Роль E3 убиквитин-лигазы Hyd в клетках зародышевой линии Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Галимова Юлия Александровна

• Галимова Юлия Александровна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Галимова Юлия Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Протеостаз и UPS

1.2. Убиквитинирование и роль Е3 убиквитин-лигаз

1.2.1. Классификация Е3 убиквитин-лигаз

1.3. Роль UPS в регуляции процессов созревания зародышевых клеток

1.3.1. Сперматогенез дрозофилы

1.3.2. Регуляция сперматогенеза посредством UPS

1.3.3. Оогенез дрозофилы

1.3.4. Регуляция оогенеза посредством UPS

1.4. Hyd - уникальный член семейства E3 лигаз

1.4.1. Hyd в тканях дрозофилы

1.4.2. Протеолитические функции Hyd

1.4.3. Непротеолитические функции Hyd

1.4.4. Роль Hyd в онкологических заболеваниях человека

1.5. Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Линии дрозофилы, использованные в работе

2.2. Определение нуклеотидной последовательности мутаций hyd

2.2.1. Выделение геномной ДНК дрозофилы

2.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.3. Очистка продуктов ПЦР

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности (по Сэнгеру)

2.3. Определение уровня экспрессии мРНК гена hyd методом обратной транскрипции с последующей ПЦР в режиме реального времени

2.3.1. Выделение тотальной РНК

2.3.2. Обратная транскрипция

2.3.3. Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

2.4. Выделение плазмидной ДНК клона FI24602

2.5. Гидролиз эндонуклеазами рестрикции

2.6. Лигирование ДНК

2.7. Трансформация клеток Е.еоН

2.8. Трансформация клеток зародышевого пути D.melanogaster

2.9. Окраска семенников и яичников D.melanogaster при помощи DAPI

2.10. Окраска семенников и яичников D.melanogaster антителами

2.11. Окрашивание яичников D.melanogaster с помощью LysoTracker

2.12. Окраска семенников MitoTrackerRed

2.13. Электронная микроскопия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Описание гена hyd и его мутаций

3.2. Оценка влияния мутаций hyd на уровень экспрессии hyd мРНК в семенниках и яичниках D. melanogaster

3.3. Влияние мутаций в гене hydна сперматогенез D. melanogaster

3.3.1. Цитологический анализ нарушений сперматогенеза

3.3.2. Ультраструктурный анализ нарушений сперматогенеза с помощью электронной микроскопии

3.4. Влияние мутаций hydна оогенез D. melanogaster

3.5. Эктопическое подавление экспрессии гена hyd с помощью РНК- интерференции

3.5.1. Анализ нарушений сперматогенеза при эктопическом подавлении экспрессии гена hyd

3.5.2. Анализ нарушений оогенеза при эктопическом подавлении экспрессии гена hyd

3.5.2.1. Ранняя гибель зародышевых клеток в яичниках nanos-GAL4ÍUAS-hyd-RNA

3.5.2.2. Гибель зародышевых клеток в среднем оогенезе у самок озкаг-GAL4ÍUAS-hyd-RNAi

СО17

3.6. Ультраструктурный анализ яичников oskar-GAL4ÍUAS-hyd-RNAi и hya /hyd с помощью электронной микроскопии

3.7. Анализ влияния РНК-интерференции генов, участвующих в системе убиквитинирования, на развитие клеток зародышевой линии D.melanogaster

3.8. Спасение мутантного фенотипа с помощью экспрессии полноразмерного белка Иуа

3.9. Влияние эктопической экспрессии гена hyd на развитие клеток зародышевого пути

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

114

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ALP - (Autophagy-Lysosome Pathway) аутофагосомно-лизосомный путь

DABCO - 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан

DAPI - 4',6'-диамидино-2-фенилиндол

IAP - (Inhibitor of Apoptosis Proteins) ингибитор апоптоза

Lys - лизин

PBS - (Phosphate buffered saline) фосфатно-солевой буфер UAS - Upstream Activated Sequence Ub - убиквитин

UPS - (Ubiquitin-Proteasome System) убиквитин-протеасомная система

а.к. - аминокислота

дцРНК - двуцепочечная РНК

кДНК - комплиментарная ДНК

КЗЛ - клетки зародышевой линии

мРНК - матричная РНК

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Регулируемая деградация белков является одним из ключевых механизмов поддержания протеостаза в клетке. Вместе с системами, контролирующими синтез и укладку, регулируемая деградация белка позволяет избежать накопления неправильно свернутых или дефектных белков, а также является механизмом контроля уровней функциональных белков, регулируя тем самым различные клеточные процессы: клеточный цикл, передачу сигнала, реакцию на повреждение ДНК, метаболизм, контроль транскрипции и апоптоз. Убиквитин-протеасомная система, или UPS (Ubiquitin - Proteasome System), является частью регулируемой деградации и отвечает за протеолиз короткоживущих, неправильно свернутых или поврежденных одиночных белков. Основой функционирования этой системы является реакция убиквитинирования, которая представляет собой ковалентное присоединении молекул убиквитина к белку-субстрату, что является сигналом для последующего расщепления белка протеасомой.

В системе UPS Е3 убиквитин-лигазы отвечают за специфичность выбора субстрата, к которому ковалентно присоединяют убиквитин. В последние годы возрос интерес к изучению Е3 убиквитин-лигаз в качестве потенциальных мишеней для терапии многих болезней, включая рак. Одним из интересных представителей семейства Е3 убиквитин-лигаз является HECT-убиквитин-лигаза UBR5, известная также как EDD (E3 identified by Differential Display). Изначально UBR5 был идентифицирован в клетках рака молочной железы при скрининге генов, регулируемых прогестином [ Callaghan et. al., 1998]. В дальнейшем оказалось, что амплификация UBR5 характерна для многих видов рака [Clancy et. al., 2003], но механизм, посредством которого этот белок вносит вклад в инициацию и прогрессию опухолей, остается невыясненным.

Белок UBR5 имеет близкого ортолога у дрозофилы - белок Hyd (Hyperplastic discs). В первых работах было показано, что в процессе развития дрозофилы hyd играет роль в контроле пролиферации соматических клеток, и на этом основании его отнесли к супрессорам опухолевого роста [Martin et. al., 1977; Mansfield et al., 1994].

Изучение мутаций гена hyd в соматических тканях дрозофилы выявило интересную особенность этого онкосупрессора. Оказалось, что при сильных мутациях

мухи умирают на личиночной стадии или на ранней стадии куколки, а имагинальные диски меньше по размеру или отсутствуют совсем. При слабых мутациях, наоборот, чаще встречаются разросшиеся диски, а особи доживают до поздних стадий куколки или до взрослого состояния. Причем в одной личинке могут встречаться как разросшиеся, так и редуцированные диски [Mansfield et al., 1994]. Функции Hyd в зародышевой ткани практически не изучены. В единственной работе на эту тему было показано, что в гене hyd приводят к аномалиям развития зародышевых тканей и стерильности [Mansfield et al., 1994].

Исследования показали, что Hyd, за счет своих протеолитических и регуляторных функций, вовлечен в различные сигнальные пути, контролирующие рост и развитие. Но в каких именно процессах развития клеток зародышевой линии задействован hyd остается неизвестным.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выявить роль E3 убиквитин-лигазы Hyd в клетках зародышевой линии Drosophila melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать молекулярную природу мутаций аллелей hyd15 и hydC017.

15 ~£2017

2. Исследовать влияние мутаций hyd , hyd~ на деление и морфогенез клеток зародышевого пути в сперматогенезе и оогенезе D.melanogaster.

3. При помощи РНК-интерференции провести эктопическое подавление экспрессии гена hyd в соматических и зародышевых клетках семенников и яичников на разных стадиях гонадогенеза, выявить ткани и стадии, чувствительные к недостатку белка Hyd.

4. С помощью трансгенной конструкции, позволяющей экспрессировать полноразмерную копию гена hyd, исследовать влияние его эктопической экспрессии на развитие клеток зародышевой линии D.melanogaster.

Научная новизна

В данной работе мы впервые определили молекулярную природу мутации hyd15 и показали, что она, как и мутация hyd017 приводит к снижению экспрессии мРНК гена hyd. Впервые описаны неизвестные прежде функции белка Hyd в гонадогенезе

дрозофилы. Показано, что в оогенезе Hyd необходим для поддержания жизнеспособности зародышевых клеток и регуляции их митотических делений, а в сперматогенезе, напротив, мутации Hyd не приводят к избыточной пролиферации зародышевых клеток, а влияют на мейоз и дифференцировку сперматид. Показано, что избыток белка Hyd не влияет на развитие зародышевых клеток.

Практическая значимость

Изучение компонентов UPS и, в частности, E3 лигаз, часто невозможно по причине летальности мутантных особей в эмбриогенезе. Благодаря большому набору генетических инструментов, разработанных для дрозофилы, использование ее в качестве модельного объекта позволяет изучать функции генов в различных тканях и на разных стадиях, что особенно актуально для изучения Е3 лигаз, так как набор субстратов для них может отличаться в зависимости от контекста. Поскольку белок Hyd является высококонсервативным, то результаты, полученные в данной работе на дрозофиле, помогут в понимании механизмов функционирования его ортолога у млекопитающих -UBR5, являющегося частой причиной рака, а также способствуют лучшему пониманию особенностей убиквитиновой системы в различных тканях.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутация hyd15 вызвана заменой 1545 нуклеотида (G^A) (NCBI Reference Sequence: NM_079572.4 Reference Release 6.32), что приводит к образованию преждевременного СТОП-кодона и формированию усеченной формы белка, содержащей только убиквитин-связывающий домен UBA. Показано, что мутации

15 ~£2017

hyd и hya вызывают снижение экспрессии мРНК гена hyd, что приводит к возникновению мутантного фенотипа.

15 ~£2017

2. В сперматогенезе дрозофилы эффекты мутаций hyd и hya затрагивают все события и структуры, обеспечивающие деление клеток (формирование центросом, веретена деления, конденсацию и расхождение хромосом, цитокинез), а также вызывают нарушения дифференцировки сперматид. В сперматогенезе мутации hyd15 и hyd0017 не приводят к избыточной пролиферации клеток зародышевого пути и особенность гена как супрессора опухоли здесь не проявляется.

3. В оогенезе дрозофилы белок Hyd необходим для поддержания жизнеспособности клеток зародышевой линии, его недостаток вызывает масштабную гибель яйцевых камер и деградацию яичников. В отличие от сперматогенеза, в оогенезе дрозофилы белок Hyd участвует в регуляции пролиферации клеток зародышевого пути. Подавление экспрессии гена hyd в гермарии приводит к дополнительным раундам митоза зародышевых клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль E3 убиквитин-лигазы Hyd в клетках зародышевой линии Drosophila melanogaster»

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: 12th International Multiconference "Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology", Novosibirsk, Russia, 2020; Беляевские чтения. Международной конференции, посвященная 100-летию со дня рождения академика АН СССР Д.К. Беляева. Новосибирск, 2017; II международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии», Одесса, Украина, 2010.

Публикации

По результатам работы опубликованы следующие статьи в рецензируемых журналах:

1. Галимова Ю.А., Дорогова Н.В., Федорова С.А. Функции Е3-убиквитин-лигазы HYD в тканях дрозофилы // Молекулярная биология. - 2021. - том 55. - № 3. - с. 355-361.

2. Dorogova N.V., Galimova Y.A., Bolobolova E.U., Baricheva E.M., Fedorova S.A. Loss of Drosophila E3 ubiquitin ligase Hyd promotes extra mitosis in germline cysts and massive cell death during oogenesis // Front Cell Dev Biol. - 2020. - V. 8:600868.

3. Pertceva J. A. (Galimova), Dorogova N. V., Bolobolova E.U., Nerusheva O.O., Fedorova S. A. and Leonid Omelyanchuk L.V. The role of Drosophila hyperplastic discs gene in spermatogenesis // Cell Biol. Int. - 2010. - V. 34. - № 10. - Р. 991-996.

Материалы конференций

1. Galimova Iu., Dorogova N., Fedorova S. Functional roles of the E3 ubiquitin ligase Hyd in Drosophila tissues. Тезисы 12-й Международной мультиконференции

«Биоинформатика регуляции и структуры генома/Системная биология» (BGRSÍSB-2020), Новосибирск, Россия. С. 28-29.

2. Галимова Ю.А., Дорогова Н.В., Федорова С.А. Изучение функций опухолевого супрессора Иуд в клетках зародышевой линии D. melanogaster. Беляевские чтения. Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АН СССР Д.К. Беляева. Новосибирск, 2017. с. 98.

3. Дорогова Н.В., Перцева Ю.А. (Галимова Ю. А), Болоболова Е.У., Омельянчук Л.В. Роль супрессора опухоли Иуд в клетках зародышевого пути Drosophila melanogaster. Материалы конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» Одесса - 2010. С. 45-47.

Вклад автора

Основные результаты получены и проанализированы автором самостоятельно. Цитологический анализ нарушений сперматогенеза и оогенеза дрозофилы проводился совместно с к.б.н. Дороговой Н.В. и к.б.н. Федоровой С.А. Электронная микроскопия гонад выполнена к.б.н. Болоболовой Е.У.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах текста и состоит из введения, обзора научной литературы, описания использованных материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 211 наименований, и приложения. Работа включает в себя 6 таблиц и 28 рисунков.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность за помощь и огромный вклад в выполнение данной работы к.б.н. Федоровой С.А. и к.б.н. Дороговой Н.В., а также д.б.н. Омельянчуку Л.В., под чьим руководством начиналась эта работа. Я очень признательна к.б.н. Пиндюрину А.В. за ценные консультации и всестороннюю помощь в проведении данной работы. Огромная благодарность всем сотрудникам лаборатории клеточного деления ИМКБ СО РАН за помощь в экспериментальной работе и дружескую поддержку.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Протеостаз и убиквитин-протеасомная система

Протеомы эукариотических клеток представляют собой совокупность огромного количества белков: от ~ 6000 различных белков в клетках дрожжей [Picotti et al., 2013] до ~ 10000 белков в клетках человека [Kulak et al., 2017], причем протеомный состав варьируется в зависимости от типа клеток и тканей. Белки также сильно различаются по своему количеству: для некоторых факторов транскрипции это менее 50 копий на клетку, а для молекул гистонов и цитоскелетных или рибосомных белков - более 10 миллионов [Ghaemmaghami et al., 2003; Geiger et al., 2012]. Большинство белков сворачиваются в четко определенные трехмерные структуры и должны оставаться свернутыми на протяжении всей своей жизни, чтобы выполнять свои биологические функции. Более того, необходимо тщательно контролировать количество каждого из тысяч различных белков в клетке. Это состояние сбалансированного протеома называется белковым гомеостазом или протеостазом. Поддержание сбалансированного протеома требует, чтобы клетки координировали функции трех взаимосвязанных ветвей сети протеостаза: (1) синтез белка, (2) укладку белка и поддержание его конформации и (3) деградацию. Сеть протеостаза служит для гарантии того, что правильно свернутые белки образуются в нужное время, в нужном месте клетки и в нужном количестве. Понимание организации и регуляции этой сети в ответ на внешние и эндогенные стимулы имеет фундаментальное значение в биологии и медицине, поскольку неспособность поддерживать протеостаз связана со старением и многочисленными дегенеративными заболеваниями [Taylor and Dillin, 2011; Labbadia and Morimoto, 2015].

Изначально предполагалось, что процесс укладки белков происходит спонтанно, но теперь известно, что для эффективного сворачивания многих белков, особенно тех, которые имеют более сложную структуру и / или содержат несколько доменов, требуются молекулярные шапероны. Молекулярный шаперон определяют как любой фактор, который взаимодействует и помогает в сворачивании или сборке другого белка, не являясь частью его окончательной структуры [Hartl, 1996]. Шапероны действуют во время и после трансляции, предотвращая (или обращая вспять) неправильную укладку и агрегацию посредством АТФ-зависимых и независимых механизмов связывания и

высвобождения белков [Kim et al., 2013; Balchin et al., 2016; Carra et al., 2017], либо направляя их на переработку посредством аутофагии или деградацию в UPS в случае невозможности формирования правильной конфигурации [Arndt et al., 2007].

Помимо контролируемого синтеза и укладки, регулируемая деградация белка также позволяет избежать накопления неправильно свернутых или дефектных белков, а также является механизмом контроля количества функциональных белков, регулируя тем самым различные клеточные процессы. Белки расщепляются двумя основными протеолитическими путями: убиквитин-протеасомной системой (UPS - Ubiquitin-Proteasome System) и аутофагосомно-лизосомным путем (ALP - Autophagy-Lysosome Pathway) [Ciechanover, 2017; Dikic, 2017]. Вместе эти механизмы предотвращают накопление белковых агрегатов, которые потенциально токсичны. В обеих протеолитических системах молекулярные шапероны участвуют в распознавании неправильно свернутых видов белков и помогают поддерживать их в компетентном к деградации состоянии [Arndt et al., 2007; Shiber et al., 2014]. UPS является основным протеолитическим путем для короткоживущих, неправильно свернутых и поврежденных одиночных белков, способных проникать в узкий канал протеасомы. Этот путь выполняет важные функции в регуляции передачи сигналов и транскрипции клеток и участвует во множестве клеточных процессов, включая развитие клеточного цикла, пролиферацию, апоптоз и другие важные клеточные пути [Mocciaro and Rape, 2012; Liu et al, 2007; Orlowski, 1999; Boutillier et al, 1999; Daulny and Tansey, 2009; Strous and Govers, 1999; Rahimi, 2012]. ALP распознает и удаляет более крупные и потенциально опасные клеточные компоненты, такие как белковые агрегаты, нефункциональные или избыточные органеллы, патогены. ALP стал важным адаптивным механизмом для борьбы с различными клеточными стрессами (недостаток питательных веществ, гипоксия, окислительный стресс и т.д.) [Lamb et al., 2013; Dikic, 2017]. Фундаментальная важность обеих систем деградации была подтверждена двумя Нобелевскими премиями: в 2004 году Нобелевская премия по химии была присуждена совместно Аарону Цихановеру, Авраму Хершко и Ирвину Роузу за открытие деградации белка, опосредованной убиквитином (Ub), а в 2016 году Ёсинори Осуми получил Нобелевскую премию по медицине и физиологии за свои новаторские исследования аутофагии.

Важно отметить, что все системы, участвующие в поддержании протеостаза,

взаимосвязаны и взаимодействуют друг с другом с помощью различных механизмов [Ji and Kwon, 2017; Pohl and Dikic, 2019].

1.2. Убиквитинирование и роль Е3 убиквитин-лигаз

Убиквитинирование - одна из самых частых посттрансляционных модификаций белков, контролирующая практически все клеточные процессы. Убиквитинирование используется в качестве сигнала для маркировки грузов и в убиквитин-протеасомной, и в лизосомной системах деградации. Суть этой модификации состоит в ковалентном присоединении молекул убиквитина к белку-субстрату. Убиквитин (Ub) - небольшой высококонсервативный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков. Ub присутствует во всех клетках (отсюда и название: англ. ubiquitous - присутствующий везде). Существуют разные типы убиквитиновых модификаций (Рисунок 1): моноубиквитинирование - присоединение одной молекулы убиквитина к белку путем ковалентного связывания с остатком лизина (Lys) в молекуле субстрата; мультиубиквитинирование (или множественное моноубиквитинирование) -одновременное присоединение убиквитина к нескольким остаткам Lys белка-субстрата; полиубиквитинирование - формирование поли-Ub цепи, состоящей из нескольких молекул убиквитина, связанных между собой посредством специфических остатков лизина и глицина (Рисунок 1).

иь **

С вШ

Моно- Мульти-

убиквитинирование убиквитинирование

Рисунок 1. Виды убиквитинирования.

До недавнего времени считалось, что функция иЬ заключается лишь в формировании поли-иЬ цепей, которые в убиквитин-протеасомной системе служат

сигналом для протеасомной деградации белка [Finley, 2009]. Однако впоследствии оказалось, что убиквитин не только регулирует деградацию белков посредством UPS, но и выполняет множество непротеолитических регуляторных функций. Различные виды убиквитиновых модификаций представляют собой различные сигналы, которые запускают широкий спектр биологических реакций. Этот «язык» посттрансляционных модификаций получил название «убиквитиновый код» [Komander and Rape, 2012]. Убиквитинирование изменяет поверхность белка-субстрата, что влияет на его активность, стабильность, способность взаимодействовать с другими белками, а также на его внутриклеточную локализацию [Schnell and Hicke, 2003; Mukhopadhyay and Riezman, 2007]. Моноубиквитинирование или мультиубиквитинирование необходимы для попадания определенных белков в везикулы на разных стадиях секреторно-эндоцитозного пути. В этом случае убиквитин выступает в роли регулируемого сортировочного сигнала [Hicke, 2001]. А в случае полиубиквитинирования различная топология поли-Ub-цепей приводит к связыванию со специфическими белками-адапторами, что, в свою очередь, имеет различные последствия. Возможны по меньшей мере восемь различных типов связей между мономерами убиквитина. Семь из них образуются за счет внутренних остатков лизина в структуре убиквитина, а восьмой осуществляется через N-концевой остаток метионина [Kirisako et al., 2006]. К примеру, связывание через Lys48 используется главным образом для направления белка на деградацию, а связывание через Lys63 играет важную роль в репарации ДНК, воспалительной реакции, эндоцитозе и синтезе белка на рибосомах [Pickart and Fushman, 2004].

Связывание убиквитина с белками-субстратами осуществляется путем трех последовательных ферментативных реакций (Рисунок 2). Сначала убиквитин-активирующий фермент E1 АТР-зависимо активирует убиквитин с формированием высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле Е1. Затем активированный убиквитин переносится на специфический остаток цистеина убиквитинсвязывающего фермента Е2 с формированием сходной тиоэфирной связи. На третьем этапе убиквитин-лигаза E3 взаимодействует одновременно с Е2, благодаря Е2-связывающему домену, и с белком-субстратом, благодаря субстратсвязывающему домену. Убиквитин-лигаза Е3 осуществляет перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат с формированием

изопептидной связи между е-аминогруппой субстрата и С-концевой карбоксильной группой убиквитина [Bemassola а/., 2008]. Именно на этом этапе происходит распознавание специфичного субстрата, сайта и типа убиквитиновой модификации, поэтому убиквитин-лигазы Е3 играют ключевую роль в каскаде реакций убиквитинирования.

Рисунок 2. Каскад энзиматических реакций по присоединению убиквитина.

(Из https://commons.wikimedia.org/wikiMle:UЫqшtylation.svg с модификациями. Объяснение в тексте).

1.2.1. Классификация Е3 лигаз

Чтобы использовать весь функциональный потенциал убиквитинирования, в эукариотических клетках существуют сотни Е3 убиквитин-лигаз, которые содержат несколько основных типов каталитических доменов и разнообразные субстратсвязывающие домены и регуляторные элементы. Это свойство позволяет Е3 убиквитин-лигазам функционировать в разных клеточных контекстах, отвечать на

различные клеточные сигналы и стимулировать процессинг разнообразных белковых субстратов. И если ферментов Е1 в геноме человека найдено всего два, а убиквитинсвязывающих ферментов Е2 - около сорока, то Е3 лигаз - уже около 1000 [Zheng and Shabek, 2017]. В зависимости от структуры Е2-связывающего домена их делят на три основных класса: RING (Really Interesting New Gene)/U-box, HECT (Homologous to E6AP C-Terminus) и RBR (RING between RING) [Sun, 2006]. Каждый из этих классов имеет свой особый белоксвязывающий домен (RING-finger или HECT) для связывания с Е2 и различные домены для взаимодействия с субстратами.

RING-домен устроен по типу цинковых пальцев, он осуществляет перенос убиквитина от Е2 на субстрат за один шаг. Это самое большое семейство Е3 убиквитин-лигаз. У человека насчитывается около 600 представителей данного семейства [Deshaies and Joazeiro, 2009]. Среди них есть белки, осуществляющие свои функции как самостоятельно (например, IAP - inhibitor of apoptosis, предотвращающий апоптоз; Mdm2, катализирующий убиквитинирование p53), так и в составе мультибелковых комплексов (таких как SCF - Skp-Cullin-F-box и APC/C - anaphase-promoting complex/cyclosome), мишенями которых служат циклины и секурины - ингибиторы анафазы [Deshaies, 1999; Yang et al., 2000; Fang et al., 2000; Chang and Barford, 2014].

Второй класс Е3 лигаз - HECT-лигазы - характеризуется наличием С-концевого домена из ~350 аминокислотных остатков, содержащего активный сайт -консервативный остаток цистеина, с помощью которого образуется временная тиоэфирная связь с убиквитином, а затем его перенос на остаток лизина в молекуле целевого белка [Scheffner et al., 1995]. В геноме человека обнаружено около 50 генов белков этого семейства. К этому классу относятся белки E6-AP, Huwel и Nedd4.

Е3 лигазы третьего класса - RBR - совмещают в себе черты двух первых классов, так как имеют два RING-домена, один из которых функционирует как каркас, а другой содержит каталитический остаток цистеина, образующий промежуточную связь с убиквитином. У человека известно 14 Е3 лигаз класса RBR, из которых наиболее изучен Parkin [Wenzel et al., 2011].

1.3. Роль UPS в регуляции процессов созревания зародышевых

клеток

1.3.1. Сперматогенез дрозофилы

Сперматогенез - сложный и строго регулируемый процесс. В ходе сперматогенеза стволовые клетки преобразуются в зрелые спермии, претерпевая серию специфических изменений: митотическую пролиферацию, дифференцировку в сперматоциты и два мейотических деления с образованием гаплоидных сперматид, которые проходят окончательный морфогенез, чтобы произвести зрелые сперматозоиды.

Зрелые семенники дрозофилы содержат от 5 до 8 апикальных стволовых клеток, каждая из которых делится таким образом, что одна дочерняя клетка продолжает функционировать в качестве стволовой клетки, в то время как другая становится первичной гониальной клеткой [Lindsley and Tokuyasu , 1978] (Рисунок 3). Гониальная клетка претерпевает 4 митотических деления. Цитокинез в ходе этих митозов неполный, поэтому образуются цитоплазматические межклеточные связи (кольцевые каналы), которые сохраняются в ходе всего сперматогенеза. Итогом 4-х гониальных делений являются 16 взаимосвязанных первичных сперматоцитов. Первичные сперматоциты на стадии роста увеличиваются в объеме в 30 раз, при этом они смещаются в середину семенника [Lindsley and Tokuyasu, 1978].

а б в где

Ж 3 и

Рисунок 3. Схема развития клеток зародышевой линии самцов ЗтоъорЫЫ melanogaster. (а) стволовая клетка зародышевой линии; (б) первичная гониальная клетка; (в) вторичные сперматогонии; (г) полярный первичный сперматоцит; (д) аполярный первичный сперматоцит; (е) вторичные сперматоциты: (ж) сперматиды на стадии луковицы; (з) сперматиды на стадии элонгации; (и) зрелые сперматиды после стадии индивидуализации.

Развитие сперматоцитов завершается 2-мя быстрыми мейотическими делениями, в результате которых образуются 64 сперматиды. Цитокинез в мейозе самцов также неполный, поэтому все сперматиды в цисте остаются связанными кольцевыми каналами. Митохондрии во время мейоза собираются вокруг веретена деления в его экваториальной области и во время цитокинеза распределяются примерно поровну между дочерними клетками [Lindsley and Tokuyasu, 1978].

Далее следует ряд морфологических изменений, объединенных общим названием «спермиогенез». Митохондрии мигрируют из бывшей экваториальной области к той стороне ядра, где находится центриоль. Далее митохондрии соединяются вместе, образуя один или несколько агломератов, которые частично окружают ядро. Уплотнение митохондрий и слияние их мембран продолжается до тех пор, пока не образуются 2 гигантские митохондрии, которые очень плотно упакованы в сферу. Эта структура называется небенкерн (nebenkern - «находящийся около ядра» в переводе с немецкого), а данная стадия развития сперматиды - стадией луковицы, так как плотно прилегающие друг к другу слои мембран в небенкерне на срезе напоминают луковицу. В это же время центриоль превращается в базальное тельце, из которого начинает свое происхождение аксонема.

После этого начинается процесс элонгации, сперматиды удлиняются, небенкерн вытягивается в двураздельную уплощенную структуру, которая тянется вдоль всей сперматиды, одновременно происходит рост аксонемы. Хроматиновый материал конденсируется, ядро уменьшается в объеме, вытягивается (Рисунок 3).

Далее следует процесс индивидуализации (Рисунок 4), в ходе которого образуются отдельные спермии. Он начинается с того, что на базальном конце цисты вокруг ядер формируются конусовидные структуры, богатые фибриллярным актином. Эти структуры входят в состав индивидуализационного комплекса, который движется вдоль длинной оси цисты от базального конца, где расположены ядра, до апикального. Вокруг индивидуализационного комплекса в цисте образуется утолщение, «cystic bulge», диаметр которого постепенно увеличивается за счёт излишков цитоплазмы, мембран и прочих органелл, которые в его составе продвигаются к апикальному концу цисты. Когда индивидуализационный комплекс достигает конца цисты, утолщение, в котором он находится, вместе с содержащимися в нём цитоплазмой и деградирующими

органеллами превращается в «waste-bag», или «мусорный мешок», который удаляется из цисты [Lindsley and Tokuyasu, 1978].

индивидуализационный комплекс

апикалънъш конец

оболочка цисты направление индивидуализации

Рисунок 4. Схема индивидуализации сперматид.

1.3.2. Регуляция сперматогенеза посредством UPS

Большую роль в сперматогенезее играют ремоделирование белковых комплексов и быстрый обмен белков, как в развивающихся половых клетках, так и в клетках семенного эпителия. Исследование убиквитинирования белков в тканях крысы показало, что уровень убиквитинирования в семенниках приблизительно в три раза выше, чем во всех остальных исследованных органах [Rajapurohitam et al., 2002]. Этот факт говорит о том, что процесс сперматогенеза в большой степени зависит от регуляции функций и стабильности белков посредством убиквитинирования. Нарушения в работе UPS-ассоциированных генов коррелируют с возникновением стерильности у самцов, что также свидетельствует о критически важной роли UPS в нормальном развитии и функционировании клеток зародышевой линии [Manku et al., 2012]. Более того, в семенниках был обнаружен особый тканеспецифичный тип протеасомы. На данный момент описано всего три тканеспецифичных 20S-субъединицы эукариотической протеасомы: это иммунопротеасома, тимопротеасома и сперматопротеасома [Kniepert and Groettrup, 2014]. Считается, что эти тканеспецифичные версии протеасом более эффективно обеспечивают деградацию белковых субстратов, вовлеченных в уникальные функции этих тканей. В семенниках млекопитающих коровая 20S протеасома содержит альтернативную а4 субъединицу - a4s/PSMA8 [Skerget et al., 2013; Qian et al., 2013].

Хотя а4 субъединица и не обладает протеолитической активностью, она взаимодействует с регуляторными частицами, обеспечивающими специфичность взаимодействия с субстратом. Так, в семенниках млекопитающих высоко экспрессируется регуляторная частица РА200 [Ustrell et al., 2002; Qian et al., 2013]. Предполагается, что субъединица a4s/PSMA8 присоединяет частицу РА200 более эффективно, чем обычная а4-субъединица. В процессе элонгации сперматид в семенниках млекопитающих коровые гистоны вначале подвергаются ацетилированию, затем ацетилированные гистоны распознаются частицей PA200, соединенной с протеасомой, что приводит к их диссоциации из нуклеосом, деградации и постепенному замещению протаминами [Kniepert and Grorttrup, 2014; Qian et al., 2013]. Ацетилирование гистонов также происходит в местах двуцепочечных разрывов ДНК. С участием РА200-содержащих протеасом происходит деградация ацетилированных гистонов, чтобы белки репарации ДНК могли проникнуть к поврежденным участкам. Таким образом, РА200 вызывает опосредованную ацетилированием деградацию коровых гистонов, обеспечивая тем самым механизмы, с помощью которых ацетилирование регулирует деградацию гистонов, репарацию ДНК и сперматогенез. Еще одним примером специфической функции сперматопротеасомы является ее участие в реакции капацитации и проникновении сперматозойда в яйцеклетку [Sutovsky, 2011].

Очевидно, что помимо широко распространенных основных функций, убиквитиновая система имеет специализированные функции в сперматогенезе. Это хорошо видно на примере мутаций генов USP9Y и HR6B у человека и мыши соответственно. Оба этих гена кодируют белки, которые принимают участие в системе убиквитина и повсеместно экспрессируются, но их мутации не вызывают какого-либо фенотипа, кроме мужского бесплодия. Ген USP9Y кодирует убиквитиновую протеазу, способную высвобождать убиквитин из поли-(иЪ) цепи. Его мутация приводит к аресту сперматогенеза на стадии сперматоцитов с небольшим количеством постмейотических зародышевых клеток [Sun et al., 1999]. Ген HR6B является гомологом дрожжевого RAD6, также называемого UBC2, и кодирует E2 связывающий фермент. Нокаут этого гена вызывает схожие дефекты мейоза и постмейотического развития, но основные нарушения происходят на стадии конденсации ядра в сперматидах [Roest et al., 1996; Grootegoed et al., 1998].

Анализ экспрессии предполагаемых Е3 убиквитин-лигаз у мышей, основанный на данных, полученных с помощью микрочипов, показал, что большинство предполагаемых E3 лигаз экспрессируются в семенниках (340 из 398, найденных в результате анализа), а количество E3 лигаз, высоко экспрессирующихся или специфичных для семенников (73 из 340), было намного выше, чем в других тканях, таких как печень, легкие и мышцы. Анализ экспрессии E3 лигаз по стадиям сперматогенеза мышей указывает на то, что большая часть специфичных для семенников E3 лигаз экспрессируются в сперматоцитах и сперматидах. Поскольку сперматоциты подвергаются мейозу, а сперматиды проходят через ряд уникальных преобразований, таких как формирование акросом, замещение гистонов, образование жгутиков и удаление большей части цитоплазмы, естественно, что этим клеткам требуется много тканеспецифичных E3 лигаз, чтобы катализировать обмен белков [Hou et al, 2012].

Как и другие биологические процессы, сперматогенез зависит как от протеолитических, так и от непротеолитических функций убиквитинирования. Как описывалось ранее, ключевую роль в этом процессе играют E3 убиквитин лигазы, определяющие специфичность всего каскада реакций. Рассмотрим примеры, иллюстрирующие участие E3 убиквитин-лигаз в регуляции сперматогенеза на разных этапах.

Мейоз

Во время сперматогенеза сперматогониальные клетки (сперматогонии) делятся с образованием первичных сперматоцитов, которые затем проходят через мейоз I и II с образованием гаплоидных сперматид (Рисунок 3).

Siah1a - это высококонсервативный белок млекопитающих, содержащий домен RING. Siah1a является компонентом лигазы E3, которая контролирует деградацию в-катенина, N-CoR и DCC [Dickins et al., 2002]. Участие Siahla в мейозе зародышевых клеток было продемонстрировано путем разрушения гена Siahla у мышей посредством генного таргетинга. Было обнаружено, что получившиеся мутантные мыши стерильны из-за неспособности половых клеток преодолевать мейоз I, что приводит к потере этих клеток в результате апоптоза [Dickins et al., 2002]. Подобные наблюдения были также

сделаны для мышей с дефицитом гена Itch, у которых была обнаружена недостаточность и/или задержка мейотической прогрессии. Однако фенотип мышей с дефицитом гена Itch не был таким выраженным, как тот, что наблюдался у мышей мутантных по Siahla; мыши с дефицитом гена Itch все еще могли производить зрелые функциональные сперматозоиды, хотя и в значительно меньшем количестве [Dwyer and Richburg, 2012].

Cul4A - это лигаза E3, которая принадлежит к семейству убиквитин-лигаз Cullin, крупнейшему семейству лигаз, обнаруженному у млекопитающих [Sarikas et al., 2011]. Было известно, что Cul4A играет важную роль в процессе репликации ДНК, конденсации хроматина, клеточном цикле и восстановлении ДНК после повреждений, что говорило о том, что он также может играть важную роль в семенниках, особенно во время мейоза. Разными группами исследователей были получены мыши с дефицитом гена Cul4A (Cul4A - / -) [Kopanja et al., 2011; Yin et al., 2011]. Они обнаружили, что самцы таких мышей стерильны. Семенники самцов Cul4A - / - имели значительно меньшую массу и меньшее количество сперматид, сильно деформированных и с очень низкой подвижностью, а также увеличенное количество аномальных многоядерных и апоптотических половых клеток. Первичные сперматоциты этих мышей не преодолевали позднюю профазу I. На стадии пахитены их ДНК подвергалась стойким двуцепочечным разрывам, вероятно, из-за неудачной гомологичной рекомбинации [Kopanja et al., 2011]. Эти исследования выявили роль Cul4A в поддержании сперматогенеза за счет продвижения мейотической дифференцировки половых клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Галимова Юлия Александровна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Базылев С.С., Адашев В.Е., Шацких А.С., Оленина Л.В., Котов А.А.

Соматические клетки цисты как микроокружение для поддержания и дифференцировки терминальных клеток в сперматогенезе Drosophila" // ОНТОГЕНЕЗ. - 2021. - том 52. - № 1. - с. 27-45.

2. Галимова Ю.А., Дорогова Н.В., Федорова С.А. Функции Е3-убиквитин-лигазы HYD в тканях дрозофилы // Молекулярная биология. - 2021. - том 55. - № 3. -с. 355-361.

3. Adrain C., Creagh E.M., Cullen S. P., Martin S.J. Caspase-dependent inactivation of proteasome function during programmed cell death in Drosophila and man // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279. - № 35. - P. 36923-36930.

4. Arama E., Agapite J., Steller H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila // Dev. Cell. - 2003. - V.4. - № 5. - P. -687-697.

5. Arama E., Bader M., Rieckhof G.E., Steller H. A ubiquitin ligase complex regulates caspase activation during sperm differentiation in Drosophila // PLoS Biol. - 2007. -V. 5. - № 10. - P. 2270-2287.

6. Arama E., Bader M., Srivastava M., Bergmann A., Steller H. The two Drosophila cytochrome C proteins can function in both respiration and caspase activation // EMBO J. - 2006. -V. 25. - № 1. - P. 232 - 243.

7. Arndt V., Rogon C., Höhfeld J. To be, or not to be — molecular chaperones in protein degradation // Cell. Mol. Life Sci. - 2007. - V. 64. - № 19-20. - P. 2525-2541.

8. Ayyub C. Cullin-5 and cullin-2 play a role in the development of neuromuscular junction and the female germ line of Drosophila // J. Genet. - 2011. - V. 90. - № 2. -Р. - 239-249.

9. Bader M., Arama E., Steller H. A novel F-box protein is required for caspase activation during cellular remodeling in Drosophila // Development. - 2010. - V. 137. - № 10. - Р. 1679-1688.

10. Badisco L., Van Wielendaele P., Vanden Broeck J. Eat to reproduce: a key role for the insulin signaling pathway in adult insects // Front. Physiol. - 2013. - V. 4. - art. 202.

11. Bakhrat A., Pritchett T., Peretz G., McCall K., Abdu U. Drosophila Chk2 and p53 proteins induce stage-specific cell death independently during oogenesis // Apoptosis. - 2010. - V. 15. - № 12. - P. 1425-1434.

12. Balchin D., Hayer-Hartl M. & Hartl F. U. In vivo aspects of pr otein folding and quality control // Science. - 2016. - V. 353. - № 6294. - aac4354.

13. Barth J.M., Szabad J., Hafen E., Köhler K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis // Cell Death Differ. - 2011. - V. 18. - № 6. - P. 915-924.

14. Barton L.J., Pinto B.S., Wallrath L.L., Geyer P.K. The Drosophila nuclear lamina protein otefin is required for germline stem cell survival // Dev Cell. - 2013. - V. 25. -№ 6. - P. 645-654.

15. Belote J., Zhong L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis // Heredity (Edinb). - 2009. - V. 103. - № 1. - P.23-31.

16. Bergmann A. The role of ubiquitylation for the control of cell death in Drosophila // Cell Death Differ. - 2010. - V. 17. - № 1. - P. 61-67.

17. Bernassola F., Karin M., Aaron Ciechanover A., Melino G. The HECT family of E3 Ubiquitin Ligases: multiple players in cancer development // Cancer Cell. - 2008. - V. 14. - № 1. - P. 10-21.

18. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., Karch F., Basler K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. - V. 104. - № 9. - P. 3312-3317.

19. Bolobolova E. U., Dorogova N. V., and Fedorova S. A. Major scenarios of genetically regulated cell death during oogenesis in Drosophila melanogaster // Rus. J. Genet. -2020. - V. 56. - P. 655-665.

20. Boutillier A.L., Kienlen-Campard P., Loeffler J.P. Depolarization regulates cyclin D1 degradation and neuronal apoptosis: A hypothesis about the role of the ubiquitin/proteasome signalling pathway // Eur. J. Neurosci. - 1999. - V. 11. - № 2. -P. 441-448.

21. Brand A. H., Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes // Development. - 1993. - V.118. - № 2. - P.401-415.

22. Braun A.L., Meghini F., Villa-Fombuena G., Guermont M., Fernandez-Martinez E., Qian Z., Dolores Martín-Bermudo M., González-Reyes A., Glover D.M., Kimata Y. The careful control of Polo kinase by APC/C-Ube2C ensures the intercellular transport of germline centrosomes during Drosophila oogenesis // Open Biol. - 2021. - V. 11. -№ 6. - 200371.

23. Callaghan M.J., Russell A.J., Woollatt E., Sutherland G.R., Sutherland R.L., Watts C.K. Identification of a human HECT family protein with homology to the Drosophila tumor suppressor gene hyperplastic discs // Oncogene. - 1998. - V. 17. - № 26. - P. 3479-3491.

24. Cammarata-Mouchtouris A., Nguyen X.H., Acker A., Bonnay F., Goto A., Orian A., Fauvarque M.O., Boutros M., Reichhart J.M., Matt N. Hyd ubiquitinates the NF-kB co-factor Akirin to operate an effective immune response in Drosophila // PLoS Pathog. - 2020. - V. 16. - № 4. - e1008458.

25. Carra S., Alberti S., Arrigo P.A., Benesch J.L., Benjamin I.J., Boelens W., Bartelt-Kirbach B., Brundel B.J.J.M., Buchner J., Bukau B., Carver J.A., Ecroyd H., Emanuelsson C., Finet S., Golenhofen N., Goloubinoff P., Gusev N., Haslbeck M., Hightower L.E., Kampinga H.H., Klevit R.E., Liberek K., Mchaourab H.S., McMenimen K.A., Poletti A., Quinlan R., Strelkov S.V., Toth M.E., Vierling E., Tanguay R.M. et. al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions // Cell Stress Chaperones. - 2017. - V. 22. - № 4. - P. 601-611.

26. Chai J., Yan N., Huh J.R. et al. Molecular mechanism of Reaper-Grim-Hid-mediated suppression of DIAP1-dependent Dronc ubiquitination // Nat. Struct. Biol. - 2003. - V. 10. - № 11. - P. 892-898.

27. Chang L., Barford D. Insights into the anaphase-promoting complex: a molecular machine that regulates mitosis // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2014. - V. 29. - P. 1-9.

28. Chang Y.J., Pi H., Hsieh C.C., Fuller M.T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development // Dev Biol. - 2013. - V. 383. - № 1. - P. 106-120.

29. Chen D., McKearin D.M. A discrete transcriptional silencer in the bam gene determines asymmetric division of the Drosophila germline stem cell // Development. - 2003. - V. 130. - № 6. - P. 1159-1170.

30. Chen D., Wang Q., Huang H., Xia L., Jiang X., Kan L., Sun Q., Chen D. Effetemediated degradation of Cyclin A is essential for the maintenance of germline stem cells in Drosophila // Development. - 2009. - V. 136. - № 24. - P.4133-4142.

31. Chen H.Y., Sun J.M., Zhang Y., Davie J.R., Meistrich M.L. Ubiquitination of histone H3 in elongating spermatids of rat testes // J Biol Chem. - 1998. - V. 273. - № 21. - P. 13165-13169.

32. Ciechanover A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting // Best Pract. Res. Clin. Haematol. - 2017. - V. 30. - № 4. - P. 341-355.

33. Clancy J.L., Henderson M.J., Russell A.J., Anderson D.W., Bova R.J., Campbell I.G., Choong D.Y., Macdonald G.A., Mann G.J., Nolan T., Brady G., Olopade O.I., Woollatt E., Davies M.J., Segara D., Hacker N.F., Henshall S.M., Sutherland R.L., Watts C.K. EDD, the human orthologue of the hyperplastic discs tumour suppressor gene, is amplified and overexpressed in cancer // Oncogene. - 2003. - V. 22. - № 32. - P. 5070-5081.

34. Daulny A., Tansey W.P. Damage control: DNA repair, transcription, and the ubiquitin-proteasome system // DNA Repair (Amst). - 2009. - V. 8. - № 4. - P. 444448.

35. de Cuevas M., Spradling A.C. Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification // Development. - 1998. - V. 125. - № 15. - P. 2781-2789.

36. de Krester D.M., Kerr J.B. The cytology of testis. In: Knobil E.; Neill J., editors. The physiology of reproduction // New York: Raven Press. - 1994. - P. 1177-1290.

37. Dealy M.J., Nguyen K.V., Lo J., Gstaiger M., Krek W., Elson D., Arbeit J., Kipreos E.T., Johnson R.S. // Nat Genet. - 1999. - V. 23. - № 2. - P. 245-248.

38. Denton D., Aung-Htut M.T., Kumar S. Developmentally programmed cell death in Drosophila // Biochim. Biophys. Acta. - 2013. - V. 1833. - № 12. - P. 3499-3506.

39. Deo R.C., Sonenberg N., Burley S.K. X-ray structure of the human hyperplastic discs protein: an ortholog of the C-terminal domain of poly(A)-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2001. - V. 98. - № 8. - P. 4414-4419.

40. Deshaies R.J. SCF and cullin/RING H2-based ubiquitin ligases // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 1999. - V. 15. - P. 435- 467.

41. Deshaies R.J., Joazeiro C.A.P. RING domain E3 ubiquitin ligases // Annu. Rev. Biochem. - 2009. - V. 78. - P. 399-434.

42. Deveraux Q.L., Reed J.C. IAP family proteins-suppressors of apoptosis // Genes Dev.

- 1999. - V. 13. - № 3. - P. 239-252.

43. Dickins R.A., Frew I.J., House C.M., O'Bryan M.K., Holloway A.J., Haviv I., et al. The ubiquitin ligase component Siahla is required for completion of meiosis I in male mice // Mol Cell Biol. - 2002. - V. 22. - № 7. - P. 2294-2303.

44. Dikic I. Proteasomal and autophagic degradation systems // Annu. Rev. Biochem. -2017. - V. 86. - P. 193-224.

45. Ditzel M., Broemer M., Tenev T., Bolduc C., Lee T.V., Rigbolt K.T., et al. Inactivation of effector caspases through nondegradative polyubiquitylation // Mol Cell. - 2008. - V. 32. - № 4. - P. 540-553.

46. Doronkin S., Djagaeva I., and Beckendorf S. K. The COP9 signalosome promotes degradation of Cyclin E during early Drosophila oogenesis // Dev. Cell. -2003. - V.4. - № 5. - P. 699-710.

47. Drummond-Barbosa D., Spradling A.C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis // Dev. Biol. - 2001. - V. 231. - № 1.

- P. 265-278.

48. Dwyer J.L., Richburg J.H. Age-dependent alterations in spermatogenesis in itchy mice // Spermatogenesis. - 2012. - V. 2. - № 2. - P. 104-116.

49. Fairchild M.J., Islam F., Tanentzapf G. Identification of genetic networks that act in the somatic cells of the testis to mediate the developmental program of spermatogenesis // PLoS Genet. - 2017. -V. 13. - № 9. -e1007026.

50. Fang S., Jensen J.P., Ludwig R.L., Vousden K.H., Weissman A.M. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53 // J. Biol. Chem. - 2000. -V.275. - № 12. - P. 8945-8951.

51. Feldman R.M., Correl C.C., Kaplan K.B., and Deshaies R.J. A complex of Cdc4p, Skp1p, and Cdc53p/Cullin catalyzes ubiquitination of the phosphorylated CDK inhibitor Sic1p // Cell. - 1997. - V. 91. - № 2. - P. 221-230.

52. Finley D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome // Annu. Rev. Biochem. - 2009. - V. 78. - P. 477-513.

53. Flack J. E., Mieszczanek J., Novcic N., Bienz M. Wnt-dependent inactivation of the Groucho/TLE corepressor by the HECT E3 ubiquitin ligase Hyd/UBR5 // Mol. Cell. -2017. - V. 67. - № 2. - P. 181-193.

54. Forbes S.A., Bhamra G., Bamford S., Dawson E., Kok C., Clements J. The catalogue of somatic mutations in cancer (COSMIC) // Curr. Protoc. Hum. Genet. - 2008. -Chapter 10. - Unit 10, 11.

55. Fuller M. Spermatogenesis. In Bate M and Arias AM, editors. The Development of Drosophila melanogaster // NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1993э - P.71-147.

56. Fuller M.T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis // Semin Cell Dev Biol. - 1998. - V. 9. - № 4. - P.433-444.

57. Gadre P., Chatterjee S., Varshney B., Ray K. Cyclin E and Cdk1 regulate the termination of germline transit-amplification process in Drosophila testis // Cell Cycle. -2020. - V. 19. - № 14. - P.1786-1803.

58. Gancz D., Lengil T., Gilboa L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling // PLoS Biol. - 2011. - V. 9. - № 11. - e1001202.

59. Gateff E. Gonial cell neoplasm of genetic origin affecting both sexes of drosophila melanogaster // Prog Clin Biol Res. - 1982. - V. 85. - Pt B. - P.621-632.

60. Gateff E. Tumor suppressor and overgrowth suppressor genes of Drosophila melanogaster: developmental aspects // Int. J. Dev. Biol. - 1994. - V. 38. - № 4. - P. 565-590.

61. Gatfield D., Unterholzner L., Ciccarelli F.D., Bork P., Izaurralde E. Nonsensemediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways // EMBO J. - 2003. - V. 22. - № 15. - P. 3960-3970.

62. Geiger T., Wehner A., Schaab C., Cox J. & Mann M. Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins //Mol. Cell. Proteomics. - 2012. - V. 11. - № 3. - M111.014050.

63. Ghaemmaghami S., Huh W.K., Bower K., Howson R.W., Belle A., Dephoure N., O'Shea E.K., Weissman J.S. Global analysis of protein expression in yeast // Nature. -2003. - V. 425. - № 6959. - P. 737-741.

64. Giorgi F., and Deri P. Cell death in ovarian chambers of Drosophila melanogaster // J. Embryol. Exp. Morphol. - 1976. - V. 35. - № 3. - P. 521-533.

65. Gönczy P., Matunis E., DiNardo S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis // Development. - 1997. - V. 124. - № 21. - P. 4361- 4371.

66. Goyal L., McCall K., Agapite J. et al. Induction of apoptosis by Drosophila reaper, hid and grim through inhibition of IAP function // EMBO J. - 2000. - V. 19. - № 4. - P. 589-597.

67. Greenwood J., and Gautier J. From oogenesis through gastrulation: developmental regulation of apoptosis // Semin. Cell. Dev. Biol. - 2005. - V. 16. - № 2. - P. 215224.

68. Grootegoed J.A., Baarends W.M., Roest H.P., Hoeijmakers J.H. Knockout mouse models and gametogenic failure // Mol. Cell. Endocrinol. - 1998. - V. 145. - № 1-2. -P. 161-166.

69. Gupta I., Singh K., Varshney N.K., Khan S. Delineating crosstalk mechanisms of the ubiquitin proteasome system that regulate apoptosis // Front Cell Dev Biol. - 2018. -V.6. - P. 11.

70. Hakem R., Hakem A., Duncan G.S., Henderson J.T., Woo M., Soengas M.S., Elia A, de la Pompa JL, Kagi D, Khoo W, Potter J, Yoshida R, Kaufman SA, Lowe SW, Penninger JM, Mak TW. Differential requirement for caspase 9 in apoptotic pathways in vivo // Cell. - 1998. - V. 94. - № 3. - P. 339-352.

71. Hao Y., Sekine K., Kawabata A., Nakamura H., Ishioka T., Ohata H., Katayama R, Hashimoto C, Zhang X, Noda T, Tsuruo T, Naito M. Apollon ubiquitinates SMAC and caspase-9, and has an essential cytoprotection function // Nat Cell Biol. - 2004. -V. 6. - № 9. - P. 849-860.

72. Hartl F. U. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature. - 1996. - V. 381. - № 6583. - P. 571-579.

73. Hauser H.P., Bardroff M., Pyrowolakis G., Jentsch S. A giant ubiquitin-conjugating enzyme related to IAP apoptosis inhibitors // J Cell Biol. - 1998. - V. 141. - № 6. - P. 1415-1422.

74. Hawkins N.C., Thorpe J., Schüpbach T. Encore, a gene required for the regulation of germ line mitosis and oocyte differentiation during Drosophila oogenesis // Development. - 1996. - V. 122. - № 1. - P. 281-290.

75. Hay B.A., Guo M. Caspase-dependent cell death in Drosophila // Annu Rev Cell Dev Biol. - 2006. - V. 22. - P. 623-650.

76. Hicke L. A new ticket for entry into budding vesicles—Ubiquitin // Cell. - 2001. - V. 106. - № 5. - P. 527-530.

77. Hinnant T.D., Alvarez A.A., Ables E. Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline // Dev Biol. - 2017. - V. 429. - № 1. - P. 118-131.

78. Homer H. The APC/C in female mammalian meiosis I // Reproduction. - 2013. - V. 146. - № 2. - P. 61-71.

79. Honarpour N., Du C., Richardson J.A., Hammer R.E., Wang X., Herz J. Adult Apaf-1-deficient mice exhibit male infertility // Dev Biol. - 2000. - V. 218. - № 2. - P. 24858.

80. Hou X., Zhang W., Xiao Z., Gan H., Lin X., Liao S., Han C. Mining and characterization of ubiquitin E3 ligases expressed in the mouse testis // BMC Genomics. - 2012. - V. 13:495.

81. Hou Y.C., Chittaranjan S., Barbosa S.G. et al. Effector caspase Dcp-1 and IAP protein Bruce regulate starvation-induced autophagy during Drosophila melanogaster oogenesis // J. Cell Biol. - 2008. - V. 182. - № 6. - P. 1127-1139.

82. Huang J., Reilein A., Kalderon D. Yorkie and Hedgehog independently restrict BMP production in escort cells to permit germline differentiation in the Drosophila ovary // Development. - 2017. - V. 144. - № 14. - P. 2584-2594.

83. Huen M.S., Grant R., Manke I., Minn K., Yu X., Yaffe M.B., Chen J. RNF8 transduces the DNA-damage signal via histone ubiquitylation and checkpoint protein assembly // Cell. - 2007. - V. 131. - № 5 - P. 901-914.

84. Huh J.R., Vernooy S.Y., Yu H., Yan N., Shi Y., Guo M., Hay B.A. Multiple apoptotic caspase cascades are required in nonapoptotic roles for Drosophila spermatid individualization // PLoS Biol. - 2004. - V. 2. - № 1: E15.

85. Jacobs H.W., Knoblich J.A., Lehner C.F. Drosophila Cyclin B3 is required for female fertility and is dispensable for mitosis like Cyclin B // Genes Dev. - 1998. - V. 12. -№ 23. - P. 3741-3751.

86. Jenkins V.K., Timmons A.K., McCall K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary // Trends Cell Biol. - 2013. - V. 23. - № 11. - P. 567-574.

87. Jeong E.B., Jeong S.S., Cho E., Kim E.Y. Makorin 1 is required for Drosophila oogenesis by regulating insulin/Tor signaling // PLoS One. - 2019. - V. 14. - № 4:e0215688.

88. Ji C.H., Kwon Y.T. Crosstalk and Interplay between the Ubiquitin-Proteasome System and Autophagy // Mol Cells. - 2017. - V. 40. - № 7. - P. 441-449.

89. Ji S., Li C., Hu L., Liu K., Mei J., Luo Y., Tao Y., Xia Z., Sun Q., Chen D. Bam-dependent deubiquitinase complex can disrupt germ-line stem cell maintenance by targeting cyclin A // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2017. - V. 114. - № 24. - P. 63166321.

90. Kahney E.W., Snedeker J.C., Chen X. Regulation of Drosophila germline stem cells // Curr Opin Cell Biol. - 2019. - V. 60. - P. 27-35.

91. Kaplan Y., Gibbs-Bar L., Kalifa Y., Feinstein-Rotkopf Y., Arama E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids // Dev. Cell. - 2010. - V. 19. - № 1. - P. 160-173.

92. Keating J., Grundy C.E., Fivey P.S., Elliott M., Robinson J. Investigation of the association between the presence of cytoplasmic residues on the human sperm midpiece and defective sperm function // J. Reprod. Fertil. - 1997. - V. 110. - № 1. -P. 71-77.

93. Kiger A.A., Jones D.L., Schulz C., Rogers M.B., Fuller M.T. Stem cell self-renewal specified by JAK-STAT activation in response to a support cell cue // Science. - 2001. - V. 294. - № 5551. - P. 2542- 2545.

94. Kiger A.A., White-Cooper H., Fuller M.T. Somatic support cells restrict germline stem cell self-renewal and promote differentiation // Nature. - 2000. - V. 407. - № 6805. -P. 750 -754.

95. Kim Y. E., Hipp M. S., Bracher A., Hayer-Hartl M. & Hartl F. U. Molecular chaperone functions in protein folding and proteostasis // Annu. Rev. Biochem. -2013. - V. 82. - P. 323-355.

96. King R. C. Oogenesis in adult Drosophila melanogaster. II. Stage distribution as a function of age // Growth. - 1957. - V. 21. - № 2. - P. 95-102.

97. King R. C. Ovarian development in Drosophila melanogaster // Academic Press, New York. 1970.

98. King R.C. The meiotic behavior of the Drosophila oocyte // Int. Rev. Cytol. - 1970. -V. 28. - P.125-168.

99. Kirisako T., Kamei K., Murata S., Kato M., Fukumoto H., Kanie M., Sano S., Tokunaga F., Tanaka K., Iwai K. A ubiquitin ligase complex assembles linear polyubiquitin chains // EMBO J. - 2006. - V. 25. - № 20. - P. 4877-4887.

100. Kniepert A., Groettrup M. The unique functions of tissue-specific proteasomes // Trends Biochem. Sci. - 2014. - V. 39. - № 1. - P. 17-24.

101. Koepp D.M., Schaefer L.K., Ye X., Keyomarsi K., Chu C., Harper J.W., Elledge S.J. Phosphorylation-dependent ubiquitination of cyclin E by the SCFFbw7 ubiquitin ligase // Science. - 2001. - V. 294. - № 5540. - P. 173-177.

102. Komander D., Rape M. The ubiquitin code // Annu. Rev. Biochem. - 2012. - V. 81. -P. 203-229.

103. Kopanja D., Roy N., Stoyanova T., Hess R.A., Bagchi S., Raychaudhuri P. Cul4A is essential for spermatogenesis and male fertility // Dev. Biol. - 2011. - V. 352. - № 2. -P. 278-287.

104. Kovacs L., Nagy A., Pal M., Deak P. Usp14 is required for spermatogenesis and ubiquitin stress responses in Drosophila melanogaster // J Cell Sci. - 2020. - V. 133. -№ 2. - jcs237511.

105. Kozlov G., Nguyen L., Lin T., De Crescenzo G., Park M., Gehring K. Structural basis of ubiquitin recognition by the ubiquitin-associated (UBA) domain of the ubiquitin ligase EDD // J. Biol. Chem. - 2007. - V. 282. - № 49. - P. 35787-35795.

106. Kugler J. M., Lem C. and Lasko P. Reduced cul-5 activity causes aberrant follicular morphogenesis and germ cell loss in Drosophila oogenesis // PLoS One. - 2010. - V. 5. - № 2: e9048.

107. Kulak N. A., Geyer P. E. & Mann M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics // Mol. Cell. Proteomics. - 2017. - V. 16. - № 4. - P. 694-705.

108. Kumar S. Caspase function in programmed cell death // Cell Death Differ. - 2007. - V. 14. - № 1. - P. 32-43.

109. Kumar S., Doumanis J. The fly caspases // Cell Death Differ. - 2000. - V. 7. - № 11. -P.1039-1044.

110. Labbadia J. & Morimoto R. I. The biology of proteostasis inaging and disease // Annu. Rev. Biochem. - 2015. - V. 84. - P. 435-464.

111.LaFever L., Feoktistov A., Hsu H.J., Drummond-Barbosa D. Specific roles of Target of rapamycin in the control of stem cells and their progeny in the Drosophila ovary // Development. - 2010. - V. 137. - № 13. - P. 2117-2126.

112. Lagace M., Xuan J.Y., Young S.S., McRoberts C., Maier J., Rajcan-Separovic E., et al. Genomic organization of the X-linked inhibitor of apoptosis and identification of a novel testis-specific transcript // Genomics. - 2001. - V. 77. - № 3. - P. 181-188.

113. Lamb C.A., Yoshimori T., Tooze S.A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2013. - V. 14. - № 12. - P. 759774.

114. Laws K.M., Drummond-Barbosa D. Control of Germline Stem Cell Lineages by Diet and Physiology // Results Probl Cell Differ. - 2017. - № 5. - P. 67-99.

115. Lee J.D., Amanai K., Shearn A., Treisman J.E. The ubiquitin ligase Hyperplastic discs negatively regulates hedgehog and decapentaplegic expression by independent mechanisms // Development. - 2002. - V. 129. - № 24. - P. 5697-5706.

116. Lee T.V., Fan Y., Wang S., Srivastava M., Broemer M., Meier P., Bergmann A. Drosophila IAP1-mediated ubiquitylation controls activation of the initiator caspase DRONC independent of protein degradation // PLoS Genet. - 2011. - V. 7. - № 9:e1002261.

117. Li L., Halaby M.J., Hakem A., Cardoso R., El Ghamrasni S., Harding S., Chan N., Bristow R., Sanchez O., Durocher D., Hakem R. Rnf8 deficiency impairs class switch recombination, spermatogenesis, and genomic integrity and predisposes for cancer // J. Exp. Med. - 2010. - V. 207. - № 5. - P. 983-997.

118. Lilly M.A., De Cueva M., Spradlin A.C. Cyclin A associates with the fusome during germline cyst formation in the Drosophila ovary // Dev. Biol. -2000. - V. 218. - № 1. - P. 53-63.

119. Lim J.G., Fuller M.T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes // Proc Natl Acad Sci U S A. -2012. - V. 109. - № 45. - P.18477-18481.

120. Lim N.S., Kozlov G., Chang T.C., Groover O., Siddiqui N., Volpon L., De Crescenzo G., Shyu A.B., Gehring K. Comparative peptide binding studies of the PABC domains

from the ubiquitin-protein isopeptide ligase HYD and poly(A)-binding protein. Implications for HYD function // J. Bio.l Chem. - 2006. - V. 281. - № 20. - P. 1437614382.

121. Lin H., Spradling A.C. Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria // Dev Biol. - 1993. - V. 159. - P. 140-152.

122. Lindsley D.I., Tokuyasu K.T. Spermatogenesis. In: Ashburner M., Wright T.R., editors. Genetics and biology of Drosophila // New York: Academic Press. -1980. - P. 225-294.

123. Liu C.H., Goldberg A.L., Qiu X.B. New insights into the role of the ubiquitin-proteasome pathway in the regulation of apoptosis // Chang Gung Med. J. - 2007. - V. 30. - № 6. - P. 469-479.

124. Liu Z., Miao D., Xia Q., Hermo L., Wing S.S. Regulated expression of the ubiquitin protein ligase E3(Histone)/LASU1/Mule/ARF-BP1/HUWE1, during spermatogenesis // Dev Dyn. - 2007. - V. 236. - № 10. - P. 2889-2898.

125. Liu Z., Oughtred R., Wing S.S. Characterization of E3Histone, a novel testis ubiquitin protein ligase which ubiquitinates histones // Mol Cell Biol. - 2005. - V. 25. - № 7. -P. 2819 - 2831.

126. Lu L.Y., Wu J., Ye L., Gavrilina G.B., Saunders T.L., Yu X. RNF8-dependent histone modifications regulate nucleosome removal during spermatogenesis // Dev Cell. -2010. - V. 18. - № 3. - P.371 - 384.

127. Lu T., Wang S., Gao Y., Mao Y., Yang Z., Liu L., Song X., Ni J., Xie T. COP9-Hedgehog axis regulates the function of the germline stem cell progeny differentiation niche in the Drosophila ovary // Development. - 2015. - V. 142. - № 24. - P. 42424252.

128. Ma J., Katz E., Belote J.M. Expression of proteasome subunit isoforms during spermatogenesis in Drosophila melanogaster // Insect Mol Biol. - 2002. - V. 11. - № 6. - P.627-639.

129. MacDonald T.M., Thomas L.N., Daze E., Marignani P., Barnes P.J., Too C.K. Prolactin-inducible EDD E3 ubiquitin ligase promotes TORC1 signalling, anti-apoptotic protein expression, and drug resistance in breast cancer cells // Am J Cancer Res. - 2019. - V. 9. - № 7. - P. 1484-1503.

130. Manku G., Wing S.S., Culty M. Expression of the ubiquitin proteasome system in neonatal rat gonocytes and spermatogonia: role in gonocyte differentiation // Biol Reprod. - 2012. - V. 87. - № 2:44.

131. Mansfield E., Hersperger E., Biggs J., Shearn A. Genetic and molecular analysis of hyperplastic discs, a gene whose product is required for regulation of cell proliferation in Drosophila melanogaster imaginal discs and germ cells // Dev Biol. - 1994. - V. 165 - № 2. - Р. 507-526.

132. Martin P., Martin A., Shearn A. Studies of l(3)c43hs1 a polyphasic, temperature-sensitive mutant of drosophila melanogaster with a variety of imaginal disc defects // Dev. Biol. - 1977. - V. 55. - № 2. - Р. 213-232.

133.Mathieu J., Huynh J.R. Monitoring complete and incomplete abscission in the germ line stem cell lineage of Drosophila ovaries // Methods Cell Biol. - 2017. - V.137. - Р. 105-118.

134. Matsuura K., Huang N.J., Cocce K., Zhang L., Kornbluth S. Downregulation of the proapoptotic protein MOAP-1 by the UBR5 ubiquitin ligase and its role in ovarian cancer resistance to cisplatin // Oncogene. - 2017. - V. 36. - № 12. - Р. 1698-1706.

135. Matta-Camacho E., Kozlov G., Menade M., Gehring K. Structure of the HECT C-lobe of the UBR5 E3 ubiquitin ligase // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. - 2012. - V. 68. - Pt. 10. - Р. 1158-1163.

136. McCall K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary // Dev Biol. - 2004. - V. 274. - № 1. - Р. 3-14.

137. McKearin D.M., Spradling A.C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis // Genes Dev. - 1990. - V. 4. - № 12B. - Р. 2242-2251.

138. Meissner B., Kridel R., Lim R.S., Rogic S., Tse K., Scott D.W., Moore R., Mungall A.J., Marra M.A., Connors J.M., Steidl C., Gascoyne R.D. The E3 ubiquitin ligase UBR5 is recurrently mutated in mantle cell lymphoma // Blood. - 2013. - V. 121. - №

16. - Р. 3161-3164.

139. Mills N.C., Van N.T., Means A.R. Histones of rat testis chromatin during early postnatal development and their interactions with DNA // Biol Reprod. - 1977. - V.

17. - № 5. - Р. 760-768.

140. Moberg K.H., Bell D.W., Wahrer D.C., Haber D.A., Hariharan I.K. Archipelago regulates Cyclin E levels in Drosophila and is mutated in human cancer cell lines // Nature. - 2001. - V. 413. - № 6853. - Р.311-316.

141. Mocciaro A., Rape M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control // J. Cell. Sci. - 2012. - V. 125. - Pt. 2. - Р. 255-263.

142. Mukhopadhyay D., Riezman H. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling // Science. - 2007. - V. 315. - № 5809. - Р. 201-205.

143. Muñoz-Escobar J., Matta-Camacho E., Kozlov G., Gehring K. The MLLE domain of the ubiquitin ligase UBR5 binds to its catalytic domain to regulate substrate binding // J Biol Chem. - 2015. - V. 290. - № 37. - Р. 22841-22850.

144. Muzzopappa M. and Wappner P. Multiple roles of the F-box protein Slimb in Drosophila egg chamber development // Development. - 2005. - V. 132. -№ 11. - Р. 2561-2571.

145. Napoletano F., Gibert B., Yacobi-Sharon K., Vincent S., Favrot C., Mehlen P., Girard V., Teil M., Chatelain G., Walter L., Arama E., Mollereau B. p53-dependent programmed necrosis controls germ cell homeostasis during spermatogenesis // PLoS Genet. - 2017. - V. 13. - № 9. - e1007024.

146. Nezis I.P., Lamark T., Velentzas A.D. Cell death during Drosophila melanogaster early oogenesis is mediated through autophagy // Autophagy. - 2009. - V. 5. - № 3. - P. 298-302.

147. Ni J.Q., Zhou R., Czech B., Liu L.P., Holderbaum L., Yang-Zhou D., Shim H.S., Tao R., Handler D., Karpowicz P., Binari R., Booker M., Brennecke J., Perkins L.A., Hannon G.J., Perrimon N. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila // Nat. Methods. - 2011. - V. 8. - № 5. - Р. 405 - 407.

148. O'Brien P.M., Davies M.J., Scurry J.P., Smith A.N., Barton C.A., Henderson M.J., Saunders D.N., Gloss B.S., Patterson K.I., Clancy J.L., Heinzelmann-Schwarz V.A., Scolyer R.A., Zeng Y, Williams E.D., Scurr L., DeFazio A., Quinn D.I., Watts C.K.W., Hacker N.F., Henshall S.M., Sutherland R.L. The E3 ubiquitin ligase EDD is an adverse prognostic factor for serous epithelial ovarian cancer and modulates cisplatin resistance in vitro // Br J Cancer. - 2008. - V. 98. - № 6. - Р. 1085-1093.

149. Ohlmeyer J.T., Schupbach T. Encore facilitates SCF-Ubiquitin-proteasome-dependent proteolysis during Drosophila oogenesis // Development. - 2003. - V. 130. - № 25. -P. 6339-6349.

150. Ohlstein B., McKearin D. Ectopic expression of the Drosophila Bam protein eliminates oogenic germline stem cells // Development. - 1997. - V. 124. - № 18. - P. 3651-3662.

151. Orlowski R.Z. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in apoptosis // Cell Death Differ. - 1999. - V.6. - № 4. - P. 303-313.

152. Orme M., Meier P. Inhibitor of apoptosis proteins in Drosophila: gatekeepers of death // Apoptosis. - 2009. - V. 14. - № 8. - P. 950-960.

153. Pertceva J.A., Dorogova N.V., Bolobolova E.U., Nerusheva O.O., Fedorova S.A., Omelyanchuk L.V. The role of Drosophila hyperplastic discs gene in spermatogenesis // Cell Biol. Int. - 2010. - V. 34. - № 10. - P. 991 - 996.

154. Peterson J.S., Timmons A.K., Mondragon A.A., McCall K. The End of the Beginning: Cell Death in the Germline // Curr Top Dev Biol. - 2015. - V. 114. - P. 93-119.

155. Pickart C.M., Fushman D. Polyubiquitin chains: polymeric protein signals // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2004. - V. 8. - № 6. - P. 610 - 616.

156. Picotti P., Clement-Ziza M., Lam H., Campbell D.S., Schmidt A., Deutsch E.W., Röst H., Sun Z., Rinner O., Reiter L., Shen Q., Michaelson J.J., Frei A., Alberti S., Kusebauch U., Wollscheid B., Moritz R.L., Beyer A., Aebersold R. A complete mass-spectrometric map of the yeast proteome applied to quantitative trait analysis // Nature. - 2013. - V. 494. - № 7436. - P. 266-270.

157. Pohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy // Science. - 2019. - V. 366. - № 6467. - P. 818 - 822.

158. Pritchett T.L., McCall K. Role of the insulin/Tor signaling network in starvation-induced programmed cell death in Drosophila oogenesis // Cell Death Differ. - 2012. -V. 19. - № 6. - P. 1069-1079.

159. Pritchett T.L., Tanner E.A., McCall K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary // Apoptosis. - 2009. - V. 14. - № 8. - P. 969-79.

160. Qian M.X., Pang Y., Liu C.H., Haratake K., Du B.Y., Ji D.Y., Wang G.F., Zhu Q.Q., Song W., Yu Y., Zhang X.X., Huang H.T., Miao S., Chen L.B., Zhang Z.H., Liang Y.N., Liu S., Cha H., Yang D., Zhai Y., Komatsu T., Tsuruta F., Li H., Cao C., Li W.,

Li G.H., Cheng Y., Chiba T., Wang L., Goldberg A.L., Shen Y., Qiu X.B. Acetylation-mediated proteasomal degradation of core histones during DNA repair and spermatogenesis // Cell. - 2013. - V. 153. - № 5. - P. 1012-1024.

161. Qiao X., Liu Y., Prada M.L., Mohan A.K., Gupta A., Jaiswal A., Sharma M., Merisaari J., Haikala H.M., Talvinen K., Yetukuri L., Pylvänäinen J.W., Klefström J., Kronqvist P., Meinander A., Aittokallio T., Hietakangas V., Eilers M., Westermarck J. UBR5 is coamplified with MYC in breast tumors and encodes an ubiquitin ligase that limits MYC-dependent apoptosis // Cancer Res. - 2020. - V. 80. - № 7. - P. 1414 -1427.

162. Rahimi N. The ubiquitin-proteasome system meets angiogenesis // Mol. Cancer Ther.

- 2012. - V. 11. - № 3. - P. 538-548.

163. Rajapurohitam V., Bedard N., Wing S.S. Control of ubiquitination of proteins in rat tissues by ubiquitin conjugating enzymes and isopeptidases // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2002. - V. 282. - № 4. - P. 739-745.

164. Reubens M.C., Biller M.D., Bedsole S.E., Hopkins L.T., Ables E.T., Christensen T.W. Mcm10 is required for oogenesis and early embryogenesis in Drosophila // Mech Dev.

- 2015. - V. 138. - Pt 3. - P. 291-299.

165. Richter B.W., Mir S.S., Eiben L.J., Lewis J., Reffey S.B., Frattini A., Tian L., Frank S., Youle R.J., Nelson D.L., Notarangelo L.D., Vezzoni P., Fearnhead H.O., Duckett C.S. Molecular cloning of ILP-2, a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family // Mol Cell Biol. - 2001. - V. 21. - № 13. - P. 4292-4301.

166. Rodriguez A., Chen P., Oliver H., Abrams J.M. Unrestrained caspase-dependent cell death caused by loss of Diap1 function requires the Drosophila Apaf-1 homolog, Dark // EMBO J. - 2002. - V. 21. - № 9. - P. 2189-2197.

167. Roest H.P., van Klaveren J., de Wit J., van Gurp C.G., Koken M.H.M., Vermey M., van Roijen J.H., Vreeburg J.T.M., Baarends W.M., Bootsma D., Grootegoed J.A., Hoeijmakers J.H. Inactivation of the HR6B ubiquitin-conjugating DNA repair enzyme in mice causes a defect in spermatogenesis associated with chromatin modification // Cell. - 1996. - V. 86. - № 5. - P. 799-810.

168. R0rth P. Gal4 in the Drosophila female germline // Mech Dev. - 1998. - V. 78. - № 12. - P. 113-118.

169. Salvesen G.S., Duckett C.S. IAP proteins: blocking the road to death's door // Nature reviews Molecular cell biology. - 2002. - V. 3. - № 6. - P.401-410.

170. Sarikas A., Hartmann T., Pan Z.Q. The cullin protein family // Genome Biol. - 2011. -V. 12. - № 4:220.

171. Sarkissian T., Timmons A., Arya R., Abdelwahid E., and White K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells // Methods. - 2014. - V. 68. - № 1. - P. 8996.

172. Scheffner M., Kumar S. Mammalian HECT ubiquitin-protein ligases: Biological and pathophysiological aspects // Biochim. Biophys. Acta.- 2014. - V. 1843. - № 1. - P. 61-74.

173. Scheffner M., Nuber U., Huibregtse J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade // Nature. - 1995. - V. 373. - № 6509. - P. 81 -83.

174. Schnell J.D., Hicke L. Non-traditional functions of ubiquitin and ubiquitin binding proteins // J Biol Chem. - 2003. - V. 278. - № 38. - P. 35857-35860.

175. Shearer R.F., Iconomou M., Watts C.K., Saunders D.N. Functional roles of the E3 ubiquitin ligase UBR5 in cancer // Mol Cancer Res. - 2015. - V. 13. - № 12. - P. 1523-1532.

176. Shiber A. & Ravid T. Chaperoning proteins for destruction: diverse roles of Hsp70 chaperones and their co-chaperones in targeting misfolded proteins to the proteasome // Biomolecules. - 2014. - V. 4. - № 3. - P. 704-724.

177. Sigrist S., Ried G., Lehner C.F. Dmcdc2 kinase is required for both meiotic divisions during Drosophila spermatogenesis and is activated by the Twine/cdc25 phosphatase // Mech Dev. - 1995. - V. - 53. - № 2. - P. 247-260.

178. Skerget S., Rosenow M., Polpitiya A., Petritis K., Dorus S., Karr T.L. The Rhesus Macaque (Macaca mulatta) Sperm Proteome // Molecular & cellular proteomics: MCP. - 2013. - V. 12. - № 11. - P. 3052-3067.

179. Skowyra D., Craig K.L., Tyers M., Elledge S.J., and Harper J.W. F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex // Cell. - 1997. - V. 91. - № 2. - P. 209-219.

180. Strohmaier H., Spruck C.H., Kaiser P., Won K.A., Sangfelt O., Reed S.I. Human F-box protein hCdc4 targets cyclin E for proteolysis and is mutated in a breast cancer cell line // Nature. - 2001. - V. 413. - № 6853. - Р. 316-322.

181. Strous G.J., Govers R. The ubiquitin-proteasome system and endocytosis // J. Cell. Sci. - 1999. - V. 112. - Pt. 10. - Р. 1417-1423.

182. Styhler S., Nakamura A., Swan A., Suter B., Lasko P. Vasa is required for GURKEN accumulation in the oocyte, and is involved in oocyte differentiation and germline cyst development // Development. - 1998. - V. 125. - № 9. - Р. 1569-1578.

183. Su H., Meng S., Lu Y, Trombly M.I., Chen J., Lin C., Turk A., Wang X. Mammalian hyperplastic discs homolog EDD regulates miRNA-mediated gene silencing // Molecular cell. - 2011. - V. 43. - № 1. - Р. 97-109.

184. Sun C., Skaletsky H., Birren B., Devon K., Tang Z., Silber S., Oates R., Page D.C. An azoospermic man with a de novo point mutation in the Y-chromosomal gene USP9Y // Nat. Genet. - 1999. - V. 23. - № 4. - Р. 429-432.

185. Sun Y. E3 ubiquitin ligases as cancer targets and biomarkers // Neoplasia. - 2006. -V. 8. - № 8. - Р. 645 -654.

186. Sutovsky P. Sperm proteasome and fertilization // Reproduction. - 2011. - V. 142. - № 1. - Р. 1-14.

187. Tasaki T., Mulder L.C., Iwamatsu A., Lee M.J., Davydov I.V., Varshavsky A., Muesing M., Kwon Y.T. A family of mammalian E3 ubiquitin ligases that contain the UBR box motif and recognize N-degrons // Mol Cell Biol. - 2005. - V. 25. - № 16. -Р. 7120-7136.

188. Tavosanis G., Gonzalez C. gamma-Tubulin function during female germ-cell development and oogenesis in Drosophila // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - V. 100. - № 18. - Р. 10263-10268.

189. Taylor R. C. & Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse // Cold Spring Harb. Persp. Biol. - 2011. - V. 3. - № 5: a004440.

190. Taylor R.C., Cullen S.P., Martin S.J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. - V. 9. - № 3. - P. 231-241.

191. Teixeira L.K., Reed S.I. Ubiquitin ligases and cell cycle control // Annu Rev Biochem. - 2013. - V. 82. - Р. 387-414.

192. Thurlings I., de Bruin A. E2F Transcription Factors Control the Roller Coaster Ride of Cell Cycle Gene Expression // Methods Mol Biol. - 2016. - V. 1342. - P. 71-88.

193. Tulina N., Matunis E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila spermatogenesis by JAK-STAT signaling // Science. - 2001. - V. 294. - № 5551. - P. 2546-2649.

194. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G., Rechsteiner M. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair // EMBO J. - 2002. - V. 21. - № 13. - P. 35163525.

195. Vedelek V., Kovacs, A.L., Juhasz, G. et al. The tumor suppressor archipelago E3 ligase is required for spermatid differentiation in Drosophila testis // Sci Rep. - 2021. -V. 11. - № 1. - P. 8422.

196. Vucic D., Stennicke H.R., Pisabarro M.T., Salvesen G.S., Dixit V.M. ML-IAP, a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas // Curr Biol. - 2000. - V. 10. - № 21. - P.1359-1366.

197. Wang B., Elledge S.J. Ubc13/Rnf8 ubiquitin ligases control foci formation of the Rap80/Abraxas/Brca1/Brcc36 complex in response to DNA damage // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - V. 104. - № 52. - P. 20759-20763.

198. Wang D., Xu Q., Yuan Q., Jia M., Niu H., Liu X., Zhang J, Young C.Y., Yuan H. Proteasome inhibition boosts autophagic degradation of ubiquitinated-AGR2 and enhances the antitumor efficiency of bevacizumab // Oncogene. - 2019. - V. 38. - № 18. - P. 3458-3474.

199. Wang G., Tang X., Chen Y., Cao J., Huang Q., Ling X., Ren W., Liu S., Wu Y., Ray L., Lin X. Hyperplastic discs differentially regulates the transcriptional outputs of Hedgehog signaling // Mech Dev. - 2014. - V. 133. - P. 117-125.

200. Wang Z., Lin H. The division of Drosophila germline stem cells and their precursors requires a specific cyclin // Curr Biol. - 2005. - V. 15. - № 4. - P. 328-333.

201. Wenzel D.M., Lissounov A., Brzovic P.S., Klevit R.E. UBCH7 reactivity profile reveals parkin and HHARI to be RING/HECT hybrids // Nature. - 2011. - V. 474. - № 7349. - P. 105-108.

202. White-Cooper H., Alphey L., Glover D.M. The cdc25 homologue twine is required for only some aspects of the entry into meiosis in Drosophila // J Cell Sci. - 1993. - V. 106. - Pt 4. - P. 1035-1044.

203. Wykes S.M., Krawetz S.A. The structural organization of sperm chromatin // J Biol Chem. - 2003. - V. 278. - № 32. - P.29471-29477.

204. Yacobi-Sharon K., Namdar Y., Arama E. Alternative germ cell death pathway in Drosophila involves HtrA2/Omi, lysosomes, and a caspase-9 counterpart // Dev Cell. -2013. - V. 25. - № 1. - P. 29-42.

205. Yang X., Mao F., Lv X., Zhang Z., Fu L., Lu Y., Wu W., Zhou Z., Zhang L., Zhao Y. Drosophila Vps36 regulates Smo trafficking in Hedgehog signaling // J Cell Sci. -2013. - V. 126. - Pt 18. - P. 4230-4238.

206. Yang Y., Fang S., Jensen J.P., Weissman A.M., Ashwell J.D. Ubiquitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in proteasomes in response to apoptotic stimuli // Science. - 2000. - V. 288. - № 5467. - P. 874-877.

207. Yin Y., Lin C., Kim S.T., Roig I., Chen H., Liu L., Veith G.M., Jin R.U., Keeney S., Jasin M., Moley K., Zhou P., Ma L. The E3 ubiquitin ligase Cullin 4A regulates meiotic progression in mouse spermatogenesis // Dev Biol. - 2011. - V. 356. - № 1. -P. 51-62.

208. Yoshida H., Kong Y.Y., Yoshida R., Elia A.J., Hakem A., Hakem R., Penninger J.M., Mak T.W. Apaf-1 is required for mitochondrial pathways of apoptosis and brain development // Cell. - 1998. - V. 94. - № 6. - P. 739-750.

209. Yuan X., Miller M., Belote J.M. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila melanogaster encoding testes-specific isoforms // Genetics. - 1996. - V. 144. - № 1. -P.147-157.

210. Zheng N., Shabek N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation // Annu. Rev. Biochem. - 2017. - V. 86. - P. 129-157.

211. Zhong L., Belote J.M. The testis-specific proteasome subunit Prosalpha6T of D. melanogaster is required for individualization and nuclear maturation during spermatogenesis // Development. - 2007. - V. 134. - № 19. - P.3517-3525.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 6. Список белков, взаимодействующих с белком Hyd

Название гена Flybase ID Биологический процесс (GO Biological process)

Клеточный цикл

Pdk1 FBgn0020386 Регуляция клеточного роста

Sgg FBgn0003371 Позитивная регуляция перехода метафаза/анафаза в митозе

Mts FBgn0004177 Митотический клеточный цикл

Myc FBgn0262656 Клеточная пролиферация, регуляция клеточного цикла

CG14262 FBgn0039503 SCF убиквитин-лигазный комплекс

Wee1 FBgn0011737 Контрольная точка митотического клеточного цикла

Rad9 FBgn0025807 Контрольная точка репликации, контрольная точка повреждения ДНК

Mkp3 FBgn0036844 Регуляция клеточной пролиферации, негативная регуляция каскада MAPK

Ci FBgn0004859 Транскрипци, клеточное деление и разделение хромосом, позитивная регуляция перехода G1/S в митозе

Gmd FBgn0031661 Сигнальный путь Notch, регуляция делений стволовых клеток

Fzr2 FBgn0034937 Выход из митоза, катаболические процессы, зависимые от APC, позитивная регуляция убиквитин-лигазной активности

Апоптоз

Pdk1 FBgn0020386 Негативная регуляция апоптоза

Myc FBgn0262656 Регуляция апоптоза

CG5059 FBgn0037007 Позитивная регуляция апоптоза, регуляция программируемой клеточной гибели, пермеабилизация наружной мембраны митохондрий

Corp FBgn0030028 Связывание p53, негативная регуляция сигнального пути апоптоза в ответ на повреждения ДНК

Diap1 FBgn0260635 Негативная регуляция апоптоза

Аутофагия

Pdk1 FBgn0020386 mTOR сигнальный путь

Mts FBgn0004177 Аутофагия

Myc FBgn0262656 Регуляция аутофагии

Wdr24 FBgn0027518 Позитивная регуляция макроаутофагии

RagC-D FBgn0033272 Позитивная регуляция сигнального пути TOR, клеточный ответ на голодание, регуляция аутофагии

Tsp FBgn0031850 Клеточная адгезия, опосредованная интегрином, фагосома

Atg101 FBgn0030960 Сборка аутофагосом, аутофагия, позитивная регуляция

макроаутофагии, программируемая клеточная гибель в личиночном кишечнике

UPS (убиквитин-протеасомная система)

Sgg FBgn0003371 Фосфорилирование белков, регуляция протеолиза

CG14262 FBgn0039503 SCF убиквитин-лигазный комплекс

Vhl FBgn0041174 Убиквитин-трансферазная активность, убиквитин-лигазная активность

Rpt6 FBgn0020369 Протеасомная регуляторная частица, посттрансляционные модификации, оборот белков, шапероны

Rpt1 FBgn0028687 Протеасомная регуляторная частица, посттрансляционные модификации, оборот белков, шапероны

Prosbeta2R2 FBgn0037296 Коровый комплекс протеасомы

Mib2 FBgn0086442 Убиквитин-трансферазная активность

Jon44E FBgn0001285 Протеолиз

Usp10 FBgn0052479 Деубиквитинировнаие белков

CG30496 FBgn0050496 Негативная регуляция убиквитинирования

CG15800 FBgn0034904 Убиквитин-зависимый катаболический процесс, компонент SKP1

Другие

Vha36-1 FBgn0022097 Транспорт протонов, фагосома

Trf FBgn0010287 Позитивная регуляция транскрипции с промотора РНК полимеразы II

Thoc7 FBgn0035110 Процессинг мРНК

Fd59A FBgn0004896 Активность транскрипционного фактора

Rexo5 FBgn0286051 РНКаза T/ДНК полимераза III

PIG-T FBgn0030035 Эндоплазматический ретикулум

O-fut2 FBgn0027791 Эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, регуляция транскрипции

Lectin-46Ca FBgn0040093 Локализация белков, межклеточное пространство

Hsp70Aa FBgn0013275 Ответ на гипоксию, ответ на нарушение укладки белков

Hsp22 FBgn0001223 Посттрансляционные модификации, оборот белков, шапероны, ответ на оксидативный стресс, митохондрии

Sema1a FBgn0011259 Позитивная регуляция миграции клеток

Sals FBgn0051374 Связывание с актиновыми филаментами

Osk FBgn0003015 Регуляция стабильности мРНК, позитивная регуляция трансляции

Gs1 FBgn0001142 Фагоцитоз, организация митохондрий

Dph1 FBgn0036194 Фагоцитоз

CG9596 FBgn0031832 Метилирование тРНК, латеральное ингибирование

CG5541 FBgn0030603 Мембранный компонент,нервно-мышечная передача сигнала, долгосрочная память

CG30350 FBgn0050350 Белковая пептидил-пролил изомеризация, укладка белков

CG33523 FBgn0053523 Нейрогенез, мембрана ЭР

CG3358 FBgn0033117 Mg-зависимая ДНКаза

Brf FBgn0038499 Регуляция транскрипции с промотора РНК-полимеразы III

Atms FBgn0010750 Элонгация транскрипции с промотора РНК-полимеразы II

Arp1 FBgn0011745 Организация цитоскелета, движение за счет микротрубочек

Akirin FBgn0082598 Позитивная регуляция пути Imd

CG4004 FBgn0030418 Домен MADF

CG3526 FBgn0040355 Связывание ионов Zn

CG31835 FBgn0051835 Связывание ионов Zn

CG32295 FBgn0260480 Неизвестно

CG30412 FBgn0050412 Неизвестно

CG1561 FBgn0030317 Неизвестно