Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Бейрахова, Ксения Андреевна

• Бейрахова, Ксения Андреевна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Бейрахова, Ксения Андреевна

Оглавление

Введение

Глава 1. Препараты на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза как альтернатива анти-УЕвР-направленной терапии неоваскулярных глазных

заболеваний

1.1 Основные этапы развития ангиогенеза

1.2. AHTH-VEGF-направленная терапия

1.2.1. VEGF как терапевтическая мишень

1.2.2. Офтальмологические препараты, блокирующие действие VEGF

1.2.3. Ограничения и побочные эффекты при терапии блокаторами VEGF

1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза и их терапевтический потенциал в офтальмологии

1.3.1. Тромбоспондин

1.3.2. Фактор дифференцировки пигментного эпителия (Pigment epithelium-derived factor, PEDF)

1.3.3. Фрагменты коллагена IV — аррестен, канстатин, тумстатин

1.3.4. Фрагмент коллагена XVIII — эндостатин

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

2.2. Ферменты

2.3. Штаммы и клеточные линии

2.4. Плазмидные вектора

2.5. Лабораторное оборудование

2.6. Растворы

2.7. Методы

Глава 3. Получение и свойства рекомбинантных полипептидных

препаратов на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза

3.1 Получение рекомбинантного фрагмента тумстатина (L69K-95)

2

3.2. Получение рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77)

3.3. Получение рекомбинантного фрагмента эндостатина (1-49)

3.4. Оценка биологической активности рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vitro

3.5. Биологическая активность рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vivo

3.5.1. Оценка антиангиогенной активности пептидов на модели неоваскуляризации роговицы кролика

3.5.2. Оценка аваскулогенной активности пептидов на модели щелочного ожога роговицы

Выводы

Список литературы

Перечень сокращений

ВМД — возрастная макулярная дегенерация

ГБ — гибридный белок

ДМСО — диметилсульфоксид

ДР — диабетическая ретинопатия

ДТТ — дитиотреитол

ИК5о — ингибирующая концентрация

ИПТГ — изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

ОФ ВЭЖХ — обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография

ПААГ — полиакриламидный гель

ПЭГ — полиэтиленгликоль

ТПС — трубочко-подобные структуры

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭК — эндотелиальные клетки

CBD — хитинсвязывающий домен

СОХ-2 — циклооксигеназа-2

ED5o — эффективная доза

ESI — ионизация распылением в электрическом поле

bFGF — основной фактор роста фибробластов

HIF — фактор, индуцируемый гипоксией

ММР — матриксная металлопротеиназа

NC1 — неколлагеновый домен

PDGF — тромбоцитарный фактор роста

PEDF — фактор дифференцировки пигментного эпителия

PMSF — фенилметилсульфонилфторид

SDS — додецилсульфат натрия

TFA — трифторуксусная кислота

TOF — времяпролётный масс-спектрометрический детектор

TSP-1 — тромбоспондин-1

VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом»

Введение

Неоваскуляризация является основной причиной снижения зрительных функций при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР), ретинопатии недоношенных, хронической хориоидальной неоваскуляризации при близорукости и др. Распространенность этих заболеваний неуклонно прогрессирует. По данным ВОЗ за 2008 г только количество заболевших ВМД превысило 8 млн. человек. Антиангиогенная терапия этих заболеваний признана перспективным методом лечения. Современная стратегия антиангиогенной терапии в офтальмологии основана на применении препарата (Луцентис), ингибирующего действие сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), ключевого фактора неоангиогенеза. Узкая направленность ингибиторов VEGF и наличие обходных путей ангиогенеза с участием других проангиогенных молекул объясняют их неполноценный и непродолжительный клинический эффект. В этом аспекте представляет научный и практический интерес исследование природных биологически активных белков и их фрагментов, обладающих ангиостатическими свойствами, избирательно проявляющимися на разных этапах ангиогенеза, слабой иммуногенностью и токсичностью с целью создания на их основе инновационных лекарственных препаратов офтальмологического назначения.

Цель настоящего исследования: получение рекомбинантных аналогов функциональных фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза, изучение их способности блокировать различные этапы ангиогенеза и исследование биологической активности полученных полипептидов ш vivo на моделях заболеваний глаз, сопровождающихся патологическим ангиогенезом.

Для создания рекомбинантных полипептидов были выбраны биологически активные фрагменты трёх эндогенных ингибиторов

ангиогенеза: фактора дифференцировки пигментного эпителия (PEDF), тумстатина и эндостатина.

Основными задачами работы являлись:

1. Создание эффективных штаммов-продуцентов гибридных белков, содержащих фрагменты PEDF (44-77), тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49);

2. Разработка эффективных схем выделения и очистки полипептидов, представляющих собой рекомбинантные аналоги фрагментов PEDF (44-77), тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49);

3. Изучение биологических свойств полученных полипептидов на моделях различных этапов развития неоангиогенеза in vitro;

4. Исследование in vivo биологической активности пептидов на экспериментальных моделях неоваскуляризации роговицы.

В результате выполнения работы были разработаны новые эффективные способы получения рекомбинантных аналогов фрагментов эндогенных ингибиторов ангиогенеза (PEDF (44-77) тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49)). Впервые исследована антиангиогенная активность фрагмента эндостатина (1-49) на моделях неоангиогенеза in vitro. Впервые исследована биологическая активность фрагментов тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49) на экспериментальной модели патологической неоваскуляризации роговицы.

Предложен метод выделения целевых полипептидов, позволяющий исключить стадию ферментативного расщепления гибридного белка за счет использования мини-интеина в качестве белка-носителя, и таким образом снизить себестоимость получения полипептидов. Дана количественная оценка антиангиогенной активности рекомбинантных аналогов PEDF (44-77), тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49). Экспериментально подобраны предполагаемые терапевтические дозы рекомбинантных полипептидов PEDF (44-77), эндостатина (1-49) и тумстатина (L69K-95).

Таким образом, полученные рекомбинантные аналоги фрагментов PEDF (44-77), тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49) обладают антиангиогенной активностью на различных этапах неоангиогенеза: подавляют пролиферацию эндотелиальных клеток и образование трубочко-подобных структур in vitro и препятствуют развитию патологической неоваскуляризации in vivo.

Глава 1. Препараты на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза как альтернатива антиЛ/ЕСР-направленной терапии неоваскулярных глазных заболеваний

Неоваскуляризация — основная причина потери зрения при таких глазных заболеваниях, как диабетическая ретинопатия (ДР), возрастная дегенерация сетчатки (ВМД), ретинопатия недоношенных и др. Механизм развития глазной неоваскуляризации не до конца изучен, и, как следствие, не существует специфической и эффективной терапии соответствующих заболеваний. Гомеостаз в глазу здорового человека поддерживается балансом про- и антиангиогенных молекул [1, 2, 3]. Этот баланс нарушается под воздействием неблагоприятных факторов (ишемия, гипоксия, воспаление), что приводит к развитию патологического ангиогенеза [4, 5, 6]. Современные терапевтические стратегии направлены на подавление действия основного проангиогенного фактора - эндотелиального фактора роста сосудов (УЕОР). Между тем, в природе существует несколько обходных путей для неоангиогенеза, например, с помощью ЬБОР или ангиогенина. Это объясняет неполноценность и непродолжительность действия УЕОР-зависимых препаратов. В связи с этим активно развиваются альтернативные подходы к терапии неоангиогенеза, в том числе основанные на восполнении дефицита в глазу эндогенных антиангиогенных факторов [7].

1.1 Основные этапы развития ангиогенеза

Неоангиогенез — сложный многоступенчатый процесс, на каждом этапе которого задействованы различные регуляторные молекулы. К факторам, способствующим росту сосудов относятся ростовые факторы (кислый и основной факторы роста фибробластов (аРОР и ЬРОР) [8], УЕОР [9], тромбоцитарный фактор роста (РБОР) [10]), белки клеточной адгезии, белки матрикса, матриксные металлопротеиназы (ММР). К ангиостатикам принадлежат фактор дифференцировки пигментного эпителия (РЕБР) [11],

тромбоспондин-1 [12], протеолитические фрагменты внеклеточного матрикса [13] и др.

Неоангиогенез характеризуется тремя основными этапами [14] (Рисунок 1): пролиферация эндотелиальных клеток, миграция ЭК, дифференцировка и стабилизация сосудов.

Пролиферация

Стрессовые воздействия (ишемия, гипоксия) вызывают в клетках повреждённых тканей выброс проангиогенных факторов (УЕОБ, ЬЕвЕ, 1Ь-8, ангиопоэтин-2). Они взаимодействуют с узнающими рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток близлежащих сосудов и запускают пролиферацию этих клеток. Перициты отделяются от стенки сосуда (под воздействием ангиопоэтина-2), УЕвР вызывает повышенную проницаемость слоя эндотелиальных клеток, в результате чего белки плазмы крови выходят в межклеточное пространство.

Миграция

Пролиферирующие эндотелиальные клетки секретируют коллагеназы, растворяющие базальную мембрану сосуда, и начинают мигрировать под действием сигналов интегринов (аУ|33 и аУ(35). Матриксные металлопротеиназы способствуют росту сосуда, моделируя внеклеточный матрикс с высвобождением проангиогенных факторов (РОБ, УЕОБ).

Рисунок 1. Этапы формирования сосуда при неоангиогенезе [14]. Дифференцировка и стабилизация сосудов.

Для образования функционального сосуда необходимо его созревание и стабилизация. РЭвЕ, ангиопоэтин-1, эфрин-В2 промотируют

присоединение перицитов к новообразованному сосуду. Тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs) и ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) способствуют образованию базальной мембраны. Межклеточные контакты восстанавливаются с участием VE-кадгерина.

Многие из описанных факторов экспрессируются в тканях только во время неоваскуляризации, и таргетное воздействие на эти молекулы может оказаться перспективным для подавления неоангиогенеза.

1.2. AHmu-VEGF-напраеленная терапия 1.2.1. VEGF как терапевтическая мишень

VEGF — гликопротеин размером 46 кДа (гомодимер), впервые выделенный из васкуляризированных опухолей в 1983 г [15]. Известно по крайней мере 6 изоформ VEGF, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК [16]. VEGF]65 - наиболее распространённая изоформа, которая стимулирует несколько этапов неоваскуляризации (включая пролиферацию, миграцию и образование капилляроподобных структур) и таким образом играет важную роль как при физиологическом, так и при патологическом ангиогенезе [17, 18]. VEGF известен также как фактор проницаемости сосудов (vascular permeability factor, VPF) [15, 18].

VEGF взаимодействует с двумя мембранными рецепторами, обладающими тирозин-киназной активностью, - VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase-1, Fit-1) и VEGFR-2 (kinase insert domain-containing receptor, или Flk-1/KDR). Эти рецепторы экспрессированы преимущественно на поверхности эндотелиальных клеток и в меньшей степени - на моноцитах и макрофагах [19, 20]. Связывание VEGF с VEGFR-2 запускает сигнальный каскад, стимулирующий ангиогенез.

В сетчатке глаза VEGF секретируется клетками пигментного эпителия, эндотелиальными клетками, перицитами, Мюллеровскими клетками, нейронами, астроцитами [21, 22, 23], что свидетельствует о важной

физиологической роли этого фактора. При гипоксии секреция УЕСР усиливается [21]* повышенные уровни этого фактора в глазу ассоциированы с неоваскуляризацией при ДР и ВМД [24, 25]. На животных моделях пролиферативной ретинопатии было продемонстрировано, что терапевтическое ингибирование УЕвР приводит к значительному снижению неоваскуляризации и проницаемости сосудов [26, 27, 28] .

1.2.2. Офтальмологические препараты, блокирующие действие

Существует несколько терапевтических стратегий для подавления проангиогенного действия УЕСР: нейтрализация самого УЕСЩ> блокада рецептора \ZEGFR-2, ингибирование тирозинкиназного каскада, деградация мРНК УЕОР с помощью малых интерферирующих РНК [29, 30] (Рисунок 2). Рассмотрим наиболее перспективные препараты, уже использующиеся в клинической практике или находящиеся на стадии клинических испытаний.

Рисунок 2. Блокаторы сигнального пути УЕОР в терапии диабетической ретинопатии. миРНК - малые интерферирующие РНК, ЭК - эндотелиальные клетки, Н1Р - фактор, индуцируемый гипоксией.

\7EGF

чатка

Bevacizumab (Avastin, Genentech) — рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, селективно связывающее все изоформы VEGF-A. Bcvacizumab ингибирует взаимодействие VEGF с его рецепторами и таким образом блокирует ангиогенез и снижает проницаемость сосудов. Этот препарат разрабатывался для подавления опухолевого ангиогенеза и был одобрен для лечения метастатического колоректального рака [31]. С 2005 года Bevacizumab используется в офтальмологической практике без зарегистрированных показаний. Многочисленные, но разрозненные, клинические исследования свидетельствуют об эффективности Bcvacizumab для лечения пролиферативных заболеваний глаз, в том числе влажной формы возрастной макулярной дегенерации [32, 33, 34, 35], макулярного отека при окклюзии ретинальных вен [36, 37, 38] и других.

Bevacizumab получают путём экспрессии рекомбинантных генов в клетках яичников китайских хомячков (СНО). Антитело имеет молекулярный вес около 149 кДа, состоит из двух идентичных лёгких цепей (214 а.о.) и двух тяжёлых цепей (453 а.о.), содержит один сайт гликозилирования в Fe фрагменте (Asp303) [39]. Bevacizumab был создан на основе мышиного моноклонального антитела к VEGF muMab A4.6.1 [40, 41]. Шесть гипервариабельных CDR участка A4.6.1 были перенесены в Fab каркас иммуноглобулина человека (вариабельный домен тяжёлой цепи VH III и вариабельный домен лёгкой цепи VL к I [42]), в результате чего аффинность к VEGF упала в 1000 раз [40]. Для того чтобы повысить связывание гуманизированного антитела к VEGF, семь каркасных остатков из человеческой VH цепи и один из VL цепи были заменены на мышиные. Полученный фрагмент Fab-12 после объединения с константными доменами

человеческого IgGI образует полноразмерное гуманизированное антитело rhuMab-VEGF (Bevacizumab), в котором мышиный компонент составляет 7%, и которое связывает все изоформы VEGF так же эффективно (константа диссоциации (Kd) 1,1 нмоль/л), как исходное антитело muMab A4.6.1 (Kd 0,8 нмоль/л) [40, 41]. Кристаллографический анализ комплекса антиген-связывающего фрагмента Fab-12 с VEGF (разрешение 2,4 Ä) показал, что антитело стерически блокирует сайт связывания VEGF с рецепторами [43].

Ranibizumab (Lucentis®; Genentech Inc.) — рекомбинатный Fab фрагмент гуманизированного моноклонального антитела (молекулярный вес 48 кДа), связывающий все изоформы VEGF-A. В 2006 г Ranibizumab был одобрен FDA для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии (ВМД). Препарат разрабатывался для локального введения (интравитреальные инъекции). Благодаря относительно небольшому (по сравнению с полноразмерным антителом) размеру он быстро и полностью проникает в сетчатку [44].

При разработке Ranibizumab за основу был взят фрагмент Bevacizumab Fab-12. Для достижения максимального ингибирования VEGF указанным моновалентным фрагментом последовательность Fab-12 была оптимизирована путём аффинной селекции мутантов с использованием фагового дисплея [45]. Отобранный мутант Fab Y0317 (Ranibizumab) обладал в 20 раз более высокой аффинностью к VEGF и отличался от Fab-12 шестью аминокислотами: четыре мутации в вариабельной части тяжёлой цепи (H109>Y, SI 12>Т, T29>D, N36>H), одна мутация в цепи VL (M4>L) и одна -в шарнирной области (T10>L). Ranibizumab не гликозилирован и успешно синтезируется в бактериальных клетках Е. coli.

VEGF Trap-Eye (Regeneron)—■ рекомбинантный химерный белок (ПОкДа, синтезируется клетками СНО), объединяющий в себе последовательности VEGF-связывающих доменов растворимых рецепторов VEGF-R1 и VEGF-R2, а также Fc фрагмент lgG. VEGF Trap-Eye значительно снижает неоваскуляризацию у пациентов с ВМД [46] и в настоящий момент проходит III фазу клинических испытаний, где его эффективность в терапии ВМД сравнивается с таковой препарата Lucentis.

Растворимые рецепторы VEGF — эндогенные физиологические

блокаторы VEGF, обеспечивающие, в частности, отсутствие роста сосудов в

роговице здорового человека. В нескольких работах была

продемонстрирована антиангиогенная активность внеклеточного домена

VEGF-R1 [47, 48, 49, 50], но малое время жизни этого полипептида в

организме не позволяет использовать его в качестве лекарственного

препарата. Улучшить фармакокинетические свойства VEGF-R1 можно,

соединив лиганд-связывающий домен рецептора (первые три Ig-подобные

домена) с Fc доменом IgG [51, 52]. Однако полученный химерный белок

обладал высоким положительным зарядом и неспецифически связывался с

отрицательно заряженными гликопротеинами внеклеточного магрикса.

Структурные исследования показали, что наибольшим сродством к VEGF

обладает второй иммуноглобулин-подобный домен VEGF-R1 и третий Ig-

подобный домен VEGF-R2 [53]. Соединив эти 2 домена друг с другом и с Fc

фрагментом IgG, получили химерный белок VEGF-TrapRl R2 (VEGF Trap-

Eye) (pi 8,82), который не связывался с внеклеточным матриксом и обладал

хорошими фармакокинетическими свойствами [54] (Рисунок 3). VEGF Trap-

Eye ингибирует все факторы семейства VEGF: VEGF-A, -В, -С, -D, P1GF-1 и -

2 с очень высокой эффективностью (в 140 раз выше, чем у Ranibizumab),

14

ОО

/л

V£GFR2 1 2 3 4 И 5 б Í 7

(Fik-1)

VEGF

TraPRlR2 4 - —< fe i

Рисунок 3. Создание рекомбинантного химерного белка VEGF-Trap Eye, ингибитора факторов семейства VEGF. Схематическое изображение VEGFR1 (красный) и VEGFR2 (голубой) с обозначением семи IgG доменов, трансмембранных, участков (чёрные вертикальные полосы) и киначных доменов (овалы) [54],

Пегаптаниб (Pegaptanib) (Macugen; Eyetech/Pfizer) — ПЭГилированный модифицированный олигорибонуклеотид, селективно связывающий изоформу VECE-A]^ [55].Пегаптаниб был одобрен FDA в 2004 г для лечения влажной формы ВМД, и стал первым препаратом для терапии глазной неоваскуляризации.

Для создания Пегаптаниба осуществляли отбор аптамеров, специфически связывающих VEGF165;, методом SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment- систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении) [56]. Так как немодифицированные оли гону клеотиды очень быстро претерпетвают деградацию ta vivo под действием нуклеаз, при создании библиотеки аптамеров были использованы 2'-F замещённые пир имид ин о вы е нуклеотиды [57, 58]. В результате селекпии были отобраны 3 аптамера с максимальной аффинностью к VEGF16s, в которые затем были внесены дополнительные модификации: 2' — ОН группы пуриновых нуклеотидов были метилированы, а 3' — конец кэпирован З'-З' связанным дезокситимидином. К аптамеру, продемонстрировавшему после внесённых модификаций наибольшую стабильность и активность, был добавлен полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 40 кДа. ПЭГилирование снизило аффинность аптамера к VEGF в 4 раза, но улучшило ингибирование VEGF на 83%, вероятно, за счёт снижения

почечного клиренса препарата [59]. Полученный таким образом 28-членный ПЭГштированный аптамер (Пегаптаниб) и его взаимодействие с УЕОЕ]65 показаны на Рисунок 4.

А А А Б

Рисунок 4, Структура Пегаптаниба и его связывание с мишенью, А Последовательность и предсказанная вторичная структура Пегаптаниба. 2-0-метилированные пурины показаны красным. 2'-фтор-модифицированные пиримидины показаны синим. Б Взаимодействие между гепарин-связывающим доменом УЕйРш (показан серым) и Пегаптанпбом (показан го.тубым) (структура определена ЯМР [60], 61). Стрелками показано взаимодействие уридина-14 аптамера и цистеипа 137 УЕОГ^ [62].

1.2.3. Ограничения и побочные эффекты при терапии блокаторами \ZEGF

Основным фактором, ограничивающим применение блокаторов ¥ЕОР, является способ доставки их к месту неоваскуляризации (препарат вводится с помощью инъекции в полость стекловидного тела). Для поддержания терапевтического эффекта необходимы многократные внутриглазные инъекции этих препаратов. Интравитреальные инъекции сопряжены с повышенным риском развития таких тяжёлых осложнений как эндофтальмит, кровоизлияния в сетчатку и отслоение сетчатки [63].

При неоваскулярных заболеваниях нередко наблюдается нарушение гематоофтальмического барьера [64, 65], и блокаторы УЕОР из внутриглазной жидкости могут попадать в системный кровоток. УЕвЕ выполняет важные физиологические функции: участвует в процессах

репарации, проявляет нейропротекторные свойства [66]. Системное ингибирование этого фактора, в особенности у пациентов с диабетом, повышает риск развития тромбоэмболии и сердечно-сосудистых заболеваний [67, 68].

1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза и их терапевтический потенциал в офтальмологии.

Гипотеза о существовании природных ингибиторов ангиогенеза и их существенной роли в регуляции ангиогенеза была предложена Фолкманом в 1971 г [69]. В 1977 были получен доказательства существования таких ингибиторов в стекловидном теле [70]. Первый эндогенный ингибитор ангиогенеза, ангиостатин, был выделен в 1994 г [71]; в последующие годы было обнаружено более 30 природных антиангиогенных молекул [72].

Эндогенные ингибиторы ангиогенеза присутствуют в норме в жидкостях и тканях организма, и поэтому, в отличие от блокаторов УЕвИ, обладают минимальными побочными эффектами. Особенность природных антиангиогенных молекул - это наличие, как правило, нескольких активных доменов, взаимодействующих с различными рецепторами. Таким образом обеспечивается подавление ангиогенеза через различные механизмы и сигнальные пути.

Понимание механизмов действия природных ангиостатиков необходимо для создания новых эффективных терапевтических препаратов для подавления неоангиогенеза.

1.3.1. Тромбоспондин

Тромбоспондин-1 (Т5Р-1) — мультимерный гликопротеин,

обладающий как прямым антианги о генным действием на эндотелиальные клетки через соответствующие рецепторы (С036, С047, интегрины и протеогликаны), так и опосредованным - за счёт связывания проангиогенных факторов во внеклеточном матриксе. Такое комплексное биологическое

действие этой молекулы объясняется её сложной мульти доменной структурой.

Структура тром по с по i ¡дин о в

Семейство тромбоспондинов образовано пятью гликопротеинами: гомотримеры TSP-1 и TSP-2 принадлежат к группе А, пентамерные белки TSP-3, -4, -5 - к группе В [73]. Мономер TSP-1 содержит N-концевой глобулярный домен, за которым следует домен олигомеризации, проколлагеновый домен, три пропердин-подобных домена (повторы I типа), два EGF-подобных домена (повторы II типа), кальций-связывающие домены (повторы III типа) и С-концевой лектин-подобный глобулярный домен (Рисунок 5).

а.0.1-277 а.о. 278-355 (а,о, 385-522) (а.о. 559-669) (а.о. 784-932) а.о. 926-1152

I ^ ___

2 |_а 2 w 2 1 з з з з з з з

N-концевой Проколлагеновый Повторы Повторы Повторы Са2'-связывающий домен

домен домен типа 1 (TSR) типа 2 тапаЗ

Рисунок 5. Схематическое изображение структуры TSP-1.

Повторы I типа являются доменами, преимущественно отвечающими за антиаигиогенные свойства TSP-1 [74]. Повторы III типа содержат сайт узнавания интегринов (RGD) [75], две последовательности, связывающие катепсин G и эластазу [76], а также сайты связывания коллагена V и FGF2 [77], Однако эти активные участки молекулы становятся стерически доступными только в восстанавливающих условиях или при низкой концентрации ионов кальция.

Рецепторы тромбоспондинов

Наиболее изученным рецептором TSP является CD36: ЭК, не экспресс ирующие CD36, а также мыши, нокаутные по соответствующему гену, невосприимчивы к антиангиогенному действию TSP1 [78, 79].

Белок плазмы HRGP (histidine-rich glycoprotein), связывается с TSP1 по тому же сайту, что и CD36, и таким образом препятствует взаимодействию тромбоспондина с рецептором [80]. HRGP может ослаблять активность TSP1 при патологических состояниях, когда происходит просачивание плазмы крови в окружающие ткани.

TSP1 также образует комплексы с bFGF и VEGF, нейтрализуя проангиогенное действие этих факторов [81, 82]. Кроме того, TSP-1 связывает некоторые лротеиназы, включая ММР-2, плазмин, нейтрофильную эластазу и катепсин G. Тромбоспондин способствует эндоцитозу ММР-2 [83] и подавляет ММР-3 опосредованную активацию проММР-9 [84].

Однако наряду с антиангиогенными свойствами тромбоспондин может проявлять и проангиогенную активность: N-концевой проангиогенный домен TSP-1 способствует высвобождению ММР-2 и ММР-9 и снижает экспрессию ингибитора металлопротеиназ TIMP-2 эндотеяиальными клетками [85]. В отличие от растворимого тромбоспондина иммобилизованный TSP1 стимулирует пролиферацию ЭК за счёт связывания N-концевого фрагмента 190-201 с интегрином а3|31 [86]. Другой проангиогенный сайт (а.о. 17-31) взаимодействует с кальретикулином на поверхности клеток и может способствовать миграции ЭК за счёт нарушения фокальных контактов [87].

Сигнальные пути, активизируемые TSP-I

Образование комплекса TSP1/CD36 вызывает гибель эндотелия микрососудов. Связывание TSP1 с CD36 способствует фосфорилированню р38 и JNK киназ (Jun N-ierminal kinases (JNKs)) Src киназой p59fyn [88]. Активация p38 усиливает транскрипцию проапоптотической молекулы CD95(Fas)L, которая, связывая рецептор CD95(Fas), активирует каспазы, фрагментацию ДНК и апоптоз [89].

Таким образом, многообразие биологических эффектов TSP1 связано с способностью этого мультидоменного гликопротеина одновременно связывать несколько молекул, присутствующих в жидкостях организма, внеклеточном матриксе и на поверхности ЭК. Тромбоспондин может быть

представлен как центр сложного взаимодействия между ироангиогенными факторами, компонентами экстрацеллюлярного матрикса, их рецепторами и иротеиназами. Т8Р1 определяет их доступность, взаимное связывание и активность и таким образом регулирует поведение ЭК при аигиогенезе (Рисунок 6).

Рисунок 6. Взаимодействия TSP-1 с различными участника процесса неоваскуляризации. АФР — анги о генные ростовые факторы, ЭЦМ - экетрацеллюлярный матрикс [90].

Биологически активные фрагменты TSP-) и ах синтетические аналоги В исследованиях по обнаружению и характеризации активных доменов TSP-1 были использованы различные подходы : применение антител к различным фрагментам полипептида, контролируемый протеолиз исходной молекулы (например, тромбином [91]) или синтез отдельных участков молекулы. Скрининг синтетических пептидов позволил обнаружить

антианги о генную активность в проколлагеновом домене (пептид GVITR.TR) и в повторах I типа (пептид СЭУТСС) [92, 93]. Была продемонстрирована способность пептида СЗУТСО из повтора типа 1 (а.о. 429-434) связывать С036, основной рецептор ТШМ. Однако исследование кристаллической структуры повтора типа 1 показало, что положительно заряженный фрагмент ОУТТК^ (а.о, 436-442) экспонирован на поверхности домена и скорее всего является истинным участником взаимодействия с рецептором, а менее стерически доступный С8УТСС играет дополнительную роль [94] (Рисунок 7). Ещё один фрагмент повтора типа 1 с антиангиогенными свойствами -консервативный участок \VxxWxxW (а.о. 420-426), блокирующий неоваскуляризацию, индуцированную ЬЕСР [95].

Рисунок 7. Распределение электростатического потенциала на поверхности второго повтора типа 1 (TSR2) тромбоспондипа-1. Заряженные аминокислотные остатки подписаны [96].

Синтетические стереоспецифические аналоги фрагмента TSP-1

KRFKQDGGWSHWSPWSSC позволили определить структурные основы

механизма действия пептида. Кроме того, эти пептидомиметики обладают

более высокой стабильностью in vivo и могут быть использованы как

эффективные ингибиторы bFGF - стимулированного ангиогенеза [97]. Были

получены и другие модифицированные аналоги активных фрагментов TSP-1:

CVX-22 - химерная молекула, полученная ковалентным присоединением

21

двух синтетических аналогов пептидов TSP-1 к гуманизированному IgGK CVX-22 индуцирует апоптоз активированных ЭК, экспрессирующих VEGFR-2 при опухолевом ангиогенезе [98].

АВТ-510 - это модифицированный аналог пептида GVITRIR (TSP-1, а.о. 436-442). Первый изолейцин последовательности GVITRIR был заменён на D-Ile, что позволило значительно усилить антиангиогенную активность пептида [99]. Полученный пептидомиметик кэпировали по N-концу саркозином, а по С-концу пролинэтиламидом. Первый остаток аргинина заменили на норвалин для улучшения фармакокинетических свойств пептида. Синтезированная таким образом молекула АВТ-526 ингибировала миграцию микроваскулярных ЭК с ИК50 0,07 нМ и обладала временем полужизни в организме мыши 2 ч [100]. Замена D-Ile на D-allo-Ile позволила в 3 раза увеличить растворимость пептидомиметика, а также значительно улучшить его фармакокинетические характеристики. В результате был получен АВТ-510, оптимизированный аналог антиангиогенного фрагмента TSP-1 (Рисунок 8). В многочисленных предклинических испытаниях in vitro и in vivo, в том числе на модели неоваскуляризации роговицы крысы, АВТ-510 продемонстрировал способность эффективно подавлять неоангиогенез [101].

1.3.2. Фактор дифференцировки пигментного эпителия (Pigment epithelium-derived factor, PEDF)

PEDF — секретируемый гликопротеин размером 50 кДа, относящийся к классу серпинов [102]. PEDF был впервые идентифицирован в культуре клеток пигментного эпителия эмбриональной сетчатки человека как нейротрофный фактор [103]. PEDF оказывает нейропротекторное действие на нейроны головного и спинного мозга, а также на фоторецепторы сетчатки при воздействии различных повреждающих факторов, таких как ишемия, аксотомия. окислительный стресс и др. [104, 105, 106, 107]. Пейротрофная и антиапоптотическая активность PEDF опосредована фактором NFkB (nuclear

factor kappa-B), ключевым внутриклеточным медиатором, способствующим выживанию и пролиферации клеток [108].

CK

W СИ, Н,г он ( СИ

Г-- V irNrW? Vi ° > ■ >

^ > Nif

H N --<- ,, П.гч си нг он ( ot

ФрагментTijP-l ' - * j J Г g Д , jV fl J-

I й 1П I > ь J ( Г!

>

li 3« "ТН'-и

Ы, О Ö „" 0 Mi н о <1\

iu v )» f« я

5 (AST-E26J " (-H И,С ja

1y А

У

HA tu, нг. он V ™

0 .. и Y о V о у о

S

4? ^

'nhh

%

' 41 и

Я»' ^ !Ш «н

КС j0H \ <V|

} 1 чуСН

т ■у ТУ- тхучз

си, о о ( о <1 —■J

си. и .с s ¡дв 1-5Ю) ми

л

ил

МП

Рисунок 8. Разработка антиангиогенпого препарата АВТ-5Ю. Показаны структуры АВТ-5Ю, исходного фрагмента TSP-1 (436-442) и промежуточных биологически активных пептидомиметиков [100].

Помимо нейропрогекторной функции PEDF также выполняет роль сильнейшего эндогенного ингибитора ангиогенеза [109]. В моделях in vitro PEDF дозозависимо ингибирует миграцию эндотелиальных клеток с эффективной дозой EDso 0,4 нМ, и таким образом является более активным ангиоингибитором, чем эндостатин (ЕОц = 3 нМ) и тромбоспондин-1 (ED5o = 0,5 нМ). PEDF блокирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, активированных различными проангиогеиными факторами, такими как PDGF, VEGF, IL-8, aFGF [109].

Механизмы антиангиогенпого действия PEDF

В тканях и жидкостях глаза PEDF является основной ангиоингибирующей молекулой, уравновешивающей проангиогенное

действие VEGF [110, 111]. Нарушение этого баланса наблюдается при различных неоваскулярных заболеваниях органов зрения. У пациентов с диабетической ретинопатией, ВМД, окклюзией ретинальных вен снижение уровня PEDF в стекловидном теле сопровождается повышением концентрации VEGF [110, 111, 112, 113, 114]. Так в образцах внутриглазной жидкости пациентов с диабетом уровень VEGF был повышен до 492 пиког/мл (в норме - 292 пиког/мл), в то время как концентрация PEDF наоборот упала и составила 1740 нг/мл при норме в 3680 нг/мл [1 15, 116]. Несмотря на существование обратной зависимости концентраций этих двух факторов, было выявлено, что PEDF не влияет на транскрипцию VEGF, и наоборот [1 17]. На уровне белковых взаимодействий существует несколько механизмов, с помощью которых PEDF блокирует действие VEGF.

PEDF ингибирует патологический ангиогенез, подавляя фосфорили-рование рецептора VEGFR-1, а также активируя у-секретазу, которая расщепляет VEGFR-1 и VEGFR-2 [118, 119]. Также показано, что апоптоз эндотелиальных клеток, вызываемый PEDF, промотируется р38 MAP киназ-зависимым расщеплением каспаз 3, 8 и 9 [120]. Кроме того, PEDF ингибирует активацию фактора NFAT (nuclear factor of activated T ceils), необходимого для VEGF-индуцированного трубочкообразования и неоваскуляризации [121].

Был обнаружен рецептор PEDF, который опосредует антиангиогенное действие этого гликопротеина [122]. 37/67 кДа ламининовый рецептор (LR) служит также рецептором для различных вирусов [123, 124] и прионов [125] и участвует в некоторых физиологических и патологических процессах, таких как дифференцировка, рост и миграция клеток, а также опухолевое метастазирование [126].

Терапевтическое использование PEDF

В настоящий момент PEDF проходит вторую фазу клинических испытаний в качестве препарата против ВМД. Первая фаза клинических

24

испытаний на 28 пациентах показала, что разовая интравитреальная инъекция гена PBDF в составе адено-ассоциированного вируса (AdPEDF) не оказывает токсических и серьёзных побочных эффектов. Кроме того, имеются данные, указывающие на улучшение зрительных функций пациентов, получивших более высокие дозы препарата [127].

Биологически активные фрагменты PEDF

Совмещение в одной молекуле PEDF двух таких различных функций как нейропротекторная и антиангиогенная могло свидетельствовать о наличии по крайней мере двух отдельных функциональных эпитопов на поверхности молекулы, взаимодействующих с двумя различными рецепторами. Синтетический пептид, представляющий собой фрагмент PEDF Va!78-Thrl21 обладает нейротрофной активностью, способствует нейрональной дифференцировке клеток ретинобластомы [128], защищает моторные нейроны спинного мозга от хронической глутаматной токсичности [129] и предотвращает повреждение сетчатки при ишемии [130]. Другой синтетический пептид, PEDF (Asp44-Asn77) не обладает нейропротекторными свойствами, но проявляет антиангиогенную активность, характерную для полноразмерного PEDF: ингибирует миграцию и пролиферацию ЭК, индуцирует их апоптоз, подавляет патологическую неоваскуляризацию роговицы и сосудистой оболочки глаза [131, 132]. С помощью дрожжевой дигибридиой системы оценки белок-белковых взаимодействий (Y2H) было продемонстрировано, что именно участок PEDF (Asp44-Asn77) специфически взаимодействует с ламининовым рецептором. Этот фрагмент имеет преимущественно а-спиральную структуру, его локализация в составе структуры полноразмерного PEDF показана на Рисунок 9.

л

Рисунок 9. Трёхмерная структура PEDF. Красным цветом выделен участок взаимодействия PEDF с ламшшновым рецептором (а.о. 46-70) (анализ in silico с использованием программы Visual molecular dynamics) [122].

Недавно было показано, что помимо антиангиогенной активности фрагмент PEDF(44-77) при системном введении обладает способностью подавлять васкулогенез (т. е. новообразование сосудов из предшественников зндотелиальных клеток (EPCs - endothelial progenitor cells), попадающих в кровоток из костного мозга). На модели диабетической ретинопатии крыс было продемонстрировано, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции синтетического пептида PEDF(44-77) на 65% снижали концентрацию предшественников зндотелиальных клеток в крови, не влияя на их количество в костном мозге. Действие пептида было VEGF-независимым и позволило снизить патологическую неоваскуляризацию на 50% [133].

Был разработан способ получения рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77) в бактериальных клетках E.coli в составе гибридного белка с глутатион-Б-трансферазой. Гибридный белок был получен в растворимой форме и очищен с помощью аффинной хроматографии. После расщепления гибридного белка тромбином целевой фрагмент PEDF (44-77) очищали с

помощью ультрафильтрации. Выход пептида составил 10 мг с 1 л культуральной среды [134].

1.3.3. Фрагменты коллагена IV — аррестен, канстатин, тумстатин

Коллаген IV типа — один из наиболее распространённых компонентов базальных мембран, образующий каркасную структуру в внеклеточном матриксе. В семейство коллагена IV входит шесть полипептидов (цепи alii), каждый из которых состоит из цистеин-богатого N-концевого 7S домена, центрального коллагеного домена (1400 а.о.) и С-концевого неколлагенового домена (NC1, 230 а.о.) (Рисунок 10). Цепи коллагена IV образуют три типа гетеротримеров: alala2, присутствующий в базальных мембранах всех тканей, а также менее распространённые a3a4a5 и a5a5a6 [135, 136].

Сигнапьный ^пептид

тзшшшйшшш

N-концевой 7S центральный коппагекоэый домен С-концедазй МС1

домен (13 а о ) (1398 а о ) домен (231 а о )

Рисунок 10. Структура цепи аЗ коллагена IV типа [137].

NC1 -домены al, a2 и аЗ-цепей коллагена IV, названные, соответственно, аррестен, канстатин и тумстатин, обладают антиангиоген-ными свойствами [138] (Таблица 1). In vitro эти молекулы ингибируют пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. На моделях in vivo было показано, что они блокируют прорастание сосудов в имплантат Матригеля и ингибируют опухолевый рост у мышей с перевитыми опухолями. В то же время гомологичные домены цепей а4 и а5 не обладают антиангиогенной активностью.

Таблица 1. Ингибиторы ангиогенеза, высвобождающиеся при

протеолизе коллагена IV, и механизмы их действия

Аррестен al(IV)NCI Канстагин a2(IV)NCl Тумстатин «3(IV)NCI

Происхождение al цепь коллагена IV типа a2 цепь коллагена IV типа аЗ цепь коллагена IV типа

Ферменты, высвобождающие активный ингибитор ММР-2, ММР-9 ММР-2, ММР-9 ММР-2, ММР-9

Рецепторы Инте грины aipi Интегрины aVß5/ aVß3 Интегрины aVß3/ a3ßl

Пролиферация ЭК ингибирует ингибирует ингибирует

Миграция ЭК ингибирует ингибирует не оказывает действия

Образование ТПС ингибирует ингибирует ингибирует

Механизм действия FAK, Ras, c-Raf, МЕК1/2, р38, ERK1/2, HIFla-опосредованные сигнальные пути FAK, Akt, P13K/mTOR/eIF-4E/4E-BP1 сигнальный каскад и FasL- опосредованный апоггтоз FAK, Akt, PI3 K/mTOR/el F- 4Е/4Е-ВР1 и NFkB/COX-2 сигнальные каскады

Исследование кристаллической структуры NC1 доменов коллагена IV

показало, что они образованы двумя гомологичными N- и С-субдоменами, которые состоят преимущественно из [3-слоёв [139] (Рисунок 11). Наименее консервативные участки, определяющие различия между субдоменами, заключены между остатками Рго86 - Рго95 (N-субдомен) и Ilel96 - Thr 209 (С-субдомен).

Из трёх NC1 доменов коллагена IV типа, обладающих антиангиогенными свойствами, тумстатин является наиболее изученным и перспективным в качестве лекарственного препарата.

Тумстатин (28 кДа)—NC1 домен цепи аЗ коллагена IV типа, встречающейся в гломерулярных и альвеолярных базальиых мембранах, а также в БМ передней капсулы хрусталика, внутреннего уха и некоторых других органов [140]. Тумстатин высвобождается из базальной мембраны в результате гидролиза коллагена IV под воздействием металл о протеиназы

ММР-9. Физиологическая концентрация тумстатина в крови составляет около 300 нг/мл. Исследования на мышах с инактивированным геном цепи аЗСо1ГУ показали, что отстуствие тумстатина в крови не влияет на эмбриональное развитие, физиологический ангиогенез и репаративные процессы, однако приводит к ускоренному росту опухолей в результате усиленной патологической неоваскуляризации [141].

Рисунок 11. Совмещенное изображение структур гомологичных субдоменов цепи «1 коллагена IV типа. Красным цветом показан К-копцевой субдомен, зелёным — С-копцевой субдомен [139].

Механизмы антиангиогенного и противоопухолевого действия тумстатина

Тумстатин ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, стимулированных ЬРОИ и УЕвР [142, 143], задерживая их деление на стадии в]. Тумстатин индуцирует апоптоз пролиферирующих ЭК, активируя каспазу-З [144].

Было показано, что а нтиангио генная активность тумстатина локализована в фрагменте шт5 (а.о. 54-132) [143]. Этот фрагмент, взаимодействуя с интегрином аУрЗ активирует РАК-РВ-РКВ/АкМпТСЖ сигнальный каскад и предотвращает диссоциацию фактора инициации

трансляции 4Е от 4Е-связывающего белка, в результате чего происходит подавление Сар-зависимой трансляции в эндотелиальных клетках [145]. В составе фрагмента tum5 был найден более короткий биологически активный участок, состоящий из 25 а.о. (74-98) [144].

Сравнение гомологичных последовательностей тумстатина и NC1 домена цепп а5 CoHV, не обладающего антиангиогенными свойствами [146], позволило выявить аминокислоты, ответственные за антиангиогенную активность тумстатина: Leu78, Val82 и Asp84 (Рисунок 12).

Рисунок 12. Определение аминокислотных остатков, отвечающих за антиангиогениые свойства тумстатина. Трёхмерные модели тумстатина (А) и биологически неактивного мутантного тумстатина (В). Цветом выделены поверхностные заряды (синий - положительный заряд, красный - отрицательный заряд). Антиангиогенный фрагмент тумстатина (74-98) выделен жёлтой рамкой. Стрелками показаны остатки, подвергнутые мутагенезу [146].

Существует второй биологически активный фрагмент тумстатина (а.о.

185-203), отвечающий за противораковую активность этого полипептида []47]. Этот фрагмент способен связываться с интегрином a3ßl и ингибировать циклооксигеназу СОХ-2 в эндотелиальных клетках, действуя через сигнальный путь FAK/Akt/NFicB [148]. Подавление активности СОХ-2 приводит к снижению опухолевого ангиогенеза и замедлению роста опухоли [149] (Рисунок 13).

Ещё одной мишенью тумстатина может быть металлопротеиназа ММР-2: в организме мышей с инактивиро ванным геном a3ColIV наблюдалось повышение уровня активности ММР-2 [150]. Однако на данный момент прямое взаимодействие тумстатина с каталитическим доменом металлопротеиназ не доказано.

a3<IV)MC1

a3<IV)NC1

Рисунок 13. Схематическое изображение различных сигнальных каскадов, запускаемых тумстатином в эи д отели ал ьных клетках [137].

Исследование терапевтического потенциала тумстатина в офтал ъмологии

Недавно была исследована антиангиогенная активность рекомбинантного тумстатина, полученного в бакуловирусной экспрессионной системе, на модели неоваскуляризации роговицы мыши. Рекомбинантный препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг. Был выявлен значимый антиангиогенный эффект тумстатина и отмечено снижение экспрессии \TiGF у экспериментальных животных [151].

1.3.4. Фрагмент коллагена XVIII — эндостатин

Эндостатин (20 кДа)-—С-концевой фрагмент коллагена, ингибирующий миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток [152, 153, 154, 155]. Эндостатин обладает широким спектром аитиапгиогенной активности: он регулирует экспрессию более чем 12% генов в эндотелиальных клетках [156], и в то же время эндостатин обладает очень низкой токсичностью. Клинические испытания не выявили токсичности и резистентности к эндостатину при ежедневном введении этого препарата на протяжении 3,5 лет.

Были получены кристаллические структуры человеческого и мышиного эндостатииов [157, 158] (Рисунок 14А). Эндостатин обладает структурным сходством с углевод-узнающим доменом лектинов С-типа, а также с Е-селектином. Две дисульфидные связи (Cys33-Cysl73 и Cysl35-Cys165) вносят вклад в стабильность и биологическую активность эндостатина, причём связь Cys33-Cysl73 стабилизирует преимущественно вторичную, a Cysl 35-Cysl 65 - третичную структуру полипептида.

N-концевой участок эндостатина (остатки HI, PI3, Н11 и D76) связывает один ион цинка [157] (Рисунок 14В). Такое связывание стабилизирует структуру рекомбинан гного человеческого эндостатина при физиологических значениях рН [159]. Добавление дополнительного нинк-связывающего пептида (zinc-binding peptide, ZBP) к N-концевой части полипептида приводит к связыванию ещё одного иона цинка, что способствует ещё большей стабилизации эндостатина [160].

Методом поверхностного плазмонного резонанса показано, что цинк необходим для связывания эндостатина с гепарином и гепаран сульфатом [161]. Нуклеолин, рецептор эндостатина на поверхности эндотелиальных клеток, взаимодействует с гепарин-связывающим сайтом эндостатина [162]. ZBP-эндостатин обладает значительно более высокой аффинностью к нуклеолину, чем эндостатин дикого типа, что объясняет его более выраженные антиангиогенные и противоопухолевые свойства [160]. ZBP-

эндостатин (торговое название ЕрдозШг) был одобрен в Китае для лечения немелкокле !очного рака лёгких.

Рисунок 14. Структура лндостатина человека. А — общая структура. Голубым цветом обозначены остатки 1-6. Атом цинка обозначен чёрной точкой. В — К-концевая петля и цинк-связывающий сайт эндостатина [157].

Механизм действия эндостатина.

Эндостатин обладает очень широким спектром активности, и механизм его действия нельзя свести к нескольким определённым сигнальным путям. Для целого ряда белков (тропомиозин, глипикапы, ламинин, интегрин, матриксная металлопротеиназа ММР-2 и др.) была продемонстрирована способность связывать эндостатин и опосредовать его антиангиогенное действие [163, 164, 165, 166, 167]. Нуклеолин, мультифункциональный белок, первоначально найденный в ядрышке [168], был недавно идентифицирован в качестве рецептора эндостатина [162]. Нуклеолин существенно влияет на пролиферацию клеток, организацию ядрышкового хроматина, упаковку пре-РНК, транскрипцию рДНК и сборку рибосом [168, 169, 170]. В проангиогенных условиях нуклеолин начинает экспрессироваться на поверхности клеток эндотелия, что является маркером новообразованных сосудов [171, 172]. Блокирование нуклеолин а на поверхности эндотелиальных клеток приводит к потере антиэндотелиальной активности эндостатина [162].

N

А

Б

Биологически активные фрагменты эндостатина.

Первый рекомбинантный препарат эндостатина, синтезированный в лаборатории Дж. Фолкмана, был получен в денатурированной форме и вводился мышам в виде суспензии. Несмотря на отсутствие правильно фолдированной структуры белок обладал значительной антиангиогенной активностью. Этот факт привёл исследователей к предположению о том, что антиангиогенные свойства могут проявлять отдельные участки молекулы эндостатина. Были синтезированы пептиды, соответствующие разным фрагментам эндостатина, и исследована их биологическая активность. N-концевой домен эндостатина, состоящий из 27 а. о., обладал противоопухолевой активностью, подавлял миграцию эндотелиальных клеток и снижал проницаемость сосудов аналогично полноразмерному эндостатину [173]. Этот пептид содержит 3 остатка His, необходимые для связывания иона цинка. Замена этих остатков на Ala приводит к потере противоопухолевой активности пептида (Рисунок 15).

В работах [ 174, 175] была продемонстрирована способность фрагментов эндостатина 6-49 и 134—178 ингибировать пролиферацию и миграцию ЭК с большей эффективностью, чем полноразмерный эндосгатин. Указанные фрагменты проявляли антиангиогенные свойства в концентрациях 1-10 нМ. N-концевой фрагмент 6-49 обладал активностью несмотря на отсутствие пяти первых аминокислот, отвечающих за связывание ионов цинка. Таким образом, механизм действия этого пептида отличается от механизма действия фрагмента 1-27, для активности которого необходимо наличие остатков His 1 и His3.

тР1: НТНа01*аРУШ1.УАШТР1-ЗССМ1МЗга тР1-Н1/ЗА: АТА00РаРУ1-Н1-УА1-МТР1.5ССМ[*ст

ШР1

тР1-Н1/ЗА

Рисунок 15, Схематическое изображение фрагмента 1-27 мышиного эндостатина (тР1), Замена остатков Н 1 и Шз§. на остатки аланина приводит к неспособности связывания пептида с ионом цинка [173].

В работах [176] и [177] был выявлен ещё один фрагмент эндостатина, обладающий аитиаигиогенными свойствами, - богатый аргинином мотив И62-И63-А64-П65-1166-А67. При анализе кристаллической структуры полноразмерного эндостатина было выявлено, что сходный мотив образуется в результате сближенного расположения остатков 1127-028-А29-030 и Я47-А48. Исследование фрагмента эндостатина 6-49 методом молекулярной динамики показало, что при фолдинге этого фрагмента сохраняется кластер 1127-С28-А29-030-К.47-А48, что, по-видимому, и определяет антиангиогенные свойства этого пептида [178] (Рисунок 16).

Рисунок 16. Фрагмент эндостатина (6—49) в начале (слева) и в конце 30-наноеекундпой симуляции молекулярной динамики. Основные структурные изменения претерпевает М-концсвая часть пептида (показана стрелкой), в то время как расположение остатков кластера Ш7-Ш8-А29-Ш0-Я47^А48 остаётся стабильным на протяжении всей симуляции [ 178].

\

\

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Бейрахова, Ксения Андреевна

Выводы:

1. Получены рекомбинантные аналоги функциональных фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза, подавляющие различные этапы неоангиогенеза.

2. Получены высокоэффективные штаммы-продуценты, обеспечивающие суперэкспрессию (свыше 35% от суммарного белка клетки) гибридных белков, содержащих в своём составе фрагменты тумстатина, PEDF и эндостатина.

4. Разработаны эффективные схемы выделения и очистки рекомбинантных аналогов фрагментов тумстатина (L69K-95), PEDF (44-77), эндостатина (1-49). Получены целевые полипептиды чистотой более 99% для биологических испытаний. Применение интеиновой системы для биотехнологического синтеза PEDF (44-77) и эндостатина (1-49) позволило исключить стадии хроматографической очистки и энзиматического расщепления гибридного белка.

5. Продемонстрирована антиангиогенная активность фрагмента тумстатина (L69K-95), фрагмента PEDF (44-77) и фрагмента эндостатина (149) на разных этапах развития ангиогенеза на моделях in vitro: PEDF (44-77) оказывал цитостатический и антипролиферативный эффект на эндотелиальные клетки, тумстатин (L69K-95) подавлял пролиферацию, все три пептида ингибировали образование трубочко-подобных структур в пределах изученных концентраций (0,1 - 20 нМ).

6. Продемонстрирована in vivo эффективность аналогов тумстатина (L69K -95), PEDF (44-77) и эндостатина (1-49) в терапии заболеваний глаз, сопровождающихся ангиогенезом (на экспериментальной модели неоваскуляризации роговицы). При одновременном введении с индукторами ангиогенеза каждый из пептидов блокировал врастание сосудов (ранние этапы ангиогенеза). Рекомбинантный аналог тумстатина (L69K-95) продемонстрировал способность резорбировать новообразованные сосуды (поздние этапы ангиогенеза).

Заключение

По мере накопления данных по применению в клинической практике препаратов для подавления ангиогенеза (Луцентис) выявляются категории пациентов, для которых анти-УЕОР направленная терапия слабоэффективна или неэффективна [205]. Более того, ряд исследований подтверждает снижение лечебного эффекта от таких препаратов при повторных инъекциях.

В среднем, после пяти инъекций Луцентиса наблюдается значительное снижение лечебного эффекта [206]. Для таких пациентов необходимы альтернативные терапевтические стратегии, подавляющие ангиогенез с

80 использованием УБвР-независимых механизмов. Существует гипотеза, согласно которой сочетанное действие таких препаратов с ингибиторами УЕОБ будет наиболее эффективно [207].

Рекомбинантные полипептиды, созданные на основе структур эндогенных ингибиторов ангиогенеза, могут стать альтернативой или дополнением к современной анти-УЕвЕ-направленной терапии. К преимуществам разработанных нами полипептидов можно отнести способность воздействовать одновременно на несколько компонентов патологического процесса: помимо антиангиогенного действия препараты обладали явным противовоспалительным эффектом. Кроме того, рекомбинантный фрагмент тумстатина был эффективен на стадиях созревания и стабилизации сосудов, что свидетельствует о УЕОЕ-независимом механизме его действия. Важно также отметить, что рекомбинантные препараты действовали в очень небольших дозах - менее 1 мкг. Для сравнения, доза Луцентиса составляет 0,3 мг. Низкие действующие концентрации препаратов предполагают минимальные системные побочные эффекты от их применения, а также существенно снижают стоимость терапии.

Не до конца изучены также последствия полного ингибирования всех изоформ УЕОБ, которое необходимо для достижения максимального эффекта от препаратов-блокаторов УЕОБ. Находится всё больше подтверждений тому, что УЕвЕ необходим для выживания фоторецепторных и Мюллеровских клеток, и системная нейтрализация этого ростового фактора может приводить к снижению функций сетчатки [208, 209]. Созданные нами рекомбинантные полипептиды несут в себе структуру фрагментов природных молекул-ингибиторов ангиогенеза, присутствующих в норме в организме человека. Более того, дозы рекомбинантных препаратов, показавшие эффективные результаты, близки к физиологическим

81 концентрациям эндогенных ингибиторов. В этой связи можно предположить минимальные побочные эффекты таких препаратов на ткани глаза.

Ещё одним достоинством разработанных рекомбинантных полипептидов является их сравнительно небольшой молекулярный вес (около 4-5 кДа, что приблизительно в 10 раз меньше веса молекулы ЯашЫгшпаЬ (препарат Луцентис)). Небольшие размеры полипептидов позволяют им легко проникать в ткани глаза, в связи с чем становится эффективной субконъюнктивальная доставка этих препаратов. Преимущества такого введения по сравнению с интравитреальными инъекциями, используемыми для доставки препарата Луцентис, весьма значительны: процедура менее инвазивна и сопровождается существенно меньшим риском таких серьёзных осложнений, как эндофтальмит и отслойка сетчатки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Бейрахова, Ксения Андреевна, 2012 год

Список литературы

1. Folkman J., Ingber D. Inhibition of angiogenesis // Semin. Cancer Biol. 1992. V. 3.

2. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2001. V. 33. № 4. P. 357-369.

3. Gao G., Ma J. Tipping the balance for angiogenic disorders // Drug Discov. Today. 2002. V. 7. № 3. P. 171-172.

4. Battegay E.J. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects // J. Mol. Med. 1995. V. 73. № 7. P. 333-346.

5. Ma J.X., Zhang S.X., Wang J.J. Down-regulation of angiogenic inhibitors: a potential pathogenic mechanism for diabetic complications // Curr. Diab. Rev. 2005. V. 1, № 2. P. 183-196.

6. Benelli R., Morini M., Carrozzino F., Ferrari N., Minghelli S., Santi L., Cassatella M., Noonan D.M., Albini A. Neutrophils as a key cellular target for angiostatin: implications for regulation of angiogenesis and inflammation // FASEB J. 2002. V. 16. № 2. P. 267-269.

7. Zhang S.X., Ma J.X. Ocular neovascularization: Implication of endogenous angiogenic inhibitors and potential therapy // Prog. Retin. Eye Res. 2007. V. 26. № l.P. 1-37.

8. Folkman J, Shing Y. Angiogenesis // J. Biol. Chem. 1992. V. 267 № 16. P. 10931-10934.

9. Ferrara N., Houck K., Jakeman L., Leung D.W. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins // Endocr. Rev. 1992. V. 13. № 1. P. 18-32.

10. Ishikawa F., Miyazono K., Hellman U., Drexler H., Wernstedt C., Hagiwara K., Usuki K., Takaku F., Risau W., Heldin C.H. Identification of angiogenic activity and the cloning and expression of platelet-derived endothelial cell growth factor // Nature. 1989. V. 338. № 6216. P. 557-562.

11. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P., Crawford S.E., Xu H., Benedict W., Bouck N.P. Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis // Science. 1999. V. 285. № 5425. P. 245-248

12. Tolsma S.S., Volpert O.V., Good D.J., Frazier W.A., Polverini P.J., Bouck N. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin- 1 have anti-angiogenic activity// J. Cell. Biol. 1993. V. 122. №2. P. 497-511.

13. Sund M., Nyberg P., Eikesdal H.P. Endogenous Matrix-Derived Inhibitors of Angiogenesis // Pharmaceuticals. 2010. V. 3. № 10. P. 3021-3039.

14. Carmeliet P., Jain R.K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis // Nature. 2011 V. 473. № 7347. P. 298-307.

15. Senger D.R., Galli S.J., Dvorak A.M., Perruzzi C.A., Harvey V.S., Dvorak H.F. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid // Science. 1983. V. 219. № 4587. P. 983-985.

16. Robinson C.J., Stringer S.E. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors // J. Cell. Sci. 2001. V. 114. P. 853-865.

17. Aiello L.P., Wong J.S. Role of vascular endothelial growth factor in diabetic vascular complications // Kidney Int. Suppl. 2000. V.77. SI 13—SI 19.

18. Dvorak H.F., Brown L.F., Detmar M., Dvorak A.M. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. № 5. P. 1029-1039.

19. de Vries C., Escobedo J.A., Ueno H., Houck K., Ferrara N., Williams L.T. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor // Science. 1992. V. 255. № 5047. P. 989-991.

20. Terman B.I., Dougher-Vermazen M., Carrion M.E., Dimitrov D., Armellino D.C., Gospodarowicz D., Bohlen P. Identificationof the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor // Biochem. Biophysic. Res. Commun. 1992. V. 187. № 3. P. 1579-1586.

21. Aiello L.P., Northrup J.M., Keyt B.A., Takagi H., Iwamoto M.A. Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor in retinal cells // Arch. Ophthalmol. 1995. V. 113. № 12. P. 1538-44.

22. Famiglietti E.V., Stopa E.G., McGookin E.D., Song P., LeBlanc V., Streeten B.W. Immunocytochemical localization of vascular endothelial growth factor in neurons and glial cells of human retina // Brain Res. 2003. V. 969. № 1-2. P. 195-204.

23. Sandercoe T.M., Geller S.F., Hendrickson A.E., Stone J., Provis J.M. VEGF expression by ganglion cells in central retina before formation of the foveal depression in monkey retina: evidence of developmental hypoxia // J. Comp. Neurol. 2003. V. 462. № 1. p. 42-54.

24. Kvanta A., Algvere P.V., Berglin L., Seregard S. Subfoveal fibrovascular membranes in age-related macular degeneration express vascular

endothelial growth factor // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. V. 37. № 9. P. 1929-1934.

25. Aiello L.P., Avery R.L., Arrigg P.G, Keyt B.A., Jampel H.D., Shah S.T., Pasquale L.R., Thieme H., Iwamoto M.A., Park J.E., Nguyen H.V., Aiello L.M., Ferrara N., King G.L. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders // N. Engl. J. Med. 1994. V. 331. № 22. P. 1480-1487.

26. Aiello LP, Pierce EA, Foley ED, Takagi H., Chen H., Riddle L., Ferrara N., King G.L., Smith L.E. Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using soluble VEGF-receptor chimeric proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. № 23. P. 10457-10461.

27. Krzystolik M.G., Afshari M.A., Adamis A.P., Gaudreault J., Gragoudas E.S., Michaud N.A., Li W., Connolly E., O'Neill C.A., Miller J.W. Prevention of experimental choroidal neovascularization with intravitreal anti-vascular endothelial growth factor antibody fragment // Arch. Ophthalmol. 2002. V. 120. № 3. P. 338-346.

28. Qaum T., Xu Q., Joussen A.M., Clemens M.W., Qin W., Miyamoto K., Hassessian H., Wiegand S.J., Rudge J., Yancopoulos G.D., Adamis A.P. VEGF-initiated blood-retinal barrier breakdown in early diabetes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. № 10. P. 2408-2413.

29. Takeda A., Hata Y., Shiose S., Sassa Y., Honda M., Fujisawa K., Sakamoto T., Ishibashi T. Suppression of experimental choroidal neovascularization utilizing KDR selective receptor tyrosine kinase inhibitor // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2003. V. 241 № 9. P. 765-772.

30. Tolentino MJ., Brucker A.J., Fosnot J., Ying G.S., Wu I.H., Malik G., Wan S., Reich S.J. Intravitreal injection of vascular endothelial growth factor small interfering RNA inhibits growth and leakage in a nonhuman primate, laser-induced model of choroidal neovascularization // Retina. 2004. V. 24. № 1. P. 132-138.

31. Mulcahy M.F., Benson A.B. Bevacizumab in the treatment of colorectal cancer // Expert Opin. Biol. Ther. 2005. V. 5. № 7. P. 997-1005.

32. Avery L., Pieramici J., Rabena D., Castellarin A.A., Nasir M.A., Giust M.J. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for neovascular age-related macular degeneration // Ophthalmology. 2006. V. 113. № 3. P. 363-372

33. Moshfeghi A.A., Rosenfeld P.J., Puliafito C.A., Michels S., Marcus E.N., Lenchus J.D., Venkatraman A.S. Systemic bevacizumab (Avastin) therapy

for neovascular age-related macular degeneration: twenty-four-week results of an uncontrolled open-label clinical study // Ophthalmology. 2006. V. 113. № 11. P. 1-12.

34. Madhusudhana K.C., Hannan S.R., Williams C.P., Goverdhan S.V., Rennie C., Lotery A.J., Luff A.J., Newsom; R.S. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for the treatment of choroidal neovascularization in age-related macular degeneration: results from 118 cases // Br. J. Ophthalmol. 2007. V. 91. № 12. P. 1716-1717.

35. Bashshur Z.F., Haddad Z.A., Schakal A., Jaafar R.F., Saab M., Noureddin B.N. Intravitreal bevacizumab for treatment of neovascular age-related macular degeneration: a one-year prospective study // Am. J. Ophthalmol. 2008. V. 145. № 2. P. 249-256.

36. Kriechbaum K., Michels S., Prager F., Georgopoulos M., Funk M., Geitzenauer W., Schmidt-Erfurth U. Intravitreal Avastin for macular oedema secondary to retinal vein occlusion: a prospective study // Br. J. Ophthalmol. 2008. V. 92. №4. P. 518-522.

37. Priglinger S.G., Wolf A.H., Kreutzer T.C., Kook D., Hofer A., Strauss R.W., Alge C.S., Kunze C., Haritoglou C., Kampik A. Intravitreal bevacizumab injections for treatment of central retinal vein occlusion: six-month results of a prospective trial // Retina. 2007. V. 27. № 8. P. 1004-1012.

38. Byeon S.H., Kwon Y.A., Oh H.S., Kim M, Kwon O.W. Short-term results of intravitreal bevacizumab for macular edema with retinal vein obstruction and diabetic macular edema // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2007. V. 23. № 4. P. 387394.

39. European Public Assessment Report (EPAR) on Avastin, European Medicine Agency (EMEA), 2005.

40. Presta L.G., Chen H., O'Connor S.J., Chisholm V., Meng Y.G., Krummen L., Winkler M., Ferrara N. Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders // Cancer Res. 1997. V. 57 № 20. P. 4593-4599.

41. Kim K.J., Li B., Houck K., Winer J., Ferrara N. The vascular endothelial growth factor proteins: identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies // Growth Factors. 1992. V. 7. № 1. P. 53-64.

42. Kabat E.A., Wu T.T., Perry. H.M., Gottesmann. K.S., Foeller. C. Sequences of proteins of immunological interest. Ed. 5. Public Health Service. National Institutes of Health. Bethesda. MD, 1991.

43. Muller Y.A., Chen Y., Christinger H.W., Li B., Cunningham B.C., Lowman H.B., de Vos A.M. VEGF and the Fab fragment of a humanized neutralizing antibody: crystal structure of the complex at 2.4 A resolution and mutational analysis of the interface // Structure. 1998. V. 6. № 9. P. 1153-1167.

44. Ferrara N., Damico L., Shams N., Lowman H., Kim R. Development of ranibizumab, an anti-vascular endothelial growth factor antigen binding fragment, as therapy for neovascular age-related macular degeneration // Retina. 2006. V. 26. № 8. P. 859-870.

45. Chen Y, Wiesmann C., Fuh G., Li B., Christinger H.W., McKay P., de Vos A.M., Lowman H.B. Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinitymatured Fab in complex with antigen // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. № 4. P. 865-881.

46. Slakter S., CLEAR-IT 2 Investigators. A phase 2, randomized, controlled dose-and interval-ranging study of intravitreal VEGF trap-eye in patients with neovascular agerelated macular degeneration: optical coherence tomography (OCT) and fluorescein angiography (FA) outcomes at 1 Year // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009. V. 50, abstract no. 1890.

47. Honda M., Sakamoto T., Ishibashi T., Inomata H., Ueno H. Experimental subretinal neovascularization is inhibited by adenovirus- mediated soluble VEGF/flt-1 receptor gene transfection: A role of VEGF and possible treatment for SRN in age-related macular degeneration // Gene Ther. 2000. V. 7. № 11. P. 978-985.

48. Shiose S., Sakamoto T., Yoshikawa H., Hata Y., Kawano Y., Ishibashi T., Inomata H., Takayama K., Ueno H. 2000. Gene transfer of a soluble receptor of VEGF inhibits the growth of experimental eyelid malignant melanoma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. V. 41. № 9. p. 2395- 2403.

49. Bainbridge J., Mistry A., Alwis M.D., Paleolog E., Baker A., Thrasher A.J., Ali R.R. Inhibition of retinal neovascularization by gene transfer of soluble VEGF receptor sFlt-1 // Gene Ther. 2002. V. 9. № 5. P. 320-326.

50. Lai Y.K., Shen W.Y., Brankov M., Lai C.M., Constable I.J., Rakoczy P.E. Potential long-term inhibition of ocular neovascularization by recombinant adeno-associated virus-mediated secretion gene therapy // Gene Ther. 2002. V. 9. № 12. P. 804-813.

51. Ferrara N., Chen H., Davis-Smyth T., Gerber H. P., Nguyen T. N., Peers D., Chisholm V., Hillan K.J., Schwall R.H. Vascular endothelial growth factor is essential for corpus luteum angiogenesis // Nat. Med. 1998. V. 4. № 3. P. 336-340.

52. Gerber H.P., Vu T.H., Ryan A.M., Kowalski J., Werb Z., Ferrara N. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation // Nat. Med. 1999. V. 5. № 6. P. 623-628.

53. Lu D., Kussie P., Pytowski B., Persaud K., Bohlen P., Witte L., Zhu Z. Identification of the Residues in the Extracellular Region of KDR Important for Interaction with Vascular Endothelial Growth Factor and Neutralizing Anti-KDR Antibodies // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. 19. P. 14321-14330.

54. Holash J., Davis S., Papadopoulos N., Croll S.D., Ho L., Russell M., Boland P., Leidich R., Hylton D., Burova E., Ioffe E., Huang T., Radziejewski C., Bailey K., Fandl J.P., Daly T., Wiegand S.J., Yancopoulos G.D., Rudge J.S. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2002. V. 99. № 17. P. 11393-11398.

55 Gragoudas E.S., Adamis A.P., Cunningham E.T. Jr, Feinsod M., Guyer D.R. Pegaptanib for neovascular age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. 2004. V. 351. № 27. P. 2805-2816.

56. Eaton B. The joys of in vitro selection: chemically dressing oligonucleotides to satiate protein targets // Curr. Opin. Chem. Biol. 2005. V. 1. № l.P. 10-16.

57. Pieken W.A., Olsen D.B., Benseier F., Aurup H., Eckstein F. Kinetic characterization of ribonucleaseresistant 2'-modified hammerhead ribozymes // Science. 1991. V.253. № 5017. P. 314-317.

58. Ruckman J., Green L.S., Beeson J., Waugh S., Gillette W.L., Henninger D.D., Claesson-Welsh L., Janjic N. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF 165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain // J. Biol. Chem. 1998. V. 273, №32. P. 20556-20567.

59. Healy J.M., Lewis S.D., Kurz M., Boomer R.M., Thompson K.M., Wilson C., McCauley T.G. Pharmacokinetics and biodistribution of novel aptamer compositions // Pharm. Res. 2004. V. 21. № 12. 2234-2246.

60. Fairbrother W.J., Champe M.A., Christinger, H.W., Keyt, B.A., Starovasnik M.A. Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor // Structure. 1998. V. 6. № 5. P. 637-648.

61. Lee J.-H., Canny M.D., De Erkenez A., Krilleke D., Ng Y.S., Shima D.T., Pardi A., Jucker F. A therapeutic aptamer inhibits angiogenesis by

specifically targeting the heparin binding domain of VEGF165 // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 52. P. 18902-18907.

62. Ng E.W., Shima D.T., Calias P., Cunningham E.T. Jr, Guyer D.R., Adamis A.P. Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. № 2. P. 123-132.

63. Gragoudas E.S., Adamis A.P., Cunningham E.T. Jr, Feinsod M., Guyer D.R. Pegaptanib for neovascular age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. 2004. V. 351. № 27. P. 2805-2816.

64. Cunha-Vaz J., Faria de Abreu J.R., Campos A.J. Early breakdown of the bloodretinal barrier in diabetes // Br. J. Ophthalmol. 1975. V. 59. № 11. P. 649656.

65. Vinores S.A., Derevjanik N.L., Ozaki H., Okamoto N., Campochiaro P. A. Cellular mechanisms of blood-retinal barrier dysfunction in macular edema // Doc. Ophthalmol. 1999. V. 97. № 3-4. P. 217-228.

66. Storkebaum E., Lambrechts D., Carmeliet P. VEGF: once regarded as a specific angiogenic factor, now implicated in neuroprotection // Bioessays. 2004. V. 26. № 9. P. 943-954.

67. Csaky K. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for neovascular agerelated macular degeneration: promises and pitfalls // Ophthalmology. 2003. V. 110. № 5. P. 879-881.

68. Ratner M. Genentech discloses safety concerns over Avastin // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. № 10. P.1198.

69. Wahl M.L., Moser T.L., Pizzo S.V. Angiostatin and antiangiogenic therapy in human disease // Rec. Prog. Horm. Res. 2004. V. 59. P. 73-104.

70. Preis I., Langer R., Brem H., Folkman J. Inhibition of neovascularization by an extract derived from vitreous // Am. J. Ophthalmol. 1977. V. 84. № 3. P. 323-328.

71. O'Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y., Chen C., Rosenthal R.A., Moses M., Lane W.S., Cao Y., Sage E.H., Folkman J. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma // Cell. 1994. V. 79. 2. P. 315-328.

72. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2001. V. 33. № 4. P. 357-369.

73. Bornstein P. Thrombospondins: structure and regulation of expression // FASEB J. 1992. V. 6. № 14. P. 3290-3299.

74. Tucker R.P. The thrombospondin type 1 repeat superfamily // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36. № 2. 969-974.

75. Kvansakul M., Adams J.C., Hohenester E. Structure of a thrombospondin C-terminal fragment reveals a novel calcium core in the type 3 repeats // Embo. J. 2004. V. 23. № 6. P. 1223-1233.

76. Hogg P.J. Thrombospondin 1 as an enzyme inhibitor // Thromb. Haemost. 1994. V. 72. №> 6. P. 787-792.

77. Margosio B., Rusnati M., Bonezzi K., Cordes B.L., Annis D.S., Urbinati C., Giavazzi R., Presta M., Ribatti D., Mosher D.F., Taraboletti G. Fibroblast growth factor-2 binding to the thrombospondin-1 type III repeats, a novel antiangiogenic domain // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008. V. 40. № 4. P. 700-709.

78. Dawson D.W., Pearce S.F., Zhong R., Silverstein R.L., Frazier W.A., Bouck N.P. CD36 mediates the In vitro inhibitory effects of thrombospondin-1 on endothelial cells // J. Cell. Biol. 1997. V. 138. № 3. P. 707-717.

79. Jimenez B., Volpert O.V., Crawford S.E., Febbraio M., Silverstein R.L., Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1 // Nat. Med. 2000. V. 6. № 1. P. 41^8.

80. Simantov R., Febbraio M., Crombie R., Asch A.S., Nachman R.L., Silverstein R.L. Histidine-rich glycoprotein inhibits the antiangiogenic effect of thrombospondin-1 // J. Clin. Invest. 2001. V. 107. № 1. P. 45-52.

81. Taraboletti G., Belotti D., Borsotti P., Vergani V., Rusnati M., Presta M., Giavazzi R. The 140-kilodalton antiangiogenic fragment of thrombospondin-1 binds to basic fibroblast growth factor // Cell. Growth. Differ. 1997. V. 8. № 4. P. 471-479.

82. Gupta K., Gupta P., Wild R., Ramakrishnan S., Hebbel R.P. Binding and displacement of vascular endothelial growth factor (VEGF) by thrombospondin: effect on human microvascular endothelial cell proliferation and angiogenesis // Angiogenesis. 1999. V. 3. № 2. P. 147-158.

83. Fears C.Y., Grammer J.R., Stewart J.E. Jr., Annis D.S., Mosher D.F., Bornstein P., Gladson C.L. Low-density lipoprotein receptor-related protein contributes to the antiangiogenic activity of thrombospondin-2 in a murine glioma model // Cancer Res. 2005. V. 65. № 20. P. 9338-9346.

84. Rodriguez-Manzaneque J.C., Lane T.F., Ortega M.A., Hynes R.O., Lawler J., Iruela-Arispe M.L. Thrombospondin-1 suppresses spontaneous tumor growth and inhibits activation of matrix metalloproteinase-9 and mobilization of

vascular endothelial growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 22. P. 12485-12490.

85. Taraboletti G., Morbidelli L., Donnini S., Parenti A., Granger H.J., Giavazzi R., Ziche M. The heparin binding 25 kDa fragment of thrombospondin-1 promotes angiogenesis and modulates gelatinase and TIMP-2 production in endothelial cells // Faseb J. 2000. V. 14. № 12. P. 1674-1676.

86. Chandrasekaran L., He C.Z., Al-Barazi H., Krutzsch H.C., Iruela-Arispe M.L., Roberts D.D. Cell contact-dependent activation of alpha3betal integrin modulates endothelial cell responses to thrombospondin-1 // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. №9. P. 2885-2900.

87. Goicoechea S., Orr A.W., Pallero M.A., Eggleton P., Murphy-Ullrich J.E. Thrombospondin mediates focal adhesion disassembly through interactions with cell surface calreticulin // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 46. P.36358-36368.

88. Jimenez B., Volpert O.V., Crawford S.E., Febbraio M., Silverstein R.L., Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1 // Nat. Med. 2000. V. 6. № 1. P. 41-48.

89. Volpert O.V., Zaichuk T., Zhou W., Reiher F., Ferguson T.A., Stuart P.M., Amin M., Bouck N.P. Inducer-stimulated Fas targets activated endothelium for destruction by anti-angiogenic thrombospondin-1 and pigment epithelium-derived factor // Nat. Med. 2002. V. 8. № 4. P. 349-357.

90. Rusnati M., Urbinati C., Bonifacio S., Presta M., Taraboletti G. Thrombospondin-1 as a paradigm for the development of antiangiogenic agents endowed with multiple mechanisms of action // Pharmaceuticals. 2010. V. 3. № 4. P. 1241-1278.

91. Taraboletti G., Morbidelli L., Donnini S., Parenti A., Granger H.J., Giavazzi R., Ziche M. The heparin binding 25 kDa fragment of thrombospondin-1 promotes angiogenesis and modulates gelatinase and TIMP-2 production in endothelial cells // Faseb J. 2000. V. 14. № 12. P. 1674-1676.

92. Dawson D.W., Volpert O.V., Pearce S.F.A., Schneider A.J., Silverstein R.L., Henkin J., Bouck N.P. Three distinct d-amino acid substitutions confer potent antiangiogenic activity on an inactive peptide derived from a thrombospondin-1 type 1 repeat// Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. № 2. P. 332-338.

93. Tolsma S.S., Volpert O.V., Good D.J., Frazier W.A., Polverini P.J., Bouck N. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity// J. Cell. Biol. 1993. V. 122. № 2. P. 497-511.

94. Silverstein R.L. The face of TSR revealed: an extracellular signaling domain is exposed // J. Cell. Biol. 2002. V. 159. № 2. P. 203-206.

95. Iruela-Arispe M.L., Luque A., Lee N. Thrombospondin modules and angiogenesis // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004. V. 36. № 6. P. 1070-1078.

96. Tan K., Duquette M., Liu J.H., Dong Y., Zhang R., Joachimiak A., Lawler J., Wang J.H. Crystal structure of the TSP-1 type 1 repeats: a novel layered fold and its biological implication // J. Cell. Biol. 2002. V. 159. № 2. P.373-382.

97. Guo N.H., Krutzsch H.C., Inman J.K., Shannon C.S., Roberts D.D. Antiproliferative and antitumor activities of D-reverse peptides derived from the second type-1 repeat of thrombospondin-1 // J. Pept. Res. 1997. V. 50. № 3. P. 210-221.

98. Coronella J., Li L., Johnson K., Pirie-Shepherd S., Roxas G., Levin N. Selective activity against proliferating tumor endothelial cells by CVX-22, a thrombospondin-1 mimetic CovXBody // Anticancer Res. 2009. V. 29. № 6. P. 2243-2252.

99. Dawson D.W., Volpert O.V., Pearce S.F., Schneider A.J., Silverstein R.L., Henkin J., Bouck N.P. Three distinct D-amino acid substitutions confer potent antiangiogenic activity on an inactive peptide derived from a thrombospondin-1 type 1 repeat// Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. № 2. P. 332-338.

100. Haviv F., Bradley M.F., Kalvin D.M., Schneider A.J., Davidson D.J., Majest S.M., McKay L.M., Haskell C.J., Bell R.L., Nguyen B., Marsh K.C, Surber B.W., Uchic J.T., Ferrero J., Wang Y.C., Leal J., Record R.D., Hodde J., Badylak S.F., Lesniewski R.R., Henkin J. Thrombospondin-1 mimetic peptide inhibitors of angiogenesis and tumor growth: design, synthesis, and optimization of pharmacokinetics and biological activities // J. Med. Chem. 2005. V. 48. № 8. P. 2838-2846.

101. Greenaway J., Henkin J., Lawler J., Moorehead R., Petrik J. ABT-510 induces tumor cell apoptosis and inhibits ovarian tumor growth in an orthotopic, syngeneic model of epithelial ovarian cancer // Mol. Cancer Ther. 2009. V. 8. № 1. P. 64-74.

102. Becerra S.P., Sagasti A., Spinella P., Notario V. Pigment epitheliumderived factor behaves like a noninhibitory serpin. Neurotrophic activity does not require the serpin reactive loop // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 43. P. 25992-25999.

103. Tombran-Tink J., Johnson L.V. Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced by medium conditioned by human RPE cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1989. V. 30. № 8. P. 1700-1707.

104. Cao W., Tombran-Tink J., Chen W., Mrazek D., Elias R., McGinnis J.F. Pigment epithelium-derived factor protects cultured retinal neurons against hydrogen peroxide-induced cell death // J. Neurosci. Res. 1999. V. 57. № 6. P. 789-800.

105. DeCoster M.A., Schabelman E., Tombran-Tink J., Bazan N.G. Neuroprotection by pigment epithelial-derived factor against glutamate toxicity in developing primary hippocampal neurons // J. Neurosci. Res. 1999. V. 56. № 6. P. 604-610.

106. Houenou L.J., D'Costa A.P., Li L., Turgeon V.L., Enyadike C., Alberdi E., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor promotes the survival and differentiation of developing spinal motor neurons // J. Comp. Neurol. 1999. V. 412. №3. P. 506-514.

107. Bilak M.M., Corse A.M., Bilak S.R., Lehar M., Tombran-Tink J., Kuncl R.W. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1999. V. 58. № 7. p. 719-728.

108. Barnstable C.J., Tombran-Tink J. Neuroprotective and antiangiogenic actions of PEDF in the eye: Molecular targets and therapeutic potential // Prog. Retin. Eye Res. 2004. V. 23. № 5. P. 561-577.

109. Dawson D.W, Volpert O.V., Gillis P., Crawford S.E., Xu H, Benedict W., Bouck N.P. Pigment epithelium-derived factor: A potent inhibitor of angiogenesis // Science. 1999. V. 285. № 5425. P. 245-248.

110. Ohno-Matsui K., Morita I., Tombran-Tink J., Mrazek D., Onodera M., Uetama T., Hayano M., Murota S.I., Mochizuki M. Novel mechanism for age-related macular degeneration: an equilibrium shift between the angiogenesis factors VEGF and PEDF. J Cell Physiol 2001. V. 189. № 3. P.323-333.

111. Funatsu H., Yamashita H., Nakamura S., Mimura T., Eguchi S., Noma H., Hori S. Vitreous levels of pigment epithelium-derived factor and vascular endothelial growth factor are related to diabetic macular edema // Ophthalmology. 2006. V. 113. №2. P. 294-301.

112. Ogata N., Nishikawa M., Nishimura T., Mitsuma Y., Matsumura M. Unbalanced vitreous levels of pigment epithelium-derived factor and vascular

endothelial growth factor in diabetic retinopathy // Am. J. Ophthalmol. 2002. V. 134. № 3. P. 348-353.

113. Patel J.I., Tombran-Tink J., Hykin P.G., Gregor Z. J., Cree I.A. Vitreous and aqueous concentrations of proangiogenic, antiangiogenic factors and other cytokines in diabetic retinopathy patients with macular edema: Implications for structural differences in macular profiles // Exp. Eye Res. 2006. V. 82. № 5. P. 798-806.

114. Spranger J., Osterhoff M., Reimann M., Mohlig M., Ristow M., Francis M.K., Cristofalo V., Hammes H.P., Smith G., Boulton M., Pfeiffer A.F. Loss of the antiangiogenic pigment epithelium-derived factor in patients with angiogenic eye disease // Diabetes. 2001. V. 50. № 12. P. 2641-2645.

115. Boehm B.O., Lang G., Volpert O., Jehle P.M., Kurkhaus A., Rosinger S., Lang G.K., Bouck N. Low content of the natural ocular anti-angiogenic agent pigment epithelium-derived factor (PEDF) in aqueous humor predicts progression of diabetic retinopathy // Diabetologia. 2003. V. 46. № 3. p. 394^00.

116. Boehm B.O., Lang G., Feldmann B., Kurkhaus A., Rosinger S., Volpert O., Lang G.K., Bouck N. Proliferative diabetic retinopathy is associated with a low level of the natural ocular anti-angiogenic agent pigment epithelium-derived factor (PEDF) in aqueous humor, a pilot study // Horm. Metab. Res. 2003. V. 35. № 6. P. 382-386.

117. Aparicio S., Sawanta S., Lara N., Barnstable C.J. Expression of angiogenesis factors in human umbilical vein endothelial cells and their regulation by PEDF // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 326. № 2. P. 387-394.

118. Cai J., Jiang W.G., Grant M.B., Boulton M. Pigment Epithelium-derived Factor Inhibits Angiogenesis via Regulated Intracellular Proteolysis of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 6. P. 3604-3613.

119. Ablonczy Z., Prakasam A., Fant J., Fauq A., Crosson C., Sambamurti, K. Pigment Epithelium-derived Factor Maintains Retinal Pigment Epithelium Function by Inhibiting Vascular Endothelial Growth Factor-R2 Signaling through y-Secretase // J. Biol. Chem. 2009.V. 284. № 44. P. 30177-30186.

120. Chen L., Zhang S.S., Barnstable C.J., Tombran-Tink J. PEDF induces apoptosis in human endothelial cells by activating p38 MAP kinase dependent cleavage of multiple caspases // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006 V. 348. № 4. P. 1288-1295.

121. Zaichuk T.A., Shroff E.H., Emmanuel R., Filleur S., Nelius T., Volpert O.V. Nuclear Factor of Activated T Cells Balances Angiogenesis Activation and Inhibition// J. Exp. Med. 2004. V. 199, № 11. P. 1513-1522.

122. Bernard A., Gao-Li J., Franco C.A., Bouceba T., Huet A., Li Z. Laminin Receptor Involvement in the Anti-angiogenic Activity of Pigment Epithelium-derived Factor // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. № 16. P. 10480-10490.

123. Thepparit C., Smith D. R. Serotype-Specific Entry of Dengue Virus into Liver Cells: Identification of the 37-Kilodalton/67-Kilodalton High-Affinity Laminin Receptor as a Dengue Virus Serotype 1 Receptor // J. Virol. 2004. V. 78. № 22. P. 12647-12656

124. Akache B., Grimm D., Pandey K., Yant S.R., Xu H., Kay M.A. The 37/67-Kilodalton Laminin Receptor Is a Receptor for Adeno-Associated Virus Serotypes 8, 2, 3, and 9 // J. Virol. 2006. V. 80. № 19. P. 9831-9836.

125. Gauczynski S., Peyrin J.M., Ha'ik S., Leucht C., Hundt C., Rieger R., Krasemann S., Deslys J.P., Dormont D., Lasme'zas C.I., Weiss S. The 37-kDa/67-kDa laminin receptor acts as the cell-surface receptor for the cellular prion protein // EMBO J. V. 20. № 21. P. 5863-5875.

126. Nelson J., McFerran N.V., Pivato G., Chambers E., Doherty C., Steele D., Timson D.J. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease // Biosci. Rep. 2008. V. 28. № 1. P. 33-48.

127. Campochiaro P.A., Nguyen Q.D., Shah S.M., Klein M.I., Holz E., Frank R.N., Saperstein D. A., Gupta A, Stout J.T., Macko J., DiBartolomeo R., Wei L.L. Adenoviral vector-delivered PEDF for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial // Hum. Gene Ther. 2006. V. 17. № 2. P. 167-176.

128. Alberdi E., Aymerich M.S., Becerra S.P. Binding of pigment epithelium- derived factor (PEDF) to retinoblastoma cells and cerebellar granule neurons: evidence for a PEDF receptor // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 44. P. 31605-31612.

129. Bilak M.M., Becerra S.P., Vincent A.M., Moss B.H., Aymerich M.S., Kuncl R.W. Identification of the neuroprotective molecular region of pigment epithelium-derived factor and its binding sites on motor neurons // J. Neurosci. 2002. V. 22. № 21. P. 9378-9386.

130. Li H., Tran V.V., Hu Y., Mark Saltzman W., Barnstable C.J., Tombran-Tink J. A PEDF N-terminal peptide protects the retina from ischemic injury when delivered in PLGA nanospheres // Exp. Eye Res. 2006. V. 83. № 4. P. 824-833.

131. Filleur S., Volz K., Nelius T., Mirochnik Y., Huang H., Zaichuk T.A., Aymerich M.S., Becerra S.P., Yap R., Veliceasa D., Shroff E.H., Volpert O.V. Two functional epitopes of pigment epithelial-derived factor block angiogenesis and induce differentiation in prostate cancer // Cancer Res. 2005. V. 65. № 12. P. 5144-5152.

132. Amaral J., Becerra S. P. Effects of Human Recombinant PEDF Protein and PEDFDerived Peptide 34-mer on Choroidal Neovascularization // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. V. 51. № 3. P. 1318-1326.

133. Longeras R., Farjo K., Ihnat M., Ma J.-X. A PEDF-Derived Peptide Inhibits Retinal Neovascularization and BlocksMobilization of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cells // Exp. Diabetes Res. 2012. V. 2012. P. 518426.

134. Gong Q, Yang X, Cai W, Gao G, Yang Z. Expression and purification of functional epitope of pigment epithelium-derived factor in E. coli with inhibiting effect on endothelial cells // Protein J. 2010. V. 29. № 3. P. 167-173.

135. Borza D.B., Bondar O., Ninomiya Y., Sado Y., Naito I., Todd P., Hudson B.G. The NCI domain of collagen IV encodes a novel network composed of the alpha 1, alpha 2, alpha 5, and alpha 6 chains in smooth muscle basement membranes // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 30. P. 28532-28540.

136. Gunwar S., Ballester F.,Noelken M.E., Sado Y.,Ninomiya Y.,Hudson B.G. Glomerular basement membrane. Identification of a novel disulfide-cross-linked network of alpha3, alpha4, and alpha5 chains of type IV collagen and its implications for the pathogenesis of Alport syndrome. J. Biol. Chem. 1998. V. 273 № 15. P. 8767-8775.

137. Sudhakar A., Boosani C.S. Inhibition of tumor angiogenesis by

tumstatin: insights into signaling mechanisms and implications in cancer regression // Pharm. Res. 2008. V. 25. № 12. P. 2731-2739.

138. Colorado P.C., Torre A., Kamphaus G., Maeshima Y., Hopfer H., Takahashi K., Volk R., Zamborsky E.D., Herman S., Sarkar P.K., Ericksen M.B., Dhanabal M., Simons M., Post M., Kufe D.W., Weichselbaum R.R., Sukhatme V.P., Kalluri R. Anti-angiogenic cues from vascular basement membrane collagen // Cancer Res. 2000. V. 60. № 9. P. 2520-2526.

139. Sundaramoorthy M., Meiyappan M., Todd P., Hudson B.G. Crystal structure of NCI domains. Structural basis for type IV collagen assembly in basement membranes // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 34. P. 31142-31153.

140. Hudson B.G., Reeders S.T., Tryggvason K. Type IV collagen:structure, gene organization, and role in human diseases. Molecular basis of Goodpasture and Alport syndromes and diffuse leiomyomatosis // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 35. P. 26033-26036.

141. Hamano Y., Zeisberg M., Sugimoto H., Lively J.C., Maeshima Y., Yang C., Hynes R.O., Werb Z., Sudhakar A., Kalluri R. Physiological levels of tumstatin, a fragment of collagen IV alpha3 chain, are generated by MMP-9 proteolysis and suppress angiogenesis via alphaV beta3 integrin // Cancer Cell. 2003. V.3.№6. P. 589-601.

142. Maeshima Y., Colorado P.C., Torre A., Holthaus K.A., Grunkemeyer J.A., Ericksen M.B., Hopfer H., Xiao Y., Stillman I.E., Kalluri R. Distinct antitumor properties of a type IV collagen domain derived from basement membrane // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 28. P. 21340-21348.

143. Maeshima Y., Manfredi M., Reimer C., Holthaus K.A., Hopfer H., Chandamuri B.R., Kharbanda S., Kalluri R. Identification of the anti-angiogenic site within vascular basement membrane-derived tumstatin // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 18. P. 15240-15248.

144. Maeshima Y., Yerramalla U.L., Dhanabal M., Holthaus K.A., Barbashov S., Kharbanda S., Reimer C., Manfredi M., Dickerson W.M., Kalluri R. Extracellular matrix-derived peptide binds to alpha(v)beta(3) integrin and inhibits angiogenesis // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 34. 31959-31968.

145. Maeshima Y., Sudhakar A., Lively J.C., Ueki K., Kharbanda S., Kahn C.R., Sonenberg N., Hynes R.O., Kalluri R. Tumstatin, an endothelial cell-specific inhibitor of protein synthesis // Science. 2002. V. 295. № 5552. P. 140-143.

146. Petitclerc E., Boutaud A., Prestayko A., Xu J., Sado Y., Ninomiya Y., Sarras M.P. Jr, Hudson B.G., Brooks P.C. New functions for non-collagenous domains of human collagen type IV. Novel integrin ligands inhibiting angiogenesis and tumor growth in vivo // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 11. P. 8051-8061.

147. Han J., Ohno N., Pasco S., Monboisse J.C., Borel J.P., Kefalides N.A. A cell binding domain from the alpha3 chain of type IV collagen inhibits proliferation of melanoma cells // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 33. P. 2039520401.

148. Boosani C.S., Mannam A.P., Cosgrove D., Silva R., Hodivala-Dilke K.M., Keshamouni V.G., Sudhakar A. Regulation of COX-2 mediated signaling by {alpha} 3 type IV noncollagenous domain in tumor angiogenesis // Blood. 2007. V. 110. №4. P.l 168-1177.

149. Church R.D., Fleshman J.W., McLeod H.L. Cyclo-oxygenase 2 inhibition in colorectal cancer therapy // Br. J. Surg. 2003. V. 90. № 9. P. 10551067.

150. Zeisberg M., Khurana M., Rao V.H., Cosgrove D., Rougier J.P., Werner M.C., Shield C.F. 3rd, Werb Z,. Kalluri R. Stage-specific action of matrix metalloproteinases influences progressive hereditary kidney disease // PLoS Med. 2006. V. 3.№4. P. el00.

151. Gunda V., Wang S., Sheibani N., Sudhakar, A. Inhibitory Effect of Tumstatin on Corneal Neovascularization Both In-vitro and In-vivo // J. Clinic. Experiment. Ophthalmol. 2011. V.2. P. 132.

152. Dhanabal M., Ramchandran R., Volk R., Stillman I. E., Lombardo M., Iruela-Arispe M. L., Simons M., Sukhatme V.P. Endostatin: yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma // Cancer Res. 1999. V. 59. № l.P. 189-197.

153. Yamaguchi N., Anand-Apte B., Lee M., Sasaki T., Fukai N., Shapiro R., Que I., Lowik C., Timpl R., Olsen B.R. Endostatin inhibits VEGF-induced endothelial cell migration and tumor growth independently of zinc binding // EMBO J. 1999. V. 18. № 16. P. 4414^423.

154. O'Reilly M.S., Boehm T., Shing Y., Fukai N., Vasios G., Lane W.S., Flynn E., Birkhead J.R., Olsen B.R., Folkman, J. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth // Cell. 1997. V. 88. № 2. P. 277-285.

155. Boehm T., Folkman J., Browder T., O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance // Nature. 1997. V. 390. № 6658. P. 404-407.

156. Abdollahi A., Hahnfeldt P., Maercker C., Grone H.J., Debus J., Ansorge W., Folkman J., Hlatky L., Huber P.E. Endostatin's antiangiogenic signaling network // Mol. Cell. 2004. V. 13. № 5. P. 649-663.

157. Ding Y.H., Javaherian K., Lo K.M., Chopra R., Boehm T., Lanciotti J., Harris B.A., Li Y., Shapiro R., Hohenester E., Timpl R., Folkman J., Wiley D.C. Zinc-dependent dimers observed in crystals of human endostatin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 18. P. 10443-10448.

158. Hohenester E., Sasaki T., Olsen B.R., Timpl R. Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 A resolution // EMBO J. 1998. V. 17. № 6. P. 1656-1664.

159. Han Q., Fu Y., Zhou H., He Y., Luo Y. Contributions of Zn(II)-binding to the structural stability of endostatin // FEBS Lett. 2007. V. 581. № 16. P. 30273032.

160. Fu Y., Tang H., Huang Y., Song N., Luo Y. Unraveling the mysteries of endostatin // IUBMB Life. 2009. V. 61. № 6. P. 613-626.

161 Ricard-Blum S., Feraud O., Lortat-Jacob H., Rencurosi A., Fukai N., Dkhissi F., Vittet D., Imberty A., Olsen B.R., van der Rest M. Characterization of endostatin binding to heparin and heparin sulfate by surface plasmon resonance and molecular modeling: role of divalent cations // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. №

4. P. 2927-2936.

162. Shi H., Huang Y., Zhou H., Song X., Yuan S., Fu Y., Luo Y. Nucleolin is a receptor that mediates antiangiogenic and antitumor activity of endostatin // Blood. 2007. V. 110. № 8. P. 2899-2906.

163. Sudhakar A., Sugimoto H., Yang C., Lively J., Zeisberg M., Kalluri R. Human tumstatin and human endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by alpha v beta 3 and alpha 5 beta 1 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 8. P. 4766-4771.

164. Javaherian K., Park S.Y., Pickl W.F., LaMontagne K.R., Sjin R.T., Gillies S., Lo K.M. Laminin modulates morphogenic properties of the collagen XVIII endostatin domain // J. Biol. Chem. 2002 . V. 277. № 47. P. 45211—45218.

165. Karumanchi S.A., Jha V., Ramchandran R., Karihaloo A., Tsiokas L., Chan B., Dhanabal M., Hanai J.I., Venkataraman G., Shriver Z., Keiser N., Kalluri R., Zeng H., Mukhopadhyay D., Chen R.L., Lander A.D., Hagihara K., Yamaguchi Y., Sasisekharan R., Cantley L., Sukhatme V.P. Cell surface glypicans are low-affinity endostatin receptors // Mol. Cell. 2001. V.7. № 4. P. 811-822.

166. Lee S.J., Jang J.W., Kim Y.M., Lee H.I., Jeon J.Y., Kwon Y.G., Lee

5.T. Endostatin binds to the catalytic domain of matrix metalloproteinase-2 // FEBS Lett. 2002. V. 519. № 1-3. P. 147-152.

167. MacDonald N.J., Shivers W.Y., Narum D.L., Plum S.M., Wingard J.N., Fuhrmann S.R., Liang H., Holland-Linn J., Chen D.H., Sim B.K. Endostatin binds tropomyosin. A potential modulator of the antitumor activity of endostatin // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 27. P. 25190-25196.

168. Ginisty H., Sicard H., Roger B., Bouvet P. Structure and functions of nucleolin // J. Cell Sci. 1999. V. 112, № 6. P. 761-772.

169. Erard M.S., Belenguer P., Caizergues-Ferrer M., Pantaloni A., Amalric, F. A major nucleolar protein, nucleolin, induces chromatin decondensation by binding to histone HI // Eur. J. Biochem. 1988. V. 175. № 3. p. 525-530.

170. Kharrat A., Derancourt J., Doree M., Amalric F., Erard M. Synergistic effect of histone HI and nucleolin on chromatin condensation in mitosis: role of a phosphorylated heteromer. Biochemistry. 1991.V. 30. № 42. P. 10329-10336.

171. Christian S., Pilch J., Akerman M.E., Porkka K., Laakkonen P., Ruoslahti E. Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels // J. Cell Biol. 2003. V. 163. № 4. P. 871-878.

172. Huang Y., Shi H., Zhou H., Song X., Yuan S., Luo Y. The angiogenic function of nucleolin is mediated by vascular endothelial growth factor and nonmuscle myosin // Blood. 2006. V. 107. № 9. P. 3564-3571.

173. Tjin Tham Sjin R.M., Satchi-Fainaro R., Birsner A.E., Ramanujam V.M., Folkman J., Javaherian K. A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity // Cancer Res. 2005. V. 65. № 9. P. 3656- 3663.

174. Cattaneo M.G., Pola S., Francescato P., Chillemi F., Vicentini L.M., Human endostatin-derived synthetic peptides possess potent antiangiogenic properties in vitro and in vivo // Exp. Cell Res. 2003. V. 283. № 2. P. 230-236.

175. Morbidelli L., Donnini S., Chillemi F., Giachetti A., Ziche M., Angiosuppressive and angiostimulatory effects exerted by synthetic partial sequences of endostatin // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9. № 14. P. 5358-5369.

176. Wickstrom S.A., Alitalo K., Keski-Oja J. An endostatinderived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial cells // J. Biol. Chem. 2004.V. 279. № 19. P. 20178-20185.

177. Olsson A.K., Johansson I., Akerud H.A., Einarsson B., Christofferson R., Sasaki T., Timpl R., Cleasson-Welsh L. The minimal active domain of endostatin is a heparin binding motif that mediates inhibition of tumour vascularization // Cancer Res. 2004. V. 64. № 24. P. 9012-9017.

178. Pieraccini S., Sironi M., Francescato P., Speranza G., Vicentini L.M., Manitto P. A molecular dynamics study of human endostatin and its synthetic fragments with antiangiogenic properties // Phys. Chem. Chem. Phys. 2006. V. 8. №26. P. 3066-3071.

179. Walter-Yohrling J., Morgenbesser S., Rouleau C., Bagley R., Callahan M., Weber W., Teicher B.A. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells // Clin. Cancer Res. 2004. V. 10. № 6. P. 2179-2189.

180. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

181. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.

182. Скоблов М.Ю., Шибанова Е.Д., Ковалева E.B., Баирамашвили Д.И., Скоблов Ю.С., Мирошников А.И. Количественное определение содержания ДНК в генно-инженерных активных фармацевтических субстанциях методом ПЦР в реальном времени // Биоорг. Химия. 2010. Т. 36. № 1.С. 112-116.

183. Копаева В.Г., Андреев Ю.В., Ронкина Т.И., Кишкина В .Я., Качалина Г.Ф., Васин В.И., Пономарев Г.В., Кирилова Г.Н., Ковтун В.Ю. Новый способ фотохимической деструкции новообразованных сосудов роговицы (экспериментальное исследование) // Офтальмохирургия. 1993. № 3. С. 50-57.

184. Hamano Y., Kalluri R. Tumstatin, the NCI domain of alpha3 chain of type IV collagen, is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 333. № 2. P. 292-298.

185. Maeshima Y., Colorado P.C., Kalluri R. Two RGD-independent alphavbeta3 integrin binding sites on tumstatin regulate distinct antitumor properties // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 31. P. 23745-23750.

186. Maeshima Y., Colorado P.C., Torre A. Distinct antitumor properties of a type IV collagen domain derived from basement membrane // Biol. Chem. 2000. V. 275. № 28. P. 21340-21348.

187. Maeshima Y., Yerramalla U.L., Dhanabal M., Holthaus K.A., Barbashov S., Kharbanda. S., Reimer C., Manfredi M., Dickerson W.M., Kalluri R. Extracellular matrix-derived peptide binds to avh3 integrin and inhibits angiogenesis // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 34. P. 31959-31968.

188. Walker J.R., Altman R.K., Warren J.W, Altman E. Using protein-based motifs to stabilize peptides // J. Peptide. Res. 2003. V. 62. P. 214-226.

189. Esipov R.S., Stepanenko V.N., Beyrakhova K.A., Muravjeva T.I., Miroshnikov A.I. Production of thymosin alpha 1 via non-enzymatic acetylation of the recombinant precursor // Biotechnol. Appl. Biochem. 2010. V. 56. № 1. P. 1725.

190. Eikesdal H.P., Sugimoto H., Birrane G., Maeshima Y., Cooke V.G., Kieran M., Kalluri R. Identification of amino acids essential for the antiangiogenic activity of tumstatin and its use in combination antitumor activity // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105. № 39. P. 15040-15045.

191. Tombran-Tink J., Chader G.G., Johnson L.V. PEDF: a pigment epithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity // Exp. Eye Res. 1991. V. 53. №3. P. 411-414.

192. Filleur S., Nelius T., de Riese W., Kennedy R.C. Characterization of PEDF: a multi-functional serpin family protein // J. Cell. Biochem. 2009. V. 106. № 5. P. 769-775.

193. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P., Crawford S.E., Xu H., Benedict W., Bouck N.P. Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis // Science. 1999. V. 285. № 5425. P. 245-248.

194. Zhang S.X., Wang J.J., Gao G., Parke K., Ma J.X. Pigment epithelium-derived factor downregulates vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and inhibits VEGF-VEGF receptor 2 binding in diabetic retinopathy // J. Mol. Endocrinol. 2006. V. 37. № 1. P. 1-12.

195. Fong B.A., Wu W.Y., Wood D.W. The potential role of self-cleaving purification tags in commercial-scale processes //Trends Biotechnol. 2010 V. 28. № 5. P. 272-279.

196. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G.E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2006, V. 48. № 1. P. 1-13.

197. Esipov R.S., Stepanenko V.N., Gurevich A.I., Chupova L.A., Miroshnikov A.I. Production and purification of recombinant human glucagon overexpressed as intein fusion protein in Escherichia coli // Protein Pept. Lett. 2006. V. 13. №4. P. 343-347.

198. Esipov R.S., Stepanenko V.N., Chupova L.A., Boyarskikh U.A., Filipenko M.L., Miroshnikov A.I. Production of recombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system // Protein Expr. Purif. 2008. V. 61. № l.P. 1-6.

199. Stepannenko V.N., Esipov R.S., Gurevich A.I., Chupova L.A., Miroshnikov A.I. Recombinant oxyntomodulin// Bioorg. Khim. 2007. V. 33. № 2. P. 245-250.

200. Мирошников А.И., Лихванцева В.Г., Степанова Е.В., Арутюнян Е.В., Осипов Р.А., Бейрахова К.А., Степаненко В.Н., Белоус О.В. // Офтальмохирургия. 2011. № 1. С. 76-82.

201. O'Connel К., Edidin М. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells // J. Immunol. 1990. V. 144. № 2. P. 521-525.

202. Apte R.S., Barreiro R.A., Duh E., Volpert O., Ferguson T.A. Stimulation of neovascularization by the anti-angiogenic factor PEDF // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V. 45. № 12. P. 4491^1497.

203. Montezuma S.R., Vawas D., Miller J.W. Review of the ocular angiogenesis animal models // Semin. Ophthalmol. 2009. V. 24. № 2. P. 52-61.

204. Gunda V., Wang S., Sheibani N., Sudhakar, A. Inhibitory Effect of Tumstatin on Corneal Neovascularization Both In-vitro and In-vivo // J. Clinic. Experiment. Ophthalmol. 2011. V.2. P. 132.

205. Rosenfeld P.J., Brown D.M., Heier J.S., Boyer D.S., Kaiser P.K., Chung C.Y., Kim R.Y., MARINA Study Group. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. 2006. V. 355. № 14. P. 14191431.

206. Schaal S., Kaplan H., Tezel T. Is there tachyphylaxis to intravitreal anti-vascular endothelial growth factor pharmacotherapy in age-related macular degeneration? // Ophthalmology. 2008. V. 115. № 12. P. 2199-2205.

207. Bradley J., Ju M., Robinson G.S. Combination therapy for the treatment of ocular neovascularization // Angiogenesis. 2007. V. 10. № 2. P. 141-148.

208. Saint-Geniez M., Maharaj A.S., Walshe Т.Е., Tucker B.A., Sekiyama E., Kurihara Т., Darland D.C., Young M.J., D'Amore P.A. Endogenous VEGF is required for visual function: evidence for a survival role on miiller cells and photoreceptors // PLoS One. 2008. V. 3. № 11. p. e3554.

209. Brar V.S., Sharma R.K., Murthy R.K., Chalam K.V. Bevacizumab neutralizes the protective effect of vascular endothelial growth factor on retinal ganglion cells // Mol Vis. 2010. V. 16. P. 1848-1853.

Благодарности

Автор благодарен академику А.И. Мирошникову за внимание к работе и ценные консультации, коллегам и соавторам Т.И. Муравьёвой, JI.A. Чуповой, В.Н. Степаненко, Ю.А. Абрамчик, М.А. Костроминой, К.В. Антонову. Выражаю признательность ведущему научному сотруднику Института Экспериментальной Диагностики и Терапии Опухолей, д.м.н. Е.В. Степановой за помощь в проведении экспериментов, обсуждении результатов и подготовке публикаций. Особую благодарность выражаю моим научным руководителям P.C. Есипову и В.Г. Лихванцевой за поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы.