Синтез и исследование свойств конъюгатов олиго- и полинуклеотидов с низкомолекулярными лигандами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Прохоренко, Игорь Адамович

• Прохоренко, Игорь Адамович
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Прохоренко, Игорь Адамович

Оглавление

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Синтез, свойства и применение конъюгатов олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями (обзор литературы)

1.1 Присоединение активированных производных флуоресцентных красителей к олигонуклеотидам с функциональными группами

1.1.1 Методы присоединения красителей по алифатической аминогруппе и реагенты для её введения в олигонуклеотиды

1.1.2 Методы введения в олигонуклеотиды тиольной группы

1.1.3 Модифицирующие реагенты для получения конъюгатов олигонуклеотидов с красителями с помощью реакций циклоприсоединения

1.2 Методы прямого введения производных красителей в олигонуклеотиды с помощью модифицирующих твердофазных носителей и амидофосфитных реагентов.

1.2.1 Флуоресцеин и другие ксантеновые красители

1.2.2 Пирен и другие полициклические ароматические углеводороды

1.2.3 Цианиновые красители

1.3 Взаимодействие флуорофоров, присоединенных к ДНК, с сенсибилизаторами, тушителями, другими флуорофорами.

1.3.1 Резонансный перенос энергии флуоресценции в исследовании нуклеиновых КИСЛОТ

1.3.1.1 Неразветвленные комплексы НК

1.3.1.2 Разветвленные комплексы НК

1.3.1.3 Взаимодействие НК с белками и рибозимами

1.4 Применение резонансного переноса энергии флуоресценции для в ДНК-диагностике.

1.5 Взаимодействие двух одинаковых флуорофоров: эксимерная флуоресценция.

ГЛАВА 2. Синтез модифицирующих реагентов. Синтез и изучение свойств флуоресцентно меченных олигонуклеотидных конъюгатов (результаты и обсуждение)

2.1 Синтез модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.

2.1.1 Синтез пиренсодержащего фосфамидитного реагента на основе гидроксипролинола.

2.1.2 Синтез и свойства модифицированных олигонуклеотидов, содержащих пиреновый псевдонуклеозид на основе гидроксипролинола.

2.1.3 Разработка универсального подхода к синтезу модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.

2.1.4 Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих ацетиленовые группы и флуоресцентные цианиновые красители, и их использование в создании микрочипа для детекции точечных мутаций.

2.2 Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с сольватохромным флуоресцентным красителем Нильским красным.

2.3 Синтез и свойства конъюгатов олигонуклеотидов с пиреновым бифлуорофором.

2.4 Синтез и флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

2.4.1 Флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

2.4.2 Разработка метода детекции точечных мутаций с помощью олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть

Материалы

Методы

Выводы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и исследование свойств конъюгатов олиго- и полинуклеотидов с низкомолекулярными лигандами»

Одним из важнейших факторов, обеспечивающих последние значительные достижения молекулярной биологии и медицинской диагностики, явился прогресс в области синтеза модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов. В связи с этим современные методы синтеза модифицированных олигонуклеотидов постоянно совершенствуются [1-3]. Пожалуй, наиболее широкое применение модифицированные олигонуклеотиды находят в ДНК-анализе, основанном на специфической гибридизации. Традиционный гибридизационный анализ с применением современных микрометодов развился в технологии микрочипов и микроэррэев и прочих микроматриц [4-5]. В настоящее время также бурно развиваются микро- и нанотехнологии с использованием олигонуклеотидов. При этом получило своё развитие и такое современное направление, как химия микро- и наночастиц, в том числе и их конъюгатов с биомолекулами, такими как олигонуклеотиды [6].

Помимо этого олигонуклеотиды продолжают находить применение в молекулярно-биологических исследованиях для изучения процессов жизнедеятельности клетки, молекулярных механизмов функционирования нуклеиновых кислот, субстратной специфичности ферментов, а также в качестве ген-направленных реагентов как антисмысловых ингибиторов экспрессии генов и РНК-интерферирующих агентов [7-8]. Много работ было посвящено изучению структуры и свойств продуктов взаимодействия с таким известным канцерогеном, как бенз[а]пирен и другими токсичными производными полициклических ароматических углеводородов [9-11]. Пиреновые производные олигонуклеотидов используются для моделирования индуцирования канцерогенеза полициклическими ароматическими углеводородами [12-16]. Для применения модифицированных олигонуклеотидов как ген-направленных реагентов были синтезированы аналоги с модифицированными нуклеиновыми основаниями, образующими более прочные водородные связи, конформационно фиксированные нуклеиновые кислоты (ЬЫА), пептидные нуклеиновые кислоты (РКА) и их фосфо-аналоги, конъюгаты с молекулами, стабилизирующими образование дуплекса (с интеркаляторами, малобороздочными лигандами). В настоящее время интенсивно изучаются возможности применения специальных олигорибонуклеотидов и их дуплексов, которые, благодаря недавно открытому механизму РНК интерференции, связываясь с комплементарной цепью РНК, способны специфически расщеплять её и блокировать работу гена. Ведётся работа по изучению эффективности олигонуклеотидных конъюгатов с различного рода алкилирующими агентами, органическими основаниями, комплексообразователями, комплексами активных переходных металлов, катализирующими окислительное или другого типа расщепление комплементарной мишени нуклеиновой кислоты антибиотиками, обладающими такого типа активностью. Мишенями для таких реагентов могут быть и взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами белки. Модифицированные олигонуклеотиды помогают также и в исследованиях функции таких белков, изучении механизма их работы. Широкое применение в этих исследованиях получили конъюгаты олигонуклеотидов с так называемыми фотоафинными реагентами, которые способны ковалентно связываться с мишенью после активации световым излучением [17].

Среди широкого спектра научного и практического применения модифицированных олигонуклеотидов в авангарде находятся современные методы анализа ДНК. Для этого применяют конъюгаты олигонуклеотидов с репортерными группами, дающими аналитический сигнал, который позволяет регистрировать комплементарные взаимодействия между олигонуклеотидными зондами и исследуемыми образцами ДНК. Методы повышения чувствительности репортерных групп с использованием достижений современной биохимии довольно быстро шагнули на весьма высокий уровень благодаря разработке ферментных методов детекции. По аналогии с современным иммуноферментным анализом вначале ферментные метки присоединяли к олигонуклеотидным зондам ковалентно. Затем во избежание трудоёмких стадий получения и очистки таких конъюгатов в обиход вошли афинные метки, позволяющие присоединять молекулу фермента после гибридизации в виде белок-белкового конъюгата за счёт биоспецифических взаимодействий. Одной из самых распространённых афинных меток является биотин, дающий очень прочный комплекс с белком стрептавидином. В настоящее время в массовом масштабе получают конъюгаты стрептавидина с ферментами для использвания в диагностике. Применение биотиновых амидофосфитов позволяет получать 5'-меченые биотинилированные зонды [18-21]. В принципе, в олигонуклеотиды в качестве аффинной метки могут быть введены самые разнообразные гаптены с последующей детекцией при помощи специфических антител, например, реагенты предназначены для множественного мечения олигонуклеотидов остатками 3-(4-нитрофенил)-1-адамантилацетамидаи карбазола [23].

Однако в связи с дальнейшим развитием оптической техники, особенно флуориметрических приборов, конъюгаты с флуоресцентными метками в значительной степени вытеснили радиоактивные метки из большинства областей ДНК-анализа, а особенно из рутинных процедур диагностики. Технические возможности современных приборов и физические свойства самих флуорорфоров дают огромные преимущества при использовании флуоресцентных меток как в медицинской диагностике, так и в фундаментальных исследованиях.

В настоящее время существуют целые классы флуоресцентных красителей, производные которых получили широкое применение в ставших уже рутинными процедурах анализа ДНК, особенно автоматизированных современными специализированными аналитическими приборами. В первую очередь это ксантеновые красители, к которым относится и один из самых известных флуорофоров - флуоресцеин. Это один из самых обширных по применению классов соединений, куда входят также и родамины, а также галогено-, сульфо- и другие производные флуоресцеинов и родаминов [24-27]. Другой большой класс флуорофоров - это цианиновые красители. В первую очередь следует упомянуть индокарбоцианиновые соединения СуЗ, Су5, Су7, а также другие производные этого ряда и их аналоги, поскольку они в силу удобства синтеза и характерных люминесцентных свойств получили наиболее широкое применение в биохимических исследованиях [28-30]. Существует ещё ряд красителей, некоторые производные которых получили применение в синтезе конъюгатов с олигонуклеотидами. Это производные дипирролилметена ВСЮГРУ [31], биман [32], бензоксадиазол (№Ш-С1) [33]. Благодаря своим интересным свойствам они по прежнему находят различные интересные применения в этой области.

Весьма высокую популярность для мечения олигонуклеотидов приобрели производные полициклических ароматических углеводородов [34-37]. Высокий интерес к ним обусловлен как доступностью исходных флуорофоров и хорошо разработанными методами функционализации, так и весьма интересными физико-химическими свойствами. Это и люминесцентные свойства, особенно способность к эксимерной флуоресценции, и специфическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, а также другими биомолекулами и их комплексами. Конъюгаты олигонуклеотидов с ПАУ продолжают находить всё новые и новые применения в биомедицинских исследованиях и некоторые из них в ближайшее время наверняка войдут в набор рутинных методов ДНК-диагностики.

Комплексы переходных металлов с хелаторами и другими прочно связывающимися лигандами благодаря своим оригинальным люминесцентным свойствам продолжают использоваться для получения конъюгатов с биологически активными молекулами. Большое время жизни и высокий квантовый выход флуоресценции делают комплексы переходных металлов особенно подходящими для изучения энергетических и электронных переносов в ДНК- дуплексах. Из них в первую очередь выделяются комплексы рутения и редкоземельных элементов, с которыми были получены олигонуклеотидные конъюгаты.

Конъюгаты олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями находят очень широкое применение в современных биологических исследованиях и медицинской диагностике. В неё входит круг вопросов, связанных с обнаружением и идентификацией микроорганизмов, в том числе и вирулентных бактерий и вирусов, исследованиями онкологических заболеваний, генетических нарушений, включая те, которые вызваны точечными мутациями. Например, благодаря возможностям современной флуоресцентной микроскопии осуществляют селективное окрашивание и визуальное наблюдение определённых участков хромосом или даже отдельных генов с использованием метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) [38-39]. В современных методах секвенирования ДНК флуоресцентные метки уже давно и прочно заняли ведущие позиции [26, 40-42]. Это флуоресцентные методы секвенирования с использованием автоматических приборов, современные методы анализа на основе ПЦР, такие как ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Так гибридизационный анализ на ДНК-микрочипах, микроэррэях. Флуоресцентные метки в составе конъюгатов обычно используются для детекции олиго- и полинуклеотидной части конъюгатов, реже они служат источником информации о структурных изменениях в процессе различных взаимодействий.

Наряду с твердофазными методами анализа на основе технологии микрочипов флуоресцентные олигонуклеотидные конъюгаты позволили осуществить с помощью ПЦР-амплификации генетический анализ в растворе с добавлением специальных флуоресцентных зондов. Существуют различные варианты таких зондов [43-45]. Для того, чтобы зонды меняли флуоресценцию при связывании с мишенью, используется два способа физического воздействия на флуорофор в возбуждённом состоянии: резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и тушение. В первом случае в молекулу с флурофором вводится акцептор, и такой зонд меняет спектр испускания при взаимодействии с мишенью. Если вместо акцептора присоединить тушитель, то в исходном состоянии флуоресценция зонда потушена, а при связывании с мишенью происходит разгорание, которое детектируется прямо в пробирке в процессе реакции амплификации ДНК-мишени на специальном приборе. Существуют разные красители, которые применяются в качестве тушителей флуоресценции, и не обязательно их спектр поглощения должен перекрываться со спектром испускания флуорофора.

В обзоре литературы собраны наиболее интересные примеры изменения эмиссионных спектров одиночных флуоресцентных красителей (особое внимание уделено пирену) в результате их взаимодействия с НК, а также данные о применении пар красителей, присоединенных к НК.

Целью данной работы явился синтез ряда модифицирующих реагентов, получение на их основе олигонуклеотидных конъюгатов и исследование спектральных свойств полученных флуоресцентных производных олигонуклеотидов.

Настоящая работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Прохоренко, Игорь Адамович

выводы

1. Разработан ряд ненуклеотидных модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола (Э.Я,5£-3-гидрокси-5-гидроксиметилпирролидина) (амидофосфиты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения в состав олигонуклеотидов функциональных групп (алифатические амино- и тиольная группы, терминальный алкин), аффинной метки (биотин) и флуоресцентных меток (FAM, TAMRA, СуЗ, Су5).

2. Синтезированы конъюгаты олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями Нильским красным, пиреновым бихромофором и 1-фенилэтинилпиреном. Для полученных коньюгатов изучены флуоресцентные и гибридизационные свойства.

3. Разработана система для обнаружения однонуклеотидных замен A2144G, A2143G и А2143С в гене 23S rRNA Helicobacter pylori с помощью эксимеробразующих флуоресцентных зондов на основе олигонуклеотидных коньюгатов с фенилэтинилпиреном. Установлено оптимальное расположение флуорофоров в структуре зондов для наиболее эффективного обнаружения мутаций. Продемонстрирована возможность использования полученных зондов для анализа образцов ДНК, выделенных из бактериальных штаммов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор посвящает свою работу памяти Юрия Адольфовича Берлина, руководство которого помогло освоить различные аспекты научных исследований в области химии природных соединений, почувствовать уверенность в своих силах и стимулы для дальнейшего совершенствования професиональных навыков. Автор выражает благодарность своему научному руководителю Владимиру Аркадьевичу Коршуну за руководство и помощь в освоении методов органохимической работы, навыков работы с литературой и проведения лабораторных исследований. Автор благодарит своих коллег по лаборатории А. Д. Малахова, Н. Н. Дюбанкову, М. В. Скоробогатого и К. Р. Бирих за постоянную помощь и поддержку, И. А. Степанову за помощь в расшифровке ЯМР-спектров. Автор благодарен заведующему лабораторией В. А. Ефимову за полезные научные обсуждения и поддержку, Т. С. Зацепину за помощь и плодотворное сотрудничество, 3. О. Шенкареву за регистрацию и помощь в расшифровке ЯМР-спектров. Автор также благодарит членов своей семьи и родственников за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Прохоренко, Игорь Адамович, 2009 год

1. Beaucage S.L., 1.er R.P. The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives. Tetrahedron, 1993, 49 (10), 1925-1963.

2. Коршун В.А., Берлин Ю.А. Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция. Биоорган, химия, 1994, 20 (6), 565616.

3. Cobb A. J.A. Recent highlights in modified oligonucleotide chemistry. Org. Biomol. Chem., 2007, 5 , 3260-3275.

4. Heller M.J. DNA Microarray Technology: Devices, Systems, and Applications. Annu. Rev. Biomed. Eng., 2002, 4, 129-153.

5. Roth CM. Yarmush M.L. Nucleic Acid Biotechnology. Annu. Rev. Biomed. Eng., 1999, 1, 265-297.

6. Lebedeva I., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: promise and reality. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, 41, 403^119.

7. Crooke S.T., Bennett C.F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996, 36, 107-129.

8. Weinstein I.В., Jeffrey A.M., Jennette K.W., Blobstein S.H., Harvey R.G., Harris C., Autruf H., Kasai H., Nakanishi K. Benzoa.pyrene diol epoxides as intermediates in nucleic acid binding in vitro and in vivo. Science, 1976,193 (4253), 592-595.

9. Steinbrecher Т., Becker A., Stezowski J.J., Oesch F., Seidel A. Synthesis of oligodeoxynucleotides containing diastereomeric dihydrodiol cpoxide-A^-deoxyadenosine adducts of polycyclic aromatic hydrocarbons. Tetrahedron Lett., 1993, 34 (11), 1773-1774.

10. Lee H, Luna E., Hinz M., Stezowski J.J., Kiselyov A.S., Harvey R.G. Synthesis of oligonucleotide adducts of the bay region diol epoxide metabolites of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Org. Chem. 1995, 60 (17), 5604-5613.

11. Chaturvedi S., Lakshman M.K Site-specific modification of the human N-ras photo-oncogene with each diol epoxide metabolite of benzoa.pyrene and thermal denaturation studies of the adducted duplexes. Carcinogenesis, 1996, 17 (12), 2747-2752.

12. Zou Y., Liu T.-M., Geacintov N.E., Van Houten B. Interaction of the UvrABC nuclease system with a DNA duplex containing a single stereoisomer of dG-(+)- or dG-(—)-anti-BPDE. Biochemistry, 1995, 34 (41), 13582-13593.

13. Liebmann M., Di Pasquale F., Marx A. A new photoactive building block for investigation of DNA backbone interactions: photoaffinity labeling of human DNA polymerase beta. ChemBioChem., 2006, 7 (12), 1965-1969.

14. Kumar P., Sharma A.K., Gupta K.C. Base-labile group protected biotinphosphoramidite reagents for solid phase biotinylation of oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1996, 15 (7/8), 1263-1273.

15. Korshun V.A., Pestov N.B., Nozhevnikova E.V., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Berlin Y.A. Reagents for multiple non-radioactive labelling of oligonucleotides. Synth. Commun., 1996, 26(13), 2531-2547.

16. Olejnik J., Krzymanska-Olejnik E., Rothschild K.J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 1996, 24 (2), 361-366.

17. Zhao Z., Ackroyd J. A biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5'-biotinylated oligonucleotides . Nucleosides Nucleotides, 1999,18 (6/7), 1231-1234.

18. Fang S., Bergstrom D.E. Fluoride-cleavable biotinylation phosphoramidite for 5'-end-labeling and affinity purification of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 2003, 31 (2), 708-718.

19. Fino J.R., Mattingly P.G., Ray K.A. A convenient method for the preparation of hapten phosphoramidites. Bioconjugate Chem., 1996, 7 (2), 274—280.

20. Wojczewski, C., Stolze, K., and Engels, J. W. Fluorescent oligonucleotides-versatile tools as probes and primers for DNA andRNA analysis. Synlett 1999, 1667-1678.

21. Asseline U. Development and applications of fluorescent oligonucleotides. Curr. Org. Chem., 2006, 10(4), 491-518.

22. Topics in Fluorescence Spectroscopy, V. 7: DNA Technology (Lakowicz, J. R., Ed.) 2003, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.

23. Ranasinghe, R. T., and Brown, T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. Chem. Commun. 2005, 5487-5502.

24. Griesang N., Giefiler K., Lommel T., Richert C. Angew. Four-color, enzyme-free interrogation of DNA sequences with chemically activated, 3'-fluorophore-labeled nucleotides. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 6144-6148.

25. Johansson M. K, Fidder II, Dick II, Cook R. M. Intramolecular dimers: a new strategy to fluorescence quenching in dual-labeled oligonucleotide probes. J. Am. Chem. Soc. 2002,124, 6950-6956.

26. Jaluria P., Konstantopoulos K., Betenbaugh M., Shiloach J. A perspective on microarrays: current applications, pitfalls, and potential uses. Microb. Cell Factories 2007, 6, 1-14.

27. Wanninger-Weiss C., Di Pasquale F., Ehrenschwender T., Marx A., Wagenknecht H.-A. Nucleotide insertion and bypass synthesis of pyrene- and BODIPY-modified oligonucleotides by DNA polymerases. Chem. Commun., 2008, (12), 1443-1445.

28. Armstrong B., Garner H.R. Analysis of protocol variations on DNA yield. Genet. Anal.: Biomol. Eng. 1996, 9 (5/6), 127-133.

29. Meyer J., Buldt A., Vogel M., Karst U. 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,l,3-benzooxadiazole (MNBDH): a novel fluorogenic peroxidase substrate. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39 (8), 1453-1455.

30. Burmeister J., Azzawi A., von Kiedrowski G. Synthesis of novel phosphoramidite derivatives bearing pyrenyl and dansyl groups. Tetrahedron Lett., 1995, 36 (21), 3667-3668.

31. Yamana K, Tekei M., Nakano H. Synthesis of oligonucleotide derivatives containing pyrene labeled glycerol linkers: enhanced excimer fluorescence on binding to complementary DNA sequence. Tetrahedron Lett., 1997, 38 (34), 6051-6054.

32. Ren R. X.-F., Chaudhuri N.C., Paris P.L., Rumney IVS., Kool E. Naphthalene, phenanthrene, and pyrene as DNA base analogues: synthesis, structure, and fluorescence in DNA. J. Am. Chem. Soc., 1996,118 (33), 7671-7678.

33. Yamana K., Kumamoto S., Nakano H. Homopyrimidine oligonucleotides modified by a pyrenylmethyl group at the terminal position: enhanced fluorescence upon binding to double helical DNA. Chem. Lett., 1997 (11), 1173-1174.

34. SchrokE., du Manoir S., Veldman T., Schoell B., Wienberg J., Ferguson-Smith M. A., Ning Y., Ledbetter D. H., Bar-Am I, Soenksen D., Garini Y., Ried T. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 1996, 273, 494-497.

35. Ju J., Glazer A.N., Mathies R.A. Cassette labeling for facile construction of energy transfer fluorescent primers. Nucl. Acids Res., 1996, 24 (6), 1144-1148.

36. Hung S.-C., Ju J., Mathies R.A., Glazer A.N. Energy transfer primers with 5- or 6-carboxyrhodamine-6G as acceptor chromophores. Anal. Biochem., 1996, 238 (2), 165-170.

37. Ju J., Glazer A.N., Mathies R.A. Energy transfer primers a new fluorescence labeling paradigm for DNA sequencing and analysis. Nature Med., 1996, 2 (2), 246-249.

38. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnol., 1996,14 (3), 303-308.

39. Tyagi S., Landegren U., Tazi M., Lizardi P.M., Kramer F.R. Extremely sensitive, background-free gene detection using binary probes and Q(3 replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (11), 5395-5400.

40. Methods in Molecular Biology, V. 353: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes (Hilario, E., Mackay, J., Ed.) Humana Press, New Jersey, 2007 167-176, 177-203.

41. Caruthers M.H. Chemical synthesis of DNA and DNA analogues. Acc. Chem. Res., 1991, 24 (9), 278-284.

42. Davies, M. J., Shah, A., and Bruce, I. J. Synthesis of fluorescently labelled oligonucleotides and nucleic acids. Chem. Soc. Rev. 2000, 29, 97-107.

43. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edittion, Springer, Baltimore, MD, 2003, 63-95.

44. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Elsevier, 2008, 1195 p.

45. De Vos M.J., Van Elsen A., Bollen A. New non nucleosidic phosphoramidites for the solid phase multi-labeling of oligonucleotides: comb- and multifork-like structures. Nucleosides Nucleotides, 1994, 13 (10), 2245-2265.

46. Behrens C., Petersen K.H., Egholm M., Nielsen J., Buchardt O., Dahl O. A new achiral reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5 (16), 1785-1790.

47. Lyttle M.H., Adams H., Hudson D., Cook R.M. Versatile linker chemistry for synthesis of 3'-modified DNA. Bioconjugate Chem., 1997, 8 (2), 193-198.

48. Kumar A. A rapid solid phase method for the synthesis of 3'-thiol group containing oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1993,12 (7), 729-736.

49. Kumar A. A versatile solid phase method for the synthesis of masked 3'-thiol group containing oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1993, 12 (10), 1047-1059.

50. Salo II., Guzaev A., Azhayev A., Lonnberg H. Disulfide tethered solid supports for oligonucleotide synthesis: preparation and a comparative study on the resistance to ammonolysis. Collect. Czech. Chem. Commun., 1996, 61 (Spec. Iss.), sllO-slll.

51. Reed M.V., Lukhtanov E.A., Gorn V.V., Lucas D.D., Zhou J.H. Structure activity relationships of cytotoxic cholesterol - modified DNA duplexes. J .Med. Chem. 1995, 38, 4587-4596.

52. Graham D., Enright A. Cycloadditions as a nethod for oligonucleotide conjugation. Curr. Org. Synth. 2006, 3 (1), 9-17.

53. Hill K. IV, Taunton-Rigby J., Carter J. D„ Kropp E., Vagle K, Pieken W., McGee D. P., Husar G. M., Leuck M., Anziano D. J., Sebesta D. P. Diels-Alder bioconjugation of diene-modified oligonucleotides J. Org. Chem. 2001, 66, 5352-5358.

54. Latham-Timmons H. A., Wolter A., Roach J. S., Giare R., Leuck M. Novel method for the covalent immobilization of oligonucleotides via Diels-Alder bioconjugation Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2003, 22, 1495-1497.

55. Okamoto A., Taiji T., Tainaka K., Saito I. Oligonucleotides containing 7-vinyl-7-deazaguanine as a facile strategy for expanding the functional diversity of DNA Bioorg. Med. Chem Lett., 2002,12, 1895-1896.

56. Torwe C. IV., Christensen C., Meldal M. Peptidotriazoles on solid phase: l,2,3.-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides .,/. Org. Chem., 67 (9), 3057-3064 (2002).

57. Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., Sharpless KB. A Stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective ligation of azides and terminal alkynes. Angew. Chem., Int. Ed., 2002, 41 (14), 2596-2599.

58. Chan T.R., Hilgraf R., Sharpless KB., Fokin V.V. Polytrazoles as Copper(I)-Stabilizing Ligands in Catalysis. Org. Lett, 2004, 6 (17), 2853-2855.

59. Kolb H.C., Finn M.G., Sharpless KB. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem., Int. Ed., 2001, 40 (11), 2004-2021.

60. Gierlich J., Burley G.A., Gramlich P.M.E., Hammond DM., Carell T. Click Chemistry as a Reliable Method for the High-Density Postsynthetic Functionalization of Alkyne-Modified DNA Org. Lett., 2006, (8), 3639-3642.67.