Роль глутаматных рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Казей, Василий Игоревич

• Казей, Василий Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Казей, Василий Игоревич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ I. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В АДАПТАЦИИ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ.

1.1. СИГНАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В

ВОЗБУДИМЫХ ТКАНЯХ.

I.II. ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ.

I.III. МИШЕНИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ.

РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

II. I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

11.1.1. Животные.

11.1.2. Протокол введения исследуемых соединений.

11.1.3. Физиологические методы исследования.

11.1.4. Выделение нейронов из мозжечка мышей и крыс.

11.1.5. Определение концентрации белка.

11.1.6. Определение ферментативных активностей.

11.1.7. Определение концентрации биогенных аминов.

11.1.8. Определение окисленности белков.

11.1.9. Хемилюминесцентный анализ АФК.

11.1.10. Измерение уровня Fen-индуцированной хемилюминесценции.

ILL11. Определение уровня мРНК к Na/K-A ТФазе и глутаматным рецепторам.

II.1.12. Статистическая обработка результатов.

II.II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

II.II. 1. Продукция свободных радикалов нейронами грызунов.

11.11.2. Влияние МРТР на биохимические характеристики мозга грызунов.

11.11.3. Влияние МРТР на физиологические параметры животных.

11.11.4. Экспрессия глутаматных рецепторов и Na-mpacnopmepa в возбудимых тканях грызунов.

11.11.5. Взаимное влияние Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов.

РАЗДЕЛ III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

РАЗДЕЛ IV. ВЫВОДЫ.

РАЗДЕЛУ. БЛАГОДАРНОСТИ.

РАЗДЕЛ VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Сокращения, принятые в тексте диссертации для обозначения радикальных продуктов и химических групп, соответствуют рекомендации Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC.

Другие сокращения, используемые в диссертации:

ACPD - 1-аминоциклопентан-1,3-дикарбоновая кислота

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изооксазолпропионовая кислота

DHPG - 3,4-дигидроксифенилгликоль

DNP - динитрофенилгидразин dNTP - смесь дезоксинуклеотидов АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ.

GAPDH - глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназа

GPCR - G-protein coupled receptors, рецепторы сопряженные с Gбелками mGluI (II,III) - глутаматные рецепторы 1,11,III групп соответственно M-MLV-RT - обратная транскриптаза вируса саркомы Молони грызунов.

МРТР - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин NMDA - N-метил-О-аспартат OD - оптическая плотность

SAM(P/R) - Senescence Accelerated Mice (Prone/Resistant), линия мышей с ускоренным старением (склонные/устойчивые)

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

ДОБА - диоксибензиламин кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота МАО А, В - моноаминооксидаза А, В соответственно МДА - малоновый диальдегид мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота

НСТ - нитросиний тетразолий

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОД - супероксиддисмутаза

СОШ - стандартная ошибка среднего

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль глутаматных рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса»

Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про-и антиоксидантных систем клетки и отражающийся в избыточном образовании в клетке активных форм кислорода (АФК), может являться причиной повреждения различных структур: ДНК, белков и липидов, и может приводить к клеточной смерти. Окислительный стресс сопровождает многие нейродегенеративные заболевания, по этой причине АФК принято считать вестниками клеточной смерти.

Однако в последнее время стало понятно, что активные формы кислорода принимают участие и в нормальной жизнедеятельности клетки в качестве сигнальных молекул. Так, реакции образования супероксид-аниона и гипохлорита клетками иммунной системы используется организмом при защите от инфекций и опухолевых процессов. Свободные радикалы, возникающие в цитозоле клетки в ответ на ее стимуляцию факторами роста, участвуют в регуляции процесса пролиферации. Образование простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов требует участие супероксид аниона, взаимодействующего с другим компонентом этой системы, арахидоновой кислотой - соединением, высвобождающимся из мембранных фосфолипидов в ходе индуцируемого АФК перекисного окисления липидов (ПОЛ). Недавно показано, что АФК, наряду с другими факторами, способны активировать такой транскрипционный фактор, как NF-кВ, что приводит к экспрессии различных белков.

Для исследования окислительного стресса применяются различные экспериментальные подходы, позволяющие выяснить молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. В настоящей работе мы использовали линию животных с ускоренным процессом старения SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1), выведенную путем близкородственных скрещиваний из линии AKR/J. Характерной особенностью этой линии является то, что животные нормально развиваются до 4-х месячного возраста, после чего наступает фаза ускоренного накопления старческих признаков, обусловленных повышенной продукцией АФК. Истинным контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant), также выведенная из линии AKR/J (Takeda, 1994).

Для моделирования окислительного стресса in vitro мы использовали N-метил-О-аспартат, NMDA, - соединение, активирующее одноименную группу ионотропных глутаматных рецепторов. Инкубируя выделенные из мозжечка нейроны мышей линии SAMP1 и крыс с различными концентрациями NMDA, мы наблюдали доз о- и время-зависимое увеличение продукции АФК.

Достаточно давно известно, что центральный фермент ионного гомеостаза, Ыа/К-АТФаза, также может принимать участие в процессах окислительного стресса, однако в литературе отсутствует систематическое исследование роли Ыа/К-АТФазы в этом процессе и ее функциональной связи с другими клеточными системами, принимающими участие в реализации окислительного стресса.

Целью настоящей работы явилось установление связи между глутаматными рецепторами, окислительным стрессом и Na/K-АТФазой.

Следующие задачи были сформулированы для достижения этой цели: 1) оценить продукцию АФК в клетках мозжечка двух исследуемых линий животных; 2) оценить влияние глутаматных рецепторов и Ыа/К-АТФазы на развитие окислительного стресса; 3) оценить влияние АФК на физиологические и биохимических параметры животных; 4) охарактеризовать взаимодействие между глутаматными рецепторами и Ыа/К-АТФазой.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Казей, Василий Игоревич

РАЗДЕЛ IV. ВЫВОДЫ

1. В нейронах мышей линии SAMP1 обнаружен повышенный уровень активных форм кислорода, коррелирующий с пониженной активностью супероксиддисмутазы и повышенной активностью моноаминооксидазы В.

2. Na/K-АТФаза контролирует генерацию активных форм кислорода в нейрональных клетках, и окислительный стресс нарушает этот контроль.

3. Окислительный стресс, индуцируемый МРТР, вызывает окислительную модификацию липидов и белков головного мозга, приводя к нарушениям физиологического поведения животных.

4. Экспрессия Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов в мозге грызунов проявляется на самых ранних этапах постнатального развития, обеспечивая взаимодействие этих белков в процессе контроля за окислительным стрессом.

5. Экспрессия Na/K-АТФазы в кардиомиоцитах крысы находится под контролем АФК, причем наиболее чувствительна к этому контролю альфа 2 изоформа фермента.

6. Обнаружено взаимодействие между глутаматными рецепторами NMDA-класса и Ыа/К-АТФазой, выражающееся во взаимном контроле их функционального состояния.

7. Активация NDMA-рецепторов приводит к дозозависимому увеличению уровня АФК в нейрональной клетке. Положительный вклад в увеличении продукции АФК вносит также NMDA-зависимое ингибирование Na/K-АТФазы.

РАЗДЕЛУ. БЛАГОДАРНОСТИ

Я бы хотел выразить благодарность моему научному руководителю профессору Александру Александровичу Болдыреву за внимание, помощь, предоставленную возможность работать и терпение. Без его участия настоящая работа не могла бы быть выполнена.

Я также благодарен сотрудникам лаборатории нейрохимии Института неврологии РАМН: Татьяне Николаевне Федоровой и Сергею Львовичу Стволинскому, а также сотрудникам кафедры биохимии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова: Елене Романовне Булыгиной, Ольге Владимировне Тюлиной и Томасу Аадоевичу Лейнсоо за ценные советы при обсуждении результатов и полезную дискуссию при подготовке этой диссертационной работы. Моя особая благодарность - коллегам из Гиссенского Университета - профессору В. Шонеру и профессору Г. Шайнер-Бобису за гостеприимство и руководство в овладении методами молекулярной биологии.

Огромное спасибо всем сотрудникам кафедр физиологии человека и животных и биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за помощь в выборе жизненного пути и полученную радость от работы.

РАЗДЕЛ III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы проводили исследование основных механизмов развития и регуляции окислительного стресса в возбудимых тканях. В качестве основного объекта исследования мы использовали мышей линии SAMP1, характеризующихся ускоренным старением по сравнению с контрольной линией SAMR1. Ускоренное старение мышей линии SAMP1, проявляющееся в возрасте 4-6 месяцев, характеризуется потерей двигательной активности, алопецией, лордокифозом, системным амилоидозом и прочими возрастными нарушениями. Ускоренное старение мышей этой линии может быть обусловлено дисбалансом работы про- и антиоксидантных систем клетки, проявляющимся в повышенном уровне продукции АФК. Это обстоятельство делает эту линию мышей удобной при изучении механизмов окислительного стресса. В опытах in vitro мы использовали нейрональные клетки мышей линии SAMP1 и контрольной к ней линии SAMR1. Нейрональные клетки были выбраны как наиболее чувствительные к действию АФК структуры, в которых можно значительно раньше наблюдать изменения метаболических процессов по сравнению с другими тканями. Хемилюминесцентным методом у мышей обеих линий (SAMP1 и SAMR1) нами был измерен стационарный и индуцированный ФМА и NMDA уровень АФК и показано, что нейрональные клетки, выделенные из мозжечка 12-дневных мышей SAMP1, характеризуются достоверно более высоким уровнем АФК, чем нейроны, выделенные из мозжечка контрольных животных. Таким образом, мы показали, что повышение продукции АФК в нейрональных клетках SAMP1 наблюдается на более ранней стадии онтогенеза, чем те, при которых у этих животных можно найти

86 отклонения в поведении или обучаемости - накопление старческих признаков у мышей этой линии наблюдается только с 4-месячного возраста, и в возрасте 12 дней животные исследуемых групп по морфологическим признакам неразличимы между собой. Другими словами, увеличение стационарного и индуцируемого уровня АФК в тканях предшествует появлению видимых дефектов организма и может рассматриваться как одна из причин, вызывающих эти дефекты.

При инкубации нейрональных клеток с различными концентрациями специфического ингибитора Na/K-АТФазы уабаина мы наблюдали, что в нейрональных клетках SAMP1, для которых характерен изначально повышенный уровень АФК, внесение уабаина не приводило к существенному росту АФК, в то время как в случае с нейронами SAMR1 наблюдалось повышение продукции АФК в интервалах концентрации уабаина до 10 мкМ включительно, а при большей концентрации уабаина (1 мМ) обнаруживалось некоторое снижение уровня АФК. Этот факт свидетельствует об участии Na/K-АТФазы в процессах регуляции уровня АФК в нейрональных клетках.

Мы также анализировали влияние NMDA-рецепторов на уровень АФК в нейрональных клетках мышей линии SAMP1. Обнаружилось, что инкубация клеток с агонистом NMDA-рецепторов N-метил-О-аспартатом приводит к увеличению уровня АФК в нейрональных клетках как SAMR1, так и SAMP1, причем у последних этот эффект был более выражен, вероятно, из-за сниженного уровня антиоксидантной защиты.

Для того чтобы убедиться, что в нейрональных клетках 5-дневных животных экспрессируются и глутаматные рецепторы и Na/K-АТФаза, мы проанализировали уровень матричной РНК кодирующей соответствующие белки. Анализ показал, что в нейрональных клетках мозжечка присутствует матричная РНК, кодирующая большинство ионотропных, и метаботропных глутаматных рецепторов (за исключением каинатных рецепторов II класса). В нейрональных клетках присутствует также матричная РНК к альфа-1, альфа-2, и альфа-3 субъединицам Na/K-АТФазы, причем количество матричной РНК, кодирующей альфа-3 (сигнальную) субъединицу, обнаруживается в количестве большем, чем мРНК к альфа-1 и альфа-2 субъединицам Na/K-АТФазы. Существенных различий в характере экспрессии Na/K-АТФазы в мозжечке между 5-, 9- и 11-дневными животными мы не выявили.

Классические исследования о вовлечении Na/K-АТФазы в сигнальные пути проводились на кардиомиоцитах крысы (Kometiani et al, 1998, Xie et al, 1999). Этот же объект мы использовали для того, чтобы продемонстрировать влияние окислительного стресса на уровень экспрессии Na/K-АТФазы. Для индукции окислительного стресса мы использовали изопреналин, являющийся агонистом бета-адренорецепторов, поскольку известно, что системное введение изопреналина вызывает рост АФК в кардиомиоцитах (Zhang et al, 2005). Выяснилось, что в ответ на системное введение изопреналина в кардиомиоцитах крысы наблюдается снижение количества матричной РНК, кодирующей альфа-2 субъединицу Na/K-АТФазы, при этом уровень мРНК к альфа-1 субъединице остается неизменным. Матричная РНК, кодирующая альфа-3 субъединицу Na/K-АТФазы, также была обнаружена в сердечной ткани, однако ее количество было очень небольшим. Вероятно, сигнальная функция этой субъединицы проявляется преимущественно в проводящей системе сердца (волокна Пуркинье).

Таким образом, нами показано, что в нейрональных клетках мозжечка грызунов исследованного нами возраста экспрессируются и глутаматные рецепторы, и Na/K-АТФаза, и эти белки принимают непосредственное участие в развитии и регуляции окислительного стресса, причем ионотропные глутаматные рецепторы влияют на активность Na/K-АТФазы посредством АФК. Показано также, что помимо прямого влияния на активность Na/K-АТФазы, АФК также контролируют экспрессию альфа-2 субъединицы этого белка в кардиомиоцитах крысы.

В качестве фактора усиления окислительного стресса у исследованных животных мы использовали нейротоксин МРТР, индуцирующий окислительный стресс в мозге грызунов (Sriram et al, 1997) и вызывающий симптомы паркинсонизма у приматов и грызунов (Burns et al., 1983). Систематическое введение животным этого нейротоксина приводило к изменению их физиологических и биохимических параметров. Так, после введения МРТР у животных линии SAMP1 выявлялся кратковременный тремор, значительно снижалась масса тела и увеличивалась мышечная ригидность (по сравнению с SAMR1). Двигательная активность снижалась у животных обеих групп, но более выраженным это снижение было у SAMP1. Исходя из более явного изменения их физиологических параметров, можно предположить, что животные линии SAMP1 в большей степени подвержены действию МРТР, и эти изменения указывают на возникновение индуцируемых МРТР повреждений в области черной субстанции мозга (Sedelis et al, 2000).

Концентрация дофамина в стриатуме, измеренная нами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, была настолько низка у SAMP1, что введение МРТР существенно не влияло на нее, в то время как в группе SAMR1 мы наблюдали существенное снижение уровня дофамина (практически на порядок) - до той же величины, что и у SAMP1. Концентрация норадреналина в тканях мозга зависит от содержания дофамина, в связи с этим закономерно выглядит как исходно сниженная концентрация норадреналина у SAMP1, так и ее снижение у животных обеих экспериментальных групп после введения МРТР.

Активность МАО В, изначально повышенная у мышей линии SAMP1, еще более возрастала при введении МРТР, что, очевидно, сказывалось как на уровне дофамина, так и на степени превращения МРТР в МРР+-радикал в исследуемых разделах мозга.

В мозге животных, получавших МРТР, наблюдалось увеличение уровня липидных гидроперекисей, ускорение окисления липидов и снижение их резистентности к окислению, что, по-видимому, связано с истощением антиоксидантной системы, которая должна предотвращать накопление окисленных продуктов. Эти изменения были демонстративно представлены в группе животных SAMP1, в то время как у SAMR1 количество липидных гидроперекисей в мозге не изменялось, а резистентность к окислению снижалась незначительно.

Вызванное МРТР снижение активности антиоксидантной системы удалось выявить и при измерении активности СОД. После введения МРТР активность СОД снижалась в обеих группах животных, что свидетельствует об истощении антиоксидантной системы, причем в случае SAMP1 эта система исходно характеризовалась меньшей эффективностью.

Дополнительным доказательством недостаточности антиоксидантной системы в мозге SAMP1 могут служить данные по количеству карбонильных групп белка в тканях мозга. Введение МРТР достоверно повышало концентрацию карбонильных групп и в гомогенате, и в митохондриях мозга SAMP1, но не SAMR1. Необходимо отметить, что концентрация карбонильных групп в митохондриальной фракции мозга была выше, чем в целом гомогенате, что, вероятно, связано с направленным действием МРТР в первую очередь на митохондрии - ведь именно митохондриальная МАО В осуществляет превращение МРТР в МРР+-радикал.

В результате проделанной работы нам удалось показать, что окислительный стресс, вызываемый МРТР, оказывает существенное влияние как на биохимические, так и на физиологические параметры грызунов, причем мыши линии SAMP более подвержены действию этого индуктора окислительного стресса. Повышенная продукция АФК при окислительном стрессе может контролироваться как Na/K-АТФазой, так и глутаматными рецепторами, в частности NMDA-рецепторами. Кроме того, активность Na/K-АТФазы находится под опосредованным АФК контролем NMDA рецепторов. В кардиомиоцитах АФК также контролируют уровень мРНК кодирующей альфа-2 изоформу Na/K-АТФазы.

Настоящая работа дополняет известную картину развития окислительного стресса в возбудимых тканях, позволяя получить более полную картину механизмов, участвующих в повреждении возбудимых клеток при нарушениях снабжения кислородом этих клеток. Понимание молекулярных реакций, реализующихся в ходе окислительного стресса, является основой для выработки адекватных подходов для защиты мозга и сердца от окислительного стресса и его последствий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Казей, Василий Игоревич, 2007 год

1. Болдырев А. А. Карнозин: биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Изд-во МГУ. - 1998. - 320 с.

2. Болдырев А. А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. М.: Диалог-МГУ. - 1999. - 362с.

3. Болдырев А.А. Дискриминация между апоптозом и некрозом нейронов под влиянием окислительного стресса.// Биохимия. -2000.-Т.65.-стр. 981-990.

4. Болдырев А. А. Окислительный стресс и мозг. // Соросовский Образовательный Журнал. 2001. - Т. 7. - № 4. - с. 21-28.

5. Болдырев А. А., Курелла Е.Г., Павлова Т.Н., Стволинский C.JI., Федосова Н.У.// Биологические мембраны. М. - 1992. - с. 92-93.

6. Болдырев А.А., М.О.Юнева, Е.В. Сорокина, Г.Г. Крамаренко, Т.Н.Федорова, Г.Г. Коновалова, и В.З. Ланкин. Антиоксидантные системы в тканях мышей с ускоренным темпом старения (SAM, Senescence Accelerated Mice).// Биохимия. 2001. - Т. 66. - стр. 1157-1163.

7. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев А.А. Активация глутаматных рецепторов ингибирует Na/K-АТРэзу гранулярных клеток мозжечка.// Биохимия. 2002. - Т.67. - стр. 1209-1214.

8. Бурчинский С. Г., Кузнецова С. М. Моноаминооксидаза мозга и ее ингибиторы в геронтологии. // Вопросы мед. Химии. -1988.-Т. 34.-Вып.4. -с. 2-9.

9. Владимиров Ю. А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных.// Итоги науки и техники. Серия Биофизика. 1989. - т. 24.-с. 172.

10. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты. // Вестник РАМН. 1998.- Т. 7. - с. 43-51.

11. Дурнев А., Середенин С. Мутагенез, скрининг и фармакологическая профилактика.// Медицина: М. -1999.

12. Зенков Н. К., Ланкин В. 3., Меныцикова Е. Б. Окислительный стресс.// МАИК.- 2001. -343 с.

13. Крыжановский Г. Н., Карабань И. Н., Магаева С. В., Карабань Н. В. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме.//Киев.- 1995. -139с.

14. Кудрин В. С., Мирошниченко И. И., Раевский, К. С. Различия в механизмах ауторецепторной регуляции биосинтеза и высвобождения дофамина в подкорковых структурах мозга крыс.// Нейрохимия. 1988. - Т. 7. -№1. - с. 3-9.

15. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Лемешко В.В., Шерматов К., Калиман П.А., Вихерт A.M. Возрастные изменения активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в цитозоле и митохондриях печени крыс.// Бюлл. Экспер. Биол. Мед. -1981. -Т. 92.-е. 310-311.

16. Ланкин В. 3., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. // НИИ кардиологии им. Л.А. Мясникова, пособие для врачей. М., РКНПК МЗ РФ, 2001, 78, стр. 14-39.

17. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-ATPa3bi с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами.// Биохимия. 2001. - T.66.N0 10. - стр. 1122-1131.

18. Минеева М.Ф., Стволинский С.Л. Влияние гистидинсодержащих дипептидов на тирозингидроксилазу мозга.// Бюл. эксп. биол. мед. 1996.-Т. 121.-№4. -с. 420-422.

19. Мирошниченко И. И., Кудрин В. С., Раевский К. С. Влияние карбидина, сульпирида и галоперидола на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс.// Фармаколог, и Токсикол. 1988. - Т 2. - с. 26-29.

20. Сорокина Е.В., Бастрикова Н.А., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н. Эффекты карнозина и селегилина при паркинсонизме, вызванном введением МРТР мышам линии SAM.// Нейрохимия. -2003. Т. 20. - стр. 133-138.

21. Федорова Т. Н., Болдырев А. А. и Ганнушкина И. В. Перекисное окисление липидов при экспериментальной ишемии мозга.// Биохимия. 1999. - Т. 64. - стр. 94-98.

22. Agarwal S., and Sohal R. S. Differential oxidative damage to mitochondrial proteins during aging.// Mech. Ageing Dev. 1995. - v. 85. - pp. 55-63.

23. Aiba, А., Капо, M., Chen, C., Stanton, M. E., Fox, G. D., Herrup, K., Zwingman, T. A. and Tonegawa, S. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluRl mutant mice.// Cell. 1994, v. 79.-pp. 377-388

24. Akimova OA, Bagrov AY, Lopina OD, Kamernitsky AV, Tremblay J, Hamet P, Orlov SN. Cardiotonic steroids differentially affectintracellular Na+ and Na+.i/[K+]i-independent signaling in C7-MDCK cells.// J Biol Chem. 2005. - v.280. - pp. 832-839.

25. Alper G., Girgin F.K., Ozgonul M., Mentes G., Ersoz В. MAO inhibitors and oxidant stress in aging brain tissue.// Eur. Neuropsychopharmacol. 1999. - v. 9. - pp. 247-252.

26. Ames B.N., Shigenaga M.K., and Hagen Т. M. Oxidants, antioxidants, and degenerative diseases of aging.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - v. 90. - pp. 7915-7922.

27. Arrigo A.P., and Kretz-Remmy C. Regulation of mammalian gene expression by free radicals.// In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma 0. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 183-223.

28. Aruoma О. I. Free radicals, oxidants and antioxidants: trend towards the year 2000 and beyond.// In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 1-28.

29. Barja G., and Herrero A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brai of mammals.//FASEB J. 2000. - v. 14. - pp. 312-318.

30. Basaga H. S. Biochemical aspects of free radicals.// Biochem. Cell Biol. 1990. - v. 68. - pp. 989-998.

31. Bell RM, Burns DJ. Lipid activation of protein kinase С.// J Biol Chem. 1991.-v.266.-pp. 4661-4664.

32. Bennett JA, Dingledine R. Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop.// Neuron. 1995. - v. 14(2) - pp. 373-384.

33. Blanco G. Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation.// Semin Nephrol. 2005. - v. 25. - pp. 292-303.

34. Boldyrev A, Bulygina E, Makhro A. Glutamate receptors modulate oxidative stress in neuronal cells. A mini-review.// Neurotox Res. -2004.-v. 6.-pp.581-587.

35. Boldyrev A, Kurella E. Mechanism of oxidative damage of dog kidney Na/K-ATPase.// Biochem Biophys Res Commun. 1996. - v. 15. - pp. 483-487.

36. Boldyrev A., Song R., Lawrence D., and Carpenter D. Carnosine protects against excitotoxic cell death independently of effects on reactive oxygen species.// Neurosci. 1999. - v. 94. - pp. 571-577.

37. Boveris A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria.// Methods Enzymol. 1984. -v. 105. - pp. 429-435.

38. Brines ML, Robbins RJ. Cell-type specific expression of Na+, K(+)-ATPase catalytic subunits in cultured neurons and glia: evidence for polarized distribution in neurons.// Brain Res. 1993. - v. 17. - pp. 111.

39. Britton DR, Britton KT. A sensitive open field measure of anxiolytic drug activity.// Pharmacol Biochem Behav. 1981. - v. 15. - pp. 577582.

40. Bulygina E., Gallant S., Kramarenko G., Stvolinsky S., Yuneva M., and Boldyrev A. Characterization of the Age Changes in Brain and Liver Enzymes of Senescence-Accelerated Mice (SAM).// J. Anti-Aging Med. 1999. - v. 2. - pp. 43-48.

41. Buss H., Chan Т., Sluis K., Domigan M., and Winterbourn C. Protein Carbonyl measurement by a sensitive ELISA method.// Free Rad. Biol. Med. 1997. - v .23. - pp. 361-366.

42. Cadenas E., and Davies K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.// Free Rad. Biol. Med. 2000. - v. 29. -pp. 222-230.

43. Cadet J. Free radicals and neurodegeneration.// Trends Neurosci. -1994.-v. 17.-pp. 192-193.

44. Choi D. Antagonizing excitotoxicity: A therapeutic strategy for stroke?// Mount Sinai J Med. 1998. - v.65. - pp. 133-138.

45. Choi WS, Yoon SY, Oh TH, Choi EJ, O'Malley KL, Oh YJ. Two distinct mechanisms are involved in 6-hydroxydopamine- and MPP+-induced dopaminergic neuronal cell death: role of caspases, ROS, and JNK.// J Neurosci Res. 1999. v.57. - pp. 86-94.

46. Chu Y, Kordower JH. Age-associated increases of alpha-synuclein in monkeys and humans are associated with nigrostriatal dopamine depletion: Is this the target for Parkinson's disease?// Neurobiol Dis. -2007.-v.25. pp. 134-149

47. Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, Zhang H, Kidd VJ, Son JH. Dopaminergic cell death induced by MPP(+), oxidant and specific neurotoxicants shares the common molecular mechanism.// J Neurochem. -2001. v.76. pp. 1010-1021.

48. Colotla VA, Flores E, Oscos A, Meneses A, Tapia R. Effects of MPTP on locomotor activity in mice.// Neurotoxicol Teratol. 1990. -v.12.-pp. 405-407.

49. Conn, P. J. and Pin, J. P. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors.// Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -1997.-v.37.-pp. 205-237.

50. Costantino, C., Macchiarulo, A. and Pellicciari, R. Homology model of the closed, functionally active, form of the amino terminal domain of mGluRl.// Bioorg. Med. Chem. 2001. - v.9. - pp. 847-852.

51. Cross C., Halliwell В., Borish E., Pryor W., Ames В., Saul R., McCord J., and Harman D. Oxygen radicals and human disease.// Ann. Intern. Med. 1987. - v. 107. - pp. 526-545.

52. Desai VG, Feuers RJ, Hart RW, Ali SF. MPP(+)-induced neurotoxicity in mouse is age-dependent: evidenced by the selectiveinhibition of complexes of electron transport.// Brain Res. 1996. -v.9. - pp. 1-8.

53. Dobrota D, Matejovicova M, Kurella EG, Boldyrev AA. Na/K-ATPase under oxidative stress: molecular mechanisms of injury.// Cell Mol Neurobiol. 1999. - v. 19. - pp. 141-149.

54. Ebadi M, Srinivasan SK, Baxi MD. Oxidative stress and antioxidant therapy in Parkinson's disease.// Prog Neurobiol. 1996. - v. 48. -pp. 1-19.

55. Emerling BM, Platanias LC, Black E, Nebreda AR, Davis RJ, Chandel NS. Mitochondrial reactive oxygen species activation of p38 mitogen-activated protein kinase is required for hypoxia signaling.// Mol Cell Biol. 2005. - v.25. - pp. 4853-4862.

56. Evans P. Free radicals in brain metabolism and pathology.// Brit. Med. Bull. 1993. - v. 49. - pp. 577-587.

57. Feldman AM, Tsutsui H, Shimokawa H, Takeshita A. Overexpression of tumor necrosis factor-alpha increases production of hydroxyl radical in murine myocardium.// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. - v. 284. - pp. 449-555.

58. File SE, Wardill AG. The reliability of the hole-board apparatus.// Psychopharmacologia. 1975. - v. 14. - pp. 47-51.

59. Finkel Т., and Holbrook N. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.// Nature. 2000. - v. 408. - pp. 239-247.

60. Francesconi, A. and Duvoisin, R. M. Role of the second and third intracellular loops of metabotropic glutamate receptors in mediating dual signal transduction activation.// J. Biol. Chem. 1998. - v. 273. -pp. 5615-5624.

61. Fridovich I. The reaction of xantine oxidase with molecular oxygen.// J. Biol. Chem. 1974. - v. 249. - pp. 4350-4353.

62. Gereau, R. W. and Heinemann, S. F. (1998) Role of protein kinase С phosphorylation in rapid desensitization of metabotropic glutamate receptor 5.//Neuron. 1998,-v.20.-pp. 143-151.

63. Green M. J., and Hill H.A.O. Chemistry of dioxygen.// Methods in Enzymology. 1984. - v. 105. - pp. 3-22.

64. Greene JG and Greenamyre JT. Bioenergetics and gluamate excitotoxicity.// Prog Neurobiol. 1996. - v. 48. - pp. 613-634.

65. Griendling KK, FitzGerald GA. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS.// Circulation. 2003. - v.21. - pp. 1912-1916.

66. Grune Т., Reinheckel Т., and Davies K. J. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. // The FASEB J. 1997. - v. 11. - pp. 526-534.

67. Halliwell В., and Gutteridge J. M. C. Free Radicals in Biology and Medicine. // Oxford University Press. 1999. - pp. 936.

68. Halliwell В., and Gutteridge J. M. C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease.// Biochem. J. 1984. - v. 219. -pp. 1-14.

69. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC. Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils.// Infect Immun. 1996. - v. 64. -pp. 3512-3517.

70. Hermans E. and Challiss J. Structural, signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors : prototypic family С G-protein-coupled receptors.// Biochem J. 2001. - v. 359. -pp. 465-484.

71. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptors.// Annu Rev. Neurosci. 1994.-v. 17.-pp. 31-108

72. Hollmann M, Maron C, Heinemann S. N-glycosylation site tagging suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor GluRl.// Neuron. 1994. - v.13 - pp. 1331-1343.

73. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates age-dependent disorders in SAMP strains of mice.// Mech Ageing Dev. 2002. - v.123. - pp. 1553-1561.

74. Huang WH, Wang Y, Askari A, Zolotarjova N, Ganjeizadeh M. Different sensitivities of the Na+/K(+)-ATPase isoforms to oxidants.// Biochim Biophys Acta. 1994. - v.23. - pp. 108-114.

75. Huang WH, Wang Y, Askari A. (Na+ + K+)-ATPase: inactivation and degradation induced by oxygen radicals.// Int J Biochem. 1992. - v.24. - pp. 621-626.

76. Jansen M, Dannhardt G. Antagonists and agonists at the glycine site of the NMDA receptor for therapeutic interventions.// Eur J Med Chem. 2003. - v.38. - pp. 661-670.

77. Jenner P., and Olanow C. W. Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson's disease. // Neurology. 1996,- v. 47.- pp. 161-170.

78. Juhaszova M, Blaustein MP. Na+ pump low and high ouabain affinity alpha subunit isoforms are differently distributed in cells.// Proc Natl Acad Sci. 1997. - v.94. -pp. 1800-1805.

79. Kaplan P, Matejovicova M, Herijgers P, Flameng W. Effect of free radical scavengers on myocardial function and Na+, K+-ATPase activity in stunned rabbit myocardium.// Scand Cardiovasc J. 2005. - v.39. - pp. 213-219.

80. Kettle AJ, Gedye CA, Winterbourn CC. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide.// Biochem J. -1997.-v.15.-pp. 503-508.

81. Kifle Y, Monnier J, Chesrown SE, Raizada MK, Nick HS. Regulation of the manganese superoxide dismutase and inducible nitric oxide synthase gene in rat neuronal and glial cells.// J. Neurochem. 1996. - v.66. - pp. 2128-2135.

82. Knight JA. Review: Free radicals, antioxidants, and the immune system.// Ann Clin Lab Sci. 2000. - v.30. - pp. 145-158.

83. Kometiani P, Liu L, Askari A. Digitalis-induced signaling by Na/K-ATPase in human breast cancer cells.// Mol Pharmacol. 2005. -v.67.-pp. 929-936.

84. Kopin I. J. MPTP: an industrial chemical and contaminant of illcit narcotics stimulates a new era in research on Parkinson, s disease.// Environ Heath Perspect. 1987. - v. 75. - pp. 45-51.

85. Lenaz G., Bovina C., Formiggini G., and Castelli G. P. Mitochondria, oxidative stress and antioxidant defences.// Acta Biochim Pol. 1999. - v. 46. - pp. 1-21.

86. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.// J. Biol. Chem. 1951. -v. 93.-pp. 265-275.

87. Mackes JL, Willner J. NMDA antagonist MK-801 impairs acquisition of place strategies, but not their use.// Behav Brain Res. -2006.-v. 175.-pp. 112-118.

88. Makanjuola R. O., Hill G., Dow R. C., Campbell G., and Ashcroft G. W. The effects of psychotropic drugs on exploratory and stereotyped behavior of rats studied on a hole-board.// Psychopharmacology. -1977.-v. 55.-№1.-pp. 67.

89. Misra H., and Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase.//J. Biol. Chem. 1972. - v. 247. - pp. 3170-3175.

90. Mohammadi K., P. Kometiani, Z. Xie, and A. Askari, Role of Protein Kinase С in the Signal Pathways That Link Na/K-ATPase to ERK1/2.// J. Biol. Chem. 2001. - v.276. No. 45. - pp. 42050-42056.

91. Moody TW, Merali Z, Crawley JN. The effects of anxiolytics and other agents on rat grooming behavior.// Ann N Y Acad Sci. 1988. -v.525. - pp. 281-290.

92. Morrow J. and Roberts L.J. Mass spectrometric quantification of F2-isoprostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidative stress.// Methods of Enzymology. 1999. - v. 300. - pp. 3-13.

93. Nemoto S., Takeda K., Yu Z. X., Ferrans V. J., and Finkel T. Role of mitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism.// Mol. Cell. Biol.- 2000.-v. 20. pp. 731 1-7318.

94. Newcomb T. G. and Loeb L. A. Mechanisms of mutagenicity of oxidatively-modified bases. In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 139-166.

95. Peng L, Martin-Vasallo P, Sweadner KJ. Isoforms of Na/K-ATPase alpha and beta subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures.// J Neurosci. 1997. - v. 17. - pp. 3488-3502.

96. Poewe W. H., and Wenning G. K. The natural history of Parkinson's disease.// Ann. Neurol. 1998. - v. 44. - pp. S1-S9.

97. Pryor W. A. Oxy-radicals and related species: Their formation, lifetime and reaction.// Annu. Rev. Physiol. 1986. - v. 48. - pp. 657667.

98. Raha S., and Robinson В. H. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and aging.// Trends Biochem. Sci. 2000. - v. 25. - pp. 502508.

99. Rathbun WB, Betlach MV. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate.// Anal Biochem. 1969. - v.28. - pp. 436-445.

100. Rathore N, John S, Kale M, Bhatnagar D. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in isoproterenol induced oxidative stress in rat tissues.// Pharmacol Res. 1998. - v.38. - pp. 297-303.

101. Ray, K. and Hauschild, В. C. Cys-140 is critical for metabotropic glutamate receptor-1 dimerization.// J. Biol. Chem. 2000. - v.275 -pp. 34245-34251.

102. Richter C. Biophysical consequence of lipid peroxidation in membranes.//Chem. Phys. Lipids. 1987. - v. 44. - pp. 175-189.

103. Sabri A, Hughie HH, Lucchesi PA. Regulation of hypertrophic and apoptotic signaling pathways by reactive oxygen species in cardiac myocytes.// Antioxid Redox Signal. 2003. - v.5. - pp. 731-740.

104. Schoner W, Bauer N, Muller-Ehmsen J, Kramer U, Hambarchian N, Schwinger R, Moeller H, Kost H, Weitkamp C, Schweitzer T, Kirch U, Neu H, Grunbaum EG. Ouabain as a mammalian hormone.// Ann N Y Acad Sci. 2003. - v.986. - pp. 678-684.

105. Sedelis M., Hofele K., Auburger G. W, Morgan S., Huston J. P., and Schwarting R. К. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences.//Behav Genet.- 2000. v. 30. №3. - pp. 171-182.

106. Semsei I., Rao G., and Richardson A. Expression of superoxide dismutase and catalase in rat brain as a function of age.// Mech. Ageing Dev. 1991. - v. 58. - pp. 13-19.

107. Shigenaga M. K., Hagen Т. M., and Ames B. N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994.-v. 91.-pp. 10771-10778.

108. Shih J. C., and Thompson R. F. Monoamine oxidase in neuropsychiatry and behavior.// American Journal of Human Genetics. 1999.-v. 65.-pp. 593-598

109. Shih J. C., Chen K., and Ridd M. J. Monoamine oxidase: from genes to behavior.// Annu. Rev. Neurisci. 1999.- v. 22.- pp. 197-217.

110. Sies H. Oxidative Stress II. Oxidants and antioxidants.// Academic Press, London. 1991.

111. V., and Hahn V. A behavioural study of the effect of pentadecapeptide BPC 157 in Parkinson's disease models in mice and gastric lesions induced by l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydrophyridine.// J. Physiol. Paris. 1999. - v. 93. - pp. 505-512.

112. Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bockaert, J. and Weiss, S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones.// Nature. 1985. - v.317. - pp. 717-719.

113. Slater T. F. Recent advances in biochemical pathology: toxic liver injury.// Pion Press. 1976. - pp. 1-283.

114. Sriram K, Pai KS, Boyd MR, Ravindranath V. Evidence for generation of oxidative stress in brain by MPTP: in vitro and in vivo studies in mice.// Brain Res. 1997. - v.749. - pp. 44-52.

115. Suzuki Y, Takagi Y, Nakamura R, Hashimoto K, Umemura K. Ability of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischemic damage in aged rats.// Brain Res. 2003. - v.21. -pp. 116-120.

116. Takeda T, Hosokawa M, Higuchi K. Senescence-accelerated mouse (SAM): a novel murine model of senescence.// Exp Gerontol. 1997. -v.32.-pp. 105-109.

117. Takeda Т., Hosokawa M., and Higuchi K. Senescence Accelerated Mice. A novel murine model of aging.// In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). Excerpta Medica, Amsterdam. - 1994. -pp. 15-23.

118. Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling.// Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2000. - v.279. -pp. 1005-1028.

119. Tu, J. C., Xiao, В., Yuan, J. P., Lanahan, A. A., Leoffert, K., Li, M., Linden, D. J. And Worley, P. F. Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors.// Neuron. 1998. - v.21. -pp. 717-726.

120. Turpaev KT. Reactive oxygen species and regulation of gene expression. //Biochemistry (Mosc). 2002. -v.67 No.3. - pp. 281-292.

121. Vladimirov Y. A. Studies of antioxidants with chemiluminescence.// In: Proceedings of the International Symposium on Natural Antioxidants. Molecular Mechanisms and Health Effects. Packer L., Traber M.G., and Xin W. (Eds.). - 1996. - pp. 125-144.

122. Wu HM, Chi KH, Lin WW. Proteasome inhibitors stimulate activator protein-1 pathway via reactive oxygen species production.// FEBS Lett. 2002. -v.526. - pp. 101-105.

123. Xie Z, Kometiani P, Liu J, Li J, Shapiro JI, Askari A. Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes.// J. Biol. Chem. 1999. - v.274. - pp. 19323-19328.

124. Zhang GX, Kimura S, Nishiyama A, Shokoji T, Rahman M, Yao L, Nagai Y, Fujisawa Y, Miyatake A, Abe Y. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats.// Cardiovasc Res. -2005.-v.65.-pp. 230-238.