Реконструированные липопротеины плазмы крови: Получение, структура, свойства, применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Мишарин, Александр Юрьевич

• Мишарин, Александр Юрьевич
• доктор биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации доктор биологических наук Мишарин, Александр Юрьевич

1. ВВЕДЕНИЕ. 4 1.1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. МЕТАБОЛИЗМ ЛВП В ПЛАЗМЕ КРОВИ.

2.1.1. МЕТАБОЛИЗМ "НАСЦЕНТНЫХ" ЛВП; РОЛЬ ЛХАТ И СЕТР.

2.1.2. МЕТАБОЛИЗМ ГЛОБУЛЯРНЫХ ЛВП; РОЛЬ ЛИПАЗ.

2.1.3. КАТАБОЛИЗМ ЛВП.

2.2. СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОСНОВНЫХ БЕЛКОВ ЛВП.

2.2.1. «ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ» УЧАСТКИ АПО А1.

2.2.2. СРАВНЕНИЕ АПО А1 И АПО А

2.2.3. ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ АПО А1 С ФОСФОЛИПИДАМИ

И МОДИФИКАЦИЯ ЛВП.

2.2.4. РАЗЛИЧИЯ ПОДФРАКЦИЙ ЛВП.

2.3. ЛВП И ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРИНА.

2.3.1. ЛВП И ОБМЕН ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ СОСУДОВ.

2.3.2. ПОСТУПЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ.

2.3.3. РЕГУЛЯЦИЯ БАЛАНСА ХОЛЕСТЕРИНА В ГЕПАТОЦИТЕ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. ОБЩИЕ МЕТОДЫ.

3.2.2. СИНТЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.2.2.1. ПАРАМАГНИТНЫЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТКИ И

ЗОНДЫ.

3.2.2.2. Зр-ЗАМЕЩЕННЫЕ СТЕРИНЫ.

3.2.2.3. РАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫЕ С ТЕРИНЫ.

3.2.2.4. ПОЛУЧЕНИЕ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ С ИПОЛЪЗОВАНИЕМ НОВОЙ МЕТОДИКИ АЦИЛИРОВАНИЯ.

3.2.3. ПРЕПАРАТИВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.2.3.1. АПОЛИПОПРОТЕИНЫ, ЛИПИДЫ И ЛИПОПРОТЕИНЫ.

3.2.3.2. КОМПЛЕКСЫ АПОЛИПОПРОТЕИНОВ С ФОСФАТИДИЛХОЛИНОМ.

3.2.4. ПРОЧИЕ МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ГИДРОФОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

В МОЛЕКУЛЕ ДЕЛИПИДИРОВАННОГО АПОЛИПОПРОТЕИНА А1.

4.1.1.ВЛИЯНИЕ 2-ХЛОРЭТАНОЛА НА СПЕКТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ АПО А1 И АМФИФИЛЬНОГО

ПЕПТИДА LAP

4.1.2. ВЛИЯНИЕ 2-ХЛОРЭТАНОЛА НА СТРУКТУРУ СПИН-МЕЧЕНОГО АПОА1.

4.2. ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ АПО А1 - ФОСФАТИДИЛХОЛИН.

4.2.1. АГРЕГАЦИЯ DMPC В ВОДНОМ 2-ХЛОРЭТАНОЛЕ.

4.2.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ DMPC С ПЕПТИДОМ LAP-20 В ПРИСУТСТВИИ 2-ХЛОРЭТАНОЛА.

4.2.3. ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА АПО А1 - DMPC В СМЕСИ 2-ХЛОРЭТАНОЛ - ВОДА.

4.2.4. ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ АПО А1 С ФОСФАТИДИЛ-ХОЛИНОМ. ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ЛИПИДА И УСЛОВИЙ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ.

4.2.5. КОМПЛЕКСЫ DMPC С АМФИФИЛЬНЫМИ ПЕПТИДАМИ И МОДИФИЦИРОВАННЫМ АПО А1.

4.2.6. ФОСФОЛИПИДНЫЕ МИЦЕЛЛЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА

АПО ЛВП-СЕФАРОЗЕ.

4.3. СТРУКТУРА МИЦЕЛЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ АПО А1-ФОСФАТИДИЛХОЛИН.

4.3.1. ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА АПО А1 В СОСТАВЕ ДИСКООБРАЗНОЙ МИЦЕЛЛЫ.

4.3.2. КОНФОРМАЦИЯ АПО А1 В СОСТАВЕ "БОЛЬШИХ" И "МАЛЫХ-ДИСКООБРАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ. ОБСУЖДЕНИЕ МОДЕЛЕЙ.

4.3.3. РЕКОМБИНАЦИЯ КОМПЛЕКСОВ АПО А1 - ФОСФАТИДИЛХОЛИН. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ.

4.3.4. РЕКОМБИНАЦИЯ КОМПЛЕКСОВ АПО А1 - ФОСФАТИДИЛХОЛИН. КИНЕТИКА ОБМЕНА ФОСФАТИДИЛХОЛИНА.

4.4. ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ И МОДЕЛЬНЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ НА ЛИПИДНЫЙ СПЕКТР ПЛАЗМЫ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СО СТЕРИНАМИ.

4.4.1. ВНУТРИВЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ АПО А1-ЯФХ. ВЛИЯНИЕ НА ЛИПИДНЫЙ И ЛИПОПРОТЕИНОВЫЙ СОСТАВ

6. 7.

ПЛАЗМЫ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ.

4.4.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АПО ЛВП-ФХ- СЕФАРОЗЫ С ПЛАЗМОЙ

КРОВИ in vitro.

4.4.3. ВКЛЮЧЕНИЕ СТЕРИНОВ В КОМПЛЕКС АПО А1-ФОСФАТИДИЛХОЛИН И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С КОМПОНЕНТАМИ ПЛАЗМЫ.

4.4.4. ПОЛУЧЕНИЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ДИСПЕРСИЙ ХОЛЕСТЕРИЛОВЫХ ЭФИРОВ С ФОСФАТИДИЛХОЛИНОМ И МОДИФИКАЦИЯ ЛНП И ЛВП ХОЛЕСТЕРИЛОВЫМИ ЭФИРАМИ.

4.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНЫХ И МОДЕЛЬНЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ С КЛЕТКАМИ В КУЛЬТУРЕ, УЧАСТИЕ В ОБМЕНЕ ХОЛЕСТЕРИНА И СВЯЗЬ С РЕГУЛЯЦИЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ.

4.5.1. ОБМЕН ХОЛЕСТЕРИНА МЕ>ЦЦУ КОМПЛЕКСОМ АПО А1-ФОСФАТИДИЛХОЛИН И КЛЕТКАМИ В КУЛЬТУРЕ.

4.5.2. ВЛИЯНИЕ ЛХАТ НА ОБМЕН ХОЛЕСТЕРИНА МЕЖДУ КЛЕТКАМИ

И СРЕДОЙ.

4.5.3. ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ ХОЛЕСТЕРИЛОВЫХ ЭФИРОВ КЛЕТКАМИ HEPG2.

4.5.4. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОКСИСТЕРИНАМИ МЕТАБОЛИЗМА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ И ВЛИЯНИЕ ОКСИСТЕРИНОВ НА БАЛАНС ХОЛЕСТЕРИНА В ОРГАНИЗМЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Реконструированные липопротеины плазмы крови: Получение, структура, свойства, применение»

Важнейшим фактором риска для развития сердечно-сосудистых патологий является высокий уровень холестерина в плазме крови. Исследования, проведенные в 80-е годы, главной целью которых была разработка методов снижения концентрации холестерина в плазме и, особенно, концентрации холестерина во фракции липопротеинов низкой плотности (ЛНП), продемонстрировали, что гиполипидемическая терапия у пациентов с вьюоким риском атеросклероза приводит к замедлению развития болезни, а в некоторых случаях к регрессии атеросклероза. В тех же исследованиях было установлено, что снижение уровня холестерина в плазме крови обычно вызывает достоверное повышение концентрации липопротеинов высокой плотности (ЛВП) и концентрации холестерина во фракции ЛВП [1,2].Использование гипохолестеринимических препаратов: гемфиброзила, ловастатина, правастатина, симвастатина, безафибрата, ниацина [3-9] приводило не только к снижению уровня холестерина ЛНП у больных с гиперхолестеринимией, но и к статистически достоверному повышению уровня холестерина ЛВП. Комбинация ловастатина и секвестрантов желчных кислот снижала частоту прогрессии коронарных поражений и сокращала число сердечно-сосудистых проявлений у мужчин с повышенным уровнем аполипопротеина В, а также вызывала значительное повышение уровня холестерина ЛВП [10]. При лечении прогрессирующего атеросклероза коронарных артерий ниацином и секвестрантами желчных кислот в сочетании со сбалансированной диетой было отмечено значительное увеличение уровня ЛВП и уровня холестерина ЛВП [11,12].Сниженный уровень холестерина во фракции ЛВП при повышенном или нормальном уровне общего холестерина рассматривается как независимый рискфактор сердечно-сосудистых патологий. У мужчин с нормальным уровнем общего холестерина, перенесших инфаркт миокарда, уровень ЛВП был достоверно снижен [13]. Статистически достоверная обратная корреляция между уровнем холестерина ЛВП и степенью атеросклеретического поражения аорты и коронарных артерий была установлена в результате постмортального комплексного исследования мужчин, погибших в результате несчастных случаев [14].Уровень холестерина ЛВП повышается при употреблении в пищу полиненасыщенных жиров [15,16] и умеренном потреблении алкоголя [17,18], статистически достоверно снижен у курящих [14,19,20]. Причинами этих изменений являются эффекты диеты, алкоголя и курения на активность ферментов гепатической липазы (HL), лецитин:холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ) и транспортных белков плазмы (СЕТР), участвующих в метаболизме ЛВП и транспорте холестерина (см. литературный обзор). Уровень холестерина во фракции ЛВП коррелирует с содержанием аполипопротеина А1 ( ano А 1 , основного белкового компонента ЛВП), а отношение ало А1 / ало В в плазме крови человека может служить характеристикой предрасположенности к атеросклерозу [21,22].Генетические исследования, проводимые на мышах разных линий показали, что линии, способные к развитию экспериментального атеросклероза имеют уровень ЛВП ниже, чем линии, резистентные к атерогенной диете [23]. Исследования семей, характеризующихся наследственным низким уровнем холестерина ЛВП дали основание заключить, что вклад генетической предрасположенности составляет 3550% [24,25]. Среди лиц с наследственным низким уровнем ЛВП очень высок процент проявления коронарного атеросклероза [26], однако молекулярные дефекты, ответственные за это, в настоящее время не установлены. Наследственный дефицит ano A l , вызываемый нарушениями в структуре гена [27,28], приводит к снижению ЛХАТ-активности и нарушениям в уровне липидов в плазме человека, ксантоматозам, атеросклерозу коронарных артерий [29], а также сопровождается изменениями структурных характеристик ЛВП [30].ЛВП представляют собой фракцию плазмы крови с плотностью 1.063 г/мл 1.210 г/мл. Белки - аполипопротеины (ano А 1 , ano А2, ano А4, ano E, ano C1, ano C2, ano C3, ano D) составляют около половины массы ЛВП, вторая половина - липиды (фосфолипиды, холестерин, холестериновые эфиры, триглицериды). ЛВП, выделенные из плазмы ультрацентрифугированием или хроматографией, представляют собой, в основном, сферические глобулярные частицы. Липидный и белковый состав ЛВП плазмы крови человека варьирует в достаточно широких пределах в зависимости от диеты, физической нагрузки, потребления лекарств. ЛВП плазмы крови человека представляют собой смесь подфракций, различающихся по скорости флотации и гидратированной плотности при ультрацентрифугировании, а также по размеру и электрофоретической подвижности. В кровяном русле ЛВП метаболизируют, вступая в обменные процессы с компонентами других липопротеинов и клеточных мембран, что вызывает изменения состава, структуры, размеров и устойчивости частиц ЛВП. Рассчитанное среднее время жизни ЛВП в плазме крови человека составляет 48 ч, однако ни один из компонентов не может являться «маркером» скорости катаболизма частицы ЛВП из-за высокой скорости обменных процессов в плазме. Наличие в плазме крови всего набора частиц (от "насцентных" предшественников до "зрелых" частиц) объясняет наблюдаемую гетерогенность ЛВП, а протекающие обменные процессы вносят дополнительную сложность в исследования их структуры, метаболизма и физиологической роли.В настоящее время высокий уровень ЛВП рассматривается не только как антириск-фактор развития гиперхолестеринимий и атеросклероза, но и как важнейший компонент всей системы липидного обмена в организме. Другими словами, поставлен вопрос о прямом влиянии ЛВП на улучшения состояния сердечно-сосудистой системы и возможном терапевтическом эффекте ЛВП [31].Участие ЛВП в процессах липидного обмена хорошо документировано (см. литературный обзор) и не вызывает сомнения, однако на основании имеющихся в литературе данных невозможно предсказать результаты, к которым может привести изменение концентрации ЛВП (или основных компонентов - аполипопротеина А1 и фосфатидилхолина) в плазме. Кроме того, экспериментальные подходы, позволяющие добиться значительных изменений концентрации ЛВП (и ano A l ) в плазме, в настоящее время не разработаны.В Кардиологическом Научном Центре (ныне - Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс) в течение многих лет проводятся исследования молекулярных и клеточных основ патогенеза атеросклероза. В рамках этой комплексной программы изучаются структура и функции липопротеинов плазмы крови, а также молекулярные основы участия липопротеинов в процессах липидного обмена. Данная работа посвящена моделированию структуры и функций ЛВП. Основная рабочая гипотеза состояла в том, что при помощи искусственных ЛВП комплексов аполипопротеинов с фосфатидилхолином можно добиться стимулирования обратного транспорта холестерина - комплексного процесса, снижающего концентрацию холестерина в периферических тканях и направляющего холестерин в клетки печени для окисления в желчные кислоты и выведения из организма.Цель данной работы - создание искусственных аналогов ЛВП, исследование участия природных и модельных липопротеинов в отдельных этапах липидного метаболизма и транспорта, а таюке их использование для направленного влияния на липидный обмен в культивируемых клетках и коррекции липидного и липопротеинового состава плазмы in vitro.Настоящая работа планировалась и выполнялась как биохимическое исследование. Основным методологическим подходом являлось моделирование структуры липопротеинов и липидно-белковых взаимодействий в составе липопротеинов при помощи комплексов аполипопротеина А1 и индивидуальных липидов. Эксперименты с использованием клеточных культур и опыты на животных проводились совместно с сотрудниками Института Экспериментальной Кардиологии РКНПК, Института Фармакологии Университета М. Лютера (Халле, Германия) и Лаборатории Транспорта Липидов (INSERM U-130, Марсель, Франция).В результате выполнения данной работы были решены следующие основные задачи; 1. Выяснено участие внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий в организации третичной структуры аполипопротеинов и во взаимодействии с фосфолипидами.2. Предложен и разработан новый подход к получению смешанных мицелл аполипопротеин-фосфатидилхолин (метод совместной агрегации компонентов в присутствии органических растворителей) 3. Разработана структурная модель двухкомпонентной мицеллы ano А 1 фосфатидилхолин, учитывающая гибкость полипептидной цепи аполипопротеина и кооперативность белок-липидных взаимодействий.4. Проведен химический синтез новых соединений, использованных в структурных и кинетических исследованиях природных и модельных липопротеинов, в том числе липидов, содержащих флуоресцентные, парамагнитные и радиоактивные метки, а также стеринов, регулирующих метаболизм холестерина в клетках печени.5. С использованием модельных липопротеинов проведены кинетические исследования обмена холестерина и фосфолипидов в плазме крови человека (in vitro), показана возможность направленного изменения липидного и липопротеинового состава плазмы при помощи комплексов ano ЛВП фосфатидилхолин, иммобилизованных на водонерастворимом носителе.6. Исследованы механизмы обмена холестерина между клетками в культуре и модельными ЛВП. Изучена стимуляция выхода холестерина из клеточной мембраны под действием мицеллярных комплексов ano А1 - фосфатидилхолин.Выяснена роль "специфического" связывания липопротеина с клеткой, концентрации фосфатидилхолина в среде и активности ЛХАТ плазмы в этом процессе.7. Исследованы процессы интернализации холестериновых эфиров клетками гепатомы человека линии Hep G2 в составе липопротеинов и липидных дисперсий. Показано, что рецептор-независимый эндоцитоз холестериловых эфиров клетками печени является важным путем выведения холестерина из кровотока.Для решения поставленных задач были разработаны новые методические подходы, позволяющие оценить: гибкость полипептидной цепи аполипопротеина ano А1 , адсорбцию амфифильных молекул на поверхности липидных мицелл, структурные и динамические характеристики смешанных мицелл ano А 1 фосфатидилхолин, динамические свойства липидов в составе мицелл, иммобилизованных на водонерастворимом носителе, интернализацию неполярных липидов клетками в культуре. В работе также использованы традиционные методы классической и клеточной биохимии, химии природных соединений, спектроскопии и химической кинетики.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мишарин, Александр Юрьевич

6. выводы

1. На основании проведенных исследований конформации апо А1 и агрегации фосфатидилхолина в водных растворах 2-хлорэтанола разработан новый подход к получению аполипопротеин-фосфолипидных мицелл - метод совместной агрегации компонентов в присутствии органического растворителя. С использованием данного метода получены комплексы аполипопротеинов ЛВП, нативного и модифицированного аполипопротеина А1, амфифильных пептидов с фосфатидилхолинами, различающиеся размером и стехиометрическим составом, а также фосфолипидные мицеллы, иммобилизованные на водонерастворимом носителе.

2. Разработана структурная модель мицеллярного комплекса аполипопротеин А1 -фосфатидилхолин, учитывающая гибкость полипептидной цепи и поверхностно-активные свойства аполипопротеина, а также кооперативность липидно-белковых взаимодействий в составе двухкомпонентной мицеллы.

3. Исследован обмен фосфолипидов и холестерина между клетками в культуре и природными и модельными липопротеинами, а также между компонентами плазмы крови при введении комплексов аполипопротеин А1-фосфатидилхолин. Показано, что комплексы аполипопротеин - фосфатидилхолин снижают уровень холестерина в клетке пропорционально концентрации фосфатидилхолина в среде в обменном процессе, подчиняющемся кинетике обратимой реакции 1-го порядка, не требующем "специфического" взаимодействия липопротеина или комплекса с клеточной мембраной, и, независимом от активности ЛХАТ.

4. Изучен "неспецифический" эндоцитоз холестериловых эфиров клетками гепатомы Hep G2. Доказано, что "неспецифическая" интернализация холестериловых эфиров не связана с регуляцией внутриклеточного метаболизма холестерина в клетках Hep G2. С использованием новых синтетических окстеринов показана принципиальная возможность изменить распределение холестерина между метаболическими пулами в клетках печени и повлиять на баланс холестерина в организме, в частности, на уровень холестерина и липопротеинов в плазме крови.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование структуры, функций липопротеинов плазмы крови, липидно-белковых взаимодействий в составе частицы ЛВП и участие липопротеинов в метаболизме и транспорте холестерина является одной из составных частей изучения общих механизмов липидного обмена и молекулярных основ дислипидемий. Данную работу условно можно разделить на две части: (1) моделирование структуры липопротеинов (главы 1-3); (2) изучение роли липопротеинов в транспорте липидов (главы 4 и 5).

К началу 80-х годов были полностью охарактеризованы основные классы липопротеинов плазмы крови, установлена первичная структура всех основных аполипопротеинов, сформулированы общие принципы липидно-белковых взаимодействий и в мире резко увеличилось количество исследований, посвященных моделированию структуры и функции липопротеинов. Одним из таких исследований является данная работа.

В качестве основной модели был выбран комплекс аполипопротеина А1 с фосфатидилхолином. Интуитивно нам казалось наиболее важным для описания и моделирования липидно-белковых взаимодействий в липопротеинах выяснить общие физические явления, лежащие в основе комплексообразования. Важным результатом данной работы является доказательство, что комплексообразование амфифильного пептида с фосфатидилхолином представляет собой адсорбцию амфифильной молекулы на поверхности мицеллы. Поскольку полипептидная цепь апо А1 в основном состоит из амфифильных участков равной длины (22 а.о.), близкой гидрофобности и имеющих небольшие различия в значении <ц.Н>, идея о существовании специфических "якорных" участков или специфических "функциональных детерминант" в составе апо А1 нас не привлекала. Мы, напротив, считали, что все известные свойства аполипопротеин-фосфолипидного комплекса зависят от гибкости полипептидной цепи аполипопротеина и кооперативности липидно-белковых взаимодействий. Проведенные в работе эксперименты (главы 1 и 2) продемонстрировали, что получение смешанных полипептид-фосфолипидных комплексов и описание их характеристик может быть проведено без привлечения данных о первичной последовательности определенных пептидных фрагментов. Необходимо отметить, что исследования липидно-белковых взаимодействий, проведенные с использованием моноклональных антител против различных участков апо А1 или рекомбинантных полипептидов, полученных методом направленного мутагенеза (работы 90-х годов, цитированные в литературном обзоре) не дали принципиально новой информации, хотя и подтвердили данные более ранних экспериментов и расчетов.

Логическим продолжением изучения комплексообразования апо А1 с фосфатидилхолином явилась разработка новой структурной модели духкомпонентной мицеллы апо А1 - фосфатидилхолин (глава 3). В основу модели легло представление, что роль аполипопротеина сводится к стабилизации боковой поверхности фосфолипидной мицеллы, причем гибкость полипептидной цепи аполипопротеина дает возможность одной молекуле белка стабилизировать различную площадь на границе раздела мицелла/вода. При этом количество молекул фосфолипида в мицелле определяет количество амфифильных фрагментов полипептидной цепи, контактирующих с липидом, а остальные амфифильные фрагменты аполипопротеина образуют гидрофобную белковую складку, что приводит к утолщению белкового слоя на боковой поверхности дискообразной мицеллы. Проведенные кинетические эксперименты по обмену липидов между мицеллами подтверждают справедливость предложенной модели и свидетельствуют о том, что скорость рекомбинации мицелл определяется скоростью переноса фосфатидилхолина, и что процессы рекомбинации происходят кооперативно.

Мицеллярные комплексы апо А1 при добавлении в плазму крови или к клеткам в культуре способны вызвать значительные изменения в распределении липидов между компонентами системы, в частности существенно снизить концентрацию холестерина в клетке в обменном процессе, подчиняющемся кинетике обратимой реакции 1-го порядка. Проведенные в данной работе эксперименты показали, что массоперенос холестерина в мицеллу аполипопротеин-фосфолипидного комплекса зависит только от концентрации фосфатидилхолина в комплексе, а возможные специфические взаимодействия аполипопротеина с другими компонентами исследуемой системы неспособны существенно повлиять на массоперенос холестерина или изменить кинетические характеристики обменного процесса. Результаты эксперимента in vivo по внутривенному введению комплексов апо А1-фосфатидилхолин кроликам в процессе развития экспериментальной гиперхолестеринимии находятся в разумном соответствии с результатами кинетических экспериментов по обмену холестерина in vitro и в культуре клеток.

В настоящее время не вызывает сомнения, что массоперенос холестерина в кровотоке представляет собой круговой процесс, имеющий только один регулируемый "узел" - печень, а поступление холестерина из периферических тканей в кровоток представляет собой равновесный обмен. Поскольку по принципу микроскопической обратимости в круговом процессе невозможно накопление промежуточного продукта, очевидно, что введение в кровоток ЛВП-подобных частиц или экстракорпоральное взаимодействие плазмы с апо ЛВП-ФХ-сефарозой должно быть скомпенсировано за счет стимулирования поступления дополнительной массы холестерина из периферических тканей. Увеличение концентрации ЛВП-подобных частиц (комплексов аполипопротеина и фосфолипида) в плазме вызывает сдвиг равновесия и стимулирует выход холестерина из клеток периферических тканей, что экспериментально продемонстрировано в настоящей работе.

Разумеется, наиболее привлекательным подходом к снижению холестерина в кровотоке может быть воздействие на печень, позволяющее изменить соотношение массы холестерина, секретируемого печенью в кровоток или в желчь. В последней главе данной диссертации приведены данные о том, что клетки гепатомы Hep G2 способны захватывать значительные количества холестериловых эфиров эндоцитозом и метаболизировать холестерин, образовавшийся в результате внутриклеточного расщепления эфира. Очень важно, что холестерин, поступающий в гепатоцит этим путем, не участвует в регуляции HMG СоА редуктазы и ЛНП-рецептора, а оксистерины, ингибирующие биосинтез холестерина, или соединения, регулирующие активность ЛНП-рецептора не влияют на неспецифичесое поступление холестериловых эфиров в клетку печени. Сравнение интернализации клетками Hep G2 холестериловых эфиров в составе ЛВП, ЛНП и липидных дисперсий дают основание предполагать, что масса холестериловых эфиров, поступающих в печень in vivo, мало зависит от белкового компонента липидной частицы. Следовательно, разумно полагать, что увеличение в плазме крови ЛВП-подобных частиц не может существенно влиять на поступление холестерина и холестериловых эфиров в гепатоцит и на баланс внутриклеточного холестерина в гепатоците.

Метаболизм и баланс внутриклеточного холестерина определяется уровнем эндогенных оксистеринов (принцип Кандуча и Чена) и может регулироваться введением экзогенного оксистерина. В главе 5 продемонстрировано, что синтетические оксистерины способны регулировать баланс холестерина в клетках Hep G2, влияя на биосинтез холестерина и холестериловых эфиров, интернализацию холестериловых эфиров ЛНП и сродство 25-гидроксихолестерина (а, возможно, и эндогенных оксистеринов) к цитозольным белкам. Полученные результаты доказывают, что наблюдаемые эффекты оксистеринов не связаны с их участием в регуляции баланса внутриклеточного холестерина по известному принципу обратной связи и позволяют надеяться, что продолжение исследований в этом направлении приведет к созданию новых регуляторов метаболизма холестерина в печени, способных существенно влиять на холестериновый обмен в организме.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Мишарин, Александр Юрьевич, 2001 год

1. The Expert Panel: Report of the National Cholesterol Education Program (1988). Expertpanel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults. Arch. Intern. Med., 148; 36-39.

2. Castelli W.P. Reversing the Course of Atherosclerosis A View from Framingham. Upjohn Co. Kalamazoo, Ml, 1989.

3. Averna M.R., Barbagallo C.M., Pata G. et al. (1991). Effects of two different administration regiments of gemfibrozil on plasma lipids, lipoproteins and apoproteins. Curr. Ther. Res., 49; 47-53.

4. Vega G.L., Grundy S.M. (1990). Primary hypertriglyceidemia with borderline high cholesterol and elevated apolipoprotein В concentrations. Comparison of gemfibrozil vs lovastatin therapy. JAMA., 264; 2759-2763.

5. Hunninghake D.B., Mellies M.J., Goldberg A.C. et al. (1990). Efficiacy and safety of pravastatin in patients with primary hypercholesterolemia.il. Once-daily versus twice-daily dosing. Atherosclerosis, 85; 219-227.

6. Nakandakare E., Garcia R.C., Rocha J.C., Sperotto G., Oliveira HCF., Quintao E.C.R. (1990). Effects of simvastatin, bezafibrate and gemfibrosil on the quantity and composition of plasma lipoproteins. Atherosclerosis, 85; 211-217.

7. Arntz H.-R., Bonner G., Kikis D. et al. (1991). Efficacy of pravastatin and bezafibrate in primary hypercholesterolaemia. Deutch. Med. Wochenschr., 116; 7-12.

8. Blankenhom D.M., Nessim S.A., Johnson R.L. et al. (1987). Benefitial effects of combined cholestipol-niacin therapy of coronary atherosclerosis and coronary venous by pass grafts. JAMA, 257;. 3233-3240.

9. Kane J.P., Malloy M.J., Ports T.A., Phillips N.R., Diehl J.C., Havel R.J. (1990). Regression of coronary atherosclerosis during treatment of familial hypercholesterolemia with combined drug regiments. JAMA, 264, 3007-3012.

10. Sewdarsen M., Desai R.K., Vythilingum S., Shah N., Rajput M.C. (1991). Serum lipoproteins in young normocholesterolaemic, non diabetic Indian men with miocardial infarction. Postgrad. Med. J., 67; 159-164.

11. McGill H.C. (1990). Relationship of atherosclerosis in young men to serum lipoprotein cholesterol concentration and smoking. A preliminary report from PDAY research group. JAMA, 264; 3018-3024.

12. Phosphatidylcholine. H. Peters ed., Springer, Berlin, 1976.

13. Phosphatidylcholine (polyenephosphatidylcholine/PPC): Effects on Cell Membrane and Tansport of Cholesterol. A.I. Archakov and K.-J. Gundermann eds., WBN Verlag, Bingen/Rhein, FRG, 1989.

14. Van To! A., Scheek L.M., Groener G.E.M. (1991). Net mass transfer of cholesteryl esters from LDL to HDL in plasma from normolipidemic subjects. Arterioscl. Tromb., 11; 55-63.

15. Muscat J.E., Harris R.E., Haley N.J., WynderE.L. (1991). Cigarette smoking and plasma cholesterol. Am. Heart J., 121; 141-147.

16. Moriguchi E.H., Fusegawa Y., Tamachi H., Goto Y. (1990). Effects of smoking on HDL subfraction in miocardial infarction patients: effects on lecithin: cholesterol acyltransferase and hepatic lipase. Clin. Chim. Acta, 195; 139-143.

17. Assman G. (1989) in: Prevention of Coronary Heart Desease in 1990s: Focus on HDL (Symposium Proceedings: held 2-4 June 1989, Munich, Germany).

18. Assmann G., Shulte H. (1993) Lipid Metabolism Disorders and Coronary Heart Desease. G. Assmann ed., MMV Medizin Verlag. 1993. P. 19-67.

19. Lusis A. J., Taylor B.A., Wengenstein R.W. (1983). Genetic control of lipid transport in mice. II. Genes controlling structure of HDL. J. Biol. Chem., 258; 5071-5078.

20. De Backer G., Hulstaerdt F., De Munck D., Rossenue M., Van Parijs L., Dramaix M. (1986). Serum lipids and apoproteins in students whose parents suffered prematurely from myocardial infarction. Am. Heart J., 112; 478-484.

21. Ordovas J.M., Cassidy D.K., Civeira F., Bisgaier C.L., Schaefer E.J. (1989). Familial apolipoprotein A1, С III, A IV deficiency and premature atherosclerosis due to deletion of a gene complex on chromosome 11. J. Biol. Chem., 264; 16339-16342.

22. Assmann G., von Eckardstein A., Funke H. (1993). High density lipoproteins, reverse transport of cholesterol and coronary artery desease. Circulation, 87 (III); 28-34.

23. Gordon D.J., Rifkind B.M. (1989) High-density lipoproteins the clinical implication of recent studies. N. Engl. J. Med., 321; 1311-1316.

24. Eisenberg S. (1984). High density lipoprotein metabolism. J. Lipid Res., 25; 1017-1058.

25. Steinberg D. (1978). The rediscovery of high density lipoprotein: a negative rise factor in atherosclerosis. Eur. J. Clin. Invest., 8; 107-109.

26. Alpers D.H., Lock D.R., Lancaster N., Poksay K., Schonfeld G. (1985). Distribution ofapolipoproteins A1 and В among intestinal lipoproteins. J. Lipid Res., 26; 1-10.

27. Zannis V.I., Karathanasis S.K., Keutmann H.T., Goldberger G., Breslow J.L. (1983).1.tracellular and extracellular processing of human apo A1. Secreted apo A1 isoprotein 2 is a propeptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 2574-2578.

28. McCall M.R., Forte T.M., Shore V.G. (1988). Heterogeneity of nascent high densitylipoproteins secreted by the hepatoma-derived cell line, Hep G2. J Lipid Res., 29; 11271137.

29. Forte T.M., McCall M.R., Knowles B.B., Shore V.G. (1989). Isolation and characterizationof lipoproteins produced by human hepatoma-derived cell lines other than HepG2. J Lipid Res., 30., 817-829.39