Роль фосфорилирования белка оболочки X-вируса картофеля в трансляционной активации вирионной РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Заякина, Ольга Владимировна

• Заякина, Ольга Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Заякина, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПРОТЕИНКИНАЗЫ РАСТЕНИЙ

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНКИНАЗ РАСТЕНИЙ

Кальций-зависимые протеинкиназы

Протеинкиназы. родственные SNF

Рецептор-подобные протеинкиназы

Подсемейства МАР-киназ (МАРК), МАРКК и

МАРККК

Циклин-зависимые киназы

Подсемейства казеин-киназы 1 (КК1) и казеин-киназы 2 (КК2)

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВИРУСНЫХ БЕЖОВ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЖОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

Фосфорилирование транспортного белка вируса табачной мозаики (ВТМ) и его роль в развитии вирусной инфекции

Фосфорилирование транспортного белка вируса мозаики томата

Фосфорилирование транспортных белков других вирусов растений

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

Фосфорилирование 2а компонента репликазы вируса мозаики огурца

Фосфорилирование и убиквитинирование РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ)

Фосфорилирование NS-белка вируса розеточной карликовости пшеницы

Фосфорилирование белка Pnsl2 вируса карликовости риса

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ БЕЖОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

Фосфорилирование капсидного белка вируса мозаики цветной капусты

Фосфорилирование белка VPg А-вируса картофеля

Фосфорилирование белка оболочки А-вируса картофеля 37 Фосфорилирование и гликозилирование белка оболочки вируса шарки сливы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле

Получение препарата растворимой цитоплазматической, S10) фракции

Фосфорилирование in vitro

Анализ протеинкиназной активности S10-фракции листьев N.glutinosa с использованием ингибиторов протеинкиназ

Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы

Иммуноблот

Заражение растений ХВК 51 Измерение уровня протеинкиназной и протеинфосфатаз-ной активности S10-фракции листьев 51 N. glutinosa

Выделение препарата Х-вируса картофеля

Обработка препарата ХВК трипсином

Выделение плазмидной ДНК 54 Получение мутанта ХВК с заменами остатков серина и треонина в N-конце белка оболочки (ST-мутанта)

Высокоэффективная жидкостная хроматография 56 Анализ углеводных остатков в составе триптических пептидов

Гидролиз карбоксипептидазой Y

Масс-спектрометрия

Инфракрасная спектроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. В фосфорилировании белка оболочки ХВК растворимой фракцией листьев N. glutinosa in vitro, участвует протеинкиназа, сходная с казеинкиназой

2. Смесь КК 1 и КК2 способна фосфорилировать белок оболочки ХВК в составе вирионов и трансляционно активировать инкапсидированную РНК

3. Фосфорилирование белка оболочки ХВК in situ не влияет на инфекционность вируса

4. Уровень протеинкиназной и протеинфосфатазной активности в хозяйских клетках изменяется в ходе развития вирусной инфекции

5. Удаление N-концевого фрагмента БО в составе вирионов ХВК подавляет способность вируса трансляционно активироваться фосфорилированием

6. Инфекционность препаратов XBK-Ptd снижена по сравнению с нативным ХВК

7. Замена потенциально фосфорилируемых аминокислотных остатков в N-конце БО влияет на способность инкапсидированной РНК транслироваться

8. Изменения структуры вирусной частицы, внесенные фосфорилированием, являются необратимыми

9. 5'-конец РНК ХВК доступен для взаимодействия с комплементарным олигонуклеотидом в составе фосфорилированного ХВК и ST-XBK, но не нативного или комплекса ХВК-ТБ

10. N-концевой фрагмент белка оболочки ХВК О-гликозилирован

11. Структура N-конца белка оболочки ХВК влияет на способность вириона связывать воду

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль фосфорилирования белка оболочки X-вируса картофеля в трансляционной активации вирионной РНК»

На современном этапе развития вирусологии растений большой интерес представляет изучение молекулярных механизмов межклеточного транспорта вирусной инфекции, регуляции процессов трансляции и репликации вирусных нуклеиновых кислот, а также принципов взаимодействия вируса с клетками растения-хозяина.

В момент заражения растения вирусом только небольшое число клеток оказывается инфицированным. Для дальнейшего распространения инфекции необходим межклеточный транспорт, который является активным процессом, осуществляется через плазмодесмы и требует участия одного или более кодируемых вирусом транспортных белков. Вирусная РНК перемещается из зараженной в соседние здоровые клетки в составе нуклеопротеидной структуры (транспортной формы). По-видимому, в составе транспортной формы вирусная РНК исключается из процессов трансляции и репликации, а после проникновения в здоровую клетку вновь становится доступной рибосомам для трансляции и продолжения развития инфекции. Механизмы регуляции описанных процессов и роль факторов клетки-хозяина в процессе транспорта инфекции мало изучены. На примере транспортной формы ВТМ было показано, что РНК в комплексе с транспортным белком недоступна для рибосом, однако фосфорилирование транспортного белка подавляет его репрессирующую активность, делая возможной трансляцию (Karpova et al., 1997, 1999). Трансляция РНК ВТМ родительских частиц в первично зараженных клетках происходит в результате процесса котрансляционного «раздевания» РНК рибосомами (Wilson & Shaw, 1987).

Объект нашего исследования, X вирус картофеля (ХВК) -типичный представитель рода Potexvirus. Роль транспортной формы потексвирусов выполняют либо зрелые вирусные частицы (Chapman et al., 1992; Oparka et al, 1996; Santa Cruz et al, 1998), либо комплекс РНК с белком оболочки (БО) и одним из трёх транспортных белков (ТБ1) (Lough et al1998, 2000). Ранее в нашей лаборатории было показано, что, в отличие от ВТМ, РНК ХВК в составе вирусных частиц недоступна для трансляции in vitro, но приобретает способность транслироваться в результате: (а) взаимодействия вириона с транспортным белком ТБ1 ХВК либо (б) фосфорилирования белка оболочки (БО) (Atabekov et al., 2000, 2001). Настоящая работа была посвящена дальнейшему исследованию роли фосфорилирования белка оболочки ХВК в трансляционной активации инкапсидированной РНК, характеристике протеинкиназ, способных фосфорилировать БО ХВК в клетках растения-хозяина, выявлению сайтов фосфорилирования и анализу влияния их мутационной модификации или делеции на свойства вириона и возможность трансляционной активации РНК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обратимое фосфорилирование белков - фундаментальный процесс, участвующий в регуляции практически всех аспектов жизни клетки. Важность этого явления отражает большое количество протеинкиназ и протеинфосфатаз различной специфичности, присутствующих в эукариотической клетке. В частности, геном человека кодирует порядка 2000 протеинкиназ (Hunter, 2002). Примерно 30% белков в эукариотической клетке содержат ковалентно связанный фосфат, и аномальный уровень фосфорилирования является причиной или следствием серьезных нарушений функций клетки (Cohen, 2000). Вирусные белки, попадая в клетку, могут также подвергаться фосфорилированию - дефосфорилированию клеточными киназами и фосфатазами, и вирусы могут использовать эти процессы для регуляции собственных функций в ходе развития инфекции. По имеющимся данным геномы большинства растительных вирусов не кодируют собственных протеинкиназ.

ПРОТЕИНКИНАЗЫ РАСТЕНИЙ

Исследование протеинкиназ растений, количество описанных первичных последовательностей и тем более понимание их физиологических функций сильно отстает от аналогичных исследований, проведенных на дрожжах и млекопитающих. Многие последовательности в базах данных охарактеризованы как протеинкиназы только на основании гомологии с известными нерастительными протеинкиназами, а об их реальных функциях в клетке, характере экспрессии и регуляции ничего не известно. Часто этот подход оказывается единственным ключом, позволяющим предположить возможные функции новых генов, и во многом он оправдан, поскольку протеинкиназы начали использоваться в клеточной регуляции очень рано в ходе эволюции эукариот, и базовые механизмы подобны у разных групп организмов. Однако растения эволюционировали независимо от грибов и животных на протяжении, возможно, миллиарда лет и многие их системы имеют существенные отличия. Например, в растениях до сих пор не обнаружены тирозинкиназы (Hardie, 1999), играющие важную роль в передаче сигналов в животной клетке, а гены, участвующие в ответе на этилен и цитокинины в A. thaliana, оказались членами семейства «прокариотических» двухкомпонентных гистидин/аспартат киназ (Kakimoto, 1996; Chang & Meyerov/itz, 1995), неродственных классическим «эукариотическим» киназам (Hanks & Hunter, 1995).

Основные функции фосфорилирования-дефосфорилирования можно суммировать следующим образом:

1. Ответ на сигнальные молекулы, поступающие извне, например, гормоны (Chen et al., 1995; DeLong et al, 2002).

2. Участие в защитных реакциях при проникновении чужеродных агентов (Song et al, 1995; Loh & Martin, 1995; Dunigan & Madlener, 1995).

3". Регуляция клеточного цикла (Renaudin et al., 1996), возможно, других временных событий.

4. Ответ на неблагоприятные условия окружающей среды, например, осмотический стресс (Monks et al., 2001).

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНКИНАЗ РАСТЕНИЙ.

По аминокислотной последовательности киназного домена описанных 89-ти протеинкиназ из A. thaliana их можно объединить в несколько основных групп (Hardie, 1999).

Кальций-зависимыепротеинкиназы. Кальций — распространенный промежуточный мессенжер как в животной, так и в растительной клетке. У растений его концентрация повышается в ответ на ряд стимулов, таких как прикосновение, ветер, свет, холод, фитогормоны, солевой стресс и т. д. (Poovaiah & Reddy, 1993). В животных клетках кальций связывается с белком кальмодулином и в виде такого комплекса взаимодействует с кальмодулин-зависимыми л . протеинкиназами. Однако очищенная из сои Са - зависимая киназа активировалась Са в отсутствие экзогенного кальмодулина (Harmon et al, 1987). В растительных клетках были обнаружены кальций-зависимые киназы, имеющие каталитический киназный домен и С-концевой кальций-связывающий домен с 39% гомологией с кальмодулином и характерными для кальмодулина «EF-руками» (CDPK — calmodulin-like domain protein kinases) (Hardie, 1999; Satterlee & Sussman, 1998). Это семейство киназ не было обнаружено у грибов и животных, но описано у инфузорий и слизевиков. У A. thaliana они составляют самое многочисленное семейство протеинкиназ. причем показано, что разные изоформы экспрессируются на разных стадиях развития и в разных типах клеток, что может обеспечивать специфичность и гибкость ответа в ответ на разные стимулы, вызывающие повышение концентрации кальция (Hong et al., 1996). Разные изоформы CDPK из сои отличаются чувствительностью к кальцию и субстратной специфичностью (Lee et al, 1998).

Хотя большинство описанных растительных Са - зависимых киназ относятся к семейству CDPK, найдены и другие типы киназ. Обнаружена киназа, сходная по последовательнсти с кальмодулин-зависимой киназой млекопитающих и не имеющая кальмодулин-подобного домена (Watillon et al, 1993). Описана химерная пртеинкиназа с кальмодулин-связывающим доменом и доменом, напоминающим кальций-связывающий белок визинин. Для фосфорилирования экзогенного субстрата эта киназа нуждалась в кальмодулине, а связывание кальция визинин-подобным доменом приводило к автофосфорилированию (Patil et al., 1995; Takezawa et al., 1996). Наконец, найдены родственные CDPK киназы (CRK - CDPK-related kinase), имеющие кальмодулин-подобный домен с меньшей гомологией с кальмодулином. Такая киназа, экспрессированная в E.coli, оказалась кальций-независимой (Furumoto et al., 1996).

Протеинкиназы, родственные SNF1. Белки этой группы участвуют в ответе на недостаток глюкозы (дрожжевой SNF1) или истощение запасов АТФ (АМРК млекопитающих). Они существуют в виде гетеротримеров с каталитической а-субъединицей и некаталитическими Р~ и у-субъединицами, участвующими в регуляции и определении субстратной специфичности комплекса. Активность фермента регулируется путем его фосфорилирования киназой киназы или (у млекопитающих) повышением концентрации 5-АМФ (аллостерически или также путем активации киназы киназы) (Hardie, 1999).

В растениях обнаружено две группы родственных киназ -SnRKl (описаны две в A. thaliana), сходные с каталитическими субъединицам SNF1 и АМРК, и SnRK2 (описаны четыре в А. thaliana), родственные только в пределах киназного домена (Halford &

Hardie, 1998). Они также существуют в виде крупных мультимерных комплексов, но регуляторные (3- и/или у-субъединицы в растениях не были идентифицированы. Эти киназы не активируются АМФ, но регулируются путем предварительного фосфорилирования другими киназами, на настоящий момент не охарактеризованными. Их субстраты in vivo также не идентифицированы, хотя in vitro SnRKl фосфорилируют и инактивируют ключевые ферменты синтеза изопреноидов и сахарозы и ассимиляции азота, так что активация SnRKl-комплексов, возможно, ингибирует эти анаболические пути (Sudgen et al, 1999). Также есть данные об участии SnRKl киназ в регуляции катаболических путей на уровне экспрессии генов, в частности, в регуляции экспрессии гена сахарозосинтетазы в зависимости от наличия углеводов (Purcell et al., 1998). Таким образом, предполагаемая роль SnRKl аналогична таковой у млекопитающих и дрожжей.

SnRK2 имеют киназный домен, сходный с SNF1 и АМРК, и С-концевой домен, обычно богатый кислыми аминокислотами. Функции их неизвестны. Они имеют субстратные специфичности, сходные с SnRKl; и также регулируются путем фосфорилирования (Hardie, 1999).

Рецептор-подобные протеинкиназы. Киназы этой группы характеризуются наличием N-концевого гидрофобного хвоста, заякоренного в мембране, и внутриклеточного киназного домена. В А. thaliana описаны как минимум 18 таких киназ. По первичной последовательности киназных доменов они объединяются в отдельную группу, хотя и более разнообразную, чем другие группы. Тирозин-киназы, составляющие большую часть рецепторных киназ в клетках животных, в растениях не обнаружены (Hardie, 1999; Satterlee & Sussman, 1998).

Лиганды для растительных протеинкиназ этой группы пока не найдены, и они охарактеризованы как рецепторы на основании сходства с животными серин/треониновыми рецепторными киназами. Однако косвенные данные подтверждают их участие в ответе на внеклеточные сигналы. В частности, киназы этой группы участвуют в определении самонесовместимости у Brassicaceae (Nasrallah et al., 1994), в межклеточной сигнализации в ходе развития меристем (Torii et al., 1996), ответственны за устойчивость к патогенам (Song et al., 1995; Loh & Martin, 1995) и т. д.

Подсемейства МАР-киназ (МАРК), МАРКК и МАРККК.

Эти киназы по аминокислотной последовательности киназного домена принадлежат к разным группам, но функционально объединяются в каскады фосфорилирования, действующие в направлении МАРККК—► МАРКК—> МАРК. У дрожжей и млекопитающих они активируются факторами роста, цитокинами, различными клеточными стрессами. Геном A. thaliana кодирует как минимум семь МАРК, пять МАРКК и пять МАРККК. Представители этих групп киназ описаны также у люцерны, табака, овса и петунии. Ни один каскад у растений пока не был полностью охарактеризован, однако показано, что МАРК активируются в ответ на фитогормоны и такие стимулы как прикосновение, холодовой шок, водный стресс, повреждение, инфекции (Hardie,1999).

Циклин-зависимые киназы. Киназы этой группы участвуют в регуляции клеточного цикла. У дрожжей и млекопитающих циклин-зависимые киназы имеют минимальный киназный домен (34 кД) и могут выполнять различные функции в комплексе в различными циклинами. Кроме того, их активность регулируется взаимодействием с другими белками, а также путем фосфорилирования и дефосфорилирования другими киназами и фосфатазами. Несмотря на различия в механизмах клеточного деления между грибами, животными и растениями, основные элементы контроля клеточного цикла остались неизменными в ходе эволюции. Описанные циклин-зависимые киназы растений могут частично комплементировать соответствующие мутации у дрожжей (Ferreira et al, 1991; Hirayama et al., 1991). Кроме того, у A. thaliana клонированы гены, кодирующие различные циклины (Renaudin et al, 1996; Day & Reddy, 1998) и гомологи ряда белков, взаимодействующих с циклин-зависимыми киназами (Wang et al. 1997; de Veylder et al., 1997).

Подсемейства казеин-киназы 1 (KK1) и казеин-киназы 2

KK2). Эти киназы получили свои названия, так как их активности были впервые определены с использованием казеина молока в качестве субстрата. Обе они фосфорилируют остатки серина или треонина в контексте близлежащей кислой аминокислоты, с N-концевой стороны для КК1 и с С-концевой стороны для КК2, особенно существенны положения соответственно —3 и +3. Интересно, что роль кислых остатков могут выполнять фосфоаминокислоты, поэтому действие других протеинкиназ может создавать сайты фосфорилирования для КК1 и КК2. Уровень активности обеих этих киназ in vivo остается относительно постоянным, а функции их субстратных белков могут регулироваться другими киназами и фосфатазами, которые создают или уничтожают соответствующие сайты фосфорилирования (Hardie, 1999).

Казеинкиназы 1 млекопитающих существуют в виде мономеров и находятся как в цитоплазме, так и в ядре. In vitro они фосфорилируют множество субстратов, но часто их действие не меняет функции мишени. У растений КК1 выделены из брокколи и А. thaliana, но их функции пока не известны (Hardie, 1999).

Казеинкиназы 2 млекопитающих существуют в виде тетрамера а2р2> в котором а-субъединица является каталитической, а р влияет на субстратную специфичность (Guerra & Issinger, 1999). а- и субъединицы клонированы из A. thaliana, кукурузы и табака (Hardie, 1999; Riera et al., 2001; Salinas et al, 2001). KK2 как растений, так и животных фосфорилируют большой набор белков, но как это влияет на их функции, неясно. Есть данные об участии КК2 табака в транскрипционной активации, индуцируемой салициловой кислотой (Hidalgo et al, 2001). Интересной особенностью КК2 является ее способность использовать ГТФ наравне с АТФ и относительная нечувствительность к общему ингибитору серин/треониновых протеинкиназ стауроспорину (Hardie, 1999; Guerra & Issinger, 1999).

Помимо описанных, в растениях найдены еще некоторые слабо охарактеризованные протеинкиназы, не попадающие по последовательности ни в одну из групп.

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ

Геномы РНК-содержащих вирусов растений сравнительно невелики, и не обеспечивают существеной автономии вируса внутри клетки с дублированием или замещением функций хозяйских белков, как это бывает у крупных ДНК-содержащих вирусов или бактериофагов. Они должны максимально использовать возможности хозяина и органично вписываться в существующие системы биосинтеза белка, транспорта макромолекул и т.д. Существует множество примеров виртуозного использования вирусами хозяйских механизмов в своих целях. Поскольку фосфорилирование белков участвует в регуляции большинства процессов внутри клетки, следует ожидать, что вирусные белки также могут подвергаться фосфорилированию и дефосфорилированию в ходе развития инфекции.

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ. фосфорилирование транспортного белка вируса табачной мозаики (ВТМ) и его роль в развитии вирусной инфекции.

На настоящий момент наиболее изученным растительным вирусом остается ВТМ, относящийся к группе тобамовирусов (Heinlein, 2002). Его геном представлен одноцепочечной (+)РНК длиной около 6400 нуклеотидов и кодирует два компонента репликазы, транспортный белок ЗОкДа и белок оболочки 17,5 кДа. Репликаза транслируется непосредственно с геномной РНК, два других белка - с субгеномных РНК (Meshi et al., 1982; Lehto et al., 1990).

Попадая в клетку, вирионы ВТМ подвергаются котрансляционному раздеванию (Mundry et al., 1991). Новосинтезированная репликаза начинает синтез РНК, в том числе субгеномной для транспортного белка. Образуются крупные вирусные "фабрики" репликации, связанные с эндоплазматическим ретикулумом, в которых содержатся РНК, репликаза и транспортный белок (Heinlein et al, 1998). Из первично инфицированной клетки вирус через плазмодесмы проникает в соседние клетки межклеточный транспорт), выходит в проводящие пути и проникает в неинокулированные листья (дальний транспорт). Развивается системная инфекция. Транспортный белок ВТМ не участвует в репликации, но необходим как для межклеточного, так и для дальнего транспорта ВТМ (Meshi et al, 1987; Atabekov & Taliansky, 1990).

Известны следующие функциональные свойства транспортного белка ВТМ (Rhee et al, 2000):

1) ТБ ВТМ способен неспецифически связывать одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Предполагается, что обнаруженные протяженные, неструктурированные РНП-комплексы представляют собой транспортную форму, в которой РНК ВТМ перемещается через плазмодесмы (Citovsky et al., 1990, 1992).

2) ТБ ВТМ, взаимодействуя с РНК, подавляет ее способность транслироваться in vitro. Предполагается, что in vivo РНК таким образом исключается из процессов репликации/трансляции и направляется к плазмодесмам для транспорта в соседние клетки (fCarpova et al, 1997, 1999).

3) ТБ ВТМ взаимодействует с элементами цитоскелета, с микротрубочками (Heinlein et al, 1995; McLean et al, 1995; Mas & Beachy, 1998; Lazarovitz & Beachy, 1999) и, в меньшей степени, с актиновыми микрофиламентами (McLean et al, 1995). Предполагалось, что цитоскелет используется для внутриклеточного транспорта комплекса ТБ-РНК по направлению к плазмодесмам (Boyko et al., 2000). Однако есть данные о том, что взаимодействие с микротрубочками не является необходимым для межклеточного транспорта (Gillespie et al, 2002).

4) ТБ ВТМ взаимодействует с пектинметилэстеразой, ассоциированной с клеточными стенками (Dorokhov et al., 1999; Chen et al, 2000), что может рассматриваться как первый шаг в движении ТБ к плазмодесмам. Делеция домена, ответственного за связывание с пектинметилэстеразой, подавляет межклеточный транспорт ВТМ (Chen et al., 2000).

5) ТБ ВТМ взаимодействует с плазмодесмами и увеличивает их пропускную способность (Wolf et al., 1989; Ding et al, 1992; Waigmann et al, 1994), что обеспечивает прохождение как свободного ТБ, так и транспортного комплекса в соседнюю клетку. Пропускная способность модифицированных плазмодесм (2.4-3.1 нм) сопоставима с диаметром ТБ-РНК комплексов (1.5-2.0 нм) (Wolfe? al., 1989; Citovsky et al, 1992).

В ряде работ было показано, что транспортный белок ВТМ может подвергаться фосфорилированию. По данным Citovsky с соавторами (1993) 30К способен фосфорилироваться in vitro протеинкиназной активностью, ассоциированной с фракцией клеточных стенок, по остаткам Ser-258, Thr-261 и Ser-265. Те же аминокислотные остатки фосфорилировались в растениях N. tabacum и N. benthamiana, экспрессирующих ТБ ВТМ (Waigmann et al, 2000).

Waigmann с соавторами (2000) на основании полногеномной копии ВТМ создали конструкции (а) с заменами этих трех аминокислот на остатки аспарагиновой кислоты, имитирующей фосфорилированное состояние, (б) и с делецией С-конца ТБ, содержащего сайты фосфорилирования. В опытах с микроинъекциями экспрессированного в E.coli транспортного белка они показали, что в N. tabacum только нативный и делетированный, но не «фосфорилированный» ТБ способны увеличивать пропускную способность плазмодесм,. Напротив, в N. benthamiana ТБ увеличивал пропускную способность плазмодесм независимо от внесенных мутаций. Более того, ВТМ с транспортным белком, содержащим замены, имитирующие фосфорилированное состояние, оказался не способен заражать растения N. tabacum. Однако такой вирус заражал растения N. benthamiana, а также протопласты, полученные из обоих хозяев. Репликация и накопление геномной и субгеномной РНК не были нарушены. Способность транспортного белка связывать РНК и пектинметилэстеразу также не изменилась по сравнению с диким типом. Таким образом, предполагается, что фосфорилирование блокирует способность ТБ изменять SEL плазмодесм и осуществлять транспортную функцию.

Более того, эффект фосфорилирования зависит от вида растения-хозяина. Видимо, механизмы транспорта у N. benthamiana и N. tabacum отличаются. Стратегия инактивации ТБ путем фосфорилирования, используемая N. tabacum, неэффективна у N. benthamiana, что согласуется с известным фактом, что N. benthamiana - один из самых восприимчивых к вирусным инфекциям хозяев.

Негативная регуляция ТБ ВТМ может иметь биологический смысл. Непрерывная повышенная проницаемость плазмодесм для макромолекул может нарушить нормальное взаимодействие между клетками. Поэтому транспорт должен осуществляться локально и контролируемо. В отличие от других белков ВТМ, экспрессируемых в течение всего инфекционного цикла, транспортный белок синтезируется интенсивно и кратковременно, максимальная экспрессия наблюдалась примерно через сутки после заражения (Epel et al., 1996; Padgett et al., 1996; Heinlein et al., 1998). Однако время жизни его достаточно велико, и требуется ускоренная инактивация, возможно, путем фосфорилирования. Орагка с соавторами (1997) показали, что что пропускная способность плазмодесм увеличена только на переднем фронте распространяющейся зоны инфекции ВТМ, хотя транспортный белок присутствует в неактивной форме и в плазмодесмах клеток, расположенных в центре этой зоны.

С другой стороны, делеция С-конца, путем фосфорилирования которого осуществляется негативная регуляция, не нарушает транспорт через плазмодесмы и развитие вирусной инфекции (Gafny et al., 1992; Boyko et al., 2000; Waigmann et al., 2000). Как описано выше, в растениях N benthamiana эта регуляция также может отсутствовать (Waigmann et al., 2000). Таким образом, не вполне понятно, каковы преимущества этого механизма и почему он развился и сохранился в процессе эволюции.

У растений Arabidopsis thaliana, трансгенных по 30К или зараженных ВТМ, описано протеолитическое отщепление N-конца 30К, приводящее к нарушению транспортной функции (Hughes et al., 1995). Однако это происходит на поздних стадиях заражения (на 14-ый день после инокуляции белок был еще полноразмерным), и механизмом быстрой инактивации, заменяющим фосфорилирование, не выявляемое у A. thaliana, служить не может.

Кроме инактивации путем фосфорилирования, в ходе инфекционного цикла уменьшается и количество ТБ. К моменту максимального накопления вируса оно заметно падает, и модифицированный транспортным белком эндоплазматический ретикулум возвращается в преинфекционное состояние (Heinlein et al., 1998; Reichel & Beachy, 1998). Есть данные о том, что деградация ТБ ВТМ осуществляется с участием 268-протеасом и для этого процесса существенно взаимодействие с микротрубочками (Reichel & Beachy, 2000; Gillespie et al, 2002).

Другая важная роль фосфорилирования ТБ ВТМ переключение транспортной и репликативной/трансляционной функций вирусной РНК. Karpova с соавторами (1997, 1999) показали, что связывание РНК ВТМ с транспортным белком приводит к подавлению ее трансляции in vitro и неспособности заражать протопласты. Однако такие комплексы могут инфицировать интактные растения. Было высказано предположение, что in vivo активация комплекса ТБ-РНК происходит в ходе его прохождения через плазмодесмы и осуществляется путем фосфорилирования. Действительно, фосфорилирование транспортного белка фракцией клеточных стенок или препаратом протеинкиназы С восстанавливает трансляцию связанной с ним РНК in vitro и способность заражать протопласты. Также было показано, что фосфорилирование ТБ несколько уменьшает его РНК-связывающую способность, а также существенно понижает устойчивость РНК в составе комплекса к действию РНКаз. Эти явления могут быть связаны с изменением конформации фосфорилированного ТБ и характера взаимодействия ТБ-РНК или ТБ-ТБ в составе комплекса. Таким образом, можно предполагать, что вирусная РНК в составе транспортной формы исключается из процесса трансляции, но в ходе прохождения через плазмодесмы ТБ фосфорилируется и проникшая в соседнюю клетку РНК вновь начинает функционировать в качестве матрицы.

Помимо протеинкиназной активности, ассоциированной с клеточными стенками, описано фосфорилирование ТБ ВТМ цитоплазматической фракцией из листьев табака и суспензионной культуры протопластов (Watanabe et al, 1992; Haley et al, 1995).

Определенные в этих работах сайты фосфорилирования не соответствуют результатам Citovsky с соавторами (1993). По данным Watanabe с соавторами (1992) ТБ ВТМ фосфорилируется в пределах 234-261 аминокислотных остатков, Haley с соавторами (1995) указывают остатки 61-114 и 212-268. Возможно, in vivo ТБ ВТМ способен фосфорилироваться разными киназами по разным сайтам. Физиологическая роль фосфорилирования ТБ цитоплазматическими киназами не показана.

Были охарактеризованы протеинкиназы мембранной фракции, фосфорилирующие ТБ ВТМ. Интересно, что сайты фосфорилирования, определенные группой Citovsky (1993), не соответствуют консенсусам для известных протеинкиназ. По их данным киназная активность присутствовала преимущественно в листьях, возрастала в ходе созревания листа и коррелировала с развитием вторичных плазмодесм, известных как места накопления

ЗОК (Tomenius et al, 1987; Ding et al., 1992). Также было показано, что эта киназная активность максимальна при слабощелочных рН и

2+ 2+ требует присутствия ионов Mg , но не Са (Waigmann et al., 2000). Использование ингибиторов протеинкиназ (Карпова и др., 2002) дало следующие результаты: протеинкиназы клеточных стенок оказались нечувствительны к стауроспорину (ингибитору серин/треониновых протеинкиназ), генистеину (подавляющему активность тирозиновых киназ) и Н-89 (ингибитору цАМФ-зависимых протеинкиназ), но их активность снижалась в присутствии сурамина и кверцетина -ингибиторов казеинкиназы 2. Однако ни один из использованных ингибиторов не подавлял фосфорилирование полностью. Таким образом, в фосфорилировании in vitro транспортного белка ВТМ участвуют протеинкиназы из фракций клеточных стенок N. glutinosa,

N. benthamiana и N. tabacum, относящиеся к типу КК2 и, вероятно, другие типы киназ.

Фосфорилирование транспортного белка вируса мозаики томата.

Транспортный белок другого тобамовируса — вируса мозаики томата (ВМТ) - также может подвергаться фосфорилированию. Kawakami с соавторами (1999) показали, что выделенный из зараженных ВМТ протопластов транспортный белок содержит остатки фосфосерина в положениях 37 и 238. Замена серина-238 на аланин никак не сказывалась на свойствах белка и инфекционности вируса. Однако вирус терял способность заражать растения N. tabacum при заменах серина-37 не только на. аланин или глутаминовую кислоту, но и на треонин. То есть для сохранения инфекционности существенно присутствие и/или фосфорилирование в этом положении именно серина. Серин в положении 37 присутствует в транспортном белке многих тобамовирусов.

Интересно, что отсутствие фосфорилирования в этом положении подавляло и фосфорилирование серина-238. Вероятно, фосфорилирование серина-37 вызывает конформационные изменения белка и делает серин-238 доступным для второй киназы. В свою очередь, замены на аланин остатков серина в положениях 18 и 75, которые сами не фосфорилируются, снижают эффективность фосфорилирования серина-37 и накопления мутантных белков.

Очевидно, мутации в положении 37 затрагивают несколько разных функций транспортного белка. Авторы показали, что для связывания ТБ с микротрубочками существенен отрицательный заряд - с ними связывался белок с заменой серина на треонин или глутаминовую кислоту, но не на аланин. А на время жизни белка влияет сама возможность фосфорилирования - ТБ с заменами серина на аланин и глутаминовую кислоту разрушался заметно быстрее, чем белок дикого типа, ТБ с треонином-37 имел промежуточное время жизни. Влияние замен серина-37 на способность белка связывать РНК и увеличивать пропускную способность плазмодесм не исследовалось (Kawakami etal, 1999).

В работах другой группы (Matsushita et al., 2000, 2003) иммобилизованный транспортный белок ToMV связывал киназу из растворимой фракцией из листьев N. tabacum или суспензионной культуры табачных протопластов BY-2 и фосфорилировался ею. Замены серина-37 и серина-238 не влияли на фосфорилирование, но оно полностью подавлялось делецией девяти С-концевых аминокислот, включая треонин-256, серин-257, серин-261 и серин-263. Делеция не влияла на связывание белка с киназой, то есть С-конец содержит сайты фосфорилирования, но не участвует в образовании комплекса.

Анализ с использованием ингибиторов показал, что фосфорилирование ТБ подавлялось в присутствии гепарина, сурамина и кверцетина - ингибиторов казеинкиназы 2, и не изменялось в присутствии других использованных ингибиторов. На участие в процессе фосфорилирования ТБ КК2 указывает и использование киназой ГТФ наравне с АТФ. Авторы клонировали каталитическую субъединицу казеинкиназы 2 из N. tabacum и показали, что она также способна связывать и фосфорилировать иммобилизованный транспортный белок ToMV. Однако специфичность рекомбинантной КК2 отличалась от КК2-подобной клеточной киназы - первая фосфорилировала серин-261, вторая - серин-261 и треонин-256, и обе фосфорилировали дополнительные остатки серина вне концевого 9 аминокислотного фрагмента. Разница в специфичности может быть обусловлена отсутствием в рекомбинантной киназе регуляторной Р~ субъединицы, а также наличием других изоформ каталитической субъединицы в клеточном экстракте. На существование близкородственных генов в табаке указывают результаты гибридизации по Саузерну.

Кажущееся противоречие с результатами Kawakami (1999) можно объяснить тем, что Matsushita с соавторами (2000) исследовали не равновесное состояние в клетке, где присутствует смесь различных киназ и фосфатаз, а киназу, способную образовывать стабильный комплекс с транспортным белком. Очевидно, что такой подход может давать результаты, существенно отличающиеся от событий in vivo.

В то же время результаты Matsushita согласуются с данными, полученными для ВТМ. Треонин-256, серин-257, серин-261 и серин-263 транспортного белка вируса мозаики томата по своему положению соответствуют остаткам серина-258, треонина-261 и серина-265 в С-конце 30К ВТМ. Те и другие фосфорилируются КК2-подобными киназами. Можно предполагать, что фосфорилирование этих белков приводит к аналогичным эффектам. Например, было бы интересно проверить влияние фосфорилирования на РНК-связывающие свойства ТБ ВМТ.

Однако данные о внутриклеточной локализации киназ, ответственных за фосфорилирование транспортных белков ВТМ и ВМТ, противоречат друг другу. Возможно, несоответствие результатов вызвано разницей методов, примененных разными авторами. Может быть, в условиях экспериментов Citovsky ТБ ВМТ будет фосфорилироваться мембрано-ассоциированными киназами так же, как киназами растворимой фракции, использованными в работах

Matsushita с соавторами. Однако нельзя исключить возможность, что транспортные белки разных видов действительно фосфорилируются разными киназами. фосфорилирование транспортных белков других вирусов растений.

Кроме тобамовирусов, известны случаи фосфорилирования транспортных белков нескольких вирусов других групп.

Вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК) — флоэмо-специфический лютеовирус. Его геном представлен одноцепочечной (+)-РНК длиной 5,9 kb. 17К белок BCJIK обладает способностью неспецифически связывать одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Показано, что эту функцию осуществляет его основная С-концевая часть (Tacke et al., 1991), а N-концевой фрагмент ответственен за димеризацию, наблюдаемую in vitro и in vivo (Tacke et al., 1993). В зараженных BCJIK и трансгенных по 17К растениях картофеля этот белок преимущественно выявляется в плазмодесмах, соединяющих ситовидные элементы и клетки-спутницы (Schmitz et al, 1997). На основании этих наблюдений было высказано предположение, что 17К - флоэмо-специфичный транспортный белок ВСЛК, образующий комплекс с РНК ВСЛК и осуществляющий ее транспорт через плазмодесмы флоэмы. Было показано, что в растении транспортный белок ВСЛК существует в виде фосфопротеина и что эта модификация не влияет на его РНК-связывающие свойства (Tacke et al., 1993).

Sokolova с соавторами (1997) показали, что 17К выделяется преимущественно с мембранной фракцией листьев картофеля. Фрагменты 17К, включающие амнокислотные остатки 1-54, 55-95 и 93-156, были экспрессированы в E.coli. (полноразмерный белок продуцировался бактериями в нерастворимой форме). Оказалось, что мембранная фракция из листьев картофеля способна in vitro фосфорилировать пептид 55-95. Эта киназная активность оказалась Са2+- и фосфолипид-зависимой и подавлялась специфическим ингибитором протеинкиназы С (ПКС) - пептидом, соответствующим псевдосубстратной автоингибиторной последовательности животной ПКС. Ранее были описаны киназы растений с биохимическими свойствами ПКС (Morello et al., 1993; Muszynska et al., 1993; Park & Chae, 1990). Кроме того, Sokolova с соавторами показали, что протеинкиназа С из мозга крыс способна фосфорилировать пептиды 55-95 и 93-156. Разницу в специфичности киназ они объясняют тем, что ПКС - мультигенное семейство и различные его представители могут иметь разные свойства. Физиологическая роль фосфорилирования ТБ ВСЛК не показана, но по аналогии с ЗОК ВТМ Sokolova с соавторами (1997) предполагают, что фосфорилирование может служить механизмом регуляции активности 17К.

Вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ) - представитель группы тимовирусов. Его транспортный белок 69К не участвует в репликации вируса, но необходим для системной инфекции и, возможно, для ближнего транспорта ВЖМТ (Bozarth et al, 1992). Он очень богат пролином (19,4%), длиннее других известных транспортных белков и не имеет с ними структурного сходства (Mushegian & Koonin, 1993). Аномальная электрофоретическая подвижность на уровне 80К предполагает возможные посттрансляционные модификации белка. Seron с соавторами (1996) экспрессировали 69К в бакуловирусной системе и показали, что он фосфорилирован, но не гликозилирован, и выявляется преимущественно в мембранной и в меньшей степени в цитоплазматической фракции. Связь с мембранами подтверждается и сложностью выделения 69К — для этого требуются сильные денатурирующие условия. Электрофоретическая подвижность 69К, выделенного из зараженных ВЖМТ растений и клеток насекомых, не отличается. Кроме того, ранее была показана корреляция внутриклеточной локализации белков, экспрессируемых в клетках растений и насекомых (Pascal et al, 1994). Таким образом, транспортный белок ВЖМТ представляет собой связанный с мембранами фосфопротеин. Выяснение роли фосфорилирования 69К требует дальнейших исследований.

Есть данные о фосфорилировании белка За вируса мозаики огурца (ВМО) (Matsushita et al, 2002). Транспортный белок За и белок оболочки необходимы для межклеточного транспорта РНК ВМО и для системной инфекции (Canto et al, 1997). Было показано, что За, экспрессируемый в трансгенных растениях табака, выделяется в фосфорилированной форме и содержит остатки фосфосерина, но не фосфотреонина и фосфотирозина.

Было показано фосфорилирование 50К транспортного белка вируса хлоротичной пятнистости листьев яблони (ВХПЛЯ) (Sato et al., 1995). Этот вирус относится к роду Trichovirus, имеет очень гибкие нитевидные частицы и геномную (+)-РНК длиной около 7550 нуклеотидов. 50К белок выявляется в плазмодесмах как молодых, так и зрелых листьев, способен увеличивать их пропускную способность и формировать трубки на поверхности протопластов (Satoh et al, 2000). Влияние фосфорилирования на функции 50К не показано.

Таким образом, для нескольких групп вирусов показано фосфорилирование транспортных белков. Они обладают разной структурой и свойствами, вероятно, используют разные механизмы транспорта, и следует ожидать, что фосфорилирование этих транспортных белков может играть разную роль в ходе инфекционного процесса. Описаны киназы различной специфичности и локализации, участвующие в их фосфорилировании. Несмотря на недостаточную изученность процессов транспорта, очевидно, что фосфорилирование играет существенную роль в их регуляции.

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ.

Помимо транспортных белков, показано фосфорилирование других неструктурных белков вирусов растений. фосфорилирование 2а компонента репликазы вируса мозаики огурца.

Вирус мозаики огурца (ВМО) имеет (+) РНК геном, состоящий из трех фрагментов. РНК1 и РНК2 кодируют белки - компоненты полимеразы, обозначенные соответственно как 1 а (11ОК) и 2а (97К). Для репликации вирусной РНК необходимы оба этих белка и один или более хозяйских факторов (Hayes & Buck, 1990). 2а имеет консервативный домен, общий для многих вирусных RdRp,- включая Mg -связывающий GDD-мотив (Argos, 1988). N-конец la белка имеет сходство с nsPl белком вируса Синдбис, участвующего в кэпировании РНК, а С-конец имеет сходство со многими вирусными и клеточными хеликазами (Gorbalenya et al., 1989). У родственного ВМО вируса мозаики костра показано взаимодействие 1а и 2а белков. Для образования комплекса необходимо и достаточно наличие N-конца 2а белка (115 а. к.) и хеликазо-подобного домена 1а белка (>50 кДа) (O'Reilly etal, 1995).

Было показано, что 2а белок ВМО in vivo и in vitro может подвергаться фосфорилированию (Kim et al., 2002). В зараженных ВМО протопластах фосфорилирование наблюдалось на поздних стадиях инфекции, между 48 и 60 часами после инокуляции, в то время как накопление нефосфорилированного белка выявлялось уже через три часа после заражения. Опыты по фосфорилированию in vitro показали, что 2а способен фосфорилироваться киназами мембранной фракции из листьев табака, но не цитоплазматической фракции. Были выявлены как минимум три мембрано-ассоциированных киназы с разными молекулярными массами, фосфорилирующие 2а.

Использование делеционных мутантов 2а показало, что сайты фосфорилирования находятся в трех фрагментах, ограниченных аминокислотными остатками 1-126, 290-335 и 605-685. Все эти фрагменты содержат остатки серина, треонина и тирозина. Фрагмент 1-126 в двугибридной системе и в опытах по ко-иммунопреципитации оказался необходимым и достаточным для взаимодействия с 1а белком. Было показано, что это взаимодействие подавлялось фосфорилированием белка 2а.

Обсуждается возможная биологическая роль этого явления. Из кинетики фосфорилирования 2а следует, что оно происходит в то время, когда репликация вируса большей частью завершена. Во время экспоненциальной фазы репликации (в протопластах она наблюдается через 3-6 часов после инокуляции - Gal-On et al., 1994, 1995; Kim & Palukaitis, 1997) фосфорилирование 2a не было выявлено. Возможно, именно фосфорилирование ответственно за разрушение репликативного комплекса и выход на плато или снижение РНК-полимеразной активности. Однако непонятно, чем определяется время фосфорилирования, так как киназная активность не индуцируется вирусной инфекцией, а предсуществует в незараженных листьях. Возможно, на ранних стадиях инфекции белок 2а защищен от фосфорилирования взаимодействием с хозяйским(и) белком(ами). После фосфорилирования и распада репликативного комплекса белок 2а может разрушаться или, как предполагают Kim с соавторами (2002), выполнять другие функции, например, связанные с транспортом вируса в растении. фосфорилирование и убиквитинирование РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ).

Показано фосфорилирование компонента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса желтой мозаики турнепса (66К), относящегося к группе тимовирусов (Hericourt et al., 2000). Экспрессированный в бакуловирусной системе белок содержал в N-конце остатки фосфосерина и фосфотреонина. Последовательность, содержащая сайты фосфорилирования, не является консервативной за исключением положения 80, в котором у всех тимовирусов находится серин или треонин. Однако у всех вирусов этой группы эта область обогащена остатками пролина, серина, треонина и кислых аминокислот, что характерно для так называемых PEST-последовательностей. Эти последовательности являются сигналами нестабильности и присутствуют в белках с малым временем жизни (Rogers et al., 1986). Описаны PEST-последовательности, служащие сайтами фосфорилирования, и это фосфорилирование необходимо для последующего присоединения убиквитина и деградации белков в 26S-протеасомах (Marchal et al, 1998; Lin et al, 1996; banker et al, 1996). Hericourt с соавторами (2000) подтвердили, что 66К, экспрессированный в бакуловирусной системе, содержит присоединенные молекулы убиквитина. Можно предполагать, что фосфорилирование и убиквитинирование белка 66К происходят in vivo, и последующая протеасомная деградация ответственна за его крайне низкое содержание в инфицированых клетках.

Фосфорилирование NS-белка вируса розеточной карликовости пшеницы.

Вирус розеточной карликовости пшеницы (ВРКП) — растительный рабдовирус. Его геном представлен одноцепочечной (-) РНК и кодирует 5 белков: поверхностный гликопротеин (G), белок матрикса (М), белок нуклеокапсида (N), компонент РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) и структурный белок (NS). Белки N, NS и L связаны с РНК и вместе образуют нуклеокапсид, NS и L являются компонентами РНК-зависимой РНК-полимеразы. Было показано, что белок NS как в составе нуклеокапсида, так и экспрессированный в Е. coli, способен фосфорилироваться в присутствии нуклеокапсида. Автофосфорилирование белка NS не было показано (Xie et al, 2003). Авторы считают, что киназная активность ассоциирована с белком L, так как реакция зависела от его наличия и концентрации.

У родственного рабдовируса везикулярного стоматита (ВВС) белок NS является ключевой субъединицей RdRp-комплекса. В вирионах и зараженных ВВС клетках он присутствует в нескольких фосфорилированных формах. Показано существование множества сайтов фосфорилирования в двух доменах. Фосфорилирование специфических остатков серина и треонина в кислом N-концевом домене необходимо для транскрипционной активности, в то время как оптимальная репликативная активность требует фосфорилирования в С-концевом домене (Pattnaik et al, 1997; Hwang et al, 1999).

Отсутствие фосфорилирования подавляет обе активности (Wu et al., 2002).

Для ВВС показано последовательное фосфорилирование белка NS клеточной(ыми) киназой(ами) и киназой, ассоциированной с белком L. При этом фосфатные группы, присоединяемые клеточной киназой, стабильны, а вводимые L-ассоциированной киназой быстро гидролизуются в ходе транскрипции (Barik & Banerjee, 1992а). Клеточная киназа была охарактеризована как КК2 (Barik & Banerjee, 1992b).

Для другого рабдовируса, вируса бешенства, было показано фосфорилирование белка Р (гомолог NS) клеточными киназами из мозга крысы - специфическими изомерами протеинкиназы С и гепарин-чувствительной протеинкиназой, ранее не описанной. Интересно, что эта протеинкиназа по всей видимости упакована в вирионы и имеет в их составе те же биохимические характеристики, как и очищенная из клеток (Gupta et al., 2000).

Таким образом, по аналогии с ВВС можно предполагать, что NS белок ВРКП является транскрипционным фактором, отвечающим за регуляцию транскрипции и репликации вирусной РНК и переключение этих активностей в ходе цикла размножения. Вероятно, его активность модифицируется фосфорилированием. Для определения сайтов фосфорилирования, выявления ответственных за него протеинкиназ и точной роли фосфорилирования-дефосфорилирования белка NS в жизненном цикле ВРКП вируса требуются дальнейшие исследования.

Итак, для трех групп вирусов показано фосфорилирование белков - компонентов РНК-зависимой РНК-полимеразы. Это фосфорилирование приводит к совершенно различным эффектам препятствует взаимодействию с другим компонентом полимеразы в случае кукумовируса мозаики огурца, предположительно влияет на время жизни белка тимовируса желтой мозаики турнепса и служит регулятором репликативной/транскрипционной активности для рабдовируса ВРКП. Жизнь прекрасна своим разнообразием. фосфорилирование белка Pnsl2 вируса карликовости риса.

Вирус карликовости риса (ВКР) относится к роду Phytoreovirus семейства Reoviridae. Этот вирус способен реплицироваться как в клетках злаков, так и насекомых-переносчиков. Геном ВКР представлен 12 сегментами двухцепочечной РНК длиной от 3.5 до 1.1 т. п. н. Неструктурный белок Pnsl2 кодируется большой ОРТ самого маленького сегмента. Функции его не описаны. По своей последовательности Pnsl2 не похож на известные белки других фитореовирусов и характеризуется высоким содержанием остатков серина и треонина, особенно в N-концевой части. Было показано, что в инфицированных ВКР клетках ячменя Pnsl2 локализован в цитоплазме (Suzuki et al., 1999). Из зараженных клеток насекомых Pnsl2 выделяется в фосфорилированной форме. Кроме того, рекомбинантный Pnsl2 способен фосфорилироваться in vitro киназными активностями клеток как хозяйских видов (рис, ячмень, пшеница, цикадка), так и видов, не являющихся хозяевами ВКР (табак, белый клевер, москит, человек) (Suzuki et al., 1999). Таким образом Pnsl2 - цитоплазматический неструктурный фосфопротеин. Значение его фосфорилирования на настоящий момент не известно.

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ.

Фосфорилирование капсидного белка вируса мозаики цветной капусты.

Вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК) относится к группе параретровирусов. Его капсидный белок синтезируется в виде предшественника (СР56), а затем в несколько этапов процессируется до СР44, СР39 и СР37. СР44 начинается с 77 а. к. остатка белка-предшественника, N-концы СР37 и СР39, а также С-концы всех трех белков точно не установлены. Предполагается, что СР39 образуется из СР44 удалением N-концевого фрагмента, а из СР39 путем отрезания С-конца получается СР37 (Chapdelaine et al, 2002). Ранее было показано, что в вирионах содержатся почти исключительно СР44 или СР37. То есть, процессинг происходит быстро и, вероятно, кооперативно, промежуточные формы (СР39) выявляются в минимальных количествах.

СР44 содержит в N-конце сигнал нестабильности (PEST-последовательность) (Karsies et al., 2001). Затем следуют: сигнал ядерной локализации (Leclerc et al., 1999); домен, ответственный за сборку (Chapdelaine & Hohn, 1998); участок, связывающий PHK(Chapdelaine & Hohn, 1998), включая мотив цинкового пальца, участвующего в узнавании сигнала упаковки в лидерной последовательности РНК ВМЦК (Guerra-Peraza et al, 2000). В СР37 мотив цинкового пальца отсутствует (Chapdelaine et al., 2002). Показано, что что СР44, но не СР37 и СР39, способен фосфорилироваться вирион-ассоциированной киназой, обладающей свойствами КК2. Фосфорилирование происходит по остаткам серина 82, 86 и 88. По крайней мере один из них, но не какой-то определенный, необходим для инфекционности вируса (Chapdelaine et al., 2002).

Интересно, что как фосфорилируемый N-конец СР44, так и мотив цинкового пальца в его С-конце, существенны для заражения, но в зрелом капсидном белке СР37 обе эти последовательности отсуствуют. Предполагается, что эти полипептиды требуются на ранних стадиях инфекции, в процессе сборки и/или обратной транскрипции. Точная роль фосфорилирования капсидного белка в жизненном цикле ВМЦК пока не известна.

Фосфорилирование белка VPg А-вируса картофеля.

А-вирус картофеля (АВК) - представитель группы потивирусов. Его геном представлен одноцепочечной (+)-РНК длиной 9,5 тысяч оснований. Она кодирует полипротеин, процессируемый тремя вирусными протеиназами с образованием 10 белков.

На 5'- конце геномной РНК находится ковалентно связанный через остаток тирозина белок VPg. Его возможная роль заключается в инициации трансляции вирусной РНК. Для родственного потивируса, вируса мозаики турнепса, показано образование комплекса VPg с фактором eIF4E и его корреляция с инфекционностью вируса (Leonard et al., 2000). Помимо участия в трансляции предполагается функционирование VPg потивирусов как праймера для синтеза вирусной РНК, было показано его взаимодействие in vitro с вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (Fellers et al., 1998). Также VPg необходим для дальнего транспорта вирусной инфекции в зараженном растении. Показано, что его мутации нарушают выход вируса во флоэму (Rajamaki & Valkonen, 2002).

Рекомбинантный VPg и VPg в составе вирионов способны фосфорилироваться протеинкиназной активностью экстракта листьев табака (Ivanov et al, 2001; Puustinen et al, 2002). Эта киназная активность имеет серин/треониновую специфичность, стимулируется Мп2+ эффективнее, чем Mg2+, и не зависит от Са2+ .

Puustinen с соавторами (2002) исследовали фосфорилирование VPg дикого типа и его мутантов. Было показано, что замена серина-185 на лейцин не влияла на характер фосфорилирования VPg киназами из листьев табака, но существенно изменяла рисунок фосфорилирования киназами Solarium commersonii. Эта же замена снижала накопление вируса в инокулированных листьях S. commersonii и задерживала системную инфекцию (Rajamaki & Valkonen, 2002), в то время как в растениях N. tabacum разница в инфекционности АВК дикого типа и его мутантов не выявлялась. Таким образом, наблюдается корреляция между присутствием серина в положении 185 VPg и нормальным развитием вирусной инфекции в S. commersonii, но не в N. tabacum. Очевидно, в этих двух видах растений хозяйские белки по-разному взаимодействуют с вирусным VPg. Неизвестно, связан эффект замены серина-185 напрямую с фосфорилированием или она влияет на конформацию белка, фосфорилирование VPg по другим сайтам и т. д.

Фосфорилирование белка оболочки А-вируса картофеля.

Для потивирусов не известна транспортная форма, посредством которой они перемещаются в зараженном растении. Они не кодируют отдельного транспортного белка и транспортные функции выполняются несколькими полифункциональными белками, включая белок оболочки (БО), компонент протеазы НС-Pro, белок цилиндрических включений и VPg. Ivanov с соавторами (2001, 2003) показали, что два из четырех белков, участвующих в транспорте - БО и VPg - фосфорилируются протеинкназами N. tabacum.

Согласно их результатам, протеинкиназа(ы) тотального экстракта листьев табака, способная фосфорилировать БО АВК, также фосфорилировала ТБ ВТМ. Обе киназные реакции подавлялись стауроспорином в концентрации 1мМ, не зависели от присутствия ионов Са2+, подавлялись микромолярными концентрациями Zn2+ и Cd и активировались Мп эффективнее, чем Mg (Ivanov et al., 2001).

Возможный механизм стимуляции протеинкиназ двухвалентными катионами металлов заключается в образовании комплекса этих катионов с АТФ и дальнейшего использования ферментом этого комплекса. Однако в данном случае Мп продолжал стимулировать каталитическую активность при концентрации существенно более высокой, чем та, которая необходима для полного насыщения присутствовавшего в реакционной смеси АТФ. Это говорит о дополнительном активирующем взаимодействии катионов с ферментом, помимо образования комплекса с АТФ. Таким свойством обладают некоторые животные тирозинкиназы, например Csk (Sun &

Budde, 1999). Для тех же киназ характерно ингибирование ферментативной активности микромолярными концентрациями Zn и

2+

Cd в присутствии тысячекратного избытка Мп . Таким образом, растительные протеинкиназы, участвующие в фосфорилировании БО АВК и ТБ ВТМ, могут иметь общие с некоторыми животными киназами функциональные домены, ответственные за регуляцию ферментативной активности путем взаимодействия с ионами металлов (Ivanov et я/., 2001).

Для того чтобы установить, фосфорилируются БО АВК и ТБ ВТМ одной или разными киназами, были поставлены опыты по субстратной конкуренции. Авторы показали, что эффективность фосфорилирования одного из участвующих белков падает при увеличении концентрации второго, и наоборот. То есть действительно, БО АВК и ТБ ВТМ фосфорилируются одной и той же киназной активностью. Однако VPg не конкурировал как субстрат ни с одним из этих белков, то есть его фосфорилирование осуществляет другая киназа, присутствующая в тотальном экстракте листьев табака (Ivanov et al, 2001).

Далее было показано, что БО АВК способен фосфорилироваться in vitro не только в присутствии АТФ, но и ГТФ, и что эта реакция подавляется гепарином. Эти данные свидетельствуют о том, что фосфорилирование БО АВК осуществляет КК2-подобный фермент. Действительно, БО АВК и ТБ ВТМ, но не VPg оказались способны фосфорилироваться а-каталитической субъединицей КК2 из кукурузы, а также табачной КК2, очищенной путем связывания с гепарин-сефарозой. Кроме того, при инфильтрации в листовые диски 5,6-дихлоро-1 -((З-О-рибофуранозил)-бензимидазола (ДРБ), ингибитора КК2, подавлялось фосфорилирование БО АВК in vivo. В экспериментах по определению киназной активности в геле был определен размер гепарин-чувствительной киназы, фосфорилирующей БО АВК, - 39К. Он соответствует а-субъединице КК2 табака, что подтвердилось после определения последовательности двух триптических пептидов выделенного белка. Была получена рекомбинантная рКК2а табака и продемонстрирована колокализация БО АВК и табачной КК2а в зараженных протопластах (Ivanov et al., 2003).

Основным сайтом фосфорилирования оказалась очень сильная консенсусная последовательность (242-TTSEED-247), в которой фосфорилируется первый остаток треонина, в случае его отсутствия — второй. Была создана полногеномная кДНК-копия АВК, содержащая ЗФБ, слитый с БО. При заражении растений N. benthamiana флуоресценция наблюдалась через пять дней после инокуляции в листьях, подвергавшихся бомбардменту, и через семь дней - в жилках верхних листьев. Далее был исследован эффект мутаций сайта фосфорилирования в БО АВК. Авторы заменяли все три гидроксил-содержащие кислоты на этом участке на остатки (1) аланина, неспособные фосфорилироваться, (2) аспарагиновой кислоты или (3) тирозина, имитирующие, соответственно, электростатический и стерический эффекты фосфорилирования. Кроме того, был создан мутант, в котором оба треонина и серин в сайте фосфорилирования были сохранены, но последующие кислые остатки заменены на основные остатки аргинина. Все полученные мутанты оказались неспособны к межклеточному и системному транспорту. Эти данные говорят о том, что фосфорилирование необходимо для развития вирусной инфекции в растении.

Однако репликация мутантного вируса в отдельных клетках не была нарушена. Об этом свидетельствует случай реверсии аланин-243-треонин с частичным восстановлением транспортной функции. Спектры кругового дихроизма белков оболочки дикого типа и мутантного с аланиновыми заменами в сайте фосфорилирования показали, что мутация не нарушила общую вторичную структуру белка. Спектры были почти идентичны, что говорит о том, что исследованные белки имели одинаковую конформацию (Ivanov et al., 2003). i'Ui СИ,.ОКАЯ г с-с >7у»;»ч: тг; «гиНАЯ

СИ. ОТ-tKA

При экспрессии в бактериальных клетках белок оболочки АВК способен образовывать вирусоподобные частицы. Аланиновый мутант, дефектный по фосфорилированию, также образовывал такие частицы. In vivo в первично зараженных клетках N. benthamiana было показано формирование вирионов, содержащих вирусный БО с аланиновыми заменами и РНК. Таким образом, мутации, нарушающие фосфорилирование БО АВК, подавляют межклеточный транспорт вируса, но не препятствуют его репликации и образованию вирионов в отдельных инфицированных клетках (Ivanov et al., 2003).

Очищенный препарат КК2 фосфорилировал белок оболочки АВК по единственному вышеописанному сайту, но при фосфорилировании БО киназной активностью тотального экстракта табачных листьев выявлялось по крайней мере пять радиоактивных пятен на карте триптических пептидов, одно из которых совпадало с картиной для КК2. Множественность сайтов фосфорилирования говорит о том, что в фосфорилировании БО АВК iv vivo могут принимать участие несколько киназ различной специфичности. Они могут быть ответственны за остаточную киназную активность в присутствии гепарина in vitro и ДРБ in vivo. Их присутствием можно объяснить показанное ингибирование киназной активности стауроспорином, в которому КК2 нечувствительна, - в этом случае подавлялась активность других типов киназ, дающих существенный вклад в общую картину фосфорилирования. Однако описанные эксперименты по заменам аминокислот в районе 242-247 БО доказывают, что фосфорилирование именно этого сайта существенно для межклеточного транспорта АВК. Роль остальных сайтов фосфорилирования в функционировании БО АВК пока остается неизвестной.

Было исследовано влияние фосфорилирования на РНК-связывающие свойства БО АВК (Ivanov et al., 2001, 2003). Оказалось, что белок оболочки, фосфорилированный протеинкиназной активностью тотального экстракта листьев табака или очищенной КК2, связывает РНК с гораздо более низкой эффективностью. Наоборот, было показано, что БО в составе вирусной частицы не способен подвергаться фосфорилированию, а выделенный из того же препарата свободный белок - способен. То есть, в связанном с РНК белке сайты фосфорилирования недоступны ферменту. Это согласуется с данными о том, что аминокислотные остатки 242-247 находятся в коровой части белка, обращенной внутрь частицы, и не экспонированы на поверхности (Baratova et al., 2001). Остаток треонина-242 расположен внутри структурной единицы, присутствующей у многих РНК-связывающих белков. Можно ожидать, что его фосфорилирование, изменяющее заряд и, возможно, конформацию этого участка белка, должно влиять на РНК-связывающие свойства БО АВК.

Убедительной модели транспорта потивирусов и роли фосфорилирования на данный момент не существует. Высказывались предположения о том, что взаимодействие с белком оболочки на средних и поздних стадиях инфекции исключает часть РНК из процессов репликации и трансляции и направляет ее к плазмодесмам для транспорта в соседние клетки. В ходе прохождения через плазмодесмы БО фосфорилируется и в соседней клетке освобождает из комплекса РНК - по аналогии с транспортным белком ВТМ. Однако продемонстрированная неспособность БО АВК фосфорилироваться в составе вирусной частицы противоречит этой гипотезе.

Также предполагалось, что фосфорилирование свободного БО регулирует количество белка, способного взаимодействовать с РНК. На поздних стадиях инфекции он дефосфорилируется и активируется процесс образования вирусных частиц и транспорта АВК - такой механизм был предложен для регуляции сборки вирионов у вируса краснухи (Law et al., 2003).

Однако полученные данные о том, что мутации, как подавляющие фосфорилирование, так и имитирующие его, позволяют репликацию АВК только в отдельных клетках, говорят о том, что для транспорта через плазмодесмы необходим динамический процесс фосфорилирования-дефосфорилирования. Точное выяснение механизма транспорта требует дальнейших исследований.

Фосфорилирование и гликозилирование белка оболочки вируса шарки сливы.

Вирус шарки сливы (ВШС) - еще один представитель группы потивирусов. Показано, что его белок оболочки в составе вирионов фосфорилирован по остаткам серина и треонина. Кроме того, в N-концевой области (аминокислотные остатки 13-27) он содержит О-связанные остатки P-N-ацетилглюкозамина (Fernandez-Fernandez et al., 2002). Мутации сайта гликозилирования не влияли на фосфорилирование, то есть эти две модификации осуществляются по разным сайтам и независимо друг от друга. Вирус с делегированным 13-27 фрагментом белка оболочки оказался жизнеспособным, следовательно, гликозилирование не влияет на существенные функции белка оболочки. Выяснение его роли требует дальнейших исследований. I i I

О-гликозилирование - распространенная посттрансляционная модификация, описанная для белков многих эукариот, включая животных, грибы, растения, а также их паразитов. Остатки (3-N-ацетилглюкозамина присоединяются к гидроксильным группам серина или треонина. Показано влияние гликозилирования на процессы транскрипции, трансляции, ядерного транспорта и т. д. (Comer & Hart, 2000).

Все описанные на настоящий момент белки, содержащие остатки p-N-ацетилглюкозамина, оказались также фосфорили-рованными (Comer & Hart, 2000). В ряде случаев процессы фосфорилирования и гликозилирования оказываются конкурентными, затрагивающими одни и те же или соседние гидроксильные группы (Comer & Hart, 2001). Однако отношения О-гликозилирования и О-фосфорилирования, вероятно, более сложны и разнообразны и предоставляют практически неограниченные возможности для модуляции функций белков.

Ранее было показано фосфорилирование (Atabekov et al., 2001) и гликозилирование (Tozzini et al., 1994) белка оболочки Х-вируса картофеля, что явилось предпосылкой для настоящей работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовали следующие химические реактивы: бромистый этидий, бромфеноловый синий производства фирмы "Serva", (ФРГ). Агароза, легкоплавкая агароза, акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, дитиотреитол, p-меркаптоэтанол, глицин, кумасси бриллиантовый синий, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевина, гуанидин-HCl, К,К,Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), RbCl, СаС12, LiCl, Трис, - фирм "Promega", "Sigma", (США). Канамицин, ампициллин - фирмы "ICN" (США). MgC12, Na2HP04, NaH2P04, NaCl и NaOH - фирмы "Merck", (ФРГ). Трифторуксусная кислота - фирмы "Perkin-Elmer" (Великобритания), ацетонитрил -фирмы "Криохром" (Санкт-Петербург). Бактоагар, бактотриптон и дрожжевой экстракт - фирмы "Difco", (США). NTPs, dNTPs, "Pharmacia", (Швеция). Прочие реактивы использовались только квалификации "осч", в хроматографии - "чда". В работе использовали буферы для рестрикции и транскрипции фирм "Promega", (США) и "Ферментас", (Литва).

В работе также использовали следующие радиоактивные соединения: [у-32Р]-АТФ (удельная активность 1000 Ки/мМ) производства г. Обнинск, [у- Р]-АТФ (удельная активность 5000 Ки/мМ) и

L-35S] -метионин (1200 Ки/мМ) фирмы "Amersham", (Великобритания).

В работе использовали следующие ферменты: РНК полимераза фага Т7, ингибитор РНКаз (RNasin), трипсин фирмы "Promega" (США) и ТСРК-трипсин фирмы "Sigma" (США); Т4-ДНК-лигаза производства фирмы "Promega", (США); рестриктазы производства "Ферментас" (Литва), "Сибэнзим" (Россия) и "Promega" (США).

При проведении углеводных анализов пользовались исключительно свежеприготовленным тридистиллятом (кварцевая посуда). Метанол дополнительно абсолютировали перегонкой над метилатом магния, этанол абсолютировали перегонкой над окисью кальция. Пиридин очищали двукратной перегонкой над гидроокисью натрия, а затем над окисью бария. Соляную и трифторуксусную кислоты дополнительно очищали перегонкой в посуде из боросиликатного стекла.

Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле.

К препарату, содержащему анализируемый белок, добавляли 2-3 объема буфера для нанесения на ПААГ, содержащего 60% глицерина, 20% |3-меркаптоэтанола, 10% ДСН, 1% бромфенолового синего и 0.25 М трис-HCl, рН 6.8), после чего пробу прогревали 3-10 мин при +95°С. Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля (ПААГ) размером 170x120x1.5 мм (в приборе фирмы "LKB") или 100x73x0.75 мм (в приборе фирмы "Bio-Rad") в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Верхний (концентрирующий) гель содержал 3% акриламида, 0.08% ИЛЧ'-метиленбисакрил амида 0.125 М трис-HCl, рН 6.8, и 0.1% ДСН. Нижний (разделяющий) гель содержал линейный градиент акриламида от 8 до 20% и N,N'-метиленбисакриламида от 0.08 до 0.2%, 0.4 М трис-HCl, рН 8.8, и 0.1% ДСН. Пробы вносили в лунки верхнего геля. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирм "Pharmacia" (14.4-92 кДа) или "Bio-Rad" (14.4-97.4 кДа). Электрофорез проводили в приборе фирмы "LKB" в трис- глициновом буфере, рН 8.4, (25 мМ Трис, 0.192 М глицин, 0.1% ДСН) при i I I постоянном токе 5-7 мА в течение 14-16 часов или в приборе фирмы "Bio-Rad" в аналогичном буфере при постоянном напряжении 150 -200 В в течение 45 минут. Гель окрашивали Кумасси G-250 в течение 20 мин, отмывали и высушивали на бумаге "Whatman" ЗММ в у/у приборе для вакуумной сушки гелей ("LKB"). При электрофорезе [ Р] и [35S] — меченных белков высушенный гель экспонировали с рентгеновской пленкой.

Получение препарата растворимой (цитоплазматической, S10) фракции.

Листья растений N.glutinosa гомогенизировали в буфере К (1 мл/г зеленой массы) состава: 50 мМ HEPES-KOH, рН 7.5, 5 мМ PMSF, 0.5% апротинина, 0.5% лейпептина, 0.1% р-МЭ или 1мМ ДТТ, 5% глицерина или сахарозы (в отдельных экспериментах листья перед гомогенизацией замораживали в жидком азоте). Гомогенат центрифугировали (10000 g, 15 мин.), супернатант ("растворимая фракция") использовали в последующих экспериментах по фосфорилированию.

Фосфорилирование in vitro.

Фосфорилирование ХВК растворимой фракцией листьев N.glutinosa проводили в реакционной смеси, содержащей 50 мМ HEPES-KOH рН 7.5, 5-10 мМ МпС12, 5-10 мМ MgC12,1 мМ ДТТ, 0.3 -0.15 мМ АТФ, 100-150 мкл растворимой фракции листьев 15-20 мкг ХВК.

Фосфорилирование ХВК протеинкиназой С (ПКС) проводили в соответствии с протоколом фирмы Promega в реакционной смеси, содержащей 4 мкг очищенного ХВК, 7 мкл 5-кратного активирующего буфера (1.6 мг/мл фосфатидилсерин, 0.16 мг/мл диацилглицерол, 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ MgC12), 7 мкл 5-кратного коактивирующего буфера (1.25 мМ ЭГТА, 2 мМ СаС12, 0.5 мг/мл БСА), 0.5 мкл ПКС (Promega) и АТФ в конечной концентрации 1 мМ. Конечный объем пробы составлял 35 мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин. при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ или переносом пробы на -20 °С.

Фосфорилирование ХВК казеинкиназами 1 и 2 (КК1 и КК2) проводили в соответствии с протоколом фирмы Promega в реакционной смеси, содержащей 2.5 мкг очищенного ХВК, 25 мМ трис-HCl, рН 7.4, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 200 мМ NaCl (для КК2 или смеси двух ферментов), 0.5 мкл фермента и АТФ в конецной концентрации 1 мМ. Конечный объем пробы составлял 10 мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 20 мин. при 37°С, реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ.

Для получения [32Р] — меченных белков вместо "холодного" АТФ в реакционную смесь добавляли 0.5 мкл [у-32Р] - АТФ (5000 Ки/мМ, 400 МБк/мл).

Анализ протеинкиназной активности SlO-фракции листьев N.glutinosa с использованием ингибиторов протеинкиназ.

Ингибиторы протеинкиназ добавлялись в стандартную реакционную смесь. В работе были использованы следующие ингибиторы: л I стауроспорин - ингибитор фосфолипид/Са -зависимых протеинкиназ, ПКС, конечные концентрации 1 мкМ, ЮмкМ; сурамин - ингибитор КК1 и КК2, в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ; кверцетин - ингибитор КК2, в концентрациях 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 мкМ;

Н-89 - специфический ингибитор ПКА, в концентрациях 10 мкМ, 100 мкМ; генистеин - ингибитор тирозиновых протеинкиназ, использовался в концентрациях 1 мкМ, 10 мкМ, 1 ООмкМ.

Для проверки возможности использования протеинкиназной активностью SlO-фракции в качестве донора фосфатных групп ГТФ наряду с АТФ, в стандартную пробу добавляли 10 мкМ «холодного» ГТФ.

Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы.

Трансляцию РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП) проводили согласно протоколу фирмы "Promega" с некоторыми модификациями.

Стандартная проба содержала: 10 мкл экстракта, 53 мМ ацетата калия, смесь аминокислот (по 80 мкМ каждой, кроме метионина), 16 мкКи [358]-метионина, 20 ед. РНКазина, 2 мкг РНК. Суммарный объем пробы - 20 мкл. В контрольную пробу эндогенного синтеза РЖ не добавляли. Смесь инкубировали при +25°С в течение 1 часа.

ТБ1 добавляли в трансляционную пробу в молярном соотношении ХВК:ТБ 1 1:100.

Олигонуклеотид 5'dGGTTTGGTTGTGTTG 3' (10 о.е./мкл, 2-3 мкл на трансляционную пробу) добавляли к препаратам РНК ХВК или ХВК, инкубировали при 4°С 12-14 часов, а затем добавляли в ЭЗП.

Иммуноблот-анализ.

Замороженный растительный материал растирали в ступке, добавляли 0.01М трис-HCl рН7.5 (ЮОмкл на 0.1 г листьев), центрифугировали Юмин. при 10000g. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли ЮОмкл буфера для нанесения на электрофорез.

После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозу NC45 ("Serva", ФРГ) в приборе Protean III ("BioRad"). Состав буфера для переноса - 25мМ трис-HCl, 0.19М глицин, 0.1% ДСН, 20% этанол. Режим переноса — 290мА в течение часа или ЗОВ в течение ночи при +4°С.

Нитроцеллюлозу выдерживали при покачивании в течение 2 мин. в буфере TBS (ЮмМ трис-HCl, 0.15М NaCl, рН7.5) с 2% твином, затем 5 мин. в TBS и два раза по пять минут - в TBS с 0.05% твином (tTBS). Далее фильтр инкубировали с кроличьими поликлональными антителами против ХВК (100 мкг антител на 20 мл tTBS) в течение одного часа, отмывали tTBS 3 раза по 5 мин., добавляли вторые антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Змкл на 20 мл tTBS) и инкубировали в течение одного часа. После отмывки фильтра (2 раза по 5 мин. tTBS и 5 мин. TBS) добавляли субстрат Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline

Phosphatase (Promega), нитроцеллюлозу ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.

Заражение растений ХВК.

Для заражения растений использовали в качестве инокулюма раствор ХВК или РНК ХВК в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5. В случае РНК в инокулюм добавляли РНКазин из расчета 20 ед. на 5-10 мкг РНК. Листья растений Nicotiana glutinosa (размером -12-14 см) и Chenopodium amaranticolor (размером ~ 4-7см) механически натирали инокулюмом в присутствии целита (в качестве абразива) из расчета 2мкг РНК в 100 мкл инокулюма на лист N. glutinosa и 1мкг РНК в 50 мкл инокулюма на половинку листа С. amaranticolor. В случае заражения растений вирусом инокулюм содержал 20-100 мкг/мл ХВК. Инфекционность препарата определяли по количеству некрозов, появляющихся на поверхности листа С. amaranticolor через 7 -10 дней после заражения, а в случае N. glutinosa — иммуноблотом через 28 дней после заражения.

Измерение уровня протеиикиназной и протеинфосфатаз-ной активности SlO-фракции листьев N. glutinosa.

Для измерения протеиикиназной активности растения N. glutinosa заражали ХВК или тоск-инокулировали, затем через 1, 3, 6, 9 и 24 часа после инокуляции снимали верхние неинокулированные листья. Из листьев получали SlO-фракцию и фосфорилировали БО ХВК в составе вириона в присутствии меченого [у-32Р]АТФ. Затем к вирусным частицам добавляли ПЭГ (Mr 6000) до конечной концентрации 5% и NaCI до конечной концентрации 0.2 М, после растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 часов при

4вС. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10 тыс-g и измеряли его радиоактивность.

Для определения протеинфосфатазной активности растения N. glutinosa заражали ХВК или тоск-инокулировали, затем через 1, 8 и 21 день после инокуляции снимали неинокулированные листья. Препараты ХВК фосфорилировали ПКС в присутствии меченого [у-32Р]АТФ, а затем инкубировали с SlO-фракцией, выделенной из зараженных ХВК растений. Затем к вирусным частицам добавляли ПЭГ (Mr 6000) до конечной концентрации 5% и NaCI до конечной концентрации 0.2 М, после растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 час. при +4°С. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10 тыс-g и измеряли радиоактивность осадка и супернатанта.

Радиоактивность пробы определяли в диоксановом сцинтилляторе при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика Mark-II (Nuclear Chicago).

Выделение препарата Х-вируса картофеля.

Листья зараженных ХВК (спустя 25-30 дней после заражения) растений Datura stramonium замороживали на -20°С, после чего гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора в буфере, содержащем 0.3 М глицин-КОН, 1% Na2S03, рН 7.5. После гомогенизации отжатый через марлю сок осветляли при llTbic.g, 30 мин. К осветленному соку добавляли тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и выдерживали в течение 20 мин., после чего добавляли ПЭГ (Мг 6000) до конечной концентрации 5% и NaCI до конечной концентрации 0.2 М, после растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 час. при +4°С. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10 Tbic.g. В течение 15 мин. осадок экстрагировали дважды - 0.2 М цитратным буфером, рН 7.5 и 0.025 М Трис-HCl, рН 8.0. Полученный экстракт осветляли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 20 мин. Осветленный раствор вируса ультрацентрифугировали 100 тыс. g в течение 90 мин. Полученный осадок растворяли в 0.025 М Трис-HCl рН 8.0. Второй цикл дифференциального центрифугирования проводили с использованием составной сахарозно-цезиевой подушки (20 и 22% соответственно по 2 мл) при 100 Tbic.g в течение 2.5 часов. Вирусный осадок растворяли в 0.025 Трис-HCl буфере, рН 8.0. Выделенный таким образом препарат вируса при электрофорезе в денатурирующем ПААГ содержал преимущественно полноразмерную Реформу (Koenig et al., 1978) белка оболочки ХВК.

Обработка препарата ХВК трипсином.

ХВК инкубировали с трипсином из расчета 1 мкг фермента на 500 мкг вируса в 0.5-1.0 мл 0.2 М трис-HCl рН8.0 при 37°С в течение 60-90 мин. (фосфорилированный ХВК - 1.5-2 часа). В случае ST-мутанта триптический гидролиз проводился при соотношении фермент/субстрат 1:2000 (по массе). Для получения фрагментов N-концевого триптического пептида БО ХВК концентрацию вирионов (и соответственно фермента) увеличивали примерно в 5 раз при сохранении остальных параметров гидролиза. Реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ или проводили очистку от трипсина троекратным дифференциальным центрифугированием с использованием 20% сахарозной подушки (100 тыс. g 2.5 часа), либо по следующей методике: добавляли к реакционной смеси 5% ПЭГ-6000 и 1.2% NaCl и оставляли на ночь при +4°С. Вирус осаждали центрифугированием при 10 тыс. g в течение 15 мин., осадок промывали небольшим объемом 0.01М трис-HCl рН7.5, растворяли в том же буфере и ультрацентрифугировали при 100 тыс. g в течение 2.5 часов с использованием 20% сахарозной подушки (4мл). Полученный осадок растворяли в 0.01М трис-HCl рН7.5 и осветляли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 15 мин.

Выделение плазмидной ДНК.

Бактериальный клон высевали в 2-3 мл бульона 2хУТ, содержавшего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и выращивали в течение ночи при 37°С в режиме 180 качаний/мин. Клетки осаждали центрифугированием на максимальной скорости в настольной центрифуге Eppendorf (30", 14000 об/мин); при последующих манипуляциях использовали эту же центрифугу. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I (50 мМ глюкоза, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ Трис-HCl, рН 8.0), инкубировали на столе 5 мин. и добавляли 400 мкл охлажденного во льду раствора II (0.2 М NaOH, 1% ДСН), осторожно перемешивали и выдерживали 5 мин. во льду. К лизату клеток добавляли 250 мкл раствора III (3 М ацетат калия, рН 4.8), инкубировали во льду 5-10 мин. и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 400 мкл 40% (вес/вес) ПЭГа (Мг=6000), инкубировали во льду 30 мин и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Осадок растворяли в 100 мкл воды, добавляли 100 мкл насыщенного раствора ацетата аммония, инкубировали 15 мин при -70°С и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 200 мкл изопропилового спирта и центрифугировали (10 мин., 14000 об/мин). Осадок ДНК дважды промывали 75% этанолом, подсушивали при +37°С и растворяли в 20 мкл тридистиллированной воды.

Получение мутанта ХВК с заменами остатков серина и треонина в N-конце белка оболочки (ST-мутаита).

Мутант был сконструирован на основе плазмиды pPVX.GFP, полногеномной кДНК копии штамма UK3 ХВК под контролем 35S промотера (Fedorkin et al., 2000). Фрагмент генома ХВК, содержащийся между сайтами Bspl201 и Spel, был субклонирован в плазмиду pGEM5Zf(-) по указанным сайтам, на матрице полученной конструкции был проведена ПЦР со стандартным праймером 5-d(GTAAAACGACGGCCAGT)-3' (Fermentas, Cat. # S0100) и праймером M-ST 5*-d(GCGCCTGCAGCTTTTGCGCCAGCTGCG CCACCTGCCCCAATTGGCTGTGCTCCGCCAGCTGGTGCTGCCATC TTTCGAGT)-3\

На основе ПЦР-фрагмента была получена мутантная полногеномная копия ХВК, с заменой исходной последовательности

ATGGCAGCACCAGCTGGCGGAGCACAGCCAATTGGGGCAGGTGGC GCAGCTGGCGCAAAAGCTGCAGGCGC (участок гена БО ХВК) на последовательность

ATGTCAGCACCAGCTAGCACAACACAGCCCATAGGGTCAACTACCTC AACTACCACAAAAACTGCAGGCGC, результатом чего явилось изменение аминокислотной последовательности N - концевой области БО ХВК:

MSAPASTTQPIGSTTSTTTKTAG - дикий тип (WT3)

MAAPAGGAQPIGAGGAAGAKAAG - мутант ST-XBK

Полученную мутантную полногеномную копию ХВК (далее именуемую ST-XBK) использовали для заражения растений N.benthamiana и выделения препарата ST-XBK.

Высокоэффективная жидкостная хроматография.

Разделение триптических пептидов проводилось при 35°С на хроматографе "Милихром А-02" (ЗАО Институт хроматографии "ЭкоНова", Новосибирск, Россия) на обращенно-фазной колонке 75x2 мм с сорбентом Nucleosil Cig (Macherey-Nagel, Германия). Использовалось детектирование по оптическому поглощению элюата на двух длинах волн: 214 и 280 нм. Для элюирования применялись следующие растворители: А — 0.1 % (по объему) трифторуксусная кислота (ТФУ) в воде (рН 2.2), Б - ацетонитрил с 0.1 % ТФУ (по объему), с использованием линейного градиента: 0-60 % Б за 60 мин и затем 60-80 % Б за 10 мин при скорости потока 80 мклхмин"1. Фракции собирали при помощи коллектора фракций Gilson 201 (Франция).

Анализ углеводных остатков в составе триптических пептидов.

После мягкого кислотного гидролиза гликопептидов получали флуоресцентные производные освобожденных моносахаридов - N-(4-метилкумарин-7-ил)гликамины (АМС-сахара) и анализировали их с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ (Хорлин и др., 1986). Контрольные АМС-сахара были приготовлены путем восстановительного N-алкилирования 7-амино-4-метилкумарина в присутствии NaCNBH3 следующих моносахаридов: D-глюкозы, D-галактозы, D-маннозы, L-фукозы, D-N-ацетилглюкозамина, D-N-ацетилгалактозамина, D-N-ацетилманнозамина.

Хроматографический анализ проводился на хроматографе Du Pont 8800 с флуоресцентным детектором. Использовались колонки

Ultrasphere ODS (Beckman; 250x4.6мм). АМС-сахара разделяли при 25°C с использованием 17.5% этанола в воде с 0.1% трифторуксусной кислотой, рН 2.5-2.6 при скорости потока 0.75 мл хмин"1.

Гидролиз карбоксипептидазой Y.

Гидролиз карбоксипептидазой Y N-концевого триптического пептида БО ХВК и его фрагментов проводился следующим образом: растворы пептидов, полученные с помощью ВЭЖХ, высушивались для удаления ТФУ и перерастворялись в воде до концентрации ~0.1 мгхмл"1, к этому раствору добавлялась карбоксипептидаза Y в соотношении фермент/субстрат 1:5 (по массе). Гидролиз проводился при 22°С. Для получения MALDI масс-спектров отбирали по 0.5 мкл раствора через различные промежутки времени от начала гидролиза.

Масс-спектрометрия.

Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Reflex III BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (337 нм). 0.5 мкл раствора исследуемого образца смешивали с равным объемом раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мгхмл-1 в 20 % ацетонитриле в воде с 0.1 % ТФУ (по объему)) и полученную смесь высушивали на воздухе.

Масс-спектры материала хроматографических фракций и гидролизатов после обработки карбоксипептидазой Y фракций 1* и 2* получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс - 0.01 %. Масс-спектры гидролизатов после обработки карбоксипептидазой Y материала из хроматографических фракций 3*, 1 и 2 получены в режиме отрицательных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс - 0.02 %.

Инфракрасная спектроскопия.

Инфракрасные спектры были получены на спектрометре Equinox 55/S (Bruker Analytic GmbH, Германия) в области 1000-4000 см Для получения тонких пленок 10 мкл суспензии вируса (6 мг/мл) в 20 мМ Трис-HCl, рН 7.8 наносили на подложку из фторида бария и высушивали в вакуумном эксикаторе (при 0.13 Па) над P2Os при 20°С с визуальным контролем гомогенности пленок. Для создания 100% влажности на дно вакуум-эксикатора наливали дистиллированную воду и выдерживали образцы в течение ночи.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Х-вирус картофеля (ХВК) относится к группе потексвирусов. Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы диаметром 13.5 нм и длиной 515 нм. Его геном, одноцепочечная (+) РНК, включает 6345 нуклеотидов (Skryabin et al., 1988) и кодирует пять белков. Репликаза (165К) транслируется непосредственно с геномной РНК, три транспортных белка (ТБ1, ТБ2 и ТБЗ - продукты так называемого «тройного блока генов», ТГБ) и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al, 1991).

Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка и белок оболочки. ТБ1 способен увеличивать пропускную способность плазмодесм (ПД) и транспортироваться через них даже в отсутствие других вирусспецифических белков (Lough et al., 1998). Кроме того, он содержит последовательности, характерные для хеликаз (Gorbalenya et al., 1988), является Mg -зависимой НТФазой (Kalinina et al, 1996) и обладает слабой РНК-связывающей активностью (Kalinina et al, 1996;). Белки ТБ2 и ТБЗ потексвирусов содержат кластеры гидрофобных аминокислот и являются трансмембранными белками (Morozov et al, 1989; Solovyev et al, 1996,2000).

Роль белка оболочки в транспорте ХВК остается предметом дискуссии. В отсутствие других виру специфических белков БО не проявляет сродства к ПД (Oparka et al, 1996) и не способен изменять их SEL (Santa Cruz et al, 1998). Описаны мутации белков оболочки ХВК и потексвируса мозаики белого клевера (ВМБК), подавляющие межклеточный транспорт, но не влияющие на сборку вирионов (Rouleau et al., 1995; Lough et al, 2000). Наоборот, мутантный БО ХВК, неспособный образовывать вирусные частицы, также не был способен поддерживать межклеточный транспорт (Chapman et al,

1992). Существуют две точки зрения на природу транспортной формы потексвирусов:

- геном ХВК перемещается в составе вириона (Chapman et al, 1992; Oparka et al, 1996; Santa Cruz et al, 1998);

- геном вируса мозаики белого клевера транспортируется в виде рибонуклеопротеида, содержащего РНК, белок оболочки и ТБ1 (Lough et al, 1998, 2000).

Возможно, разные потексвирусы используют различные РНП для траснлокации своих геномов через плазмодесмы.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК ХВК в составе вирусных частиц является нетранслируемой in vitro, но обретает способность транслироваться (а) в результате взаимодействия вириона с ТБ1 ХВК либо (б) фосфорилирования протеинкиназой С или киназной активностью растворимой фракции листьев N. glutinosa (SlO-фракции) (Atabekov et al, 2000, 2001). Была предложена модель, согласно которой в первично инфицированной клетке БО в составе вириона фосфорилируется хозяйскими киназами и вирусная РНК становится доступной для трансляции. Далее в цикле размножения вируса РНК одевается белком оболочки, временно исключается из процессов трансляции/репликации и направляется к плазмодесмам для перемещения в соседние клетки. Поскольку в транспорте участвует ТБ1, то проникшая в незараженную клетку РНК в составе транспортного комплекса оказывается вновь доступна для трансляции. Можно предполагать, что на средних и поздних стадиях инфекции происходит подавление протеиикиназной активности в ХВК-зараженных клетках, способствующее формированию зрелых нетранслируемых вирионов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Заякина, Ольга Владимировна

выводы.

1. Сайты фосфорилирования белка оболочки, существенные для трансляционной активации инкапсидированной РНК ХВК in vitro, находятся в N-конце БО ХВК. Уровень инфекционности препаратов ХВК с удаленным N-концевым фрагментом белка оболочки, заметно снижен по сравнению с нативным ХВК.

2. В фосфорилировании белка оболочки ХВК в составе вириона растворимой фракцией из листьев N. glutinosa и трансляционной активации одетой им РНК могут участвовать несколько различных серин/треониновых протеинкиназ, в том числе киназы, относящиеся к типу КК2.

3. В процессе трансляционной активации путем фосфорилирования БО в составе вириона или при взаимодействии частицы с траспортным белком ХВК ТБ1 участвуют разные области белка оболочки ХВК. При этом изменения, вносимые фосфорилированием, являются необратимыми.

4. N-конец белка оболочки ХВК О-гликозилирован и содержит остаток галактозы или фукозы, присоединенный к первому остатку серина. Структура N-конца белка оболочки ХВК влияет на способность вириона связывать воду и формировать вокруг себя гидратную оболочку из связанных молекул воды.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Заякина, Ольга Владимировна, 2004 год

1. Карпова, О. В., Козловский, С. В., Архипенко, М. В., Заякина, О. В., Решетникова, В. Г., Родионова, Н. П., Атабеков, И. Г. (2002). Сравнительная характеристика протеинкиназ, фосфорилирующих in vitro транспортный белок ВТМ.Д4Д 386, 825-7.

2. Argos, Р. (1988). A sequence motif in many polymerases. Nucleic Acids Res., 16, 9909-16.

3. Atabekov, J.G., Taliansky, M.E. (1990). Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes. Adv. Virus Res.,38, 201-248.

4. Atabekov, I. G., Rodionova, N. P., Karpova, О. V., Kozlovsky, S. V., Poljakov, V. Yu. (2000). The movement protein triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology, 271, 259-263.

5. Atabekov, I. G., Rodionova, N. P., Karpova, О. V., Kozlovsky, S. V., Novikov, V. K., Arkhipenko, M. V. (2001). Translation^ activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology, 286, 466-474.

6. Barik, S., Banerjee, A. K. (1992a). Sequential phosphorylation of the phosphoprotein of vesicular stomatitis virus by cellular and viral protein kinases is essential for transcription activation. Journal of Virology, 66, 1109-18.

7. Barik, S., Banerjee, A. K. (19926). Phosphorylation by cellular casein kinase II is essential for transcriptional activity of vesicular stomatitis virus phosphoprotein P. PNAS USA, 89, 6570-4.

8. Bozarth, C. S., Weiland, J. J., Dreher, T. W. (1992). Expression of ORF-69 of turnip yellow mosaic virus is necessary for viral spread in plants. Virology, 187, 124-30.

9. Chang, C., Meyerowitz, E. M. (1995). The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukaryotic two-component signaling system. PNAS USA, 92,4129-33.

10. Chapdelaine, Y., Hohn, T. (1998). The cauliflower mosaic virus capsid protein: assembly and nucleic acid binding in vitro. Virus Genes, 17, 139-50.

11. Chapdelaine, Y., Kirk, D., Karsies, A., Hohn, Т., Leclerc, D. (2002). Mutation of capsid protein phosphorylation sites abolishes cauliflower mosaic virus infectivity. Journal of Virology, 76, 1174852.

12. Chapman, S., Hills, G., Watts, J., Baulcombe, D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-230.

13. Chen, Z., Malamy, J., Henning, J., Conrath, U., Sanchez-Casas, P., Silva, H., Ricigliano, J., Klessig, D. K. (1995). Induction, modification, and transduction of the salicylic acid signal in plant defense responses. PNAS USA, 92, 4134-7.

14. Chen, M.H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A.K., Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO Journal, 19, 913-920.

15. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60, 637-647.

16. Citovsky, V., Wong, M.L., Shaw, A., Venkataram Prasad, B.V., Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell, 4, 397-411.

17. Citovsky, V., McLean, B.G., Zupan, J.R., Zambryski, P. (1993). Phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase. Genes Dev., 7, 904-910.

18. Cohen, P. (2000). The regulation of protein function by multisite phosphorylation-^ 25 year update. Trends Biochem Sci, 25(12), 596601.

19. Comer, F. I., Hart, G. W. (2000). O-Glycosylation of nuclear and cytosolic proteins. Dynamic interplay between O-GlcNAc and O-phosphate. Journal of Biological Chemistry, 275, 29179-82.

20. Comer, F. I., Hart, G. W. (2001). Reciprocity between O-GlcNAc and O-phosphate on the carboxyl terminal domain of RNA polymerase II. Biochemistry, 40, 7845-52.

21. Day, I. S., Reddy, A. S. (1998). Isolation and characterization of two cyclin-like cDNAs from Arabidopsis. Plant Molecular Biology, 36, 451-61.

22. DeLong A, Mockaitis K, Christensen S. (2002). Protein phosphorylation in the delivery of and response to auxin signals. Plant Molecular Biology, 49, 285-303.

23. De Veylder, L., Segers, G., Glab, N., Casteels, P., Van Montagu, M., Inze, D. (1997). The Arabidopsis CkslAt protein binds the cyclindependent kinases Cdc2aAt and Cdc2bAt. FEBS Letters, 412, 44652.

24. Ding, В., Haudenshield, J.S., Hull, R.J., Wolf, S., Beachy, R.N., Lucas, W.J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific sites of localisation of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell, 4,915-928.

25. Dunigan, D. D., Madlener, J. C. (1995). Serine/threonine protein phosphatase is required for tobacco mosaic virus-mediated programmed cell death. Virology, 207(2), 460-6.

26. Epel, B.L., Padgett, H.S., Heinlein, M., Beachy, R.N. (1996). Plant virus movement protein dynamics probed with a GFP-protein fusion. Gene, 173, 75-79.

27. Fellers, J., Wan, J., Hong, Y., Collins, G. В., Hunt, A. G. (1998). In vitro interactions between a potyvirus-encoded, genome-linked protein and RNA-dependent RNA polymerase. Journal of General Virology, 79, 2043-2049.

28. Fernandez-Fernandez, M. R., Camafeita, E., Bonay, P., Mendez, E., Albar, J. P., Garcia, J. A. (2002). The capsid protein of a plant single-stranded RNA virus is modified by O-linked N-acetylglucosamine. Journal of Biological Chemistry, 277,135-40.

29. Ferreira, P. С., Hemerly, A. S., Villarroel, R., Van Montagu, M., Inze, D. (1991). The Arabidopsis functional homolog of the p34cdc2 protein kinase. Plant Cell, 3, 531-40.

30. Furumoto, Т., Ogawa, N., Hata, S., Izui, K. (1996). Plant calcium-dependent protein kinase-related kinases (CRKs) do not require calcium for their activities. FEBS Letters, 396, 147-51.

31. Gafny, R., Lapidot, M., Berna, A., Holt, C. A., Deom, С. M., Beachy, R. N. (1992). Efects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology, 187, 499-507.

32. Gal-On, A., Kaplan, I., Roossinck, M. J., Palukaitis, P. (1994). The kinetics of infection of zucchini squash by cucumber mosaic virus indicate a function for RNA 1 in virus movement. Virology, 205, 280-9.

33. Gal-On, A., Kaplan, I., Palukaitis, P. (1995). Differential effects of satellite RNA on the accumulation of cucumber mosaic virus RNAs and their encoded proteins in tobacco vs zucchini squash with two strains of CMV helper virus. Virology, 208, 58-66.

34. Gerken, T.A., Butenhof, K.J. & Shogren, R. (1989) Effects of glycosylation on the conformation and dynamics of O-linked glycoproteins: carbon-13 NMR studies of ovine submaxillary mucin. Biochemistry, 28, 5536-5543.

35. Gorbalenya, A. E., Koonin, E. V., Donchenko, A. P., Blinov, V. M.1989). Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res., 17, 4713-30.

36. Guerra, В., Issinger, O.G. (1999). Protein kinase CK2 and its role in cellular proliferation, development and pathology. Electrophoresis, 20, 391-408.

37. Guerra-Peraza, O., de Tapia, M., Hohn, Т., Hemmings-Mieszczak, M. (2000). Interaction of the cauliflower mosaic virus coat protein with the pregenomic RNA leader. Journal of Virology, 74, 2067-72.

38. Gupta, A. K., Blondel, D., Choudhary, S., Banerjee, A. K. (2000). The phosphoprotein of rabies virus is phosphorylated by a unique cellular protein kinase and specific isomers of protein kinase C. Journal of Virology, 74, 91-8.

39. Haley, A., Hunter, Т., Kiberstis, P., Zimmern, D. (1995). Multiple serine phosphorylation sites on the 30 kDa TMV cell-to-cell movement protein synthesized in tobacco protoplasts. Plant Journal, 8, 715-724.

40. Halford, N. G., Hardie, D. G. (1998). SNFl-related protein kinases: global regulators of carbon metabolism in plants? Plant Molecular Biology, 37, 735-748.

41. Hanks, S. K., Hunter, T. (1995). The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB Journal, 9, 576-596.

42. Hardie, D. G. (1999). Plant protein serine/threonine kinases: classification and functions. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 97-131.

43. Harmon, A. C., Putnam-Evans, C., Cormier, M. J. (1987). A calcium-dependent but calmodulin-independent protein kinase from soybean. Plant Physiology, 83, 830-837.

44. Hayes, R. J., Buck, K. W. (1990). Complete replication of a eukaryotic virus RNA in vitro by a purified RNA-dependent RNA polymerase. Cell, 63, 363-8.

45. Heinlein, M., Epel, B.L., Padgett, H.S., Beachy, R.N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science, 270, 1983-1985.

46. Heinlein, M. (2002). The spread of tobacco mosaic virus infection: insights into the cellular mechanism of RNA transport. Cell Mol. LifeSci., 59, 58-82.

47. Hidalgo, P., Garreton, V., Berrios, C. G., Ojeda, H., Jordana, X., Holuigue, L. (2001). A nuclear casein kinase 2 activity is involved in early events of transcriptional activation induced by salicylic acid in tobacco. Plant Physiology, 125, 396-405.

48. Hirayama, Т., Imajuku, Y., Anai, Т., Matsui, M., Oka, A. (1991). Identification of two cell-cycle-controlling cdc2 gene homologs in Arabidopsis thaliana. Gene, 105, 159-65.

49. Hong, Y., Takano, M., Liu, С. M., Gasch, A., Chye, M. L., Chua, N. H. (1996). Expression of three members of the calcium-dependent protein kinase gene family in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 30, 1259-75.

50. Hughes, R., Perbal, M.-C., Maule, M., Hull, R. (1995). Evidence for proteolytic processing of tobacco mosaic virus movement protein in Arabidopsis thaliana. Mol Plant-Micr. Int., 8, 658-665.

51. Hunter, T. (2002). Tyrosine phosphorylation in cell signaling and disease. KeioJMed, 51(2), 61-71.

52. Ivanov, К. I., Puustinen, P., Merits, A., Saarma, M., Makinen, K. (2001). Phosphorylation down-regulates the RNA binding function of the coat protein of potato virus A. Journal of Biological Chemistry, 276, 13530-40.

53. Kakimoto, T. (1996). CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science, 274, 982-5.

54. Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, Т., Morozov, S.Yu., Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Letters, 397, 75-78.

55. Kalinina, N. O., Rakitina, D. V., Solovyev, A. G., Schiemann, J., Morozov, S. Y. (2002). RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology, 296(2), 321-9.

56. Karpova, O.V., Ivanov, K.I., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, I.G. (1997). Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology, 230, 11-21.

57. Karpova, O.V., Rodionova, N.P., Ivanov, K.I., Kozlovsky, S. V., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, I.G. (1999). Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology, 261, 20-24.

58. Karsies, A., Hohn, Т., Leclerc, D. (2001). Degradation signals within both terminal domains of the cauliflower mosaic virus capsid protein precursor. Plant Journal, 27, 335-43.

59. Kim, С. H., Palukaitis, P. (1997). The plant defense response to cucumber mosaic virus in cowpea is elicited by the viral polymerase gene and affects virus accumulation in single cells. EMBO Journal, 16, 4060-8.

60. Kim, S. H., Palukaitis, P., Park, Y. I. (2002). Phosphorylation of cucumber mosaic virus RNA polymerase 2a protein inhibits formation of replicase complex. EMBO Journal, 21, 2292-300.

61. Koenig, R., Stegemann, M.E., Francksen, H., and Paul, H.L. (1970). Protein subunits in potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochemica et Biophysica Acta, 207, 184-189.

62. Koenig, R., (1972). Anomaleous behavior of the coat proteins of potato virus X and cactus virus X during electrophoresis in dodecyl sulphate-containing polyacrylamide gels. Virology, 50, 263-266.

63. Lazarowitz, S.G, Beachy, R.N. (1999). Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants. Plant Cell, 11, 535-548.

64. Law, L. M., Everitt, J. C., Beatch, M. D., Holmes, C. F., Hobman, T. C. (2003). Phosphorylation of rubella virus capsid regulates its RNA binding activity and virus replication. Journal of Virology, 77, 176471.

65. Leclerc, D., Chapdelaine, Y., Hohn, T. (1999). Nuclear targeting of the cauliflower mosaic virus coat protein. Journal of Virology, 73, 553-60.

66. Lee, J. Y., Yoo, В. C., Harmon, A. C. (1998). Kinetic and calcium-binding properties of three calcium-dependent protein kinase isoenzymes from soybean. Biochemistry, 37, 6801-6809.

67. Lehto, K., Bubric, P., Dawson, W.O. (1990) Time course of TMV 30K protein accumulation in intact leaves. Virology, 174,290-293.

68. Leonard, S., Plante, D., Wittman, S., Daigneault, N., Fortin, M. G., Laliberte, J. F. (2000). Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. Journal of Virology, 74, 7730-7737.

69. Lin, R., Beauparlant, P., Makris, C., Meloche, S., Hiscott, J. (1996). Phosphorylation of IkappaBalpha in the C-terminal PEST domain by casein kinase II affects intrinsic protein stability. Molecular and Cellular Biology, 16, 1401-9.

70. Loh, Y., Martin, G. B. (1995). The disease-resistance gene Pto and the fenthion-sensitivity gene Fen encode closely related functional protein kinases. PNAS USA, 92,4181-4184.

71. Marchal, C., Haguenauer-Tsapis, R., Urban-Grimal, D. (1998). A PEST-like sequence mediates phosphorylation and efficient ubiquitination of yeast uracil permease. Molecular and Cellular Biology, 18, 314-21.

72. Mas, P., and Beachy, R.N. (1998). Distribution of TMV movement protein in single living protoplasts immobilized in agarose. Plant Journal, 15, 835-842.

73. Matsushita, Y., Yoshioka, K., Shigyo, Т., Takahashi, H., Nyunoy, H. (2002). Phosphorylation of the movement protein of cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants. Virus Genes, 24, 231-4.

74. Matsushita, Y., Ohshima, M., Yoshioka, K., Nishiguchi, M., Nyunoya, H. (2003). The catalytic subunit of protein kinase CK2 phosphorylates in vitro the movement protein of Tomato mosaic virus. Journal of General Virology, 84, 497-505.

75. McLean, В., Zupan, J., Zambryski, P. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with cyto skeleton in tobacco cells. Plant Cell, 7,2101-2114.

76. Meshi, Т., Ohno, Т., Okada, Y. (1982). Nucleotide sequence and its character of cistron coding for the 30K protein of tobacco mosaic virus. Journal of Biochemistry, 91, 1441-1444.

77. Meshi, Т., Watanabe, Y., Saito, Т., Maeda, Т., Okada, Y. (1987). Function of the 30Kd protein of tobacco mosaic virus :involvment into cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO Journal, 6, 9, 2557-2563.

78. Morello, L., Giani, S., Coraggio, I., Breviario, D. (1993). Rice membranes contain a calcium-dependent protein kinase activity with biochemical features of animal protein kinase C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 197, 55-61.

79. Morozov, S.Y., Lukasheva, L.I., Chernov, B.K., Skryabin, K.G., Atabekov, J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBS Letters, 213, 438-442.

80. Morozov, S.Yu., Dolja, V.V., Atabekov, J.G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol., 29, 52-62.

81. Mushegian, A. R., Koonin, E. V. (1993). Cell-to-cell movement of plant viruses. Insights from amino acid sequence comparisons of movement proteins and from analogies with cellular transport systems. Arch Virol., 133, 239-57.

82. Muszynska, G., Ekman, P., Engstrom, L. (1993). Phospholipid-dependent and EGTA-inhibited protein kinase from maize seedlings. Biochem. Mol. Biol. Int., 30, 849-60.

83. Nasrallah, J. В., Stein, J. C., Kandasamy , M. K., Nasrallah, M. E. (1994). Signaling the arrest of pollen-tube development in self-incompatible plants. Science, 266, 1505-1508.

84. Oparka, K.J., Roberts, A.G., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Santa Cruz, S. (1996). Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant Journal, 10, 805-813.

85. Oparka, K.J., Prior, D.A.M., Santa Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. (1997). Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus. Plant Journal, 12, 781-789.

86. O'Reilly, E. K., Tang, N., Ahlquist, P., Kao, С. C. (1995). Biochemical and genetic analyses of the interaction between the helicase-like and polymerase-like proteins of the brome mosaic virus. Virology, 214, 59-71.

87. Padgett, H. S., Epel, B. L., Kahn, T. W., Heinlein, M., Watanabe, Y., Beachy, R. N. (1996). Distribution of tobamovirus movement protein in infected cells and implications for cell-to-cell spread of infection. Plant Journal, 10, 1079-1088.

88. Park, M. H., Chae, Q. (1990). Intracellular protein phosphorylation in oat (A vena sativa L.) protoplasts by phytochrome action: involvement of protein kinase C. Biochem Biophys Res Commun, 169, 1185-90.

89. Pascal, E., Sanderfoot, A. A., Ward, В. M., Medville, R., Turgeon, R., Lazarowitz, S. G. (1994). The geminivirus BR1 movement protein binds single-stranded DNA and localizes to the cell nucleus. Plant Cell, 6, 995-1006.

90. Patil, S., Takezawa, D., Poovaiah, B. W. (1995). Chimeric plant calcium/calmodulin-dependent protein kinase gene with a neural visinin-like calcium-binding domain. PNAS USA, 92, 4897901.

91. Poovaiah, B. W., Reddy, A. S. (1993). Calcium and signal transduction in plants. CRC Crit. Rev. Plant Sci., 12, 185-211.

92. Puustinen, P., Rajamaki, M. L., Ivanov, К. I., Valkonen, J. P., Makinen, K. (2002). Detection of the potyviral genome-linked protein VPg in virions and its phosphorylation by host kinases. Journal of Virology, 76, 12703-11.

93. Rajamaki, M. L., Valkonen, J. P. (2002). Viral genome-linked protein (VPg) controls accumulation and phloem-loading of a potyvirus in inoculated potato leaves. Mol. Plant Microbe Interact., 15, 138-49.

94. Reed, К. E., Gorbalenya, A. E., Rice, Ch. M. (1998). The NS5A/NS5 protein of viruses from three genera of the family Flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. Journal of Virology, 72, 6199-6206.

95. Reichel, C., and Beachy, R. N. (1998). Tobacco mosaic virus infection induces severe morphological changes of the endoplasmic reticulum. PNAS USA, PJ, 11169-11174.

96. Reichel, C., and Beachy, R. N. (2000). Degradation of the tobacco mosaic virus movement protein by the 26S proteasome. Journal of Virology, 74, 3330-3337.

97. Rhee, Y., Tzfira, Т., Chen, M.-H., Waigmann, E., Citovsky, V. (2000). Cell-to-cell movement of tobacco mosaic virus: enigmas and explanations. Molecular Plant Pathology, 1, 33-39.

98. Riera, M., Peracchia, G., Pages, M. (2001). Distinctive features of plant protein kinase CK2. Mol. Cell. Biochem., 227, 11927.

99. Rodionova, N. P., Karpova, О. V., Kozlovsky, S. V., Zayakina, О. V., Arkhipenko, M. V., Atabekov, J. G. (2003). Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. Journal of Molecular Biology, 333, 565-72.

100. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. (1986). Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 234, 364-8.

101. Rouleau, M., Smith, R.J., Bancroft, J.B., Mackie, G.A. (1995). Subcellular immunolocalization of the coat protein of two potexviruses in infected Chenopodium quinoa. Virology, 214, 314318.

102. Salinas, P., Bantignies, В., Tapia, J., Jordana, X., Holuigue, L. (2001). Cloning and characterization of the cDNA coding for the catalytic alpha subunit of CK2 from tobacco. Mol Cell Biochem., 227, 129-35.

103. Santa Cruz, S., Roberts, A.G., Prior, D.A.M., Chapman, S., Oparka, K.J. (1998). Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant Cell, 10, 495-510.

104. Sato, K., Yoshikawa, N., Takahashi, Т., Taira, H. (1995). Expression, subcellular location and modification of the 50 kDa protein encoded by ORF2 of the apple chlorotic leaf spot trichovirus genome. Journal of General Virology, 76, 1503-7.

105. Satterlee, J. S., Sussman, M. R. (1998). Unusual membrane-associated protein kinases in higher plants. Journal of Membrane Biology, 754,205-13.

106. Seron, K., Bernasconi, L., Allet, В., Haenni, A. L. (1996). Expression of the 69K movement protein of turnip yellow mosaic virus in insect cells. Virology, 219, 274-8.

107. Skryabin, K.G., Kraev, A.S., Morozov, S.Yu., Rozanov, M.N., Chernov, B.K., Lukasheva, L.I., Atabekov, J.G. (1988). The nucleotide sequence of potato virus X RNA. Nucleic Acids Res., 16, 10929-10930.

108. Sokolova, M., Prufer, D., Таске, E., Rohde, W. (1997). The potato leafroll virus 17K movement protein is phosphorylated by a membrane-associated protein kinase from potato with biochemical features of protein kinase C. FEBS Letters, 400, 201-5.

109. Solovyev, A.G., Stroganova, T.A., Zamyatnin Jr., A.A., Fedorkin, O.N., Shiemann, J., Morozov, S.Yu. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins: TGBp3-assistedtargeting of TGBp2. Virology, 269, 113-127.

110. Song, W. Y., Wang, G. L., Chen, L. L., Kim, H. S., Pi, L. Y., Holsten, Т., Gardner, J., Wang, В., Zhai, W. X., Zhu, L. H. (1995). A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, 270, 1804-6.

111. Sun, G., Budde, R. J. (1999). Substitution studies of the second divalent metal cation requirement of protein tyrosine kinase CSK. Biochemistry, 38, 5659-65.

112. Suzuki, N., Hosokawa, D., Matsuura, Y., Kikuchi, A., Omura, T. (1999). In vivo and in vitro phosphorylation of rice dwarf phytoreovirus Pnsl2 cytoplasmic nonstructural protein. Arch. Virol., 144, 1371-80.

113. Tacke, E., Prufer, D., Schmitz, J., Rohde, W. (1991). The potato leafroll luteovirus 17K protein is a single-stranded nucleic acid-binding protein. Journal of General Virology, 72, 2035-8.

114. Takezawa, D., Ramachandiran, S., Paranjape, V., Poovaiah, B. W. (1996). Dual regulation of a chimeric plant serine/threonine kinase by calcium and calcium/calmodulin. Journal of Biological Chemistry, 271, 8126-32.

115. Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. (1987). Localisation of immunogold cytochemistry of the virus-coded 30K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology, 760,363-371.

116. Torii, K. U., Mitsukawa, N., Oosumi, Т., Matsuura, Y., Yokoyama, R., Whittier, R. F., Komeda, Y. (1996). The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats. Plant Cell, 8, 735-46.

117. Tozzini, A.C., Ek, В., Palva, E.T. & Hopp, H.E. (1994). Potato virus X coat protein: a glycoprotein. Virology 202, 651-658.

118. Tremaine, J.H. & Agrawal, H.O. (1972). Limited proteolysis of potato virus X by trypsin and plant proteases. Virology, 49, 735744.

119. Waigmann, E., Chen, M.-H., Bachmaier, R., Ghoshroy, S., Citovsky, V., (2000). Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO Journal, 19, 4875-4884.

120. Wang, H., Fowke, L. C., Crosby, W. L. (1997). A plant cyclin-dependent kinase inhibitor gene. Nature, 386, 451-2.

121. Watanabe, Y., Ogawa, Т., Okada, Y. (1992). In vivo phosphorylation of the 30-kDa protein of tobacco mosaic virus. FEBS Letters, 313,181-184.

122. Wilson, M. A., Shaw, J. G. (1987). Cotranslational disassembly of filamentous plant virus nucleocapsids in vitro and in vivo. In Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss, Inc., 159-181.

123. Wolf, S., Deom, C.M., Beachy, R.N., Lucas, W.L. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, 246, 337-339.

124. Wu, X., Gong, X., Foley, H. D., Schnell, M. J., Fu, Z. F. (2002). Both viral transcription and replication are reduced when the rabies virus nucleoprotein is not phosphorylated. Journal of Virology, 76, 4153-61.

125. Xie, В. Т., Ye, Y. J., Gong, Z. X. (2003). The phosphorylation of NS protein of wheat rosette stunt virus. Acta Biochimica and Biophysica Sinica, 35, 518-21.V