Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Шмендель, Елена Васильевна

• Шмендель, Елена Васильевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шмендель, Елена Васильевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Направленная доставка НК в эукариотические клетки

1.1.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз

1.2. Типы адресных лигандов и их использование для доставки различных терапевтических агентов

1.2.1. Использование фолиевой кислоты в качестве адресного лиганда

1.2.1.1. Адресная доставка терапевтических НК с помощью фолатсодержащих транспортных систем

1.2.1.2. Адресная доставка противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки

1.2.1.3. Адресная доставка терапевтических молекул для лечения воспалительных заболеваний

1.2.2. Использование маннозы в качестве адресного лиганда

1.2.2.1. Дендритные клетки

1.2.2.2. ДНК-вакцинация

1.2.2.3. Рецептор маннозы

1.2.3 Галактоза и ее производные

1.2.3.1. Доставка нуклеиновых кислот с помощью углеводсодержащих липосом

1.2.3.2. Использование неогалактоконъюгатов для лечения заболеваний печени

1.3. Заключение

2. Обсуждение результатов

2.1. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов

2.1.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерину

2.1.2. Связывание адресных лигандов с функционализированными диглицеридами

2.1.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов

2.1.2.2. Синтез гликоконъюгатов

2.2. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени

2.2.1. Определение цитотоксичности адресных катионных липосом

2.2.2. Изучение трансфицирующей активности адресных катионных липосом

2.2.2.1. Изучение влияния соотношения компонентов липоплексов на адресную доставку НК в эукариотические клетки

2.2.2.2. Скрининг адресных липосом с фолатсодержащими липоконъюгатами по трансфицирующей активности

2.2.2.3. Оценка способности адресных липосом направленно доставлять НК в клетки, экспрессирующие фолатные рецепторы

2.2.2.4. Доставка плазмидной ДНК в дендритные клетки с помощью

маннозилсодержащих адресных липосом

3. Экспериментальная часть

3.1. Основные методы

3.2. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов

3.2.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерину

3.2.2. Присоединение адресных лигандов к функционализированным диглицеридам

3.2.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов

3.2.2.2. Синтез гликоконъюгатов

3.3. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени

3.3.1. Приготовление адресных катионных липосом

3.3.2. Олигонуклеотиды и плазмидная ДНК

3.3.3. Приготовление комплексов КЛ/НК

3.3.4. Определение размера и поверхностного потенциала липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами

3.3.5. Электрофорез

3.3.5.1. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях

3.3.5.2. Электрофорез в агарозном геле

3.3.6. Клеточные культуры

3.3.7. Исследование цитотоксичности с помощью МТТ-теста

3.3.8. Трансфекция клеток комплексами, сформированными FITC-ODN и КЛ

3.3.9. Трансфекция клеток комплексами, сформированными pEGFP-C2 и KJI

3.3.10. Проточная цитометрия

3.3.11. Доставка нуклеиновых кислот в дендритные клетки

3.3.11.1 CDI 1с+ предшественники ДК

3.3.11.2 Незрелые ДК

3.3.11.3. Трансфекция CD11 с+ предшественников и незрелых ДК

ВЫВОДЫ

Список литературы

Список сокращений

Вое - wpe/w-бутоксикарбонил

Chol - холестерин

CHEMS - холестерилгемисукцинат

COSY - гомоядерная корреляционная спектроскопия ЯМР DOPE - 1,2-диолеоил-лтг-глицеро-З-фосфоэтаноламин

DOTMA - гас-Л^-(1-(2,3-Диолеилокси)пропил)-Л',Л',уУ-триметиламмоний хлорид DIPEA - диизопропилэтиламин DMF - диметилформамид

DSPE - 1,2-дистеароил-5«-глицеро-3-фосфоэтаноламин EGFP - зеленый флуоресцентный белок FBS - эмбриональная телячья сыворотка

FITC-ODN - флуоресцеин-меченный олигодезоксирибонуклеотид

HBTU - 0-( 1 -//-Бензотриазол-1 -ил)-^N, NN'-тетраметилурониум гексафторфосфат

ODN - олигодезоксирибонуклеотид

МНС - главный комплекс гистосовместимости

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид PBS - натрий-фосфатный буфер PEG - полиэтиленгликоль

P/N - соотношение количества отрицательно заряженных фосфатных групп НК к количеству положительно заряженных атомов азота KJI

siRNA - малая интерферирующая РНК

TBTU - N,N,N',N'-тетраметил-0-(бснзотриазол-1 -ил)уропий тетрафторборат

Thl - воспалительный иммунный ответ

Th2 - противовоспалительный иммунный ответ

АГПр - асиалогликопротеиновый рецептор

АПК - антигенпредставляющие клетки

ДК- дендритные клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИП- индекс полидисперсности

КЛ - катионные липосомы

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛВП - липопротеины высокой плотности

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

нДК - незрелые дендритные клетки

НК - нуклеиновая кислота

ПАБК - шра-аминобензойная кислота

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТА - трансфицирующая активность

ТРК - транс-ретиноевые кислоты

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ФК - фолиевая кислота

ФР - фолатный рецептор

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени»

Введение

Многие заболевания, вызванные генными аномалиями, не поддаются лечению обычной терапией. Последние научные разработки в области молекулярной биологии привели к возникновению генной терапии, одной из самых перспективных развивающихся областей, направленной создание новых лекарственных препаратов для устранения дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или для придания клеткам новых функций [1]. Генная терапия основывается на введении функциональных последовательностей нуклеиновых кислот в клетки-мишени для лечения наследственных патологий, например кистозного фиброза [2], или онкологических, инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний [3]. С момента успешного использования генной терапии в клинике в 1995 г. более 1400 клинических протоколов были разработаны и осуществлены по всему миру.

В генной терапии используются препараты на основе нуклеиновых кислот (НК), которые включают плазмидные ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы, ДНК-энзимы и аптамеры. Основными проблемами успешной коррекции генетического отклонения являются эффективная доставка НК в нужное место в необходимом количестве, а также создание условий для их длительного функционирования. В генной терапии используется три различных подхода для осуществления транспорта НК. В первом подходе используются различные физические методы, которые позволяют доставить «незащищенную» (naked) молекулу ДНК в клетку. Второй включает использование генетически измененных вирусов, которые очень эффективны с точки зрения доставки НК и последующей экспрессии трансгена [4]. Однако их широкое применение ограничивается иммуногенностыо и онкогенностыо. В третьем подходе для транспорта НК применяют искусственные невирусные системы доставки на основе катионных липосом [4, 5], которые обладают преимуществами по сравнению с вирусными системами доставки; они защищают молекулы НК от инактивации под действием клеточных ферментов, не обладают инфекционностью и иммуногенностью, способны переносить НК любого размера. В настоящее время

липосомальные ДНК/РНК-препараты рассматриваются как перспективные фармакологические агенты для лечения онкологических заболеваний, неврологических расстройств (болезнь Паркинсона и Альцгеймера), а также терапии сердечно-сосудистых заболеваний [4].

Однако, существующие на сегодняшний день липосомы далеки от идеала, что связано с низкой эффективностью и специфичностью доставки НК. Ожидается, что модификация поверхности липосом адресными лигандами, способными связываться с рецепторами специфических клеток-мишеней, позволит увеличить эффективность процесса транспорта НК.

Данная работа посвящена созданию липосомальных систем доставки НК и представляет собой комплексное исследование, в котором разработан и проведен синтез адресных липоконъюгатов, получены адресные катионные липосомы, исследована их цитотоксичность и способность опосредовать направленный транспорт НК в различные клетки-мишени.

1. Литературный обзор

1.1. Направленная доставка НК в эукариотические клетки.

Доставка терапевтических НК в «нужное время» и в «нужное место» организма

\

является не простой задачей. При инъекционном введении НК непосредственно в ткань она очень быстро дренируются в лимфатическую систему. Кроме того вне своей нормальной биологической среды НК инактивируются ферментами (ДНК-азами, РНК-азами). Потому для проявления своего терапевтического действия НК должна быть помещена в «переносчик», способный осуществить направленный транспорт НК к специфическим клеткам-мишеням.

Использование в качестве «переносчика» катионных липосом позволяет предохранить НК от взаимодействия с компонентами окружающей биологической среды, тем самым, защитив их от преждевременной деградации [6], что способствует увеличению количества НК в целевых органах и эффективности внутриклеточного проникновения.

Электростатическое взаимодействие отрицательно заряженных молекул НК и положительно заряженных катионных липосом приводит к образованию наноразмерных комплексов (липоплексы). Количественное соотношение между НК и катионными липосомами (соотношение P/N) определяет поверхностный заряд (^-потенциал) липоплексов, который влияет на эффективность доставки НК. Клеточная поверхность заряжена отрицательно за счет наличия сульфированных гликопротеинов, сиаловых кислот, а также отрицательно заряженных липидов [7]. Поэтому положительно заряженные липоплексы эффективно взаимодействуют с отрицательно заряженной клеточной мембраной за счет электростатического взаимодействия и проникают внутрь клетки с помощью неспецифического адсорбционного эндоцитоза [8,9].

Известно, что липосомы способны пассивно накапливаться в патологически измененных тканях (например, опухолях), благодаря EPR (enhanced permeability and retention) эффекту. Однако, несмотря на то, что пассивное нацеливание является основным подходом в терапии онкологических заболеваний, оно имеет ряд недостатков. Во-первых, пассивное накопление сложно контролировать, что ведет к развитию множественной лекарственной устойчивости к препаратам [10]. Во-вторых, для опухоли с нарушенной проницаемостью EPR эффект может не работать.

Для решения проблемы направленной доставки НК необходимо создавать липосомы, которые после проникновения из сосудов в ткани будут способны связываться с рецепторами, расположенными на поверхности клеток. Это связывание может быть

достигнуто введением в состав липосом липофильных молекул, содержащих в своей структуре адресные лиганды, способные с высокой селективностью связываться с рецепторами, сверхэкспрессирующимися в клетках-мишенях.

1.1.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз

При взаимодействии лиганда с рецептором запускается процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза (рис. 1.1) [9].

Рисунок 1.1. Схема рецептор-опосредованного эндоцитоза [3].

Взаимодействие лиганда с внеклеточным рецептором плазматической мембраны приводит к образованию углублений, которые "втягиваются" в клеточную цитоплазму, где затем отщепляются с образованием везикул, покрытых белком - клатрином. Вскоре после образования, везикулы теряют белковую оболочку и сливаются с себеподобными везикулами и специализированными мембранными органеллами - эндосомами, образуя ранние эндосомы. В большинстве случаев, в этом процессе с парой лиганд-рецептор и переносимыми терапевтическими молекулами не происходит никаких изменений. Тем не менее, уменьшение рН и любое незначительное изменение окружающей среды в эндосоме может привести к частичной диссоциации лиганда и рецептора.

Во время процесса "созревания" ранних эндосом в поздние эндосомы, изменяется рН эндосомальной среды и происходит проникновение ферментов из аппарата Гольджи, что приводит к полной диссоциации лиганда и рецептора и транспорту рецепторов обратно на клеточную поверхность. Однако часть поглощенных рецепторов остается в эндосомах и подвергается деградации. Переносимые терапевтические молекулы также могут отделяться от лиганда или носителя и высвобождаться из ранних или поздних

эндосом. Поздние эндосомы в итоге взаимодействуют с лизосомами, при этом происходит уменьшение значения эндосомального рН до 4.5-5. В большинстве случаев, именно на этом этапе происходит высвобождение в цитоплазму терапевтических НК [11].

Доставка НК с помощью адресного нацеливания возможна в любые клетки, сверхэкпрессирующие рецептор, который будет специфично узнавать, и связывать лиганд определенной структуры. Для увеличения нацеливания могут быть использованы мультивалентные лиганды, которые обеспечивают более сильное взаимодействие лиганда с рецептором, чем моновалентные. Например, системы доставки, связанные с 3-15 молекулами фолиевой кислоты, обладают в 2500-170000 раз большим сродством к рецепторам по сравнению со свободной фолиевой кислотой [12, 13].

1.2. Типы адресных лигандов и их использование для доставки различных терапевтических агентов

Среди адресных лигандов наиболее часто используются малые молекулы, такие как витамины и углеводы, пептиды, так как они обладают простой структурой, легко конъюгируются с другими молекулами и не проявляют иммуногенных свойств.

1.2.1. Использование фолиевой кислоты в качестве адресного лиганда

Фолиевая кислота (ФК) - водорастворимый витамин группы В (витамин В9), необходимый для синтеза нуклеотидов, а следовательно, для роста и развития всех клеток. Кроме того, для создания 8-аденозилметионина, субстрата при метилировании ДНК, гистонов, в-белков и многих метаболических строительных блоков также требуется ФК

Фолиевая кислота состоит из трех структурных единиц: остатка 2-амино-4-окси-6-метилптеридина (I), и-аминобензойной (II) и L-глутаминовой (III) кислот.

[14].

О^ОН

он

H2N N N

2 Н

__ ._

Y

"V

J

II

III

Коферментные функции фолиевой кислоты связаны не с ее свободной формой, а с ее восстановленным птеридиновым производным [15]. Восстановление сводится к

присоединению четырех атомов водорода в положения 5, 6, 7 и 8 гетероцикла с образованием тетрагидрофолиевои кислоты.

Фолаты синтезируются кишечными бактериями в количествах недостаточных для клеточного роста и регенерации тканей и полного обеспечения всего организма ФК, поэтому для ее пополнения необходимо постоянное поглощение производных ФК с пищей.

ФК - гидрофильная и анионная молекула при физиологических значениях рЫ может пассивно проходить через клеточную мембрану с помощью диффузии. Кроме того, поглощение ФК клеткой может осуществляться тремя мембраносвязанными транспортными системами [16], с помощью которых клетки аккумулируют ФК для своего роста и развития. Тетрагидрофолиевая кислота попадает в клетки путем эндоцитоза при взаимодействии со специфическим переносчиком восстановленных фолатов, которые экспрессируются в нормальных тканях взрослого человека. Протон-сопряженный высоко аффинный переносчик ФК - является основным переносчиком ФК, действующим при низком значении рН, например, в желудочно-кишечном тракте. Третий переносчик -фолатный рецептор (ФР) — гликополипептид, который прикреплен к клеточной поверхностности гликозилфосфатидилинозитольным якорем. Фолатный рецептор избирательно связывает ФК и переносит ее внутрь клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Были обнаружены две мембраносвязанные изоформы ФР (а и /? ) [17] и одна секретируемая гематопоэтическими клетками изоформа у. Фолатные рецепторы способны узнавать, связывать и поглощать молекулы, содержащие остаток ФК, а также специфичкские моноклональные антитела.

Быстро развивающиеся или недифференцированные опухоли, в отличие от нормальных тканей, сверхэкспрессируют рецепторы ФК [18]. Так, повышенная экспрессия ФР наблюдается на мембранах клеток плоскоклеточного рака (линия КВ содержит 4 миллиона ФР на клетку) [19, 20], раке яичников (клетки IGROV-1, OVCAR-3), матки (клетки HeLa) [21], толстой кишки, молочной железы, легких и почек, в частности на линии НЕК 293Т [22], так же как и при опухолях, метастазирующих в головной мозг [16]. Сверхэкспрессия ФР была также обнаружена при трофобластической опухоли, менингиоме, остиосаркоме, неходжскинской лимфоме и опухоли хороидного сплетения [23].

Таким образом, проблемы селективного нацеливания терапевтических агентов на опухолевые клетки может быть решена с помощью создания конъюгатов, содержащих в своей структуре ФК.

Как адресный лиганд, ФК имеет важные преимущества перед другими лигандами, например антителами [17] или полипептидами [23]:

1. Низкая иммуногенность (иммунный ответ на введение антител или их фрагментов делает невозможным их повторное использование);

2. Быстрое проникновение в опухоль (благодаря низкой молекулярной массе, конъюгаты ФК охотно диффундируют в опухолевую ткань);

3. Устойчивость к денатурации, происходящей при хранении, а также при растворении в органических растворителях, повторной очистке и нагревании;

4. Простое химическое строение, которое приводит к уменьшению стоимости продуктов и более легкому и качественному контролю;

5. Высокая специфичность к опухолям, высокая встречаемость опухолей, несущих рецепторы фолата.

1.2.1.1. Адресная доставка терапевтических НК с помощью фолатсодержащих транспортных систем

Катионные липосомы, в состав которых входят фолатсодержащие липоконъюгаты, были использованы для доставки ДНК [24-26], антисмысловых ODN [27] и siRNA [28].

В работе, выполненной Holfland и др. [26], описано создание комплексов ДНК с катионными липосомами, состоящими из катионного липида RPR209120 (1) и DOPE, и адресных фолатсодержащих липоконъюгатов 2 или 3. Эффективность доставки комплексов, сформированных адресными катионными липосомами и НК, в опухолевые клетки была выше эффективности доставки в нормальные клетки.

В работе Laine и др. на основе липидов археи были синтезированы адресные липоконъюгаты, в которых ФК ковалентно связана с гидрофобным доменом с помощью полиэтиленгликольного (ПЭГ) остатка [24]. Доставка плазмидной ДНК с помощью липосом, состоящих из катионного липида 4 и синтезированных липоконъюгатов 5а,b в клетки HeLa, сверхэкспрессирующие ФР, показала, что максимальный уровень экспрессии трансгена наблюдался при использовании 10 % фолатсодержащего амфифила.

н Н0Т°0

ФК-рЕС-тетраэфир: х = О, целая молекула ФК-РЕС-Диэфир: х = О, без пунктирной части

О

, | 2 I

- <

5а,Ь

ОН

"О.

Кроме того, было отмечено, что фолатсодержащие катионные липосомы способствовали переносу ДНК не только в клетки НеЬа, но и в клетки А549 и 16НВЕ14о(-) с низким уровнем экспрессии ФР. Трансфицирующая активность липосом,

содержащих ФК, снижалась при наличии свободной ФК в культуральной среде, что свидетельствовало о рецептор-опосредованном механизме проникновения ДНК в клетку [24].

Недавно, Li и др. получили комплексы, состоящие из ДНК и катионного липида, ковалентно связанного с молекулой ФК. Липоплексы селективно поглощались клетками L1210JF, сверхэксрессирующими ФР, а их трансфицирующая активность in vitro и in vivo была выше, чем комплексов, сформированных липосомами, не содержащими в качестве адресного л и ганда ФК [29].

Альтернативная стратегия создания направленных систем доставки в опухолеые клетки основана на электростатическом взаимодействии ФК с катионными липосомами. В работе S. Duarte и др. описано образование комплексов НК с липосомами, содержащими нековалентно связанную ФК [30]. Уровень биологической активности таких катионных липосом был выше, чем уровень липосом с ковалентно связанной ФК и коммерческих доступных липосом, не содержащих ФК.

Для доставки НК также были предложены полиэлектролитные мицеллярные комплексы, образующиеся при смешивании синтетического конъюгата олигонуклеотид-ПЭГ-ФК с катионными полимерами - полиэтиленимином или поли-Ь-лизином [31]. Отрицательный заряд олигонуклеотида нейтрализуется молекулами катионного полимера с образованием "ядра" мицеллярного комплекса. Гидрофильные молекулы ПЭГ располагаются на внешней стороне "ядра" и предотвращают неспецифическое взаимодействие с белками сыворотки крови. После системного введения мицеллярных комплексов в кровоток, они'пассивно накапливались около опухоли [32]. Присоединение фолиевой кислоты на дистальный конец ПЭГ повышало специфичность доставки к раковым клеткам. Так, при концентрации олигонуклеотида 4 мкг/мл использование мицеллярных комплексов с ФК приводило к более эффективному ингибированию экспрессии зеленого флуоресцентного белка (EGFP) по сравнению с ненацеливающими комплексами [33].

Дополнительное подтверждение нацеливающей способности фолатсодержащих мицеллярных комплексов было получено в ходе трансфекции клеток KB, сверхэкспрессирующих ФР, и клеток А549, несодержащих данных рецепторов [33]. Было показано, что наличие ФК в составе направляет комплексы к клеткам KB и приводит к увеличению внутриклеточной доставки антисмыслового олигонуклеотида благодаря рецептор-опосредованному эндоцитозу.

В работе Lee и др. среди 28 различных тестируемых лигандов (пептиды Hph-1, пенетратин, НР4, TAT, MAP, PSK, KQE, HKT, PLP, VQK, NKT, DM II, AEF, ESL, GWG,

DWL, FKR, KCC, SPD, SVS, SET, QKT, INL, RYA, CWL, SKE, GST и фолиевая кислота), липоплексы, содержащие в качестве адресного лиганда ФК, способствовали наиболее эффективному подавлению экспрессии репортерного гена в клетках IleLa [34].

С использованием фолатсодержащего катионного полимера была проведена эффективная трансфекция клеток линии 293Т, сверхэкспрессирующих ФР, тогда как использование ^модифицированного полимера приводило к незначительной трансфекции. Сходные результаты были получены и для клеток глиомы С6, экспрессирующих на клеточной поверхности среднее количество ФР [22]. Уровень трансфекции клеток HepG2, на поверхности которых отсутствуют рецепторы ФК [35], оставался одинаково низким для всех катионных полимеров.

Условия формирования комплексов НК с фолатсодержащими катионными наночастицами также могут влиять на эффективность трансфекции [36]. Так, было обнаружено, что в случае комплексов, сформированных в 5 мМ растворе NaCl, эффективность доставки РНК была в 8-9 раз выше, чем в случае комплексов, полученных в воде.

1.2.1.2. Адресная доставка противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки

Кроме терапевтических НК с помощью липосом или мицелл, модифицированных ФК, может быть осуществлена доставка ряда соединений, например, 6-9, обладающих противоопухолевой активностью (табл. 1.1).

Таблица 1.1. Доставляемые противоопухолевые агенты с помощью фолатсодержащих конструкций

Противоопухолевый Клеточная Фолатсодержащий

агент линия липоконъюгат

Паклитаксел KB соединение 10, 11

Доксорубицин KB

Транс-ретиноевые KB соединение 11

кислоты (ТРК)

Иринотекан SI 80 соединение 11

9-Нитрокамптоцетин HeLa и ВХРСЗ соединение 11

Паклитаксел (6) - противоопухолевый агент, применяется для лечения рака яичников, груди, головы, шеи [37]. Механизм действия связан с влиянием на процесс деления клетки.

он

о

о

ОО

/К

о

о

о

о

8

9

Доксорубицин (7) - противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда. Оказывает антимитотическое и антипролиферативное действие. Механизм действия заключается во взаимодействии с ДНК, образовании свободных радикалов и прямом воздействии на мембраны клеток с подавлением синтеза нуклеиновых кислот.

Транс-ретиноевые кислоты (ТРК) - активные метаболиты ретинола, имеют высокий потенциал в качестве противоопухолевых агентов при остром промиелоцитарном лейкозе и других опухолях [38].

Иринотекан (8) используется для лечения рака толстой кишки, резистентного рака шейки матки и других гинекологических опухолей [39, 40]. Иринотекан является про-лекарством, которое превращается in vivo в активный метаболит 7-этил-10-гидроксикамптотецин, обладающий в 100-1000 раз большей цитотоксичностью по сравнению с иринотеканом [41].

9-Нитрокамптотецин (9) - ингибитор топоизомеразы-I, используется в клинических испытаниях для лечения рака. Фармакологические исследования показывают, что противоопухолевая активность 9-нитрокампотецина выше камптотецина, однако его применение ограничено низкой растворимостью в воде, неустойчивостью и потерей активности при попадании в биологические жидкости [42].

Для увеличения селективности накопления и проникновения в опухолевые клетки [43, 44], а также для решения проблемы растворимости перечисленных выше противоопухолевых агентов [45, 46] и преждевременной деградации в биологических жидкостях [47], были разработаны адресные липосомальные системы доставки, включающие фолатсодержащие липоконъюгаты.

Для создания адресных липосом были синтезированы липофильные производные фолиевой кислоты 10 [48] и 11 [18, 49, 50], со сложноэфирным и амидным линкерами [18].

Липосомы, состоящие из дипальмитоилфосфатидилхолина,

димиристоилфосфатидилглицерина и липоконъюгатов 10, 11, имели превосходную коллоидную стабильность и были способны инкапсулировать и сохранять паклитаксел в течение длительного периода. Фолатсодержащие липосомы лучше поглощались клетками КВ, чем "обычные" липосомы. Причем этот процесс блокировался добавлением к клеткам 1 мМ свободной ФК (табл. 1.2), что указывает на рецептор-опосредованную доставку липосом [49].

Цитотоксичность различных лекарственных форм паклитаксела была определена в отношении клеток КВ (табл. 1.2) [49]. Значение 1Сзо паклитаксела, инкапсулированного в фолатсодержащие липосомы, было в 4 раза ниже значения, полученного для "обычных" липосом и в 2.5 раза ниже - мицеллярной формы паклитакселя (СгеторЬог ЕЬ). Эти результаты подтверждают более эффективную доставку паклитакселя в опухолевые клетки с помощью адресных липосом. Кроме того, было отмечено, что адресные липосомы с пакситакселем гораздо быстрее "исчезают" из кровотока по сравнению с "обычными" липосомами.

Таблица 1.2. Цитотоксичность лекарственных форм паклитаксела в отношении _клеток КВ [49]._

Противоопухолевый агент Лекарственная форма 1С50 (мкМ)

Паклитаксел Фолатсодержащие липосомы 0.048±0.015

Фолатсодержащие липосомы + 1 мМ ФК 0.151±0.052

"Обычные" липосомы 0.184±0.063

СгешорЬог ЕЬ с этанолом 0.121±0.044

Цитотоксичность адресных липосом, "нагруженных" другим противоопухолевым препаратом доксорубицином (7), на клетках КВ была в 6 раз выше цитотоксичности "обычных" липосом [18]. Фармакокинетические исследования показали, что липосомы, содержащие соединение 10 циркулируют в кровотоке дольше липосом с липоконъюгатом 11.

Для доставки транс-ретиноевых кислот (ТРК) в опухолевые клетки были получены эмульсионные липидные системы, состоящие из соевого масла, яичного фосфатидилхолина и адресного липоконъюгата 11 с ПЭГ различной длины (ПЭГ2ооо и ПЭГ3400) [20]. Было показано, что поглощение ТРК в случае эмульсий с фолатсодержащим конъюгатом 11, происходит эффективнее, чем в случае "обычных" эмульсий. Кроме того, длина ПЭГ остатка также оказывала влияние на накопление ТРК. Так, липоконъюгат с ПЭГ3400 способствовал более эффективному поглощению ТРК, чем конъюгат с ПЭГгооо-Добавление свободной ФК приводило к "соревнованию" между фолатсодержащей эмульсией и ФК за связывание с клеточным рецептором. Фолатсодержащая эмульсионная форма ТРК ингибировала рост клеток КВ, сверхэкспрессирующих ФР, в 2 раза эффективнее, чем клеток МСР-7, не содержащих ФР.

Для доставки иринотекана (8) в опухолевые клетки использовали липосомы, состоящие из соевого фосфатидилхолина, холестерина, дезоксихолата натрия (10:1:0.125 масс.) и адресного липоконъюгата 11 [51]. Иринотекан, инкапсулированный в фолатсодержащие липосомы, ингибировал рост опухоли дозозависимым образом и обладал более высокой противоопухолевой активностью и меньшей общей токсичностью по сравнению с "обычными" липосомами.

В качестве переносчика 9-нитрокамптотецина (9) были опробованы полимерные мицеллы, построенные на основе биодеградируемых амфифильных блок-сополимеров, модифицированных фолиевой кислотой (рис. 1.2) [52-54].

• 9-NC

PEG DSPE О Folic acid

Рисунок 1.2. Образование фолатсодержащих полимерных мицелл с 9-нитрокамптотецином. Полимерные мицеллы состоят из смеси фолатсодержащего липоконъюгата 3 и метоксиполиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (1:100 мольн.).

Цитотоксичность 9-нитрокамптотецина в составе фолатсодержащих полимерных мицелл, была изучена in vitro в отношении 2 линий опухолевых клеток: HeLa и ВХРСЗ (рак поджелудочной железы) (табл. 1.3).

Таблица 1.3. Значения IC50 (мкг/мл) для различных лекарственных форм

9-нитрокамптотецина

Лекарственные формы 1С50

24 ч L 8ч

HeLa ВХРСЗ HeLa ВХРСЗ

Фолатсодержащие мицеллы 0.52 8.31 0.005 7.10

"Обычные" мицеллы 1.93 9.20 0.15 7.52

9-нитрокамптотецин 8.85 14.00 1.52 9.61

Наиболее чувствительны к действию 9-нитрокамптотецина, инкапсулированному в фолатные мицеллы, были клетки НеЬа, на поверхности которых сверхэкспрессируются рецепторы ФК (1С5о=0.52 мкг/мл). Кроме того, наличие ФК увеличивало токсичность 9-нитрокамптотецина в 3.7 и 17 раз по сравнению с "обычной" мицеллярной и индивидуальной формой, соответственно (табл. 1.3). На поверхности клеток ВХРСЗ содержится небольшое количество ФР, поэтому для данной линии клеток значения 1С50 были выше, чем значения Ю50 для клеток НеЬа. Эффективность действия 9-нитрокамптотецина в составе фолатсодержащих мицелл увеличивалась с течением времени (48 ч) для клеток НеЬа и практически не изменялась для клеток ВХРСЗ [54].

1.2.1.3. Адресная доставка терапевтических молекул для лечения воспалительных заболевании

Первичная функция активированных провоспалительных макрофагов - защита от условно патогенной инфекции [55], однако ошибочная или преждевременная активация макрофагов играет ключевую роль в развитии аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Например, активированные провоспалительные макрофаги участвуют в развитии атеросклероза, диабета, ишемии, волчанки, псориаза, ревматоидного артрита, отторжения при трансплантации, язвенного колита, трамве при ударе, рассеянного склероза, склеродермии, болезни Крона, синдрома Шегрена, гломерулонефрита, саркоидоза, и других заболеваний [56-58]. Па поверхности провоспалительных макрофагов экспрессируются в большом количестве ФР [59], что может быть использовано для доставки терапевтических агентов в места воспаления с помощью ФК.

На данный момент предложено три типа терапий заболеваний, вызванных ошибочной активацией макрофагов: (1) иммунотерапия, основанная на доставке гаптенов, содержащих в качестве адресного лиганда ФК, (2) химиотерапия с помощью , фолатсодержащих противовоспалительных лекарств, и (3) иммунохимиотерапия, основанная на доставке конъюгатов противовоспалительных агентов с антителами, направленными к ФР [59].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шмендель, Елена Васильевна, 2013 год

Список литературы

1. Zhang J., Li X., Lou L., Li X., Jia Y., Jin Z., Zhu Y. Non-viral Gene Therapy in Intracellular delivery (fundamental biomedical technologies, 5ed. (Ed. Prokop A.) // Springer Netherlands - 2011. - P. 599-699.

2. Hattori Y., Maitani Y. Enhanced in vitro DNA transfection efficiency by novel folate-linked nanoparticles in human prostate cancer and oral cancer // J. Control. Release. -2004.-V. 97.-P. 173-183.

3. Faneca H., Cardoso A.L., Trabulo S., Duarte S., Pedroso de Lima M.C. Cationic liposome-based systems for nucleic acid delivery: from the formulation development to therapeutic applications in Drug delivery systems: advanced technologies potentially applicable in personalised treatment, ed. 4(Ed. Coelho J.) // Springer Netherlands - 2013. - P. 153-184.

4. Gene and cell therapy: therapeutic mechanisms and strategies (Ed. Templeton N. S.) // Boca Raton. - CRC Press. - 2009.

5. Nucleic acid transfection (Eds. Biekle W., Erbacher C.) // Springer Berlin. - 2010.

6. Torchilin V. Liposomes in Drug Delivery in Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery (Ed. Siepmann J., Siegel R.A., Rathbone M.J.) // Springer US. -2012. P 289-328.

7. Tarahovsky Y.S. Cell transfection by DNA-lipid complexes -lipoplexes // Biochemistry (Mosc.). - 2009. - V. 74. - P. 1293-1304.

8. Barratt G. Delivery to Intracellular Targets by Nanosized Particles in Intracellular delivery (fundamental biomedical technologies, 5ed. (Ed. Prokop A.) // Springer Netherlands -2011.-P. 73-95.

9. Lee Y., Kataoka K. Delivery of Nucleic Acid Drugs in Nucleic Acid Drugs (Ed. Murakami A.) // Springer Berlin Heidelberg- 2012. - V. 249. - P. 95-134.

10. Peer D., Margalit R. Fluoxetine and reversal of multidrug resistance // Cancer Lett. - 2006. -V. 237.-P. 180-187.

11. Minko T. Receptor Mediated Delivery Systems for Cancer in Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery (Ed. Siepmann J., Siegel R.A., Rathbone M.J.) // Springer US. - 2012. - P. 329-355.

12. Ilong S., Leroueil P.R., Majoros I.J., Orr B.G., Baker J.R. Jr., Banaszak IIoll M.M. The binding avidity of a nanoparticle-based multivalent targeted drug delivery platform // Chem. Biol. - 2007. - V. 14. - P.107-115.

13. Wolinsky J.B., Grinstaff M.W. Therapeutic and diagnostic applications of dendrimers for cancer treatment // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2008. - V. 60. - P. 1037-1055.

14. Loenen W. S-adenosylmethionine: jack of all trades and master of everything? // Biochem. Soc. Trans. - 2006. - V. 34. - P. 330-333.

15. Matherly L.I I., IIou Z., Deng Y. Human reduced folate carrier: translation of basic biology to cancer etiology and therapy // Cancer. Metastasis. Rev. - 2007. - V. 26. - P. 111-128.

16. Salazar M.D., Ratnam M. The folate receptor: What does it promise in tissue-targeted therapeutics? // Cancer. Metastasis. Rev. - 2007. - V. 26. - P. 141-152.

17. Lee R.J., Low P.S. Folate as a Targeting Device for Proteins Utilizing Folate Receptor-Mediated Endocytosis in Drug Targeting (Ed. Francis G. E., Delgado C.) // Humana Press -2000. - V. 25.-P. 69-76.

18. Xiang G., Wu J., Lu Y., Liu Z., Lee R.J. Synthesis and evaluation of a novel ligand for folate-mediated targeting liposomes // Int. J. Pharm. - 2008. - V. 356. - P. 29-36.

19. Lee R.J., Low P.S. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis // J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269. - P. 3198-3204.

20. Kim S.H., Kim J.K., Lim S.J., Park J.S., Lee M.K., Kim C.K. Folate-tethered emulsion for the target delivery of retinoids to cancer cells // Eur. J. Pharm. Biopharm. - 2008. - V. 68. -P. 618-625.

21. Leamon C.P., Low P. S. Folate-mediated targeting: from diagnostics to drug and gene delivery // Drug. Discov. Today. - 2001. - V. 6. - P. 44-51.

22. Liang B., He M.L., Xiao Z.P., Li Y., Chan C.Y., Kung H.F., Shuai X.T., Peng Y. Synthesis and characterization of folate-PEG-grafted-hyperbranched-PEI for tumor-targeted gene delivery // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. - V. 367. - P. 874-880.

23. Zhao X.B., Lee R.J. Tumor-selective targeted delivery of genes and antisense oligodeoxyribonucleotides via the folate receptor // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2004. - V. 56.-P. 1193-1204.

24. Laine C., Mornet E., Lemiegre L., Montier T., Cammas-Marion S., Neveu C., Carmoy N., Lehn P., Benvegnu T. Folate-equipped pegylated archaeal lipid derivatives: synthesis and transfection properties // Chemistry. - 2008. - V. 14. - P. 8330-8340.

25. Li PL, Piao L., Yu B., Yung B.C., Zhang W., Wang P.G., Lee J.L., Lee R.J. Delivery of calf thymus DNA to tumor by folate receptor targeted cationic liposomes // Biomaterials. -2011.-V. 32.-P. 6614-6620.

26. Ilofland H.E., Masson C., Iginla S., Osetinsky I., Reddy J.A., Leamon C.P., Scherman D., Bessodes M., Wils P. Folate-targeted gene transfer in vivo II Mol. Ther. - 2002. - V. 5. -P. 739-744.

27. Rait A.S., Pirollo K.F., Xiang L., Ulick D., Chang E.H. Tumor-targeting, systemically delivered antisense HER-2 chemosensitizes human breast cancer xenografts irrespective of HER-2 levels // Mol. Med. - 2002. - V. 8. - P. 475-486.

28. Feng C., Wang T., Tang R., Wang J., Long H., Gao X., Tang S. Silencing of the MYCN gene by siRNA delivered by folate receptor-targeted liposomes in LA-N-5 cells // Pediatr. Surg. Int. -2010.-V. 26.-P. 1185-1191.

29. Li P., Liu D., Sun X., Liu C., Liu Y., Zhang N. A novel cationic liposome formulation for efficient gene delivery via a pulmonary route // Nanotechnology. - 2011. - V. 22. - P. 245104.

30. Duarte S., Faneca H., Pedroso de Lima M.C. Non-covalent association of folate to lipoplexes: a promising strategy to improve gene delivery in the presence of serum // J. Contr. Rel. - 2011. - V. 149. - P. 264-272.

31. Kim S.H., Jeong J.H., Mok H., Lee S.H., Kim S.W., Park T.G. Folate receptor targeted delivery of polyelectrolyte complex micelles prepared from ODN-PEG-folate conjugate and cationic lipids // Biotechnol. Prog. - 2007. - V. 23. - P. 232-237.

32. Jeong J.H., Kim S.H., Kim S.W., Park T.G. Polyelectrolyte complex micelles composed of c-raf antisense oligodeoxynucleotide-poly(ethylene glycol) conjugate and

poly(ethylenimine): effect of systemic administration on tumor growth // Bioconjug. Chem.-2005.-V. 16.-P. 1034-1037.

33. Jeong J.II., Kim S.W., Park T.G. Novel intracellular delivery system of antisense oligonucleotide by self-assembled hybrid micelles composed of DNA/PEG conjugate and cationic fiisogenic peptide // Bioconjug. Chem. - 2003. - V.14. - P. 473-479.

34. Lee H., Lytton-Jean A.K., Chen Y., Love K.T., Park A.I., Karagiannis E.D., Sehgal A., Querbes W., Zurenko C.S., Jayaraman M., Peng C.G., Charisse K., Borodovsky A., Manoharan M., Donahoe J.S., Truelove J., Nahrendorf M., Langer R., Anderson D.G. Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery // Nat. Nanotechnol. - 2012. - V. 7. - P. 389-393.

35. Shiokawa T., Hattori Y., Kawano K., Ohguchi Y., Kawakami H., Toma K., Maitani Y. Effect of polyethylene glycol linker chain length of folate-linked microemulsions loading aclacinomycin A on targeting ability and antitumor effect in vitro and in vivo II Clin. Cancer Res. - 2005. - V. 11. - P. 2018-2025.

36. Yoshizawa T., Hattori Y., Hakoshima M., Koga K., Maitani Y. Folate-linked lipid-based nanoparticles for synthetic siRNA delivery in KB tumor xenografts // Eur. J. Pharm. Biopharm. -2008. - V. 70.-P. 718-725.

37. Rowinsky E.K., Donehower S.R.C. Paclitaxel (taxol) // Engl. J. Med. - 1995. - V. 332. -P. 1004-1014.

38. Montaldo P.G., Pagnan G., Pastorino F., Chiesa V., Raffaghello L., Kirchmeier M., Allen T.M., Ponzoni M. N-(4-hydroxyphenyl) retinamide is cytotoxic to melanoma cells in vitro through induction of programmed cell death // Int. J. Cancer - 1999. - V. 81. - P. 262-267.

39. Houghton P.J., Cheshire P.J., Hallman J.C., Bissery M.C., Mathieu-Boue A., Houghton J.A. Therapeutic efficacy of the topoisomerase I inhibitor 7-ethyl-10-(4-[l-piperidino]-l-piperidino)-carbonyloxy-camptothecin against human tumor xenografts: lack of cross-resistance in vivo in tumors with acquired resistance to the topoisomerase I inhibitor 9-dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothec // Cancer. Res. - 1993. - V. 53. - P. 28232829.

40. Gerrits C.J., De Jonge M.J., Schellens J.H., Stoter G., Verweij J. Topoisomcrase I inhibitors: the relevance of prolonged exposure for present clinical development // Br. J. Cancer. - 1997. - V. 76. - P. 952-962.

41. Rowinsky E.K., Grochow L.B., Ettinger D.S., Sartorius S.E., Lubejko B.G., Chen T.L., Rock M.K., Donehower R.C. Phase I and pharmacological study of the novel topoisomerase I inhibitor 7-ethyl-10-(4-[l-piperidino]-l-piperidino)-carbonyloxy-camptothecin (CPT-11) administered as a ninety-minute infusion every 3 weeks // Cancer. Res.- 1994. - V. 54. - P. 427-436.

42. Gao J.M., Ming J., He B., Gu Z.W., Zhang X.D. Controlled release of 9-nitro-20(S)-camptothecin frommethoxy poly(ethylene glycol)-poly(d,l-lactide) micelles // Biomed. Mater.- 2008. - V. 3. - P. 13-20.

43. Sody M.S., Strieth S., Krasnici S., Sauer B„ Schulze B., Teifel M., Michaelis U., Naujoks K., Dellian M. Neovascular targeting therapy: paclitaxel encapsulated in cationic liposomes improves antitumoral efficacy // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 9. - P. 23352341.

44. Paola C., Maueizio C., Paola B., Silvia A., Franco D. Preparation, characterization and properties of sterically stabilized palclitaxelcontaining liposomes // J. Control. Release. -2000.-V. 63.-P. 19-30.

45. Perez A.T., Domenech G.H., Frankel C., Vogel C.L. Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil®) for metastatic breast cancer: the cancer research network Inc., experience // Cancer. Invest. - 2002. - V. 2 - P. 22-29.

46. Maeda H. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting // Adv. Enzyme. Regul - 2001. - V.41.-P. 189-207.

47. Zhu C., Jung S., Luo S., Meng F., Zhu X., Park T.G., Zhong Z. Co-delivery of siRNA and paclitaxel into cancer cells by biodegradable cationic micelles based on PDMAEMA-PCL-PDMAEMA triblock copolymers // Biomaterials.- 2010. - V. 31. - P. 2408-2416.

48. Wu J., Liu Q., Lee R.J. A folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel // Int. J. Pharm. - 2006. - V. 316. - P. 148-153.

49. Stephenson S.M., Low P.S., Lee R.J. Folate receptor-mediated targeting of liposomal drugs to cancer cells // Methods. Enzymol. - 2004. - V. 387. - P. 33-50.

50. Pan X.G., Zheng X., Shi G.F., Wang H.Q., Ratnam M., Lee R.J. Strategy for the treatment of acute myelogenous leukemia based on folate receptor-targeted liposomal doxorubicin combined with receptor induction using all-trans retinoic acid // Blood. - 2002. - V. 100. -P. 594-602.

51. Zhang Z., Yao J. Preparation of irinotecan-loaded folate-targeted liposome for tumor targeting delivery and its antitumor activity //AAPS PharmSciTech. - 2012. - V. 13. - P. 802-810.

52. You J., Li X., Cui F.D., Du Y.Z., Hong Y., Hu F.Q. Folate-conjugated polymer micelles for active targeting to cancer cells: preparation, in vitro evaluation of targeting ability and cytotoxicity // Nanotechnology. - 2008. - V. 19. - P. 102-111.

53. Gourrierec L.L., Giorgio C.D., Greiner J., Vierling P. An efficient mixed solid-liquid phase synthesis of a heterobifunctional amphiphilic PEG-NH2 derivative and its conjugation to folic acid // Tetrahedron. - 2008. - V. 64. - P. 2233-2240.

54. Han X., Liu J., Liu M., Xie C., Zhan C., Gu B., Liu Y., Feng L., Lu W. 9-NC-loaded folate-conjugated polymer micelles as tumor targeted drug delivery system: preparation and evaluation in vitro II Int. J. Pharm. - 2009. - V. 372. - P. 125-131.

55. Geissmann F., Manz M.G. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells // Science.-2010.-V. 327.-P. 656-661.

56. Swirski F.K., Libby P., Aikawa E., Alcaide P., Luscinskas F.W., Weissleder R., Pittet M.J. Ly-6Chi monocytes dominate hypercholesterolemiaassociated monocytosis and give rise to macrophages in atheromata // J. Clin. Invest. - 2007. - V. 117. - P. 195-205.

57. Odegaard J.I., Ricardo-Gonzalez R.R., Goforth M.H., Morel C.R., Subramanian V., Mukundan L., Red Eagle A., Vats D., Brombacher F., Ferrante A.W., Chawla A. Macrophage-specific PPAR gamma controls alternative activation and improves insulin resistance // Nature. - 2007. - V. 447. - P. 1116-1120.

58. Gueler F., Park J.K., Rong S., Kirsch T., Lindschau C., Zheng W., Elger M., Fiebeler A., Fliser D., Luft F.C., Haller H. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing

heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages // Am. J. Pathol. - 2007. - V. 170. - P. 1192-1199.

59. M.J. Hansen, P.S. Low Folate Receptor Positive Macrophages: Cellular Targets for Imaging and Therapy of Inflammatory and Autoimmune Diseases in Targeted Drug Strategies for Cancer and Inflammation (Ed. Jackman A.L., Leamon C.P.) // Springer US -2011. P 181-193.

60. Yi Y.S., Ayala-Löpez W., Kularatne S.A., Low P.S. Folate-targeted hapten immunotherapy of adjuvantinduced arthritis: comparison of hapten potencies // Mol. Pharm. - 2009. - V. 6. - P. 1228-1236.

61. Varghese B., Haase N., Low P.S. Depletion of folate-receptor-positive macrophages leads to alleviation of symptoms and prolonged survival in two murine models of systemic lupus erythematosus // Mol. Pharm. - 2007. - V. 4. - P. 679-685.

62. Nagayoshi R., Nagai T., Matsushita K., Sato K., Sunahara N., Matsuda T., Nakamura T., Komiya S., Onda M., Matsuyama T. Effectiveness of anti-folate receptor beta antibody conjugated with truncated Pseudomonas exotoxin in the targeting of rheumatoid arthritis

I

synovial macrophages // Arthritis. Rheum. - 2005. - V. 52. - P. 2666-2675.

63. Nagai T., Tanaka M., Tsuneyoshi Y., Xu B., Michie S.A., Hasui K., Hirano H., Arita K., Matsuyama T. Targeting tumor-associated macrophages in an experimental glioma model with a recombinant immunotoxin to folate receptor beta // Cancer. Immunol. Immunother. -2009.-V. 58.-P. 1577-1586.

64. Hattori Y., Kawakami S., Suzuki S., Yamashita F., Hashida M. Enhancement of immune responses by DNA vaccination through targeted gene delivery using mannosylated cationic liposome formulations following intravenous administration in mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - V. 317. - P. 992-999.

65. Gogolâk P., Réthi B., Hajas G., Rajnavölgyi E. Targeting dendritic cells for priming cellular immune responses // J. Mol. Recognit. - 2003. - V. 16. - P. 299-317.

66. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // A. Rev. Immunol - 2002. -V. 20. - P. 621-667.

67. Reis e Sousa C. Dendritic cells as sensors of infection // Immunity. - 2001. - V. 14. - P. 495-498.

68. Ribas A., Butterfield L.H., Glaspy J.A., Economou J.S. Current developments in cancer vaccines and cellular immunotherapy // J. Clin. Oncol. - 2003. - V. 21. - P. 2415-2432.

69. Oliveira S.C., Rosinha G.M.S., de-Brito C.F.A., Fonseca C.T., Afonso R.R., Costa M.C.M.S., Goes A.M., Rech E.L., Azevedo V. Immunological properties of gene vaccines delivered by different routes // Braz. J. Med. Biol. Res. - 1999. - V. 32. - P. 207-214.

70. Liu M.A. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future // Immunol. Rev. -2011.-V. 239.-P. 62-84.

71. Ribas A. Genetically modified dendritic cells for cancer immunotherapy // Curr. Gene Ther. - 2005. - V. 5. - P. 619-628.

72. Mayordomo J.I., Zorina T., Storkus W.J., Zitvogel L., Garcia-Prats M.D., DeLeo A.B., Lotze M.T. Bone marrow-derived dendritic cells serve as potent adjuvants for peptide-based antitumor vaccines // Stem. Cells. - 1997. - V. 15. - P. 94-103.

73. Rosenberg S.A Progress in human tumour immunology and immunotherapy // Nature. -2001.-V. 411. -P. 380-384.

74. Altin J.G. Liposomes and other nanoparticles as cancer vaccines and immunotherapeutics in Innovation in Vaccinology (Ed. Baschieri S.) // Springer Netherlands - 2012. - P. 135178.

75. Mukhopadhyay A., Basu S.K. Intracellular delivery of drugs to macrophages-// Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2003. - V. 84. - P. 183-209.

76. Carrillo-Conde B., Song E.PI., Chavez-Santoscoy A., Phanse Y., Ramer-Tait A.E., Pohl N.L., Wannemuehler M.J., Bellaire B.H., Narasimhan B. Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells//Mol. Pharm.-2011,-V. 8.-P. 1877-1886.

77. Lu Y., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Development of an antigen-presenting cell-targeted DNA vaccine against melanoma by mannosylated liposomes // Biomaterials. - 2007. - V. 28. - P. 3255-3262.

78. Mével M., Breuzard G., Yaouanc J.J., Clément J.C., Lehn P., Pichon C., Jaffrès P.A., Midoux P. Synthesis and transfection activity of new cationic phosphoramidate lipids: high efficiency of an imidazolium derivative // Chembiochem. - 2008. - V. 9. - P. 1462-1471.

79. Pichon C., Midoux P. Mannosylated and histidylated LPR technology for vaccination with tumor antigen mRNA // Methods. Mol. Biol. - 2013. - V. 969. - P. 247-274.

80. Proudfoot O., Apostolopoulos V., Pietersz G.A. Receptor-mediated delivery of antigens to dendritic cells: anticancer applications // Mol. Pharm. - 2007. - V. 4. - P. 58-72.

81. White K., Rades T., Kearns P., Toth I., Hook S. Immunogenicity of liposomes containing lipid core peptides and the adjuvant Quil A // Pharm. Res. - 2006. - V. 23. - P. 1473-1481.

82. Copland M.J., Baird M.A., Rades T., McKenzie J.L., Becker B., Reck F., Tyler P.C., Davies N.M. Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells // Vaccine. - 2003. -V. 21. - P. 883-890.

83. Cui L., Cohen J.A., Broaders K.E., Beaudette T.T., Frechet J.M. Mannosylated dextran nanoparticles: a pH-sensitive system engineered for immunomodulation through mannose targeting // Bioconjug. Chem. - 2011. - V. 22. - P. 949-957.

84. Rensen P.C., Leeuwen S.H., Sliedregt L.A., Berkel T.J., Biessen E.A. Design and synthesis of novel iV-acetylgalactosamine-terminated glycolipids for targeting of lipoproteins to the hepatic asialoglycoprotein receptor // J. Med. Chem. - 2004 - V. 47. - P. 5798-5808.

85. Choi Y.H., Liu F., Choi J.S., Kim S.W., Park J.S. Characterization of a targeted gene carrier, lactose-polyethylene glycol-grafted poly-L-lysine, and its complex with plasmid DNA // Hum. Gene Ther. - 1999,- V.10. - P. 2657-2665.

86. Aneed A.E. Targeted cationic liposomes // Pharm. Technol. - 2003. - V. 27. - P. 58-62.

87. Gupta A. Asialoglycoprotein receptor and the macrophage galactose-type lectin in Animal Lectins: Form, Function and Clinical Applications (Ed. Gupta A.) // Springer Vienna. -2012.-P. 709-724.

88. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo II J. Biol. Chem. - 1988. - V.263. - P. 14621-14624.

89. Mukthavarama R., Marepallya S., Venkataa M.Y., Vegi G.N., Sistlab R., Chaudhuria A. Cationic glycolipids with cyclic and open galactose head groups for the selective targeting of genes to mouse liver // Biomaterials. - 2009. - V.30. - P. 2369-2384.

90. Gaucheron J., Santaella C., Vierling P. In vitro gene transfer with a novel galactosylated spermine bolaamphiphile // Bioconjug. Chem. - 2001. - V.12. - P. 569-575.

91. Nishikawa M., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Glycosylated cationic liposomes for carbohydrate receptor-mediated gene transfer // Methods.Enzym. - 2003. - V. 373. - P. 388-399.

92. Sato A., Takagi M., Shimamoto A., Kawakami S, Hashida M. Small interfering RNA delivery to the liver by intravenous administration of galactosylated cationic liposomes in mice // Biomaterials. - 2007. - V. 28. - P. 1434-1442.

93. Westerlind U., Westman J., Tornquist E., Smith E., Oscarson S., Lahmann M., Norberg T. Ligands of the asialoglycoprotein receptor for targeted gene delivery, part 1: Synthesis of and binding studies with biotinylated cluster glycosides containing iV-acetylgalactosamine // Glycoconj. J. - 2004. - V. 21. - P. 227-241.

94. Pathak A., Vyas S.P., Gupta K.C. Nano-vectors for efficient liver specific gene transfer // Int. J. Nanomedicine. - 2008. V. 3 - P. 31 -49.

95. Maier M. A., Yannopoulos C. G., Mohamed N., Roland A., Pitz H. Synthesis of antisense oligonucleotides conjugated to a multivalent carbohydrate cluster for cellular targeting // Bioconjug. Chem.-2003.-V. 14.-P. 18-29.

96. Carter B.Z., Wang R.Y., Schober W.D., Milella M., Chism D., Andreeff M.-Targeting Survivin expression induces cell proliferation defect and subsequent cell death involving mitochondrial pathway in myeloid leukemic cells // Cell. Cycle. - 2003. - V. 2. - P. 488493.

97. Giammona G., Cavallaro G., Maniscalco L., Craparo E.F., Pitarresi G. Synthesis and characterisation of novel chemical conjugates based on a,P-polyaspartylhydrazide and [3-cyclodextrins // Eur. Polym. J. - 2006. - V. 42. - P. 2715-2729.

' 98. Wang S.L., Yu F.B., Jiang T.Y., Sun C.S., Wang T., Zhang J.H. Design and synthesis of novel galactosylated polymers for liposomes as gene drug carriers targeting the hepatic asialoglycoprotein receptor // J. Drug Target. - 2008. - V. 16. - P. 233-242.

99. The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial results. II. The relationship of reduction in incidence of coronary heart disease to cholesterol lowering // JAMA. -1984.-V. 251.-P. 365-374.

100. Rubins H.B., Robins S.J., Collins D., Fye C.L., Anderson J.W., Elam M.B., Faas F.H., Linares E., Schaefer E.J., Schectman G., Wilt T.J., Wittes J Gemfibrozil for the secondary

prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group // N. Engl. J. Med. - 1999. - V. 341. - P. 410-418.

101. Biessen E. A., Vietsch H., Berkel T. J. Cholesterol derivative of a new triantennary cluster galactoside directs low- and high-density lipoproteins to the parenchymal liver cell // Biochem. J.- 1994. -V. 302. - P. 283-289.

102. Sliedregt L.A., Rensen P.C., Rump E.T., Santbrink P.J., Bijsterbosch M.K., Valentijn A.R., Marel G.A., Boom J.H., Berkel T.J., Biessen E.A. Design and synthesis of novel amphiphilic dendritic galactosides for selective targeting of liposomes to the hepatic asialoglycoprotein receptor // J. Med. Chem. - 1999. - V. 42. - P. 609-618.

103. Zhou X., Zhang M., Yung B., Li H., Zhou C., Lee L.J., Lee R.J. Lactosylated liposomes for targeted delivery of doxorubicin to hepatocellular carcinoma // Int. J. Nanomedicine. -2012.-V. 7.-P. 5465-5474.

104. Tiwari S., Gupta M., Vyas S.P. Nanocarrier mediated cytosolic delivery of drug, DNA and proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B: Biological Sciences. - 2012. - V. 82. - P. 127-150.

105. Ashwell G., Harford J. Carbohydrate-specific receptors of the liver // Annu. Rev. Biochem. - 1982.-V. 51.-P. 531-554.

106. Spiess M. The asialoglycoprotein receptor: a model for endocytic transport receptors // Biochemistry. - 1990,-V. 29.-P. 10009-10018.

107. Kunda N.K., Somavarapu S., Gordon S.B., Hutcheon G.A., Saleem I.Y. Nanocarriers targeting dendritic cells for pulmonary vaccine delivery // Pharm. Res. - 2013. - V.30. - P. 325-341.

108. Mornet E., Carmoy N., Laine C., Lemiegre L., Le Gall T., Laurent I., Marianowski R., Ferec C., Lehn P., Benvegnu T., Montier T. Folate-equipped nanolipoplexes mediated efficient gene transfer into human epithelial cells // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - V. 14. - P. 1477-1501.

109. Nukolova N.V., Oberoi H.S., Cohen S.M., Kabanov A.V., Bronich T.K. Folate-decorated nanogels for targeted therapy of ovarian cancer // Biomaterials. - 2011. - V. 32. - P. 54175426.

ПО. Ivanova Е.А., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A., Chupin V.V. Synthesis of bivalent neogalactolipids via modified Staudinger reaction // RSC Advanced. -2012.-V.2-P. 4600-4602.

111. Морозова Н.Г., Маслов M.A., Петухова O.A., Андронова C.B., Гришаева А.О., Серебренникова Г.А. Синтез липидных медиаторов на основе 1,2-диалкилглицерина и холестерина для направленной доставки олиго- и полинуклеотидов в гепатоциты // Изв. АН, Сер. хим. - 2010. - № 1. - С. 245-253.

112. Иванова Е.А., Морозова Н.Г., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Синтез галактозосодержащих амфифилов // Вестн. МИТХТ. - 2010. - № 5. -С. 65-70.

113. Маслов М.А. Морозова Н.Г., Сенан И.М., Серебренникова Г.А. Синтез катионных липидных агентов трансфекции с О,О- или N, Оацетальными связями // Биоорган, хим. - 2009. - № 35. - С. 696-700.

114. Маслов М.А., Аль Шоэйби З.Я., Андрюшина Т.В., Морозова П.Г., Серебренникова Г.А. Потенциально заряженные ацилаты углеводов как потенциальные медиаторы трансфекции // Биоорган, хим. - 2007. - № 33. - С. 538-543.

115. Leamon С.Р., Cooper S.R., Hardee G.E. Folate-liposome-mediated antisenseoligodeoxynucleotide targeting to cancer cells: evaluation in vitro and in vivo. II Bioconjugate. Chem. -2003. -V. 14. - P. 738-747.

116. Gardner R.A., Delcros J.-G., Konate F., Breitbeil F., Martin В., Sigman M., Huang M., Phanstiel О. Nl-Substituent Effects in the Selective Delivery of Polyamine Conjugates into Cells Containing Active Polyamine Transporters // J. Med. Chem. - 2004. - V. 47. - P. 6055-6069.

117. Bettio A., Honer M., Müller С., Brühlmeier M., Müller U., Schibli R., Groehn V., Schubiger A.P., Ametamey S.M. Synthesis and preclinical evaluation of a folic acid derivative labeled with 18F for PET imaging of folate receptor-positive tumors // J. Nucl. Med. - 2006. - V. 47. - P. 1153-1160.

118. Толкач A.M., Полоник С.Г., Уварова Н.И. Способ получения н-алкил-ß-D-гликозидов //A.c. 1428755 СССР; Бюл. Изобрет. - 1988 - С. 37.

119. Helferich glycosilation in Comprehensive organic name reaction and reagents (Ed. by Z. Wang) // Wiley-Interscience, 2010. - P. 1367-1370.

120. Bergh A., Magnusson B.G., Ohlsson J., Wellmar U., Nilsson U.J. Didecyl squarate-A practical amino-reactive cross-linking reagent for neoglycoconjugate synthesis // Glycoconj. J. - 2001. - V. 18. - P. 615-621.

121. Sejwal P., Han Y., Shah A., Luk Y.Y. Water-driven chemoselective reaction of squarate derivatives with amino acids and peptides // Org. Lett. - 2007. - V. 9 - P. 4897-4900.

122. Lemanski G., Ziegler T. Synthesis of 4-O-D-mannopyranosyl-a-D-glucopyranosides by intramolecular glycosylation of 6-0-tethered mannosyl donors // Tetrahedron. - 2000. - V. 56.-P. 563-579.

123. Podlasek C.A., Wu J., Stripe W.A., Bondo P.B., Serianni A.S. [13C]Enriched methyl aldopyranosides: structural interpretations of 13C-1H spin-coupling constants and 1H chemical shifts // J. Am. Chem. Soc. - 1995. - V. 117. - P. 8635-8644.

124. I lui S.W., Langner M., Zhao Y.L., Hurley E., Chan K. The role of helper lipids in cationic liposome-mediated gene transfer. // Biophys. J. - 1996. - V. 71. - P. 590-599.

125. Mok K.W.C., Cullis P.R. Structural and fusogenic properties of cationic liposomes in the presence of plasmid DNA. // Biophys. J. - 1997. - V. 73. - P. 2534-2545.

126. Kerner M., Meyuhas O., Ilirsch-Lerner D., Rosen L.J., Min Z., Barenholz Y. Interplay in lipoplexes between type of pDNA promoter and lipid composition determines transfection efficiency of human growth hormone in NIH3T3 cells in culture. // Biochim. Biophys. Acta.-2001.-V. 1532.-P. 128-136.

127. Petukhov I.A., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. Convenient synthesis of polycationic amphiphiles by the Fukuyama reaction // Mendeleev. Commun. - 2009. -V. 19-P. 250-252.

128. Maslov M.A., Kabilova T.O., Petukhov I.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J. Control. Release. - 2012. -V. 160.-P. 182-193.

129. Markov O.V., Mironova N.L., Maslov M.A., Petukhov I.A., Morozova N.G., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Novel cationic liposomes provide highly efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets // J. Control. Release. -2012.-V. 160.-P. 200-210.

\

130. Zuidam N.J., Barenliolz Y. Electrostatic and structural properties of complexes involving plasmid DNA and cationic lipids commonly used for gene delivery. // Biochim. Biophys. Acta. - 1998.-V. 1368.-P. 115-128.

131. Zuidam N.J., Hirsch-Lerner D., Margulies S., Barenholz Y. Lamellarity of cationic liposomes and mode of preparation of lipoplexes affect transfection efficiency. // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - V. 1419. - P. 207-220.

132. Mochizuki S., Kanegae N., Nishina K., Kamikawa Y., Koiwai K., Masunaga PL, Sakurai K. The role of the helper lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) for DNA transfection cooperating with a cationic lipid bearing ethylenediamine // Biochim. Biophys. Acta.-2013.-V. 1828.-P. 412-418.

133. Carmichael J., De Graff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B. Evaluation of tetrazolium based semi-automated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. // Cancer. Res. - 1987. - V. 47. - P. 936-942.

134. Karmali P.P., Majeti B.K., Sreedhar В., Chaudhuri A. In Vitro gene transfer efficacies and serum compatibility profiles of novel mono-, di-, and tri-histidinylated cationic transfection lipids: a structure-activity investigation. // Bioconjugate. Chem. - 2006. - V. 17. - P. 159171.

135. Lee H., Jeong J.H., Park T.G. A new gene delivery formulation of polyethylenimine/DNA complexes coated with PEG conjugated fusogenic peptide // J. Control. Release. - 2001. -V. 76.-P. 183-192.

136. Lee M., Kim S.W. Polyethylene glycol-conjugated copolymers for plasmid DNA delivery //Pharm. Res.-2005,-V. 22.-P. 1-10.

137. Аникин M.B., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Синтез 1,2-ди-О-алкилглицеринов с использованием аллилыюй защитной группы. - Черкассы. -1987. - Деп. ОНИИТЭИХим. - №915-хп87.

138. Dahmen J., Frejd Т., Magnusson G., Noori G. Preparation and applications of 2-bromoethyl glycosides: synthesis of spacer-arm glycosides and agglutination inhibitors. // Carbohyd. Res. - 1982. - V. 111. - P. C1-C4.

139. Донсон P., Эллиот Д., ЭллиотУ., Джонс К. Справочник биохимика // Москва. - 1991. - Мир.

140. Kritchevsky D., Kirk M.R. Detection of steroids in paper chromatography // Arch. Biochem. Biophys. - 1952. - V. 35. - P. 346-351. f/