Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои Glycine max: белковая инженерия и структурные исследования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Алексеева, Анастасия Александровна

• Алексеева, Анастасия Александровна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Алексеева, Анастасия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о формиатдегидрогеназе.

2.2. История открытия, локализация и физиологическая роль растительных ФДГ.

2.3. Особенности первичной структуры растительных ФДГ.

2.4. Пространственная структура формиатдегидрогеназ.

2.5. Клонирование генов и экспрессия рекомбинантных ФДГ из растений.

2.6. Основные свойства растительных формиатдегидрогеназ-.

2.6.1. Коферментная и субстратная специфичность.

2.6.2. Температурная стабильность.

2.6.3. Химическая стабильность формиатдегидрогеназ.

2.7. Стабилизация ферментов методами белковой инженерии.

2.7.1. Нупорядоченный мутагенез.

2.7.2. Направленный мутагенез.

2.8. Белковая инженерия формиатдегидрогеназ.47'

2.9. Применение ФДГ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.:.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.2. Рестрикция фрагментов ДНК.

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.

3.2.4. Лигирование.

3.2.5. Трансформация клеток Е.соН.

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.7. Направленный мутагенез гена формиатдегидрогеназы из сои Є.тах.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Экспрессия ЗоуРБН и ее мутантных форм в клетках Е.соИ.

3.2.10. Выделение и очистка БоуРБН.

3.2.11. Белковый электофорез в денатурирующих условиях.

3.2.12. Белковый электрофорез в неденатурирующих условиях.

3.2.13. Определение активности фермента.

3.2.14. Определение констант Михаэлиса.

3.2.15. Определение констант ингибирования.

3.2.16. Титрование активных центров и расчет каталитических констант.

3.2.17. Определение активности фермента при различных температурах.

3.2.18. Определение констант скорости термоинактивации.

3.2.19. Определение активационных параметров процесса термоинактивации фермента.

3.2.20. Изучение термостабильности с помощью ДСК.

3.2.21. Получение кристаллов и определение трехмерной структуры холо-формы БоуРБН.

3.2.22. Моделирование трехмерной структуры апо-фермента.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Экспрессия рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои О.тах.

4.1.1. Особенности культивирования рекомбинантной БоуРБН.

4.2. Выделение и очистка ЭоуРБН.

4.3. Кинетические свойства рекомбинантной ЗоуРЭН.

4.3.1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов.

4.3.2. Влияние рН на константу Михаэлиса.

4.3.3. Температурная зависимость активности БоуРБН.

4.3.4. Ингибирование БоуРОН неорганическими ионами.

4.3.5. Определение концентрации активных центров и каталитической константы рекомбинантной БоуРВН.

4.4. Изучение температурной стабильности БоуРБН.

4.4.1. Стабильность при повышенных температурах.

4.4.2. Влияние pH и ионной силы на термоинактивацию SoyFDH.

4.4.3. Определение активационных параметров процесса термоинактивации с помощью теории активированного комплекса.

4.5. Кристаллизация SoyFDH и определение структуры холо-формы.

4.6. Моделирование структуры апо-формы SoyFDH.

4.7. Белковая инженерия SoyFDH.

4.7.1. Введение дополнительных ионных пар.

4.7.2. Заполнение полостей внутри белковой глобулы.

4.7.3. Модификация электростатических взаимодействий на поверхности белка.

4.7.4. Увеличение жесткости полипептидной цепи.

4.7.5. Замена остатка фенилаланина на поверхности белковой глобулы.

4.7.6. Получение мутантных форм SoyFDH.

4.7.7. Изучение термостабильности мутантных SoyFDH по кинетике инактивации.

4.7.8. Изучение термостабильности мутантных SoyFDH с помощью ДСК.

4.7.9. Кинетические свойства мутантных ферментов.137'

4.7.10. Получение многоточечных мутантов.

4.7.11. Изучение термостабильности многоточечных мутантов SoyFDH.

4.7.12. Кинетические свойства многоточечных мутантных SoyFDH.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои Glycine max: белковая инженерия и структурные исследования»

NAD'-зависимая формиатдегидогеназа (ФДГ), [КФ 1.2.1.2.] относится к суперсемейству дегидрогеназ 2-оксикислот и катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Фермент широко распространен в природе. Гены,, кодирующие ФДГ, найдены в большом количестве бактерий, дрожжей, грибов и растений. Физиологическое значение, этого фермента различается в зависимости от типа организма: В метилотрофах ФДГ участвует в обеспечении энергией. Этот фермент играет ключевую роль в. жизнедеятельности патогенных микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, шдр. В растениях ФДГ является универсальным белком, стресса и ее синтез резко возрастает при таких воздействиях, как, засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температур, действие патогенов и т.п. В отличие от микроорганизмов, в,-клетках растений ФДГ локализована,в митохондриях и.ее количество при;стрессовых воздействиях достигает 9% от всех митохондриальных белков.

На практике ФДГ в основном используется для.регенерации NADH в системах-синтеза, оптически активных соединений; В1 настоящее время- фирмой* «Degussa» с использованием ФДГ в качестве, катализатора регенерации NADH реализован! промышленный процесс получения Ь-?ег/-лейцина, являющийся одним из наиболее крупнотоннажных процессов' хирального синтеза в фармацевтической химии с использованием ферментов. Кроме того, ФДГ активно применяется в биосенсорах на формиат. Последние исследования показали; что в растениях, существует несколько различных генов, кодирующих ФДГ. С помощью анализа изоферментного состава ФДГ можно определять видовую принадлежность и выявлять больные растения, подлежащие вырубке. Растительные ФДГ имеют широкую перспективу для применения: на практике. Это обусловлено тем, что ф ормиатдегидрогеназы растений имеют низкие константы Михаэлиса по субстратам, что очень важно для повышения эффективности процессов синтеза оптически активных соединений.

Хотя формиатдегидрогеназная активность в растениях впервые была показана еще в 1921 г., растительные ФДГ до последнего времени оставались малоизученными ферментами по сравнению с таковыми из бактерий и дрожжей. Это было связано с низким содержанием фермента в клетках растений. В нашей лаборатории несколько лет назад была создана высокоэффективная система экспрессии ФДГ из растений Arabidopsis thaliana в клетках E.coli. Также в 2009 г. была описана успешная экспрессия в E.coli ФДГ из бобов Lotus japonicus, однако уровень экспрессии был намного ниже, чем в случае A. thaliana.

Среди растительных ферментов наиболее подробно изучена формиатдегидрогеназа из A.thaliana (AthFDH), однако из-за невысоких каталитических характеристик AthFDH является скорее модельным, чем практически важным ферментом. В дополнение к AthFDH в нашей лаборатории также были начаты работы по получению и изучению свойств рекомбинантной ФДГ из сои (SoyFDH). Согласно предварительным данным, у этого фермента самые низкие значения^ Км даже среди растительных ФДГ. Кроме того, соя является' одним из. важнейших сельскохозяйственных растений и увеличение активности SoyFDH при том же уровне биосинтеза позволит значительно повысить устойчивость растения к различным неблагоприятным стрессовым воздействиям (засуха, повышенная температура, воздействие патогенных микроорганизмов). Для этого фермента в нашей лаборатории также создана система экспрессии в клетках E.coli, проведены-предварительные эксперименты по изучению его свойств и оказалось, что, термостабильность SoyFDH . гораздо ниже по сравнению с другими формиатдегидрогеназами. Систематических исследований этого фермента до начала данной работы не проводилось. Таким образом, исследование свойств и проведение экспериментов^ по белковой инженерии SoyFDH являются важными фундаментальными и практическими задачами.

Данная работа посвящена решеншо важных и актуальных проблем -получению с помощью методов генетической инженерии рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои, определению ее трехмерной структуры, детальному исследованию свойств фермента дикого типа и белковой инженерии SoyFDH с целью получения мутантных форм фермента с повышенной термостабильностью и каталитической эффективностью.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Алексеева, Анастасия Александровна

V. выводы

1. Получена рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои в активной и растворимой форме. Подобраны оптимальные условия культивирования и очистки. Выход составил 440 мг с литра среды. В результате получен гомогенный препарат SoyFDH.

2. Подобраны условия кристаллизации фермента; полученьг кристаллы тройного комплекса [SoyFDH-NAD+-N3"J и для. него решена трехмерная- структура с разрешением 1,9 А.

3. Изучены каталитические свойства^ рекомбинантной' SoyFDH; Разработана методика титрования активных центров с помощью тушения флуоресценции и рассчитана каталитическая константа. Показано, что SoyFDH имеет, самые низкие значения констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату среди всех ранее изученных формиатдегидрогеназ. Изучена рН зависимость констант Михаэлиса: КМПС0° и KMNAD и показано, что эти величины не меняются в диапазоне рН 5,8-9,8. Изучено ингибирование SoyFDH неорганическими ионами й установлено, что наилучшим конкурентным ингибитором по формиату является' азид-ион. Показано, что по каталитической эффективности SoyFDH- превосходит бактериальные и дрожжевые.ферменты, используемые в настоящее время широко на практике.

4. Изучена кинетика термоинактивации рекомбинантной; ФДГ сои. Установлено, что процесс термоинактивации является необратимым, соответствует кинетике реакций первого порядка; и протекает по мономолекулярному механизму. Изучено влияние ионной силы и рН на константу скорости термоинактивации SoyFDH. Показано,, что термостабйльность фермента возрастает в 10 раз при увеличении ионной силы раствора и рН. В целом, SoyFDH является одной1 из наименее стабильных среди описанных на данный момент формиатдегидрогеназ.

5. Проведены эксперименты по улучшению свойств формиатдегидрогеназы из сои методом рационального дизайна. На основании детального анализа трехмерной структуры SoyFDH, а также выравнивания аминокислотных последовательностей предложено 13 точечных аминокислотных замен:

6. Проведена наработка мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои и изучены их свойства. Термостабильность полученных ферментов изучена как по кинетике термоинактивации, так и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Установлено, что 5 из 13 полученных мутантных форм обладают более высокой термостабильностью по сравнению с ферментом дикого типа. Для лучшего мутантного белка эффект стабилизации составил 100 раз при температуре 52 °С. Изучены каталитические свойства полученных мутантных форм. Установлено, что для трех из пяти полученных более термостабильных мутантных форм происходит увеличение каталитической константы.

7. Получены мутантные формы ФДГ сои, в которых объединили аминокислотные замены, дающие положительный эффект. Исследование кинетики термоинактивации показало, что для лучшей многоточечной мутантной формы SoyFDH эффект стабилизации при температуре 52 °С составляет 856 раз.-Данные дифференциальной сканирующей калориметрии свидетельствуют, что этот мутантный фермент по термостабильности уступает только мутантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.l01.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Алексеева, Анастасия Александровна, 2011 год

1. Родионов Ю.В. Метаболизм формиата у микроорганизмов. Успехи микробиологии, 1981, т.16, с.104-138

2. Ferry J.G. Formate dehydrogenase. FEMS Microbiol.Rev., 1990, v.7, p.377-382

3. Vinals C., Depiereux E., and Feytmans E. Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1993, v.192, p.182-188'

4. Tishkov V.I., Galkin A.G., and Egorov, A. M. Kinetic isotope effect and pre-steady state kinetics of the reaction catalyzed by bacterial formate dehydrogenase. Biochimie, 1989, v.71, p.551-557

5. Tishkov V.I. and Popov V.O. Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2004, v.69, p.1252-1267

6. Tishkov V.I. and Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. BiomolEng, 2006, v.23, p.89-110

7. Hourton-Cabassa C., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small C.C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.l 16, p.627-635

8. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.l 16; p:725-732

9. Thompson P., Bowsher C. G., and. Tobin A. K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099

10. Andreadeli A., Flemetakis E., Axarli I., DimouM., Udvardi M. K., Katinakis P., and Labrou N.E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim.Biophys.Acta, 2009, v. 1794, p.976-984

11. Thunberg T. Sur la presence de certains ferments oxydants dans les grains de phaseolus vulgaris. Arch.int.Physiol., 1921, v.18, p.601-606

12. Davison D.C. Studies on plant formic dehydrogenase. Biochem.J., 1951, v.49, p.520-526

13. Davies D.D. Soluble Enzymes from Pea Mitochondria. J.Exp.Bot., 1956, v.7, p.203-218

14. Mazelis, M. Formate Oxidation by Particulate Preparations from Higher Plants. Plant Physiol, 1960, v.35, p.3 86-391

15. Halliwell, B. Oxidation* of formate by peroxisomes and mitochondria from spinach leaves. BiochemJ., 1974, v.138,' p.77-85

16. Jansch L., Kruft V., Schmitz U.K., and Braun H.P. New insights into the composition,' molecular mass and stoichiometry of the protein complexes of plant mitochondria. Plant J., 1996, v.9, p.3 57-368

17. Oliver, D. J. Formate Oxidation,and Oxygen Reduction by Leaf Mitochondria. Plant Physiol, 1981, v.68, p.703-705

18. Hanson A.D. and Nelsen C.E. Betaine Accumulation and l4C.Formate Metabolism in Water-stressed Barley Leaves. Plant Physiol, 1978, v.62, p.305-312

19. Colas des Francs-Small, Ambard-Bretteville.F., Darpas A., Sallantin M., Huet-J.-C., Pernolett J.-C., and Remy R. Variation of the Polypeptide Composition« of Mitochondria Isolated from Different Potato* Tissues. Plant-Physiol, 1992, v.98, p.273-278.

20. Colas des Francs-Small,. Ambard-Bretteville F., Small I. D., and Remy R. Identification^ of a* major soluble protein ins mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD+- dep en dent formate dehydrogenase. Plant Physiol, 1993, v. 102, p.1171-1177

21. Dubos C. and Plomion C. Identification of water-deficit responsive genes in maritime pine {Pinuspinaster Ait.) roots. Plant MohBiol., 2003, v.51, p.249-262

22. Minami A., Nagao M., Arakawa K., Fujikawa S., and Takezawa W. Abscisic acid-induced freezing tolerance in the moss Physcomitrella patens is accompanied by increased expression of stress-related genes. J Plant Physiol, 2003, v.l60,j p.475-483

23. Yin L., Lan Y., and Zhu L. Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions. Plant Mol.Biol., 2008, v.68, p.597-617

24. Fukusaki E., Ikeda T., Shiraishi T., Nishikawa T., and Kobayashi A. Formate dehydrogenase gene of Arabidopsis thaliana is induced by formaldehyde and not by formic acid. J.BioscLBioeng., 2000, v.90, p.691-693

25. Olson B. J., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J. C., and Markwell J. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: characterization and possible targeting to the chloroplast. Plant Sci., 2000, v.159, p.205-212

26. Herman P.L., Ramberg H., Baack R.D., Markwell J., and Osterman J.C. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: overexpression and subcellular localization in leaves. Plant Sci., 2002, v,163;,p.l 137-1145

27. Igamberdiey A.U., Bykova N.V., and* Kleczkowskii L.A. Origins and metabolism-of formate in higher plants. Plant Physiology and Biochemistry, 1999; v.37, p.503-513

28. Li R., Moore M., and King J. Investigating the regulation of one-carbon metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 2003, v.44, p.233-241

29. Bykova N.V., Egsgaard H., and Miller I.M. Identification of 14 new phosphoproteins involved in important plantmitochondrial processes. FEBS Letters, 2003, v.540, p.141-146

30. Bykova N. V., Stensballe A., Egsgaard H., Jensen O.N., and Moller I.M. Phosphorylation of formate dehydrogenase in potato tuber mitochondria. J.Biol.Chem., 2003- v.278, p.26021-26030

31. Kruger A., Peskan-Berghofer.T., Frettinger P., Herrmann S., Buscot F., and Oelmuller R. Identification of premycorrhiza-related plant genes in the association between Quercus robur and Piloderma croceum. New Phytolist, 2004, v.163, p.149-157

32. Bruggmann, R., Abderhalden, O., Reymond, P., and Dudler, R. Analysis of epidermis- and mesophyll-speeific transcript accumulation in powdery mildew-inoculated wheat leaves. Plant Mol.BioL, 2005, v.58, p.247-267

33. Shiraishi T., Fukusaki E., and Kobayashi A. Formate dehydrogenase in rice plant: growth stimulation effect of formate in rice plant. J.Biosci.Bioeng., 2000, v.89, p.241-246

34. David P., Chen N. W., Pedrosa-Harand A., Thareau V., Sevignac M., Cannon S. B., Debouck D., Langin T., and Geffroy V. A nomadic subtelomeric disease resistance gene cluster in common bean. Plant Physiol, 2009, v. 151, p. 1048-1065

35. Peer Y., and Rokhsar D. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa. (Torr. & Gray) Science, 2006, v.313, p.1596-1604

36. Hwang L., Hocking-Murray D., Bahrami A.K., Andersson M., Rine J., and Sil A. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray. Mol.Biol.Cell, 2003, v. 14, p.2314-2326 >

37. Tishkov V.l., Galkin A.G., and Egorov A.M. NAD+-dependent formate dehydrogenase of methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. 101: cloning, expression, and study of the genetic structure. Dokl.Akad.Nauk SSSR, 1991, v.317, p.745-748

38. Hatrongjit R. and Packdibamrung K. A novel NADP(+)-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization. Enzyme and Microbial Technology, 2010, v.46, p.557-561

39. Weerasinghe P.A., Weerasekera M.L., and Van Holm L.H. Use of isoenzymes to differentiate growth categories of Pericopsis mooniana trees. Biología Plantarum, 1999, v.42, p.547

40. Colic S., Milatovic D., Nikolic D., and Zee G. Isoenzyme polymorphism of almond genotypes selected in the region of northern Serbia. Horticultural Science, 2010, v.37, p.56-61

41. Colich S., Milatovich D., Nikolich D., and Zee G. Dehydrogenase Isoenzyme Polymorphism in Selected Almond Genotypes (Prunus Amygdalus Batsch.). Bulgarian Journal of Agricultural Science, 2009, v. 15, p.552-556

42. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., and Wilson K.S. High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. J.Mol.Biol., 1994, v.236, p.759-785

43. Schirwitz K., Schmidt A., and Lamzin V.S. High-resolution structures of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Protein Sei., 2007, v.16, p.l 146-1156

44. Шабалин И.Г. Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов. Диссертация кандидата химических наук. 2010. Москва, Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

45. Farinelli М.Р., Fry D.W., and Richardson K.E. Isolation, Purification, and Partial Characterization of Formate Dehydrogenase from Soybean Seed. Plant Physiol, 1983, v.73, p.858-859

46. Serov А.Е., Popova A.S., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from* Saccharomyces cerevisiae. Biochem.J., 2002, v.367, p.841-847

47. Seelbach K., Riebel В., Hummel W., Kula M.-R., Tishkov V.I., Egorov A.M:, Wandrey C., and Kragl U. A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase. Tetrahedron Lett., 1996, v.37, p.1377-1380

48. Baack R.D., Markwell J., Herman P.L., and Osterman J.C. Kinetic behavior of the Arabidopsis thaliana leaf formate dehydrogenase is thermally sensitive. J.Plant Physiol, 2003, v. 160, p.445-450

49. Li R., Ziola В., and King J. Purification and characterization of formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol, 2000, v. 157, p. 161-167

50. Oyama T. and Yamazaki I. Purification and some properties of formate dehydrogenase. J.Biochem., 1974, v.75, p.1257-1263

51. Uotila L. and Koivusalo M. Purification of formaldehyde and formate dehydrogenases from pea seeds by affinity chromatography and S-formylglutathione as the intermediate of formaldehyde metabolism. Arch.Biochem.Biophys., 1979, v. 196, p.33-45

52. Peacock D. andBoulter D. Kinetic studies of formate dehydrogenase. Biochem.J., 1970, v.l20,p.763-769

53. Slusarczyk H.,~Felber S., Kula M R., and Pohl M. Stabilization of NAD+-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Ew.J.Biochefn., 2000, v.267, p.1280-1289

54. Karaguler G.N., Sessions B.R., Clarke R.A., and Holbrook J.J. A single mutation in the NAD+-specific formate dehydrogenase from; Candida methylica allows the enzyme to useiNADV. Biotechnology Letters, 2001, v.23, p;283-287

55. Серов Л.Е. Взаимосвязь структуры. и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей; и метилотрофных бактерий. Дисс.канд.хим.наук. 2002, Москва, МГУ

56. Диков М.М., Карулин А., Осипов А.Ш, and Егоров A.M. Изучение методом^ аналитического' изотахофореза: изменений структуры формиатдегидрогеназы при ее инактивации; Биоорган, химия; \919; т.5,.с.1217-1221

57. Egorov A.M., AvilovaT.V., Dikov M.Mi,.Popov V.O., Rodionov Y.V., andlBerezin LV. NAD+-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and-characterization: Eur.JBiochem,,. 1979; v.99; p.569-576

58. Avilova T.V., Egorova,0:A., Ioanesyan;E.S:, and Egorov A.M. Biosynthesis, isolation and properties of NAD+-dependent formate dehydrogenase from the yeast Candida methylica: Eur.J.Biochem., 1985' v. 152, p.657-662

59. Patel R.N;, HouClT., and DerelankoP; Microbials oxidation of methanol: purification and properties of formaldehyde dehydrogenase from a Pichia sp. NRRL-Y-1 1328. Arch.Biochem. Biophys., 1983, v.221, p.135-142

60. Садыхов Э.Г Получение, термостабильность и стркутурные исследованиям формиатдегидрогеназ из различных источников. Диссертация кандидата химических наук . 2007. Москва,,Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

61. Tishkov V.I., Uglanova S.V., Fedorchuk V.V., and Savin S.S. Influence of ion strength and pll on thermal stability of yeast formate dehydrogenase. Acta Naturae, 2010, v.2, p.82-87

62. Resch A., Rosenstein R., Nerz C., and Gotz F. Differential gene expression profiling of Staphylococcus aureus cultivated under biofilm and planktonic conditions. Appl.Environ.Microbiol., 2005, v.71, p.2663-2676

63. Savin S.S. and Tishkov V.I. Inactivation by hydrogen peroxide as a method, for estimation of stress stability of formate dehydrogenase in vivo. Acta Naturae, 2010, v.2, p.78-82

64. Березин И.В., Клячко H.JI., Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В. и Хмельницкий.Л. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология, 1987, Москва; Высшая школа

65. Дебабов В.Г. и Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. Биотехнология, 1988, Москва, Высшая школа

66. Langridge J. Genetic and enzymatic experiments relating to the tertiary structure of beta-galactosidase. Journal of Bacteriology, 1968, v.96, p.1711-1717

67. Minagawa H., Yoshida Y., Kenmochi N., Furuichi M., Shimada J., and Kaneko H. Improving the thermal stability of lactate oxidase by directed evolution. Cell Mol.Life Sci., 2007, v.64, p.77-81

68. Marion В., Ansorge-Schumacher M.B., Slusarczyk H., Schumers J., and1 Hirtz D. Directed evolution of formate dehydrogenase from Candida boidinii for-improved stability during entrapment in polyacrylamide. FEBS J., 2006, v.273, p.3938-3945

69. Goihberg E., Dym O., Tel-Or S., Levin I., Peretz M., and Burstein Y. A single proline substitution is critical for the thermostabilization. of Clostridium beijerinckii alcohol dehydrogenase. Proteins, 2007, v.66, p. 196-204

70. Vogt G., Argos P., and Woell S. Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs. J. Mo I. Biol., 1997, v.269, p.631-643

71. Rose G.D., Zehfus M.H., Geselowitz A.R., Lesser G.J., and-Lee R.H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins. Science, 1985, v.229, p.834-83 8

72. Akanuma S., Qu-C., Yamagishi A., Tanaka N., and Oshima T. Effect of polar side chains at position 172 on thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus. FEBS Lett., 1997, v.410, p.141-144

73. Kotzia G.A. and Labrou N.E. Engineering thermal stability of L-asparagiriase by in vitro directed evolution. FEBS J.,2№9, v.276, p.1750-1761

74. Tanaka S., Igarashi S., Ferri S., and Sode K. Increasing stability of water-soluble PQQ glucose dehydrogenase by increasing hydrophobic interaction at dimeric interface. BMC Biochem, 2005, v.6, p:l

75. Bjork A., Dalhus B., Mantzilas D:, Eijsink V.G., and Sirevag R. Stabilization of a tetrameric rnalate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimer-dimerinterface. J.Môl.Biol.,.2003, v.334,.p.811-821

76. Goihberg E., Dym O., Tel-Or S., ShimomL., Frolow P., Peretz M^, and Burstein.Y. Thermal' stabilization of:the;protozoan» Entamoeba histolytica alcohol dehydrogenase by a single proline substitution. Proteins, 2008, v.72, p.7li-719

77. Gekko K., Kunori Y., Takeuchi? H., Ichihara S:, and;Kodama Ml Point mutations at glycine-121 of Escherichia coli dihydrofolate reductase: important roles of a flexible loop in the: stability andsftnctionï J^zoc/zem. v ^

78. Kusano Mi, Yasukawa ; K., and Inouye K. Effects ; of the; mutational combinations on: the activity and stability "of thermolysin. J.BiotechnoL, 2010;:^v. 147, p:7-16

79. Szilagyi A. and Zavodszky P. Structurait basis for the extreme thermostability of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, from Thermotoga maritima: analysis based on homology modeling. Protein Eng, 1995, v.8, p.779-789

80. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.l. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, p.183-188

81. Serov A.E. and Tishkov V.l. Role of Pro residues in stability of prokaryotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Вестн. Моск. Ун.-та. сер. 2. химия., 2002, v. 43, p. 345-349

82. Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., and Tishkov V.l. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mose.), 2005, v.70, p.804-808

83. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., and Pohl M. Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication; 2003, US2003/0157664

84. Odintseva E.R., Popova A\S., Rojkova A.M:, and Tishkov V.l. Role of cysteine residues in stability of bacterial formate dehydrogenase. Bull.Moscow Univ., 2002, Ser.2 Chem , v.43, p.356-359

85. Felber S. Optimierung der NAD+-abhafingigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii fuEr den Einsatz in der Biokatalyse. Ph.D. Thesis. Pleinrich-Heine University of Duesseldorf. 2001, URL: http://diss.ub.uni-duesseldorf.de/ebib/diss/file?dissid=78.

86. Rozzell J.D., Hua L., Mayhew M., and Novick S. Mutants of enzymes and methods for their use. US Patent Application Publication 2004, US2004/0115691

87. Hummel W. and Kula M. (1989) Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Eur.J.Biochem., v.184, p.1-13120; Zhao H. and van der Donk W.A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr.Opin.Biotechnol., 2003, v.14, p.583-589

88. Hummel, W. and Harald, G. Adh from rhodococcus erythropolis. US patent US2006246561 (Al).

89. Hummel W., Harald: G., Altenbuchner J., Menzel A. Process For Preparing Optically Active Amino Acids Using a Whole-Cell Catalyst. 2009, US patent US20090087885

90. Вommarius A.S., Drauz K., Schwann :M:, Stingl K., Kottenhahn M., and Huthmacher K. Synthesis and use of enantiomerically pure tert-JLeucine. Tetrahedron: Asymmetry, 1995, v.6, p.2851-2888'

91. Ketterer L. and Keusgen M: Ampcromctric sensor for cyanide utilizing cyanidase and formate,dehydrogenase. Anal.Chim.Acta, 2010; v.673j p.54-59125: Schaller K. PI. and Triebig G. Methods in enzymatic analysis. VCH; Weinteim, 1994, v.l, p.30-42 ' ; .

92. Sanger P., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with- chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1977, v.74, p.5463-5467.

93. Popov V.O., Lamzin V.S. NAD(+)-dependent formate dehydrogenase. Biochem: J., 1994, v.301, p.625-643.

94. Закс A.M., Авилова T.B., Егорова OA., Попов B.O., Егоров A.M. Кинетический механизм" действия- NADi-зависимош формиатдегидрогеназы. метилотрофных дрожжей. Candida methylica. Биохимия, 1982, т.47, с.546-55 Г

95. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: «Мир», 1986. С. 135169.

96. Ohyama Т.; Yamazaki I. Formate dehydrogenase. Subunit and mechanism of inhibition by cyanide and azide. J.Biochem., 1975, v.11, p. 845-852

97. Попов В.О., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин И.В. Формиатдегидрогеназа из Bacterium sp.l: число активных центров и константы связывания с коферментами. Докл. Ак.наук СССР, 1978, т.239, с. 1482-1485