., Fong, G. FI., Puri, M. C., Gradwohl, G., Alitalo, K„ and Breitman, M. L. (1995) Dev. Dyn. 203, 80-92.

91. Edwards, P. M., Van der Zee, C. E., Verhaagen, J., Schotman, P., Jennekens, F. G., and Gispen, W. H. (1984) J. Neurol. Sei. 64, 333-340.

92. Eide, F. F., Vining, E. R., Eide, B. L., Zang, K., Wang, X. Y., and Reichardt, L. F. (1996) J. Neurosci. 16, 3123-3129.

93. Elias, L. L., Huebner, A., Pullinger, G. D., Mirtclla, A., and Clark, A. J. (1999) J. Clin. Endocrinol. Metab 84, 2766-2770.

94. Ernfors, P., lbanez, C. F., Ebendal, T., Olson, L., and Persson, H. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 87, 5454-5458.

95. Eskay, R. L., Brownstein, M. J., and Long, R. T. (1979a) Science 205, 827-829.

96. Eskay, R. L„ Giraud, P., Oliver, C., and Brown-Stein, M. J. (1979b) Brain Res. 178, 55-67.

97. Facchiano, F., Fernandez, E., Mancarella, S., Maira, G., Miscusi, M., D'Arcangelo, D., Cimino-Reale, G., Falchetti, M. L., Capogrossi, M. C., and Pallini, R. (2002) J. Neurosurg. 97, 161-168.

98. Fekete, M. I., Stark, E., Herman, J. P., Palkovits, M., and Kanyicska, B. (1978) Neurosci. Lett. 10, 153-158.

99. Felling, R. J. and Levison, S. W. (2003) J. Neurosci. Res. 73, 277-283.

100. Ferrara, N. (2004) Endocr. Rev. 25, 581-611.

101. Ferrara, N„ Gerber, H. P., and LeCouter, J. (2003) Nat. Med. 9, 669-676.

102. Ferrara, N. and Hcnzel, W. J. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858.

103. Ferrara, N., Houck, K., Jakeman, L., and Leung, D. W. (1992) Endocr. Rev. 13, 18-32.

104. Ferrari, F. and Giuliani, D. (1997) Neuropharmacology 36, 769-777.

105. Finkbeiner, S., Tavazoie, S. F., Maloratsky, A., Jacobs, K. M., Harris, K. M., and Greenberg, M. E. {\991) Neuron 19, 1031-1047.

106. Forslin, A. S., Spulber, S., Popescu, L. M., Winblad, B„ Post, C., Oprica, M., and Schultzberg, M. (2006) Neuropeptides 40, 65-75.

107. Forstreuter, F., Lucius, R., and Mentlein, R. (2002) J. Neuroimmunol. 132, 93-98.

108. Frade, J. M., Rodriguez-Tebar, A., and Barde, Y. A. (1996) Nature 383, 166-168.

109. Fratta, W., Rossetti, Z. L., Poggioli, R., and Gessa, G. L. (1981) Neurosci. Lett. 24, 71-74.

110. Frcy, U. and Moms, R. G. (1997) Nature 385, 533-536.

111. Fryer, R. H., Kaplan, D. R., Feinstein, S. C., Radeke, M. J., Grayson, D. R., and Kromer, L. F. (1996)./. Comp Neurol. 374, 21-40.

112. Gantz, I., Konda, Y., Tashiro, T., Shimoto, Y., Miwa, H., Munzert, G., Watson, S. J., DelValle, J., and Yamada, T. (1993)./ Biol. Chem. 268, 8246-8250.

113. Gesing, A., Bilang-Bleuel, A., Droste, S. K., Linthorst, A. C., Holsboer, F., and Reul, J. M. (2001)./ Neurosci. 21, 4822-4829.

114. Gispen, W. H., Buitelaar, J., Wiegant, V. M., Terenius, L., and De, W. D. (1976) Eur. J. Pharmacol. 39, 393-397.

115. Gold, P. E. and Delanoy, R. L. (1981) in Endogenous Peptides and learning and memory process pp 79-97, Academ Press, London.

116. Gold, P. E. and McGaugh, J. L. (1978) in ClinicalPsychoneuroendocrinology in Reproduction (Carenza, L. and Paneheri, P., Eds.) pp 25-46, Academic Press, London.

117. Gonzalez, G. A. and Montminy, M. R. (1989) Cell 59, 675-680.

118. Gospodarowicz, D., Abraham, J. A., and Schilling, J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 7311-7315.

119. Gotz, R., Koster, R„ Winkler, C., Raulf, F., Lottspeich, F., Schartl, M., and Thoenen, H. (1994) Nature 372, 266-269.

120. Gotz, R. and Schartl, M. (1994) Comp Biochem. Physiol Pharmacol. Toxicol. Endocrinol 108, 1-10.

121. Gray, J. A. (1971) Nature 229, 52-54.

122. Greer, P. L. and Greenberg, M. E. (2008) Neuron 59, 846-860.

123. Greven, H. M. and De, W. D. (1973) Prog. Brain Res. 39, 429-442.

124. Griffon, N., Mignon, V., Facchinetti, P., Diaz, J., Schwartz, J. C„ and Sokoloff, P. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 200, 1007-1014.

125. Grivennikov, I. A., Dolotov, O. V., Zolotarev, Y. A., Andreeva, L. A., Myasoedov, N. F., Leacher, L„ Black, I. B„ and Dreyfus, C. F. (2008) Restor. Neurol. Neurosci. 26, 35-43.

126. Guzowski, J. F. and McGaugh, J. L. (1997) Proc. Natl Acad. Sci U. S. A 94, 2693-2698. 134.IIall, J., Thomas, K. L., and Everitt, B. J. (2000) Nat. Neurosci. 3, 533-535.

127. Hallbook, F., Ibanez, C. F., and Persson, H. (1991) Neuron 6, 845-858.

128. Hartmeyer, M., Scholzen, T., Becher, E., Bhardwaj, R. S., Schwarz, T., and Luger, T. A. (1997) J. Immunol. 159, 1930-1937.

129. Hayashi, T., Abe, K., Suzuki, H„ and Itoyama, Y. (1997) Stroke 28, 2039-2044.

130. Hendrie, C. A. (1988) Physiol Behav. 42, 41-45.

131. Hoeffler, J. P., Meyer, T. E., Yun, Y., Jameson, J. L., and Habener, J. F. (1988) Science 242, 1430-1433.

132. Hoi, E. M., Verhage, M., Gispen, W. H., and Bar, P. R. (1994) Brain Res. 662, 109-116. Hl.Hollt, V., Haarmann, I., Seizinger, B. R., and Ilerz, A. (1982) Endocrinology 110, 1885-1891.

133. Hong, E. J., McCord, A. E., and Greenberg, M. E. (2008) Neuron 60, 610-624.

134. Hu, B. R., Fux, C. M., Martone, M. E., Zivin, J. A., and Ellisman, M. H. (1999) Neuroscience 89, 437-452.

135. Huez, I., Creancier, L., Audigier, S., Gensac, M. C., Prats, A. C., and Prats, H. (1998) Mol. Cell Biol. 18, 6178-6190.

136. Iguchi-Ariga, S. M. and Schaffner, W. (1989) Genes Dev. 3, 612-619.146.1mpey, S., McCorlde, S. R„ Cha-Molstad, H., Dwyer, J. M., Yochum, G. S., Boss, J. M., McWeeney, S., Dunn, J. J., Mandel, G., and Goodman, R. H. (2004) Cell 119, 1041-1054.

137. Ito, M., Yu, O., and Chiu, T. H. (1988) Brain Dev. 10, 106-109.

138. Jauneau, A. C., Ischenko, A., Chatagner, A., Benard, M., Chan, P., Schouft, M. T., Patte, C., Vaudry, H., and Fontaine, M. (2006) J. Neuroinjlammation. 3, 8.

139. Jefferys, D., Copolov, D., Irby, D., and Funder, J. (1983) Eur. J. Pharmacol. 92, 99-103.

140. Jefferys, D. and Funder, J. (1996) Eur. J. Pharmacol. 295, 131-135.

141. Jeon, S. H., Chae, B. C., Kim, H. A., Seo, G. Y., Seo, D. W., Chun, G. T„ Yie, S. W., Eom, S. H., and Kim, P. H. (2007) Mol. Cells 23, 23-29.

142. Jin, K., Mao, X. 0., Batteur, S. P., McEachron, E., Leahy, A., and Greenberg, D. A. (2001) Neuroscience 108, 351-358.

143. Jin, K., Zhu, Y., Sun, Y., Mao, X. O., Xie, L., and Greenberg, D. A. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A99, 11946-11950.

144. Jin, K. L., Mao, X. O., and Greenberg, D. A. (2000a) J. Mol. Neurosci. 14, 197-203.

145. Jin, K. L., Mao, X. O., and Greenberg, D. A. (2000b) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 97, 10242-10247.

146. Joosten, E. A., Majewska, B., Houweling, D. A., Bar, P. R., and Gispen, W. II. (1999),/. Neurotrauma 16, 543-553.

147. Jorge, R. E., Robinson, R. G., Arndt, S., and Starkstein, S. (2003) Am. J. Psychiatry 160, 1823-1829.

148. Jovanovic, J. N., Czernik, A. J., Fienberg, A. A., Greengard, P., and Sihra, T. S. (2000) Nat. Neurosci. 3, 323-329.

149. Kandel, E. R. (2001) Science 294, 1030-1038.löO.Kawashima, N., Chaki, S., and Okuyama, S. (2003) Neurosci. Lett. 353, 119-122.

150. Keck, P. J., Hauser, S. D., Krivi, G., Sanzo, K., Warren, T., Feder, J., and Connolly, D. T. (1989) Science 246, 1309-1312.

151. Kelsey, J. E. (1975) J. Comp Physiol Psychol. 88, 271-280.

152. Kendall, D. A., McEwen, B. S., and Enna, S. J. (1982) Brain Res. 236, 365-374.

153. Kernie, S. G., Liebl, D. J., and Parada, L. F. (2000) EMBO J. 19, 1290-1300.

154. Khachaturian, H., Alessi, N. E., Munfakh, N., and Watson, S. J. (1983) Life Sei. 33 Suppl 1, 61-64.

155. Khorram, O., Bedran de Castro, J. C., and McCann, S. M. (1985) Endocrinology 117, 24832489.

156. Kim, J., Lu, J., and Quinn, P. G. Distinct cAMP response element-binding protein (CREB) domains stimulate different steps in a concerted mechanism of transcription activation. Proc.Natl A cad.Sei USA 97, 11292-11296. 2000.168.Rcf Type: Journal (Full)

157. Kirby, L. G., Allen, A. R., and Lucki, I. (1995) Brain Res. 682, 189-196.

158. Kistler-FIeer, V., Lauber, M. E., and Lichtensteiger, W. (1998) J. Neuroendocrinol. 10, 133146.

159. Kjaer, A., Knigge, U., Bach, F. W., and Warberg, J. (1995) Neuroendocrinology 61, 167-172.

160. Klein, R., Conway, D., Parada, L. F., and Barbacid, M. (1990) Cell 61, 647-656.

161. Knapp, R. J., Goldenberg, R., Shuck, C., Cecil, A., Watkins, J., Miller, C., Crites, G., and Malatynska, E. (2002) Eur. J. Pharmacol. 440, 27-35.

162. Kogan, J. H., Frankland, P. W., Blcndy, J. A., Coblentz, J., Marowitz, Z., Schutz, G., and Silva, A. J. (1997) Curr. Biol. 7, 1-11.

163. Korte, M., Carroll, P., Wolf, E., Brem, G., Thoenen, Ii., and Bonhoeffer, T. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 92, 8856-8860.

164. Korte, S. M., De Kloet, E. R., Buwalda, B., Bouman, S. D., and Bohus, B. (1996) Eur. J. Pharmacol. 301, 19-25.

165. Kovacs, G. L. and De, W. D. (1994) Pharmacol. Rev. 46, 269-291.

166. Kovacs, Z., Ikezaki, K., Samoto, K., Inamura, T„ and Fukui, M. (1996) Stroke 27, 1865-1872.

167. Kovalchuk, Y., Hanse, E„ Kafitz, K. W., and Konnerth, A. (2002) Science 295, 1729-1734.

168. Kreibich, A. S., Briand, L., Cleck, J. N., Ecke, L., Rice, K. C., and Blendy, J. A. (2009) Neuropsychopharmacology 34, 2609-2617.

169. Krum, J. M. and Khaibullina, A. (2003) Exp. Neurol. 181, 241-257.

170. Krum, J. M. and Rosenstein, J. M. (1998) Exp. Neurol. 154, 57-65.

171. Kudo, K., Wati, H., Qiao, C„ Arita, J., and Kanba, S. (2005) Brain Res. 1054, 30-37.

172. Kwok, R. P., Lundblad, J. R., Chrivia, J. C., Richards, J. P., Bachinger, H. P., Brennan, R. G., Roberts, S. G., Green, M. R„ and Goodman, R. H. (1994) Nature 370, 223-226.

173. Ladomery, M. R., Harper, S. J., and Bates, D. O. (2007) Cancer Lett. 249, 133-142.

174. Lee, D. R„ Semba, R., Kondo, II., Goto, S., andNakano, K. (1999) Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 337-340.

175. Lee, J., Duan, W., and Mattson, M. P. (2002) J. Neurochem. 82, 1367-1375.

176. Lee, S. J., Lee, T. S., Alves, S. E., and Strand, F. L. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sci. 739, 320323.

177. Leibrock, J., Lottspeich, F., Hohn, A., Hofer, M., Hengerer, B., Masiakowski, P., Thoenen, H., and Barde, Y. A. (1989) Nature 341, 149-152.

178. Lennmyr, F., Ata, K. A., Funa, K., Olsson, Y., and Terent, A. (1998) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 874-882.191 .Leung, D. W., Cachianes, G„ Kuang, W. J., Goeddel, D. V., and Ferrara, N. (1989) Science 246, 1306-1309.

179. Levi-Montalcini, R. (1987) Science 237, 1154-1162.

180. Levy, A. P., Levy,N. S., Wegner, S., and Goldberg, M. A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 1333313340.

181. Levy, N. S., Chung, S., Furneaux, H., and Levy, A. P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6417-6423.

182. Li, W. D., Joo, E. J., Furlong, E. B., Galvin, M., Abel, K., Bell, C. J., and Price, R. A. (2000) Int. J. Obes. Relat Metab Disord. 24, 206-210.

183. Lichtensteiger, W., Richards, J. G., and Kopp, H. G. (1978) Brain Res. 157, 73-88.

184. Lindblom, J., Kask, A., Hagg, E., Harmark, L., Bergstrom, L., and Wikberg, J. (2002) Pharmacol. Res. 45, 119-124.

185. Lindsay, R. M. (1994) Neurobiol. Aging 15, 249-251.

186. Linnarsson, S., Bjorklund, A., and Ernfors, P. (1997) Eur. J. Neurosci. 9, 2581-2587.

187. Linnik, M. D., Zobrist, R. H., and Hatfield, M. D. (1993) Stroke 24, 2002-2008.

188. Lipsky, R. I-I. and Marini, A. M. (2007) Ann. N. Y. Acad. Sci. 1122, 130-143.

189. Lohof, A. M., Ip, N. Y., and Poo, M. M. (1993) Nature 363, 350-353.

190. Lonze, B. E. and Ginty, D. D. (2002) Neuron 35, 605-623.

191. Lonze, B. E., Riccio, A., Cohen, S., and Ginty, D. D. (2002) Neuron 34, 371-385.

192. Louissaint, A., Jr., Rao, S., Leventhal, C., and Goldman, S. A. (2002) Neuron 34, 945-960.

193. Low, M. J., Simerly, R., and Cone, R. D. (1994) Current Opinion in Endocrinol Diab 1, 7988.

194. Lyons, W. E., Mamounas, L. A., Ricaurte, G. A., Coppola, V., Reid, S. W., Bora, S. H., Wihler, C., Koliatsos, V. E., and Tessarollo, L. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96, 15239-15244.

195. Lyson, K. and McCann, S. M. (1994) Neuroimmunomodulation. 1, 153-158.

196. Mabuchi, T., Kitagawa, K., Kuwabara, K., Takasawa, K., Ohtsuki, T., Xia, Z., Storm, D., Yanagihara, T., Hori, M., and Matsumoto, M. (2001)./ Neurosci. 21, 9204-9213.

197. Mahadeo, D., Kaplan, L., Chao, M. V., and Hempstead, B. L. (1994) J. Biol. Chem. 269, 6884-6891.

198. Mamounas, L. A., Altar, C. A., Blue, M. E., Kaplan, D. R., Tessarollo, L., and Lyons, W. E. (2000)./ Neurosci. 20, 771-782.

199. Marmigere, F., Givalois, L., Rage, F., Arancibia, S., and Tapia-Arancibia, L. (2003) Hippocampus 13, 646-655.

200. Marti, H. J., Bernaudin, M., Bellail, A., Schoch, II., Euler, M., Petit, E., and Risau, W. (2000) Am. J. Pathol 156, 965-976.

201. Martinez, A., Alcantara, S., Bon-ell, V., Del Rio, J. A., Blasi, J., Otal, R., Campos, N., Boronat, A., Barbacid, M., Silos-Santiago, I., and Soriano, E. (1998) J. Neurosci. 18, 73367350.

202. Matsumoto, T., Rauskolb, S., Polack, M., Klose, J., Kolbeck, R., Korte, M., and Barde, Y. A. (2008) Nat. Neurosci. 11, 131-133.

203. Matsuzaki, H., Tamatani, M., Yamaguchi, A., Namikawa, K., Kiyama, H., Vitek, M. P., Mitsuda, N., and Tohyama, M. (2001) FASEBJ. 15, 1218-1220.

204. Mayr, B. and Montminy, M. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 599-609.

205. McDonald, N. Q. and Blundell, T. L. (1991) J. Mol. Biol. 219, 595-601.

206. McDonald, N. Q. and Hendrickson, W. A. (1993) Cell 73, 421-424.

207. Millauer, B., Wizigmann-Voos, S., Schnurch, H., Martinez, R., Moller, N. P., Risau, W., and Ullrich, A. (1993) Cell 72, 835-846.

208. Mineur, P., Colige, A. C., Deroanne, C. F., Dubail, J., Kesteloot, F., Habraken, Y., Noel, A., Voo, S., Waltenberger, J., Lapiere, C. M., Nusgens, B. V., and Lambert, C. A. (2007) J. Cell Biol 179, 1261-1273.

209. Minichiello, L., Casagranda, F., Tatche, R. S., Stucky, C. L., Postigo, A., Lewin, G. R., Davies, A. M., and Klein, R. (1998) Neuron 21, 335-345.

210. Minichiello, L. and Klein, R. (1996) Genes Dev. 10, 2849-2858.

211. Minichiello, L., Korte, M., Wolfer, D., Kuhn, R., Unsicker, K., Cestari, V., Rossi-Arnaud, C., Lipp, H. P., Bonhoeffer, T., and Klein, R. (1999) Neuron 24, 401-414.

212. Mizuno, M., Yamada, K., Olariu, A., Nawa, H., andNabeshima, T. (2000) J. Neurosci. 20, 7116-7121.

213. Monacci, W. T., Merrill, M. J., and Oldfield, E. H. (1993) Am. J. Physiol 264, C995-1002.

214. Montminy, M. R. and Bilezikjian, L. M. (1987) Afatare 328, 175-178.

215. Montminy, M. R., Sevarino, K. A., Wagner, J. A., Mandel, G., and Goodman, R. H. (1986) Proc. Natl Acad. Sci U. S. A 83, 6682-6686.

216. Mountjoy, K. G. (1994) Mol. Cell Endocrinol 102, R7-11.

217. Mountjoy, K. G., Robbins, L. S„ Mortrud, M. T., and Cone, R. D. (1992) Science 257, 12481251.

218. Mountjoy, K. G. and Wong, J. (1997) Mol. Cell Endocrinol 128, 171-177.

219. Mowla, S. J., Farhadi, H. F., Pareelc, S., Atwal, J. K., Morris, S. J., Seidah, N. G., and Murphy, R. A. (2001) J. Biol. Chem. 276, 12660-12666.

220. Mu, J. S., Li, W. P., Yao, Z. B., and Zhou, X. F. (1999) Brain Res. 835, 259-265.

221. Murphy, J. V. and Miller, R. E. (1955) J. Comp Physiol Psychol. 48, 47-49.

222. Neufeld, G., Cohen, T., Gengrinovitch, S., and Poltorak, Z. (1999) FASEB J. 13, 9-22.

223. Nichols, M., Weih, F., Schmid, W., DeVack, C., Kowenz-Leutz, E., Luckow, B., Boshart, M., and Schutz, G. (1992) EMBO J. 11, 3337-3346.

224. Nilsson, A. S., Fainzilber, M„ Falck, P., and Ibanez, C. F. (1998) FEBS Lett. 424, 285-290.

225. Nowakowska, E., Chodera, A., and Kus, IC. (1996) Pol. J. Pharmacol. 48, 255-260.

226. Oliver, C. and Porter, J. C. (1978) Endocrinology 102, 697-705.243.0nesto, C., Berra, E., Grepin, R., and Pages, G. (2004) J. Biol. Chem. 279, 34217-34226.

227. Pages, G. and Pouyssegur, J. (2005) Cardiovasc. Res. 65, 564-573.

228. Palmer, T. D., Willhoite, A. R., and Gage, F. H. (2000) J. Comp Neurol. 425, 479-494.

229. Pancheri, P., Biondi, M., Delle, C. R., Maione, M. A., Fierro, A., and Giovannini, C. (1984) Ric. Clin. Lab 14, 221-229.

230. Patapoutian, A. and Reichardt, L. F. (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11, 272-280.

231. Plantinga, L. C„ Verhaagen, J., Edwards, P. M., Hali, M., Brakkee, J. H., and Gispen, W. H. (1995) Peptides 16, 319-324.

232. Plate, K. H., Beck, H., Danner, S., Allegrini, P. R., and Wiessner, C. (1999) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 654-666.

233. Porsolt, R. D., Le, P. M., and Jalfre, M. (1977) Nature 266, 730-732.

234. Porte, Y., Buhot, M. C., and Mons, N. (2007) Neurobiol. Aging.

235. Pozzo-Miller, L. D., Gottschalk, W., Zhang, L., McDermott, K., Du, J., Gopalakrishnan, R., Oho, C., Sheng, Z. H., and Lu, B. (1999) J. Neurosci. 19, 4972-4983.

236. Pranzatelli, M. R. (1994) Exp. Neurol. 125, 142-161.

237. Pritchard, L. E. and White, A. (2007) Endocrinology 148, 4201-4207.

238. Qiu, M. H., Zhang, R., and Sun, F. Y. (2003) J. Neurochem. 87, 1509-1517.

239. Raab, S., Beck, H., Gaumann, A., Yuce, A., Gerber, H. P., Plate, K., Hammes, H. P., Ferrara, N., and Breier, G. (2004) Thromb. Haemost. 91, 595-605.

240. Racca, S., Spaccamiglio, A., Esculapio, P., Abbadessa, G., Cangemi, L., DiCarlo, F., and Portaleone, P. (2005) Pharmacol. Biochem. Behav. 81, 894-900.

241. Ramaekers, F., Rigter, FI., and Leonard, B. E. (1978) Pharmacol. Biochem. Behav. 8, 547551.

242. Reichardt, L. F. (2006) Philos. Trans. R. Soc. LondBBiol. Sei. 361, 1545-1564.

243. Riccio, A., Ahn, S., Davenport, C. M., Blendy, J. A., and Ginty, D. D. (1999) Science 286, 2358-2361.

244. Richter-Landsberg, C. and Jastorff, B. (1986) J. Cell Biol. 102, 821-829.

245. Robinson, C. J. and Stringer, S. E. (2001) J. Cell Sei. 114, 853-865.

246. Rodriguez-Tebar, A., Dechant, G., and Barde, Y. A. (1990) Neuron 4, 487-492.

247. Romagnano, M. A. and Joseph, S. A. (1983) Brain Res. 276, 1-16.

248. Roozendaal, B., Okuda, S., Van der Zee, E. A., and McGaugh, J. L. (2006) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 103, 6741-6746.

249. Rosenthal, A., Goeddel, D. V., Nguyen, T., Martin, E., Burton, L. E., Shih, A., Laramee, G. R., Wurm, F., Mason, A., Nikolics, K., and . (1991) Endocrinology 129, 1289-1294.

250. Rotllant, J„ Balm, P. H., Ruane, N. M., Perez-Sanchez, J., Wendelaar-Bonga, S. E., and Tort, L. (2000) Gen. Comp Endocrinol 119, 152-163.

251. Rousseau, K., Kauser, S., Pritchard, L. E., Warhurst, A., Oliver, R. L., Slominski, A., Wei, E. T., Thody, A. J„ Tobin, D. J., and White, A. (2007) FASEB J. 21, 1844-1856.

252. Rueter, L. E. and Jacobs, B. L. (1996) Brain Res. 739, 57-69.

253. Russo-Neustadt, A. A., Beard, R. C., Iiuang, Y. M., and Cotman, C. W. (2000) Neuroscience 707,305-312.

254. Saluja, D., Vassallo, M. F., and Tanese, N. (1998) Mol. Cell Biol. 18, 5734-5743.

255. Sarkar, S., Legradi, G., and Lechan, R. M. (2002) Brain Res. 945, 50-59.

256. Sawai, H., Clarke, D. B., Kittlerova, P., Bray, G. M., and Aguayo, A. J. (1996) J. Neurosci. 16, 3887-3894.

257. Sawyer, T. K., Sanfilippo, P. J., Hruby, V. J., Engel, M. H., Heward, C. B., Burnett, J. B., and Hadley, M. E. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 77, 5754-5758.

258. Schanzer, A., Wachs, F. P., Wilhelm, D., Acker, T., Cooper-Kuhn, C., Beck, H., Winkler, J., Aigner, L., Plate, K. H., and Kuhn, H. G. (2004) Brain Pathol. 14, 237-248.

259. Schioth, H. B., Bouifrouri, A. A., Rudzish, R., Muceniece, R., Watanobe, H., Wikberg, J. E., and Larhammar, D. (2002) Regul. Pept. 106, 7-12.

260. Schioth, H. B., Mutulis, F., Muceniece, R., Prusis, P., and Wikberg, J. E. (1998) Br. J. Pharmacol. 124, 75-82.

261. Schuman, E. M. (1999) Curr. Opin. Neurobiol. 9, 105-109.

262. Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., and Segal, R. A. (1997) Neuron 19, 269-281.

263. Seipel, K., Eberhardt, M„ Muller, P., Pescia, E., Yanze, N., and Schmid, V. (2004) Dev. Dyn. 231, 303-312.

264. Selkirk, J. V., Nottebaum, L. M., Lee, J., Yang, W., Foster, A. C., and Lechner, S. M. (2007) Neuropharmacology 52, 459-466.

265. Senger, D. R., Galli, S. J., Dvorak, A. M., Perruzzi, C. A., Harvey, V. S., and Dvorak, H. F. (1983) Science 219, 983-985.

266. Sharma, H. S. (2005) Ann. N. Y. Acad. Sci. 1053, 407-421.

267. Shen, Q., Goderie, S. K., Jin, L., Karanth, N., Sun, Y., Abramova, N., Vincent, P., Pumiglia, K., and Temple, S. (2004) Science 304, 1338-1340.

268. Shieh, P. B., Hu, S. C., Bobb, K., Timmusk, T„ and Ghosh, A. (1998) Neuron 20, 727-740.

269. Shih, S. C. and Claffey, K. P. (1999) J. Biol. Chem. 274, 1359-1365.

270. Shima, D. T., Kuroki, M., Deutsch, U., Ng, Y. S., Adamis, A. P., and D'Amore, P. A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 3877-3883.

271. Shirakura, M., Inoue, M., Fujikawa, S., Washizawa, K., Komaba, S., Maeda, M., Watabe, K., Yoshikawa, Y., andHasegawa, M. (2004) Gene Ther. 11, 784-790.

272. Shirayama, Y., Chen, A. C., Nakagawa, S., Russell, D. S., and Duman, R. S. (2002) J. Neurosci. 22, 3251-3261.

273. Shors, T. J. (2001 )Neurobiol. Learn. Mem. 75, 10-29.

274. Silverman, W. F., Krum, J. M., Mani, N., and Rosenstein, J. M. (1999) Neuroscience 90, 1529-1541.

275. Sinor, A. D., Irvin, S. M., Cobbs, C. S., Chen, J., Graham, S. H., and Greenberg, D. A. (1998) Brain Res. 812, 289-291.

276. Skold, M., Cullheim, S., Hammarberg, II., Piehl, F., Suneson, A., Lake, S., Sjogren, A., Walum, E., and Risling, M. (2000) Eur. J. Neurosci. 12, 3675-3686.

277. Slominski, A., Ermak, G., and Mihm, M. (1996) J. Clin. Endocrinol. Metab 81, 2746-2749.

278. Smotherman, W. P. and Levine, S. (1978) J. Comp Physiol Psychol. 92, 22-33.

279. Snell, C. R. and Snell, P. H. (1982) FEBSLett. 137, 209-212.

280. Sondell, M., Lundborg, G., and Kanje, M. (1999a)./. Neurosci. 19, 5731-5740.

281. Sondell, M., Lundborg, G., and Kanje, M. (1999b) Brain Res. 846, 219-228.

282. Sondell, M., Sundler, F., and Kanje, M. (2000) Eur. J. Neurosci. 12, 4243-4254.

283. Soule, J., Messaoudi, E., and Bramham, C. R. (2006) Biochem. Soc. Trans. 34, 600-604.

284. Spruijt, B. M. (1992) Psychoneuroendocrinology 17, 315-325.

285. Starowicz, K. and Przewlocka, B. (2003) Life Sci. 73, 823-847.

286. Stein, L, Itin, A., Einat, P., Skaliter, R., Grossman, Z., and Keshet, E. (1998) Mol. Cell Biol. 18, 3112-3119.

287. Stone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T., and Keshet, E. (1995) J. Neurosci. 15, 4738-4747.

288. Strand, F. L. (1999) ,4««. N. Y. Acad. Sci. 897, 1-16.

289. Strand, F. L., Lee, S. J., Lee, T. S., Zuccarelli, L. A., Antonawich, F. J., Kurae, J., and Williams, K. A. (1993) Rev. Neurosci. 4, 321-363.

290. Stratton, L. O. and Kastin, A. J. (1975) Pharmacol. Biochem. Behav. 3, 901-904.

291. Svensson, B., Peters, M., Konig, H. G., Poppe, M., Levkau, B., Rothermundt, M., Arolt, V., Kogel, D., and Prehn, J. H. (2002) J. Cereb. Blood Flow Metab 22, 1170-1175.

292. Sweatt, J. D. (2001) J. Neurochem. 76, 1-10.

293. Taniguchi, N., Shinoda, Y., Takei, N., Nawa, H., Ogura, A., and Tominaga-Yoshino, K. (2006) Neurosci. Lett. 406, 38-42.

294. Tao, X., Finkbeiner, S„ Arnold, D. B., Shaywitz, A. J., and Greenberg, M. E. (1998) Neuron 20, 709-726.

295. Teng, F. Y. and Tang, B. L. (2006) J. Neurochem. 96, 1501-1508. 3 ló.Terenius, L. (1975) J. Pharm. Pharmacol. 27, 450-452.

296. Thody, A. J., Ridley, K„ Penny, R. J., Chalmers, R., Fisher, C., and Shuster, S. (1983) Peptides 4, 813-816.

297. Timmusk, T., Palm, K., Metsis, M., Reintam, T., Paalme, V., Saarma, M., and Persson, H. (1993) Neuron 10, 475-489.

298. Tischer, E., Gospodarowicz, D., Mitchell, R., Silva, M., Schilling, J., Lau, K., Crisp, T., Fiddes, J. C., and Abraham, J. A. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198-1206.

299. Trifiletti, R. R. and Pranzatelli, M. R. (1992) Eur. J. Pharmacol 226, 377-379.

300. Trivedi, P., Jiang, M., Tamvakopoulos, C. C., Shen, X., Yu, H., Mock, S., Fenyk-Melody, J., Van der Ploeg, L. H., and Guan, X. M. (2003) Brain Res. 977, 221-230.

301. Van der Ncut, R., Bar, P. R., Sodaar, P., and Gispen, W. H. (1988) Peptides 9, 1015-1020.

302. Van Wimersma Greidanus, T. B., de Rotte, G. A., Thody, A. J., and Eberle, A. N. (1981) Ciba Found. Symp. 81, 277-294.

303. Van, B. N., Thibodeaux, Ii., Palmer, J. T., Lee, W. P., Fu, L., Cairns, B., Turnas, D., Gerlai, R., Williams, S. P., van Lookeren, C. M., and Ferrara, N. (1999) J. Clin. Invest 104, 16131620.

304. Vaquero, J., Zurita, M., de, O. S., and Coca, S. (1999) J. Neurosurg. 90, 220-223.

305. Veldhuis, H. D., De Korte, C. C., and De Kloet, E. R. (1985) Eur. J. Pharmacol. 115, 211217.

306. Vermes, I., Mulder, G. Ii., and Smelik, P. G. (1980) Eur. J. Pharmacol. 63, 89-90.

307. Vesa, J., Kruttgen, A., Cosgaya, J. M., and Shooter, E. M. (2000) J. Neurosci. Res. 62, 225233.

308. Wakamatsu, K., Graham, A., Cook, D., and Thody, A. J. (1997) Pigment Cell Res. 10, 288297.

309. Walton, M., Woodgate, A. M., Muravlev, A., Xu, R., During, M. J., and Dragunow, M. (1999) J. Neurochem. 73, 1836-1842.

310. Wang, Y„ Kilie, E., Kilie, U., Weber, B., Bassetti, C. L., Marti, H. II., and Hermann, D. M. (2005) Brain 128, 52-63.

311. West, A. P. (1990) Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 14, 863-877.

312. Wiek, A., Wick, W., Waltenberger, J., Weller, M., Dichgans, J., and Schulz, J. B. (2002) J. Neurosci. 22, 6401-6407.

313. Widenfalk, J., Lipson, A., Jubran, M., Hofstetter, C., Ebendal, T., Cao, Y., and Olson, L. (2003) Neuroscience 120, 951-960.

314. Wiegant, V. M. and Gispen, W. H. (1977) Behav. Biol. 19, 554-558.

315. Wiemer, G., Gerhards, H. J., Hock, F. J., Usinger, P., Von, R. W., and Geiger, R. (1988) Peptides 9, 1081-1087.

316. Wikberg, J. E. (1999) Eur. J. Pharmacol. 375, 295-310.

317. Wikberg, J. E., Muccnicce, R., Mandrika, I., Prusis, P., Lindblom, J., Post, C., and Skottner, A. (2000) Pharmacol. Res. 42, 393-420.

318. Wu, Q., Li, X. C., Ruan, H. Z., and Li, H. D. (1999) Sheng LiXue. Bao. 51, 60-64.

319. Wu, Y. J., Kruttgen, A., Moller, J. C., Shine, D., Chan, J. R., Shooter, E. M., and Cosgaya, J. M. (2004) J. Neurosci. Res. 75, 825-834.

320. Wurmser, A. E., Palmer, T. D., and Gage, F. H. (2004) Science 304, 1253-1255.

321. Xia, Y. and Wikberg, J. E. (1996) Cell Tissue Res. 286, 63-68.

322. Xia, Y. and Wikberg, J. E. (1997) Neuropharmacology 36, 217-224.

323. Xu, B., Goulding, E. H., Zang, K., Cepoi, D., Cone, R. D., Jones, K. R., Tecott, L. H., and Reichardt, L. F. (2003a) Nat. Neurosci. 6, 736-742.

324. Xu, J. Y., Zheng, P., Shen, D. H., Yang, S. Z., Zhang, L. M„ Huang, Y. L., and Sun, F. Y. (2003b) Neuroscience 118, 59-67.

325. Yamada, IC., Mizuno, M., and Nabeshima, T. (2002) Life Sei. 70, 735-744.

326. Yang, J., Siao, C. J., Nagappan, G., Marinic, T., Jing, D., McGrath, K., Chen, Z. Y., Mark, W., Tessarollo, L., Lee, F. S., Lu, B., and Hempstead, B. L. (2009) Nat. Neurosci. 12, 113115.

327. Yang, S. Z., Zhang, L. M., Huang, Y. L., and Sun, F. Y. (2003) Anat. Ree. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 274, 851-856.

328. Yano, S., Morioka, M., Kuratsu, J., and Fukunaga, K. (2005) J. Pharmacol. Sei 97, 351-354.

329. Zachary, I. (2003) Biochem. Soc. Trans. 31, 1171-1177.

330. Zachary, I. (2005) Neurosignals. 14, 207-221.

331. Zager, E. L. and Black, P. M. (1985) Neurosurgery 17, 355-369.

332. Zhang, H., Vutskits, L., Pepper, M. S., and Kiss, J. Z. (2003) J. Cell Biol. 163, 1375-1384.

333. Zhang, Z. G., Zhang, L., Jiang, Q., Zhang, R., Davies, K., Powers, C., Brüggen, N., and Chopp, M. (2000) J. Clin. Invest 106, 829-838.

334. Zhou, Y., Unterwald, E. M., Ho, A., LaForge, K. S., Yuferov, V. P., Kreuter, J., Sirianni, M. J., Allen, R. G., and Kreek, M. J. (2001) J. Neuroendocrinol. 13, 808-817.

335. Zhu, Y., Jin, K., Mao, X. O., and Greenberg, D. A. (2003) FASEBJ. 17, 186-193.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.