Роль динеин-динактинового комплекса в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Жаппарова, Ольга Наилевна

• Жаппарова, Ольга Наилевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жаппарова, Ольга Наилевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Строение микротрубочек.

Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам.

Структура динеин-динактинового комплекса.

Участие динеин-динактинового комплекса во внутриклеточном транспорте.

Взаимодействие динеин-динактинового комплекса с микротрубочками.

Организация микротрубочек в клетке.16.

Нуклеация миктротрубочек на центросоме.

Участие динеина в процессах нуклеации микротрубочек.

Заякоривание микротрубочек на центросоме.

Участие динеин-динактинового комплекса в заякоривании микротрубочек на центросоме.

Роль протеинкиназ в регуляции организации микротрубочек.

Строение и функции протеинкиназы LOSK.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Молекулярное клонирование.

RT-PCR.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг.

Экспрессия в бактериях и аффинная очистка белка.

Соосаждение с микротрубочками.

Сборка микротрубочек на центросомах in vitro.

Киназная реакция in vitro.

Получение поликлональной сыворотки.39.

Антитела.

Культивирование клеток.

Микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Полученные в работе ДНК-конструкты.

Оценка степени радиальности микротрубочек.

Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность

Микроскопия, РЕЗУЛЬТАТЫ.

Полученные в работе ДНК-конструкты.

Оценка степени радиальности микротрубочек.

Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.

Нокдаун протеинкиназы LOSK приводит к хаотизации системы микротрубочек, уменьшению содержания динактина на центросоме и нарушению поляризации аппарата Гольджи на краю раны в монослое.

Субъединица динактинового комплекса белок pl50Glued является субстратом фосфорилирования LOSK (Thr 145-147) in vitro.

Фосфорилирование динактина по П1Г145.147 способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек.

Белок pl50Glued экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной МТ-связывающего участка. Изоформы pl50Glued по-разному взаимодействуют с микротрубочками: pl50Glued-lA, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная pl50Glued-lB - локализуется на «плюс»-концах микротрубочек.

Белок р150С1ие(1тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ. Изоформа pl50Glued-lA доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетах; изоформа pl50GIued-lB экспрессируется повсеместно.

Экспрессия изоформы pl50Glucd-lA в культивируемых клетках увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и этот белок преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ:.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Жаппарова, Ольга Наилевна

1. Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.2. Подавление экспрессии протеинкиназы LOSK приводит к уменьшению содержания динактина на центросоме, нарушению удержания микротрубочек на центросоме и к хаотизации системы микротрубочек клетки.3. Субъединица динактинового комплекса белок pl50G l u e d является субстратом фосфорилирования протеинкиназой LOSK in vitro. Сайт фосфорилирования представляет собой три следующих друг за другом остатка треонина (145-147). Фосфорилирование р150 и е по этим положениям способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек в клетке.4. Белок pl50G l u e d тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной участка связывания микротрубочек. Изоформа pl50G l u e d-lA доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетках; изоформа pl50G l u e d-lB экспрессируется повсеместно.5. Изоформы р150 и е по-разному взаимодействуют с микротрубочками: pl50 G u e -1А, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная pl50G l u e d-lB - локализуется на плюс-концах микротрубочек.6. Экспрессия в культивируемых клетках изоформы pl50 G u e -1А увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и эта изоформа преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.