Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Хушпульян, Дмитрий Михайлович

  • Хушпульян, Дмитрий Михайлович
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2007, Москва
  • Специальность ВАК РФ02.00.15
  • Количество страниц 127
Хушпульян, Дмитрий Михайлович. Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства: дис. кандидат химических наук: 02.00.15 - Катализ. Москва. 2007. 127 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Хушпульян, Дмитрий Михайлович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений

2 1 1 Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл 7 2 1.2 Структура пероксидаз и механизм расщепления пероксида водорода

2.1.3. Структурные и каталитические особенности нативной пероксидазы табака

2.1.4. Проблема субстратной специфичности пероксидаз 18 2 1.4.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы 19 2.1.4 2 Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена

2.1.5. Роль кальция в структуре и активности пероксидаз

2.1.6. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода 28 2 2. Методы получения рекомбинантных пероксидаз

2.2 1. Экспрессия в растениях

2.2.2. Экспрессия в дрожжах и грибах

2.2.3. Экспрессия в Е coli

2 3. Механизм окисления люминола под действием пероксидаз

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

3.2. Методы исследования 37 3 2.1. Клонирование гена пероксидазы табака

3.2.2. Направленный мутагенез пероксидазы табака

3.2.3. Экспрессия пероксидазы табака в клетках Е coli

3.2.4. Выделение пероксидазы табака

3.2.5. Рефолдинг пероксидазы табака 38 3 2 6 Очистка пероксидазы табака

3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез)

3.2.8. Определение молекулярной массы пероксидаз 40 3 2.9 Спектрофотометрическое определение активности пероксидаз

3.2.10. Расчет констант скорости по данным стационарной кинетики

3.2.11. Совместное окисление фенола и резорцина

3.2.12. Совместное окисление 23НМ и 34НМ

3 2 13. Радиоинактивация пероксидаз 42 3.2.14. Определение концентрации пероксида водорода в ходе радиолиза 43 3.2.14. Реакция окисления люминола

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Рефолдинг рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа

4 1.1. Оптимизация экспрессии и рефолдинга по активности 44 4 1.2 Наработка препаративных количеств фермента дикого типа 47 4 1.3. Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака

4.2. Получение мутанта рекомбинантной пероксидазы табака Glul41Phe

4.2.1. Сравнение выходов при рефолдинге ферментов дикого типа и мутанта

4.2.2. Очистка рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа и мутанта

4.3. Сравнение свойств ферментов дикого типа и мутанта

4.3.1. Субстратная специфичность

4.3.2. Влияние катионов кальция на окисление ABTS и электрохимические свойства

4.3.3. Стабильность водных растворов ферментов в условиях радиолиза

4.3.4. Люминесцентные свойства ферментов

4.4. Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака

4.4.1. Окисление фенола и резорцина

4.4.2. Окисление 23НМ и 34НМ

5. ВЫВОДЫ

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Катализ», 02.00.15 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства»

Усовершенствование старых и разработка новых вариантов ферментативного анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. Поэтому поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей

В нашей лаборатории в 90-е годы был проведен скрининг низших грибов и растений, в результате которого было установлено, что анионная пероксидаза листьев табака (ТОР) значительно более активна в хемилюминесцентной реакции окисления люминола, чем пероксидаза хрена (НИР) [1]. Для получения значительных количеств фермента в 1994-98 проводились совместные работы с проф. Лагримини (Университет Небраски-Линкольна, США), предоставившим трансгенные растения табака и томатов, суперпродуцирующих ТОР [2]. Таким образом, удалось наработать значительные количества фермента и провести изучение его каталитических свойств [3-5].

Фермент действительно является лучшим катализатором окисления люминола и не требует добавления усилителей хемилюминесценции благодаря высокой активности Соединения II [1]. ТОР из трансгенных растений табака в условиях люминесцентного ИФА показала себя на порядок лучше по активности по сравнению с НЯР, что явилось отражением большей стабильности фермента при модификации пероксидом водорода при рН 9,5 [6], [7] Таким образом, для целей люминесцентного ИФА новая пероксидаза представляет несомненный практический интерес.

В дополнение к необычно высокой стабильности Соединения I, что отличает пероксидазу табака от всех остальных пероксидаз растений, фермент показал необычную регуляцию спектральных и каталитических свойств под действием катионов кальция [3]. В присутствии 100 мМ Са2+ фермент способен катализировать окисление вератрового спирта с рН-оптимумом 1,8 [3].

Структурная модель фермента была получена к.ф.-м.н. Упоровым И.В. методом гомологичного моделирования на основании кристаллической структуры пероксидазы хрена и аминокислотной последовательности пероксидазы табака. Модель продемонстрировала основное отличие активных центров пероксидазы табака и пероксидаз арахиса и хрена, состоящее в присутствии на входе в активный центр фермента остатка глутаминовой кислоты-141, которая может отвечать за выявленные необычные свойства фермента [8]. Проверка этого предположения потребовала проведения клонирования гена пероксидазы табака и его экспрессии в Ecoli, разработки процедуры рефолдинга фермента дикого типа с последующей кристаллизацией, получения мутантной формы TOP Glul41Phe и сравнения ее каталитических свойств с ферментом дикого типа.

Ген пероксидазы табака был любезно предоставлен проф. Лагримини, конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантный фермент дикого типа и мутантную форму, было проведено к.х.н. Савицким ПА. и к.х.н. Рожковой A.M.

Задачей настоящей диссертационной работы является:

1) Оптимизация условий экспрессии гена ТОР в клетках Ecoli, рефолдинга фермента из телец включения и очистки рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа с целью ее последующей препаративной наработки и кристаллизации;

2) Оптимизация рефолдинга мутантной формы Glul41Phe пероксидазы табака;

3) Сравнительное изучение субстратной специфичности и стабильности обоих ферментов, в особенности в реакции люминесценции;

4) Изучение стабильности ферментов в условиях радиолиза (имитация инактивации в ходе реакции); л,

5) Изучение влияния ионов Ca на кинетические параметры окисления ABTS;

6) Изучение совместного окисления ABTS и фенолов (фенол, резорцин и т.д) под действием различных форм пероксидазы табака,

Диссертационная работа выполнена в рамках и при финансовой поддержке гранта РФФИ 04-04-48286.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений

Похожие диссертационные работы по специальности «Катализ», 02.00.15 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Катализ», Хушпульян, Дмитрий Михайлович

5. ВЫВОДЫ

1. Разработана методика получения негликозилированных форм пероксидазы табака Наработанные препаративные количества фермента были использованы нашими коллегами в Дании для его кристаллизации и расшифровки кристаллической структуры.

2. Получен мутант GluMJPhe пероксидазы табака и проведена его детальная характеристика в сравнении с ферментом дикого типа Подтверждена роль Glul41 в контролировании входа в активный центр при фолдинге молекулы фермента введение мутации позволило увеличить выход реактивации с 7 до 30%.

3 Впервые продемонстрирована роль водородной связи Glul41-Glnl49 в стабилизации холоформы кислой пероксидазы при хранении и в ходе реакции. Показано, что мутантный фермент менее чувствителен к регуляции активности ионами кальция и не отличается по стабильности от фермента дикого типа в условиях радиоинактивации.

4 Изучено совместное окисление ABTS и фенолов под действием различных форм пероксидазы табака. Показано, что во всех случаях работает механизм неферментативного взаимодействия окисленного ABTS с фенольным субстратом, и рассчитаны соответствующие константы скорости.

5. Детально изучены свойства обеих форм пероксидазы табака в реакции хемилюминесценции. Показано, что рекомбинантная пероксидаза табака не уступает по своей эффективности нативной пероксидазе табака и превосходит на 2 порядка по чувствительности рекомбинантную пероксидазу хрена в реакции усиленной хемилюминесценции

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Хушпульян, Дмитрий Михайлович, 2007 год

1. Gazaryan,I.G. and Lagrimini,L M Purification and unusual kinetic properties of a tobacco anionic peroxidase.//Phytochemistry, 1996,41, 1029-34.

2. Gazanan,I G., Lagrimini,L.M., George,S.J. and Thorneley,R.N. Anionic tobacco peroxidase is active at extremely low pH: veratryl alcohol oxidation with a pH optimum of 1 8 // Biochem. J., 1996, 320, 369-72.

3. Gazanan,I G., Lagrimini,L.M., Mellon,F.A., Naldrett,M J., Ashby,G A. and Thorneley,R.N. // Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in the peroxidase-catalysed oxidation of indol-3-yl acetic acid. // Biochem. J., 1998,333,223-32.

4. Gazaryan,I.G , Lagrimini,L.M, Ashby,G.A. and Thorneley,R.N. Mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anaerobic stopped-flow spectrophotometric studies on horseradish and tobacco peroxidases. // Biochem. J., 1996,313, 841-7.

5. Dzgoev,A.B, Gazaryan,I.G., Lagrimini,L.M, Ramanathan,K. and Danielsson,B. High-sensitivity assay for pesticide using a peroxidase as chemiluminescent label. // Anal. Chem , 1999, 71, 5258-5261.

6. Surugiu,L, Svitel,J., Ye,L., Haupt,K. and Danielsson,B. Development of a flow injection capillary chemiluminescent ELISA using an imprinted polymer instead of the antibody. //Anal. Chem, 2001, 73,4388-4392.

7. Газарян,ИГ, Упоров,И В, Чубарь,ТА, Фечина,В.А, Мареева,Е.А. and ЛагриминиДМ. Влияние рН на стабильность пероксидазы табака и на ее взаимодействие с пероксидом водорода. // Биохимия, 1998, 63, 708-715.

8. Welinder,K G. Plant peroxidases. Their primary, secondary and tertiary structures, and relation to cytochrome с peroxidase. // Eur. J. Biochem, 1985, 151,497-504.

9. Finzel,B.C, Poulos,TL. and Kraut,J. Crystal structure of yeast cytochrome с peroxidase refined at 1 7-A resolution. // J. Biol. Chem, 1984,259, 13027-36.

10. Patterson,WR and Poulos,T.L. Crystal structure of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase. // Biochemistry, 1995, 34,4331-41.

11. Piontek,K, Glumoff,T. and Winterhalter,K. Low pH crystal structure of glycosylated lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.5 A resolution. // FEBS Lett, 1993,315, 119-24.

12. Poulos,T.L, Edwards,SL, Wariishi,H. and Gold,M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. // J. Biol. Chem, 1993,268,4429-40.

13. Sundaramoorthy,M, Kishi,K, Gold,M.H. and Poulos,T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2 06-A resolution. // J. Biol. Chem , 1994, 269, 32759-67.

14. Petersen,J.F, Kadziola,A. and Larsen,S. Three-dimensional structure of a recombinant peroxidase from Coprinus cinereus at 2.6 A resolution. // FEBS Lett., 1994, 339,291-6

15. Schuller,D.J., Ban,N., Huystee,R.B., McPherson,A. and Poulos,TL. The crystal structure of peanut peroxidase. // Structure, 1996,4,311-21.

16. Gajhede,M, Schuller,D.J., Henriksen,A., Smith,A.T and Poulos,TL. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 A resolution. // Nat. Struct Biol, 1997, 4, 1032-8.

17. Henriksen,A., Welinder,K.G. and Gajhede,M. Structure of barley grain peroxidase refined at 1 9-A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. // J. Biol. Chem, 1998, 273,2241-8.

18. Henriksen,A., Mirza,0., Indiani,C., Teilum,K., Smulevich,G, Welinder,K.G. and Gajhede,M Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. //Protein Sci., 2001, 10, 108-15.

19. Mirza,0., Hennksen,A., Ostergaard,L, Welinder,K.G. and Gajhede,M. Arabidopsis thaliana peroxidase N: structure of a novel neutral peroxidase. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 2000, 56, 372-5.

20. Bhattacharyya,D.K., Bandyopadhyay,U. and Banerjee,R.K. Chemical and kinetic evidence for an essential histidine residue in the electron transfer from aromatic donor to horseradish peroxidase compound I. // J. Biol. Chem., 1993, 268, 22292-8.

21. Newmyer,S.L., Sun,J., Loehr,T.M. and Ortiz de Montellano,P.R. Rescue of the horseradish peroxidase His-170~>Ala mutant activity by imidazole: importance of proximal ligand tethering. // Biochemistry, 1996,35,12788-95.

22. Berglund,G.I., Carlsson,G.H., Smith,A.T., Szoke,H., Henriksen,A. and Hajdu,J. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. //Nature, 2002, 417,463.8.

23. Newmyer,S.L. and Ortiz de Montellano,P.R. Horseradish peroxidase His-42--> Ala, His-42 --> Val, and Phe-41 --> Ala mutants. Histidine catalysis and control of substrate access to the heme iron. // J. Biol Chem , 1995, 270, 19430-8

24. Newmyer,S.L. and de Montellano,P.R. Rescue of the catalytic activity of an H42A mutant of horseradish peroxidase by exogenous imidazoles. // J. Biol. Chem., 1996, 271, 14891-6.

25. Savenkova,M I, Newmyer,S.L. and Montellano,P.R. Rescue of His-42 --> Ala horseradish peroxidase by a Phe-41 --> His mutation. Engineering of a surrogate catalytic histidine //J Biol Chem , 1996, 271, 24598-603.

26. Tanaka,M, Ishimori,K., Mukai,M., Kitagawa,T. and Morishima,I. Catalytic activities and structural properties of horseradish peroxidase distal His42 --> Glu or Gin mutant. // Biochemistry, 1997, 36, 9889-98.

27. Tanaka,M., Nagano,S., Ishimori,K. and Morishima,I. Hydrogen bond network in the distal site of peroxidases: spectroscopic properties of Asn70 --> Asp horseradish peroxidase mutant //Biochemistry, 1997, 36, 9791-8.

28. Nagano,S., Tanaka,M., Watanabe,Y. and Morishima,I. Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. // Biochem Biophys. Res. Commun , 1995, 207, 417-23.

29. Nagano,S., Tanaka,M., Ishimori,K, Watanabe,Y. and Morishima,I. Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. // Biochemistry, 1996, 35, 14251-8

30. Rodriguez-Lopez,J N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. Role of arginine 38 in horseradish peroxidase. A critical residue for substrate binding and catalysis. // J. Biol. Chem., 1996,271,4023-30.

31. Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T. and Thorneley,R.N. Effect of distal cavity mutations on the binding and activation of oxygen by ferrous horseradish peroxidase. //

32. J. Biol. Chem, 1997,272, 389-95.

33. Henriksen,A, Smith,A.T. and Gajhede,M. The structures of the horseradish peroxidase C-ferulic acid complex and the ternary complex with cyanide suggest how peroxidases oxidize small phenolic substrates. // J. Biol. Chem , 1999, 274, 35005-11.

34. Farhangrazi,Z.S, Copeland,B.R, Nakayama,T, Amachi,T, Yamazaki,I. and Powers,L S Oxidation-reduction properties of Compound I and II of Arthromyces ramosus peroxidase // Biochemistry, 1994,33, 5647-5652.

35. Мареева,ЕА. Выделение и свойства пероксидазы табака из трансгенных растений. // Дисс.к х.н., 2002, МГУ, 110 с.

36. Tanaka,M., Ishimori,K. and Morishima,I. Structural roles of the highly conserved glu residue in the heme distal site of peroxidases. // Biochemistry, 1998, 37, 2629-38.

37. Doyle,W.A., Blodig,W., Veitch,N.C., Piontek,K. and Smith,A.T. Two substrate interaction sites in lignin peroxidase revealed by site-directed mutagenesis. // Biochemistry, 1998, 37, 15097-105.

38. Timofeevski,S.L , Nie,G., Reading,N.S. and Aust,S D. Addition of veratryl alcohol oxidase activity to manganese peroxidase by site-directed mutagenesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 256, 500-4.

39. Blodig,W., Doyle,W.A., Smith,A.T., Winterhalter,K., Choinowski,T. and Piontek,K. Autocatalytic formation of a hydroxy group at С beta of trpl71 in lignin peroxidase. // Biochemistry, 1998, 37, 8832-8.

40. Khindaria,A , Yamazaki,I. and Aust,S.D. Stabilization of the veratryl alcohol cation radical by lignin peroxidase. // Biochemistry, 1996, 35, 6418-24.

41. Sundaramoorthy,M, Kishi,K, Gold,M.H. and Poulos,T.L. Crystal structures of substrate binding site mutants of manganese peroxidase. // J. Biol. Chem., 1997, 272,17574-80.

42. Kishi,K, Kusters-van Someren,M., Mayfield,M.B., Sun,J., Loehr,T.M. and Gold,MH Characterization of manganese(II) binding site mutants of manganese peroxidase //Biochemistry, 1996, 35, 8986-94.

43. Kishi,K, Hildebrand,D.P., Kusters-van Someren,M., Gettemy,J., Mauk,A.G. and Gold,MH Site-directed mutations at phenylalanine-190 of manganese peroxidase: effects on stability, function, and coordination. // Biochemistry, 1997, 36,4268-77.

44. Kusters-van Someren,M., Kishi,K., Lundell,T. and Gold,M.H. The manganese binding site of manganese peroxidase: characterization of an Aspl79Asn site-directed mutant protein //Biochemistry, 1995,34, 10620-7.

45. Harris,R Z , Newmyer,S L and Ortiz de Montellano,P.R Horseradish peroxidase-catalyzed two-electron oxidations. Oxidation of iodide, thioanisoles, and phenols at distinct sites // J. Biol Chem , 1993, 268,1637-45.

46. Meunier,B, Rodriguez-Lopez,J.N., Smith,A.T., Thorneley,R.N. and Rich,P.R. Redox- and anion-linked protonation sites in horseradish peroxidase: analysis of distal haempocket mutants //Biochem J., 1998, 330, 303-9.

47. Gilfoyle,D J., Rodriguez-Lopez,J.N. and Smith,A.T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substratephenylhydrazine. //Eur J. Biochem., 1996, 236, 714-22.

48. Henriksen,A., Schuller,D.J., Meno,K., Welinder,K.G., Smith,A.T. and Gajhede,M. Structural interactions between horseradish peroxidase C and the substrate benzhydroxamic acid determined by X-ray crystallography. // Biochemistry, 1998, 37, 8054-60.

49. Henriksen,A, Schuller,D.J, Meno,K., Welinder,K.G., Smith,A.T. and Gajhede,M. Structural interactions between horseradish peroxidase C and the substrate benzhydroxamic acid determined by X-ray crystallography. // Biochemistry, 1998, 37, 8054-8060.

50. Gazaryan,I.G., Klyachko,N.L., Dulkis,Y.K, Ouporov,I.V. and Levashov,A.V. Formation and properties of dimeric recombinant horseradish peroxidase in a system of reversed micelles. // Biochem. J., 1997, 328, 643-7.

51. Gazaryan,I G., Doseeva,V.V., Galkin,A.G. and Tishkov,V.I. Effect of single-point mutations Phe41->His and Phel43-->Glu on folding and catalytic properties of recombinant horseradish peroxidase expressed in E. coll. // FEBS Lett, 1994, 354, 24850

52. Rodriguez-Lopez,J.N., Gilabert,M.A., Tudela,J., Thorneley,R.N. and Garcia-Canovas,F. Reactivity of horseradish peroxidase compound II toward substrates: kinetic evidence for a two-step mechanism. // Biochemistry, 2000, 39, 13201-9.

53. Dunford,HB. and Adeniran,A.J. Hammett rho sigma correlation for reactions of horseradish peroxidase compound II with phenols. // Arch. Biochem. Biophys., 1986, 251,536-42.

54. Van Haandel,M.J., Claassens,M.M., Van der Hout,N., Boersma,M.G, Vervoort,J. and Rietjens,I.M. Differential substrate behaviour of phenol and aniline derivatives during conversion by horseradish peroxidase // Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1435,22.9.

55. Folkes,L.K. and Candeias,L.P. Interpretation of the reactivity of peroxidase compounds I and II with phenols by the Marcus equation. // FEBS Lett., 1997,412,305.8.

56. Haschke,R.H. and FriedhoffJ.M. Calcium-related properties of horseradish peroxidase //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, 80, 1039-42

57. Ogawa,S., Shiro,Y. and Morishima,I. Calcium binding by horseradish peroxidase С and the heme environmental structure. // Biochem. Biophys. Res Commun., 1979, 90, 674-8.

58. Shiro,Y., Kurono,M. and Morishima,I. Presence of endogenous calcium ion and its functional and structural regulation in horseradish peroxidase // J. Biol. Chem., 1986, 261,9382-90.

59. Howes,B.D., Feis,A., Raimondi,L., Indiani,C. and Smulevich,G. The critical role of the proximal calcium ion in the structural properties of horseradish peroxidase. // J. Biol. Chem., 2001,276, 40704-11.

60. Wright,P.J. and English,A.M. Buffer-anion-dependent Ca2+ leaching from horseradish peroxidase at low pH. // J. Biol. Inorg. Chem., 2001, 6, 348-58.

61. Van Huystee,RB., Xu,Y. and 0'Donnel,J.P. Variation in Soret band absorption of peroxidase due to calcium // Plant Physiology & Biochemistry, 1992, 30, 293-297.

62. Nie,G., Reading,N.S. and Aust,S.D. Relative stability of recombinant versus native peroxidases from Phanerochaete chrysosporium. // Arch. Biochem. Biophys., 1999, 365, 328-34.

63. Timofeevski,S.L. and Aust,S.D. Kinetics of calcium release from manganese peroxidase during thermal inactivation. // Arch. Biochem. Biophys., 1997, 342, 169-75.

64. Reading,N.S. and Aust,S.D. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability. // Biotechnol. Prog., 2000, 16, 326-33.

65. Arnao,M.B., Acosta,M., del Rio,LA., Varon,R. and Garcia-Canovas,F. A kinetic study on the suicide inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041,43-47.

66. Arnao,M.B., Acosta,M., del Rio,J.A. and arcia-Canovas,F. Inactivation of peroxidase by hudrogen peroxide and its protection by a reductant agent. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1038, 85-89.

67. Газарян,И.Г., Гортон,Л., Рузгас,Т, Чореги,Э., Шуман,В., Лагримини,Л.М, Хушпульян,Д.М. and Тишков,В.И. Пероксидаза табака новый реагент для амперометрических биосенсоров. // Журнал Аналитической Химии, 2005, 60,629.638.

68. Cherry,J.R., Lamsa,M.H., Schneider,Р, Vind,J., Svendsen,A., Jones,A. and Pedersen,A.H. Directed evolution of a fungal peroxidase. // Nat Biotechnol., 1999, 17,379.84.

69. Teilum,K, Ostergaard,L. and Welinder,K.G, Disulfide Bond Formation and Folding of Plant Peroxidases Expressed as Inclusion Body Protein in E coli Thioredoxin Reductase Negative Strains. // Protein Expression and Purification, 1999, 15, 77-82.

70. Zhanglin,L, Thorsen,T and Arnold,F.H. Functional Expression of Horseradish Peroxidase in E. coli by Directed Evolution. // Biotechnol. Prog., 1999, 15,467-471.

71. Березин,И В, Угарова,Н.Н. and Кершенгольц,Б.М. Определение константы равновесия для нативной пероксидазы хрена и ее апо-фермента. // Биохимия, 1974, 214,701-704.

72. Kalb,V.F. and Bernlohr,R.W. A new spectrophotometric assy for protein in cell extracts // Analyt. Biochem., 1977, 82, 362-371.

73. Bradford,M M A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Analyt Biochem, 1976, 72,248.254

74. Childs,R E and Bardsley,W.G. A steady-state kinetics of peroxidase with 2,2'-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline-6-sullfonic acid) as choromogen. // Biochem. J., 1975,145,93.103.

75. Hosoya,T. Turnip peroxidase. II The reaction mechanisms of turnip peroxidase Al, A2 and D. // J. Biochem., 1960, 47, 794-803.

76. Gallati,H. Enzyme-immunological tests: determination of the activity of peroxidase with the aid of the Trinder reagent. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1997,15, 699-703.

77. Hasinoff,F. and Dunford,H.B. Kinetics of the oxidation of ferrocyanide by horseradish peroxidase Compounds I and II. // Biochemistry, 1970, 9, 4930-4939.

78. Bhattacharyya,D.K., Bandyopadhyay,U. and Banerjee,R.K. Chemical and kinetic evidence for an essential histidine in horseradish peroxidase for iodide oxidation. //

79. J. Biol. Chem, 1992, 267, 9800-9804.

80. Лебедева,O.B, Угарова,H H. and Березин,И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена //Биохимия, 1977,42,1372-1379.

81. Gallati,H. and Brodbeck,H. Horseradish peroxidase: kinetic studies and optimization of the activity determination with the substrates H202 and o-phenylenediamine. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem, 1982, 20,221-225.

82. Renganathan,V., Miki,K. and Gold,M.H. Multiple molecular forms of diarylpropane oxygenase, an H202-requiring, lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium. //Arch. Biochem. Biophys., 1985, 241, 304-314.

83. Gazaryan,I G., Ouporov,I.V., Chubar,T.A., Fechina,V.A., Mareeva,E.A. and Lagrimini,L.M. Effect of pH on tobacco anionic peroxidase stability and its interaction with hydrogen peroxide. // Biochemistry (Mosc), 1998, 63,600-6

84. Капелюх,Ю.Л. Кинетика и механизм инактивации пероксидазы в хемилюминесцентной реакции окисления люминола в присутствии производных фенолов // Дисс.к х.н., 1998, МГУ.

85. Kim,B.B., Pisarev,V.V. and Egorov,A.M. A comparative study of peroxidases from horse radish and Arthromyces ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assays.//Anal. Biochem., 1991, 199, 1-6.

86. Alpeeva,I.S. and Sakharov,I.Y. Soybean peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide. // J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 5784-5788.

87. Gazarian,I.G., Loginov,D.B, Lialulin,A.L. and Shekhovtsova,T.N. Determination of phenols using various peroxidases. // Analytical Letters, 1994,27,2917.

88. Kodun,R.S. and Tien,M. Kinetic Analysis of Lignin Peroxidase: Explanation for the Mediation Phenomena by Veratryl Alcohol. // Biochemistry, 1994, 33, 4225-4230.

89. Koduri,RS. and Tien,M. Oxidation of Guaiacol by Lignin Peroxidase: Role of Veratryl Alcohol. // J. Biol. Chem, 1995,270, 22254-22258.

90. Goodwin,D.C, Aust,S.D. and Grover,T.A. Evidence for veratryl alcohol as a redox mediator in lignin peroxidase-catalyzed oxidation. // Biochemistry, 1995,34, 5060-5065

91. Sheng,D. and Gold,M.H. Oxidative polymerization of ribonuclease A by lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. //Eur. J. Biochem., 1999,626-634.

92. Khindaria,A., Yamazaki,I. and Aust,S.D. Veratryl alcohol oxidation by lignin peroxidase. //Biochemistry, 1995, 34, 16860-16869.

93. Khindaria,A., Nie,G. and Aust,S.D. Detection and characterization of the lignin peroxidase compound II-veratryl alcohol cation radical complex. // Biochemistry, 1997, 36, 14181-5.

94. Candeias,L.P. and Harvey,P. J. Lifetime and reactivity of the veratryl alchol radical cation. //J. Biol. Chem., 1995, 270, 16745-16748.

95. Bourbonnais,R., Leech,D. and Paice,M.G. Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin. //Biochim Biophys. Acta, 1998, 1379,381.390.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.