Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцентных красителей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Дюбанкова, Наталья Николаевна

• Дюбанкова, Наталья Николаевна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Дюбанкова, Наталья Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Синтез и свойства модифицированных нуклеозидов, повышающих стабильность олигонуклеотидных дуплексов за счет стэкинг-взаимодействий (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Синтез модифицированных аналогов нуклеозидов

Физико-химические основы стэкинг-взаимодействий

Влияние ароматических углеводородов в составе нуклеозидных аналогов на стэкинг-взаимодействия

Стабилизация олигонуклеотидных дуплексов мостиковыми структурами

Полициклические гетероциклические нуклеозидные аначоги, не образующие водородные связи

Аннелированные нуклеозиды

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез 1-фенилэтинилпиренового и 9,Ю-бис(фенилэтинил)антраценового 2'-карбаматных производных уридина и амидофосфитных реагентов на их основе; спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

1.1. Получение 2'-карбаиатных нутеозидных производных: 2'-0-[4-(пирен-1-ил-этинил)фенилметиламинокарбонил]- и 2 '-0-[4-(Ю-феншэтиншантрацен-9-ил-этинил)фенилметиламинокарбонил]уридинов

1.2. Спектральные свойства 2 '-0-[4-(пирен-1-илэтинил)феншметилаиинокарбонил]- и 2'-0-[4-(10-фентэтинилантрацен-9-ил-отинил)фенг1гметшаминокарбонил]уридина

1.3. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки ФЭП и БФЭА уридин

2 '-карбаматов

2. Синтез пиренилметильного и бутильного а/?а£мн0уридин-2'-карбаматов и амидофосфитных реагентов на основе урацил-1-арабинозида; спектральные свойства пиреновых производных

2.1. Синтез пиреншметильного и бутильного арабиноуридин-2 '-карбаматных амидофосфитных реагентов

2.2. Спектральные свойства пиренового арабиноуридин-2 '-карбамата

2.3. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки пиренового и бутилового арабиноуридин-2 '-карбаматов

3. Синтез модифицирующих реагентов на основе 2,4-дигидроксибутирамида и спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

3.1. Синтез модифицирующих реагентов на основе Ы-замещенных 2,4- 66 дигидроксибутирамидов

3.2. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих 2,4-дигидроксибутираиидные синтоны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование

Растворители

Реактивы

Оборудование

Методы

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцентных красителей»

Стремительное развитие химии модифицированных нуклеиновых кислот в значительной степени обусловлено расширением области их применения в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Особое внимание уделяется разработке новых высокочувствительных реагентов для детекции взаимодействий различных биомолекул. Среди таких реагентов хорошо зарекомендовали себя нерадиоизотопные люминесцентные метки. Они характеризуются стабильностью (практически неограниченный срок хранения), высокой чувствительностью, возможностью автоматизации процедур модификации и детекции, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду и человека.

Перспективными люминесцентными красителями для создания высокочувствительных зондов оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы люминесценции. Очень интересным свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от exr/'ted dimers - возбужденные димеры). ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы я-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам резко отличающимся от исходных ПАУ (то есть, к новым красителям). Кроме того, ПАУ способны к нековалентным взаимодействиям с ДНК.

Некоторые исследователи утверждают, что водородные связи не являются основной движущей силой образования ДНК дуплексов. Они обращают внимание на другой тип взаимодействий - между основаниями, уложенными одно над другим, - стэкинг-взаимодействие (от англ. stacking - укладка). Путем химической модификации нуклеиновых кислот можно сделать такие взаимодействия более сильными, что обеспечит создание более стабильных комплексов. Одинми из направлений модификации является расширение плоскости нуклеиновых оснований путем достраивания дополнительных бензольных колец. Это приводит не только к увеличению площади стэкинга, но и к изменению спектральных свойств оснований.

Еще одним способом изменения нековалентных взаимодействий в нуклеиновых кислотах является введение в олигонуклеотид полициклических ароматических углеводородов. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции.

Литературная часть работы посвящена обсуждению природы стэкинг-взаимодействий, способов увеличения силы таких взаимодействий с помощью модификации природных оснований. В основной части диссертации рассмотрены способы введения различных полициклических ароматических углеводородов в олигонуклеотиды. Особое внимание уделено влиянию ПАУ на стабильность дуплексов и изменению их флуоресцентных свойств в составе нуклеиновых кислот.

В качестве флуоресцентных меток нами выбраны пирен, 1-фенилэтинилпирен и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен. Они имеют высокие коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции, способны к нековалентным взаимодействиям с нуклеиновыми кислотами, образованию эксимеров и эксиплексов (сокращение от excited complex -возбужденные комплексы). Кроме того, 1-фенилэтинилпирен и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен являются донорно-акцепторной парой при безызлучателыюм резонансном переносе энергии.

Для синтеза олигонуклеотидных коньюгатов мы использовали как нуклеозидные реагенты, так и соединения ненуклеозидной природы. Можно указать ряд очевидных требований к таким реагентам. Во-первых, устойчивость в условиях стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза и деблокирования раствором аммиака. Во-вторых, введение модификации в середину олигонуклеотидной последовательности не должно изменять длину олигонуклеотида по сравнению с немодифицированным аналогом. Поэтому для сохранения длины олигонуклеотида необходимо наличие 1,3-диольной системы модифицирующего синтона. Для удобства синтеза реагентов и их стабильности важно наличие первичной и вторичной гидроксильных групп. Желательно, чтобы синтоны были оптически активными. Время конденсации модифицированных реагентов должно быть сопоставимо со временем конденсации стандартных реагентов в условиях олигонуклеотидного синтеза.

Синтезированные нами реагенты удовлетворяют всем этим требованиям. Они эффективно вступают в реакцию конденсации в автоматическом режиме и выдерживают дальнейшие операции выделения и очистки олигонуклеотидов. Изучение термической стабильности дуплексов и спектральных свойств модифицированных коньюгатов подтвердило наличие нековалентных взаимодействий (интеркаляция, стэкинг и, возможно, связывание с бороздками дуплекса) выбранных нами флуоресцентных зондов с нуклеиновыми кислотами.

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Синтез и свойства модифицированных нуклеозидов, повышающих стабильность олигонуклеотидных дуплексов за счет стэкинг-взаимодействий (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Физические и химические факторы, обеспечивающие функционирование ДНК в клетке, изучаются уже на протяжении нескольких десятилетий. В последние годы эта область развивается особенно быстро благодаря усовершенствованию методов работы с ДНК. Для изучения структуры ДНК широко используются химически модифицированные аналоги нуклеозидов.

Вклад водородных связей в стабилизацию дуплексов оценивают как 0,5-1,8 ккал/моль на одну пару оснований ДНК [1-4]. Эта величина в значительной степени зависит от окружения молекулы. Относительно низкий вклад отражает конкуренцию при образовании водородных связей между основаниями и средой [5]. В газовой фазе, где такая конкуренция отсутствует, вклад одной связи оценивают как 6-7 ккал/моль [6]. Высказывается мнение, что водородные связи не являются основной движущей силой образования ДНК дуплексов [710]. Исследователи обращают внимание на другой тип взаимодействий - между основаниями, уложенными одно над другим, - стэкинг-взаимодействие (от англ. stacking -укладка).

Авторы работы [6] оценивают вклад стэкинг-взаимодействий в 1 ккал/моль на одну пару оснований РНК. Несомненно, стэкинг оснований является существенным фактором в образовании вторичной структуры дуплексов, триплексов и более сложных систем. Путем химической модификации оснований можно сделать такое взаимодействие более сильными, что обеспечит создание более стабильных комплексов. Целью данного обзора является обсуждение природы стэкинг-взаимодействий, способов увеличения силы таких взаимодействий с помощью модификации природных оснований.

Синтез модифицированных аналогов нуклеозидов

В настоящее время синтезирован широкий ряд нуклеозидов, содержащих в качестве основания полициклические ароматические гетероциклы. Их особенностью является то, что многие из них могут специфично участвовать в уотсон-криковском взаимодействии, имеют большую площадь поверхности, что может обеспечить стабилизацию содержащих их 4 9 олигонуклеотидиых дуплексов, и обладают характерными флуоресцентными свойствами, что делает их удобным инструментом в исследовании изменений в структуре ДНК дуплексов.

Соединения 1-3 образуются в результате взаимодействиея ¿/-[(триизопропилфенил)-сульфонил]пиримидиновых нуклеозидов с ароматическими диаминами [И, 12]. Например, при кипячении 3',5'-ди-0-ацетил-04-[(триизопропилфенил)сульфонил]-5-бром-2'-дезоксиуридина с 4-нитро-1,2-фенилендиамином в тетрагидрофуране с выходами 32% и 43% были получены диацетильные производные соединения 1 (Я=Вг) [11]. Аналогичная реакция с /7е/7М-диаминонафталином давала диацетильное производное соединения 2 с выходом 78% [11], а с 2,3-диаминонафталином - 3 с выходом 57% [11]. Присутствие таких модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотидиых дуплексах стабилизирует их за счет увеличения площади стэкинг-взаимодействий нуклеиновых оснований [11, 12]. При этом они не участвуют в образовании водородных связей. мо2

И X

N^0 НО уч но

ОН Я = СН3, Вг I

Группа исследователей во главе с М.Э. Маиеиса запатентовала ряд нуклеозидов 4, содержащих конденсированную с пиримидином систему [13-16]. Они стабилизируют дуплексы, проявляют флуоресцентные свойства и облегчают проникновение олигонуклеотида в клетку [17, 18]. Поэтому нуклеозиды такого типа активно синтезируются и другими исследователями [19].

Где X = 5,0. К;

Я| | Мп Я], 1*2, Яз- различные заместители см. [13-16] N N

Л, но^

ОН

Наиболее изученными соединениями такого типа являются феноксазиновые (Х=0, У=С) (5), (76) и фенотиазиновые (Х=8, У=С) (7а) нуклеозиды. В качестве примера на схемах 1 и 2 приведен их синтез [20,21].

Ключевой стадией в синтезе 5 является взаимодействие 5-гидрокси-2'-дезоксицитидина с гексафторбензолом в ЭМБО в присутствии карбоната калия при 50°С [20]. я он он он

Схема 1. Реагенты и условия: (а) 1. Вг2, Н20,20°С, затем 01ЕА; (Ь) К2С03, гексафторбензол, ЭМБО, 50°С.

Фенотиазиновый нуклеозид 7а получали из 5-иод-2'-дезоксиуридина. Диацильное производное исходного 5-галогеннуклеозида обрабатывали мезитиленсульфохлоридом в присутствии триэтиламина. Последующее взаимодействие активированного соединения с 2-аминотиофенолом в присутствии БВи, давало 6а с выходом 54%, которое кипятили в ф этаноле в присутствии трет-бутипала калия, получая 7а с выходом 38%. Аналогичный подход для феноксазинового соединения 76 оказался неудачным, поскольку на стадии циклизации происходило элиминирование иода без образования трициклического продукта. Поэтому исходным соединением выбрали 5-бром-2'-дезоксиуридин, который давал соединение 66 с выходом 27%. Циклизация оказалась более эффективной на незащищенном продукте, поэтому 66 сначала обрабатывали аммиаком в метаноле, затем кипятили в этаноле в присутствии фторида калия, получая 76 с количественным выходом [21].

Другой подход к синтезу трициклических пиримидиновых производных представлен на схеме 3 на примере нуклеозида 8. Он заключается в присоединении Вос-защищенного о-триметилстанниланилина по методу Стилле к 5-иоддезоксиуридину в присутствии • (РЬ3)2Рс1С12 в ОМР при 80°С. 5'-Гидроксильную группу полученного с 60% выходом бисарильного соединения защищали диметокситритильной группой, а З'-триметилсилильной. Затем О4 активировали, как в синтезе соединений 7а и 76 (схема 2), мезитиленсульфохлоридом в присутствии триэтиламина и ОМАР в СНгСЬ при 20°С и циклизовали с помощью ОВ11 в СНгСЬ. После снятия триметилсилильной защиты целевой нуклеозид 8 был получен с выходом 50% [22]. и ны

X а

Сг N АгО

0^1 54% (6а) 27% (66)

ОН

X = I, Вг

ОАс

6а: X = I, У = Б 66: X = Вг, У = О

ООН

7а г, 100%

66 -НО он он

76

Схема 2. Реагенты и условия: (а) Ас20 в пиридине, 20°С; (б) мезитиленсульфохлорид, Е^Ы; (в) 2-аминофенол или 2-аминотиофснол, ОВи, 20°С; (г) Ш3 в СН3ОН, 20°С; (д) 10 экв. КР в ЕЮН, кипячение; (е) гВиОК. в ЕЮП, кипячение.

НО

А. °г° г, с,™/ он а, 60 %

НО

ОН

Схема 3. Реагенты и условия: (а) (РЬ3)2Рс1С12, ОМР, 80°С; (б) БпИ-С!, Ру, 20°С; (в) I. N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамид, СН2С12, 20°С; 2. мезитиленсульфохлорид, ОМАР, Е^Ы, СН2С12, 20°С; 3. ОВи, СН2С12,20°С; (г) /ВиМН2/МеОН (1:1)20°С

Запатентован ряд полициклических производных пуриновых нуклеозидов 9-11 [17, 23], стабилизирующих дуплексы, проявляющих флуоресцентные свойства и способствующих проникновению олигонуклеотида в клетку [18].

9 10 И

На схеме 4 представлен пример синтеза нуклеозида 11. б-Хлор-7-деаза-7-иод-3',5'-ди-0-толил-2'-дезокси-(/?-0-рибофуранозил)пурин вводили в реакцию Стилле с Вос-защищенным о-триметилстанниланилином в присутствии (РИз^РсЮг в БМР при 60°С, получая бисарильный нуклеозид с выходом 68%. Его обработка БаЬсо и БВи приводила к образованию тетрациклического соединения. На этой стадии не была полностью удалена т/?е/я-бутилоксикарбонильная защита. Поэтому смесь продуктов обрабатывали трифторуксусной кислотой, получая целевое соединение с выходом 96%. После снятия защитных групп метилатом натрия в метаноле нуклеозид 11 был получен с выходом 64%

17].

ОТо1 ОТо1 ОН

11

Схема 4. Реагенты и условия: (а) Лг-(/иреот-бутилоксикарбонш1)-2-(триметилстаннш])анилин (4 экв.), (РЬ3Р)2Рс1С12 (0,1 экв.), ЭМР, 60°С, 24 ч (68%); (б) ЭаЬсо (2 экв.), ЭВи (2 экв.), 75°С, 21 ч; (в) 25% СР3СООН в СН2С12, И, 3 ч (96% на стадии б, в) (г) ЫаОМе, МеОН, И (64%).

Нуклеозиды, содержащие основания с расширенной площадью поверхности, получают также гликозилированием соответствующих оснований защищенными сахарами.

На схеме 5 показан синтез бициклических нуклеозидных аналогов 12 (а, б). Поверхность стэкинг-взаимодействий дополнительно расширена за счет введения пропинильной группы. Для этого после гликозилирования соединение иодировали хлоридом иода (I), а затем вводили в реакцию Соногаширы с пропином в присутствии (РИз^РсЮг и иодида меди (I) в триэтиламине, получая защищенный нуклеозид с выходом 77%. После снятия защитных нуклеозиды 12а и 126 были получены с выходом 87% [24, 25].

12а: R=Me 126: R=H

Схема 5. Реагенты и условия: (а) бистриметилсилил ацетамид, OToi , затем SnCl4(26%); (б) ICI, СН2СЬ (87%); (в) пропин, (Ph3P)PdC!2, Cul, Et3N (77%); (г) 0,4 M NaOMe (87%).

Большой интерес представляют флуоресцентные рибонуклеозиды 13 и 14. Полагают, что 13 может участвовать в уотсон-криковских взаимодействиях аналогично уридину. Синтез рибонуклеозидов 13 и 14 представлен на схеме 6. При обработке 1,2,3,5-тетраацетилрибозы силильным производным аллоксазина при комнатной температуре в ацетонитриле в присутствии кислоты Льюиса (тетрахлорид олова) сначала образуется смесь N1, N3 продуктов гликозилирования, которая через два часа превращается только в N1-гликозилированный продукт. Если реакцию проводить в дихлорметане при -20°С, гликозилирование протекает только положению N3 [26].

Нуклеозид 15, содержащий в качестве основания диоксопиримидо-тетратиафульвален, сильный донор электронов, участвует в образовании комплементарных водородных связей с аденозином [27]. Схема его синтеза представлена на схеме 7. Исходное соединение, полученное из барбитуровой кислоты, вводили во взаимодействие с 1,2,3,5-тетраацетилрибозой в присутствии триметилсилилтрифторметансульфоната. Продукт обрабатывали селоном 16 в присутствии трифенилфосфина. После удаления защитных групп нуклеозид 15 был получен с выходом 9% в расчете на исходное соединение. а. б, в

-0-^-ОАс

----^и^улМ

АсО

АсО ОАс а, г, в N

НО. о N О

ОН ОН 13

О N N

Схема 6. Реагенты и условия: (а) Н ТМ5-С1, РЬН; (б) БпСЬ, СН2С12, -20°С, 95% на две стадии; (в) ЫН3; (г) БпСЬ, МеСЫ, И, 85% на две стадии.

НЫ

-Л

НМ'

11>2е б

-О. ОАс ОАс

Ас^ О^И^ Б-ОАс ОАс

Т ГК]

НО. О^М^ Б

-Б Б

ОН ОН 15

Схема 7. Реагенты и условия: (а) , ТМБ-О-ТГ, МеСМ; (Ь)

ЕЮН.

6 , РРЬз, РЬМе; (с) ЫН3,

Физико-химические основы стэкинг взаимодействий

Hunter и Sanders представили простую теоретическую модель взаимодействий л-облаков гетероциклических оснований [28]. В ней рассматриваются электростатические взаимодействия л-облаков выше и ниже плоскости молекулы. Ароматические молекулы имеют характерное распределение заряда. Ядро образует положительно заряженную а-рамку, которую, как сэндвич, окружают два отрицательно заряженных л-облака. При расположении двух таких молекул в стопку возникает отталкивание между ними, однако если молекулы расположить с некоторым смещением, то а-рамка и л-облако будут притягиваться.

Показано, что стэкинг-взаимодействия природных оснований не являются очень сильными, и что не сложно найти такие соединения, которые будут в большей степени стабилизировать дуплексы [1, 10,29].

Наибольшее перекрывание поверхностей оснований обеспечивает наибольший стэкинг [10, 30]. На рисунке 1 показано перекрывание соседних молекул 5-нитроиндольного нуклеозидного аналога [31] по сравнению с гуанозиновыми остатками в GGG-фрагментах А-и В-ДНК. Для аналогов нуклеозидов, содержащих ароматические остатки, характерно' перекрывание плоскостей ароматических циклов с небольшим сдвигом в результате суммирования двух эффектов: отталкиванием л-электронов в соседних молекулах и притяжением между л-системой и а-остовом [31].

Рис. 1. Относительное расположение 5-нитроиндол-2'-дезоксирибозных остатков в молекуле (в центре) по сравнению с 2'-дезоксигуанозиновыми остатками в А-ДНК (слева) и В-ДНК (справа). Видно перекрывание между гетероциклами [31].

Многие исследователи обращают внимание на ван-дер-ваальсовы взаимодействия между нуклеиновыми основаниями [31-33] при рассмотрении силы стэкинг-взаимодействий. Эти силы зависят от площади поверхности перекрывания оснований, и их поляризуемости в водных растворах.

Влияние ароматических углеводородов в составе нуклеозидных аналогов на стэкинг-взаимодействия

В ряде работ авторы пытаются найти среди различных физических параметров (хроматографический коэффициент удерживания (log Р), поляризуемость молекул, дипольный момент, площадь поверхности и размеры области стэкинга) неполярных ароматических аналогов нуклеозидов такой, который оказывает максимальное влияние на стэкинг-взаимодействия [10, 34-36]. Физические свойства исследованных ими аналогов оснований (рис. 2) представлены в таблице 1.

Рис. 2. Структура некоторых неполярных аналогов нуклеозидов, представленных в табл. 1 [37].

Стэкинг-взаимодействия пуриновых оснований в дуплексах оказались более сильными, чем для меньших по размеру пиримидиновых оснований [33]. Так, взаимодействия между двумя соседними дезоксиаденозинами увеличивают энергию стабилизации самокомплементарной последовательности на 2,0 ккал/моль, тогда как взаимодействия между тимидиновыми основаниями дают только 1,1 ккал/моль для стабилизации дуплекса [28]. Это связано с тем, что поверхность контакта между пуриновыми основаниями больше, чем между пиримидиновыми, что обеспечивает более сильное взаимодействие с соседней парой.

Увеличение гидрофобности аналогов нуклеозидов увеличивает стабильность олигонуклеотидов, содержащих такие аналоги. Замена природных оснований в ДНК на их неполярные неприродные аналоги (рис. 2) приводит к более сильным стэкингвзаимодействиям [10]. Например, Тт самокомплементарных дуплексов с1(ХСССССС), содержащих в качестве X дифтортолуол, на 6,3°С больше, чем у тимидинсодержащих дуплексов, хотя последние имеют такой же размер, и форму [10]. Изостерический аналог аденина - 4-метилиндол увеличивает Тт на 3°С [10] (табл. 1). Очевидно, что сила взаимодействия возрастает с увеличением размера основания. Так, замена тимидина на небольшой по размеру бензольный нуклеотид приводит к незначительному увеличению Тт олигонуклеотида (0,2°С), а замена на нафталиновый - к увеличению Тт на 8,1°С (табл. 1). Однако вклад фенантренового нуклеозида, имеющего больший размер по сравнению с нафталиновым, оказался практически одинаковым. Поэтому можно предположить, что третье кольцо фенантрена не контактирует с соседними основаниями и, вероятно, не укладывается в двойную спираль ДНК (рис. 3).

Таблица 1. Рассчитанные физические свойства и сила стэкинг-взаимодействий природных нуклеиновых оснований и их неполярных аналогов1-2 по данным термической стабильности самокомплементарного дуплекса с1(ХСССССО), где Х - нуклеозид, содержащий в качестве основания указанную ароматическую структуру [10].

Ароматическая структура Т 1 OQ3 logP (октанол -вода)2,5 Поляризуемость, (А3)2 Дипольный момент, (дебай)2 Площадь поверхности, (А2)46 Площадь поверхности стэкинга, (А2)4-7 AAG" стэкинга, ккал8

Тимин 48,1 -0,36 12,3 4,51 142 95 1,1

Аденин 51,6 -1,07 13,7 2,27 142 128 2,0

Цитозин 46,2 -0,76 11,3 6,02 127 102 1,0

Гуанин 51,5 -1,36 15,0 6,55 154 139 1,3

Пиррол 46,6 +0,82 7,8 2,25 96 77 0,8

4-метилиндол 54,6 +2,91 15,5 1,94 165 157 3,1

5-нитроиндол 60,6 +2,46 16,9 8,19 173 165 3,4

Бензол 48,3 +2,52 9,1 0,26 110 88 1,4

Дифтортолуол 54,4 +3,32 12,5 1,84 144 96 2,6

Триметилбензол 51,4' +3,98 14,0 0,00 173 114 1,6

Нафталин 56,2 +3,52 15,7 0,27 158 134 2,9

Фенантрен 57,3 +4,52 19,8 0,29 203 122 2,6

Пирен 64,1 +4,67 23,9 0,35 217 184 3,4

- ¡og Р, поляризуемость и дипольный момент даны для метилированных соединений, площадь поверхности и поверхности стэкинга - для незамещенных компонентов. 2 - значения даны для оснований, имеющих метальную группу в положении присоединения к нуклеозиду. 3 - Тт измерена в IM NaCl, 10 мМ Na фосфатном буфере pH 7, концентрация дуплекса 5,0 мкМ.4 - значения даны для незамещенных оснований.J -значения вычислены по методу Ghose - Crippen [38]. Отрицательные величины показывают избыток воды, положительные - октанола. 6 - половина вычисленной площади поверхности оснований. 7 - оценочное значение для набора соседних оснований. 8 - свободная энергия стэкинга (ДДС°) получена вычитанием свободной энергии самокомплементарного дуплекса d(CGCGCG) из свободной энергии дуплекса d(XCGCGCG), где X - указанная ароматическая структура; подробности расчета ДДС° в [10]. 9 - концентрация дуплекса 6,0 мкМ.

Авторы работы [10] предложили грубую корреляцию между поляризуемостью молекул и стэкинг-взаимодействиями. Для наиболее сильно поляризуемого аналога, пирена, они максимальны, для наименее поляризуемого - пиррола - минимальны (табл. 1). Это правило верно для большинства исследованных ими структур, включая природные нуклеозиды. Однако есть исключения. Например, поляризуемость дифтортолуола и фенантрена различаются очень сильно, а их стэкинг почти равен, а примерно одинаковые по поляризуемости дифтортолуол и триметилбензол имеют значительно отличающуюся силу ♦ стэкинга.

Кроме этого, авторы сделали попытку отделить влияние дисперсионных сил (взаимодействие мгновенный диполь - наведенный диполь) на вторичную структуру ДНК от других эффектов [10]. Сравним, например, нафталин и фенантрен. Силы их стэкинг-взаимодействий приблизительно равны, тогда как поляризуемость фенантрена намного больше, чем поляризуемость нафталина (табл. 1). Площади стэкинг-взаимодействий приблизительно одинаковые. Если бы дисперсионные силы давали большой вклад или были бы доминирующими, можно было бы ожидать большей силы стэкинга для фенантрена. Так как этого не наблюдалось, то можно предположить, что взаимодействие мгновенный диполь ^ - наведенный диполь вносит относительно небольшой вклад. Это утверждение также подтверждает сравнение тимина и дифтортолуола (силы их стэкинг-взаимодействий существенно различаются, тогда как поляризуемости приблизительно одинаковы), а также 4-метилиндола и нафталина по сравнению с гуанином. Таким образом, авторы утверждают, что дисперсионные силы не вносят большого вклада в стэкинг-взаимодействия.

Рассмотрим теперь взаимодействие диполь - наведенный диполь. Оно должно зависеть как от величины диполя ароматической системы, поляризуемости партнера по стэкингу, так и от относительной ориентации оснований. Так как среди оснований, представленных в таблице 1, цитозин имеет наибольший дипольный момент, следовало бы ожидать, что взаимодействие диполь - наведенный диполь в системах, содержащих цитозин, будет зависеть преимущественно от поляризуемости ароматической структуры. Однако, как говорилось выше, поляризуемость и дисперсионные силы, зависящие от нее, не являются доминантным фактором.

Взаимодействие между частичными зарядами партнеров по стэкингу может стабилизировать или дестабилизировать систему, в зависимости от ориентации и величины поляризации локальных связей участников.

Иг

Рис. 3. Относительное расположение 5'-концевых нуклеозидных аналогов по отношению к соседней С-С парс. [10]. А - тимин или дифторбензол, В -аденин или 4-метилиндол, С - бензол, В - нафталин, Е - фенантрен, Р -пирен.

Авторы считают, что размер площади поверхности стэкинг-взаимодействия является основным фактором, отвечающим за увеличение стабильности, содержащих их олигонуклеотидных дуплексов [10]. Этот параметр определяется не только площадью поверхности молекулы, но и ее формой и геометрией перекрывания с соседней парой оснований (рис. 3). Из таблицы 1 видно, что стэкинг-взаимодействия пиррола, имеющего наименьшую площадь поверхности стэкинг-взаимодействия, наименее сильные. А введение пирена, имеющего максимальный размер площади поверхности стэкинг-взаимодействия, сильнее всего увеличивает термическую стабильность дуплекса по сравнению с любым природным основанием. Этот факт многие исследователи использовали при создании нуклеозидов с расширенной площадью стэкинг-взаимодействий [11-26].

Стабилизация олигонуклеотидных дуплексов мостиковыми структурами

Для связывания олигонуклеотидных последовательностей используют различные линкеры [39]. Наибольшее распространение получил линкер на основе этилен гликоля, поскольку его длину легко варьировать [39]. Он не обеспечивает стабильных дуплексов сам по себе. Однако недавно были синтезированы линкеры, способные стабилизировать дуплекс из связываемых последовательностей за счет взаимодействия л-облаков линкера и нуклеиновых оснований. К ним относятся линкеры на основе диимидов перилена и нафталина и стильбеновые линкеры.

Линкеры на основе диимидов перилена 17 и нафталина 18, 19 ковалентно привязывали к 5'-концу одного олигонуклеотида и З'-концу другого в триплексах [39-41]. При этом обеспечивалось стэкинг-взаимодействие между всеми тремя нуклеиновыми основаниями и линкером. Наблюдаемое гашение флуоресценции перилена при образовании комплекса может свидетельствовать о наличии л-взаимодействий между периленовым остатком и нуклеиновыми основаниями.

Данные по термической стабильности ДНК дуплексов и триплексов, стабилизированных периленовыми и нафталиновыми мостиками, в зависимости от рН среды представлены в таблице 2 [39]:

ОпП-О

ОгтЧ-О

Н)-«0 18

ОСН2СН2СМ

Р-Рч

ОСН2СН2СМ

ОгтП О

19

Из таблицы 2 видно, что при замене этиленгликольного линкера на нафталиндиимидный или перилендиимидный происходит образование более стабильных дуплексов и триплексов. Полагают, что это возможно из-за перекрывания л-облаков, что стабилизирует не только двойную спираль, но и триплексы [39] и квадруплексы [42]. Такие комплексы имеют структуру бутерброда (рис. 4). Дуплексы, триплексы и более сложные структуры могут быть стабилизированы периленовыми линкерами за счет стэкинг-взаимодействия со всеми тремя (в триплексах) или четырьмя (в квадруплексах) концевыми основаниями (рис. 4). Соответствующие нафталиновые производные проявляют похожий эффект, хотя имеют меньшую поверхность для стэкинга [39].

Таблица 2. Зависимость термической стабильности (Т„,) дуплексов и триплексов, содержащих нафталиновые и периленовые линкеры от рН [39].

Дуплекс: З'АСААААСАА

5' ТСТТТТСТТ Триплекс-9: 3'ТСТТТТСТТ

5' АСААААСАА 3' ТСТТТТСТТ Триплекс-19: 3' ТСТТТТСТТ

5' СТСССАСААААСАА—Ь—СТСС 3' 5' ТСТТТТСТТ

Линкер Комплекс Величина рН

5,5 6,4 7,0 7,5 8,0

Дуплекс - 64,0 64,0 -

-0(СН2СН20)3СН2СН2- Триплекс-9 39 35 33 30 27

Триплекс-19 34 31 27 25 23

СН2СН2ОСН2СН2О- Дуплекс 72 72 осЬ Триплекс-9 49 46 43 39 36 о^ы^о СИ2СН20СН2СН20- Триплекс-19 51 45 41 39 35

СН2СН2ОСН2СН2Оо^ы^о

О N о

СН2СН2ОСН2СН2О

Дуплекс

Триплекс-9

Триплекс-19

50 53

68

48

49

67

43

44

41

42

37

38

Из таблицы 2 также видно, что при увеличении рН среды стабильность триплексов уменьшается. Это обусловлено тем, что в триплексах образуется структура С+-С-С. При этом наибольшую стабильность тестированных триплексов обеспечивает периленовый мостик, что согласуется с моделью взаимодействия линкеров с основаниями, представленной на рисунке 4. о а) б) X О т

3' А

5'

Рис. 4. Стабилизация триплексов (а) и квадруплексов (б) периленовыми линкерами [39,42].

На основе диимида перилендикарбоновой кислоты получен также интеркалятор PIPER, стабилизирующий G-квадруплексы [42]. В качестве примера можно привести стабилизацию теломер, которые являются важными концевыми частями хромосом [42-44].

Еще одним примером линкера, стабилизирующего олигонуклеотидные дуплексы за счет взаимодействия я-облаков линкера и нуклеиновых оснований может служить стильбендикарбоксамидный линкер. Олигонуклеотиды, содержащие такой мостик, могут образовывать структуры двух типов (рис. 5). При этом форма шпильки преобладает [45, 46], что доказано данными температуры плавления и спектров флуоресценции. Линейный гетеродуплекс (справа) является естественной вторичной структурой, если отсутствует внутримолекулярная комплементарность.

Большой интерес к таким комплексам обусловлен следующими их свойствами:

• температура плавления у них необычно высока, что связано с удачной геометрией мостика, который жестко закрепляет олигонуклеотидные комплексы.

• флуоресцентные свойства стильбендикарбоксамидной группы делают возможным мониторинг ближайшего окружения мостика. В частности, это позволяет различии»

PIPER организованные ансамбли, которые несут две стильбеновые группы рядом, как, например, в дуплексе с гетерогенными последовательностями [45,46]. • чувствительность олигонуклеотидных коньюгатов к фотоиндуцируемым реакциям может быть проконтролирована путем модификации нуклеотидной последовательности, присоединенной к мостику. Например, стильбендикарбоксамидный мостик, связанный с последовательностью, начинающейся с пары сЮ:с1С, высоко устойчив к фотоиндуцируемым реакциям; если же он присоединен непосредственно к (1Т:(1А парам, то • стильбен становится чувствителен к свету. При облучении раствора стильбена или его производных образуется смесь цис- и /и/?я«с-производных, продуктов внутри- и межмолекулярной циклизации (Тт дуплекса, содержащего такие производные, значительно возрастает вследствие ковалентного связывания олигонуклеотидов) и циклобутановых производных (димеры стильбена) [45]. О

5'-с1Тп ч 5'-с1Тп-1-с1Ап 5'чЮСТОА-Е-<1АСТСТ

Е 3'-с1Ап-1-с1Тп 3'-сЮОАСТ-1-с1ТСАОА

З'^Ап/ смешанный шпилька линейный дуплекс линейный дуплекс

Рис. 5.

Следует отметить, что ёТ и с1С не гасят флуоресценцию стильбена, сЮ гасит сильнее, чем (1А, что связано с различными электроннными свойствами пуриновых и пиримидиновых оснований. Гашение флуоресценции при этом вызвано переносом электрона от основания ((1А или (Ю) к стильбеновой группе [45].

Полициклические гетероциклические нуклеозидные аналоги, не образующие ф водородные связи

Трициклические пуриновые нуклеозиды 20 обнаружены в И1ЫАРЬе грибов (20а), печени крыс (206) и растениях Гогм/ор5/5 ШИз (20в), они проявляют сильные флуоресцентные свойства и их нуклеозидная связь легко гидролизуется в слабокислых условиях, уже при рН 4 [47].

20«: Я

20а: Я-Н

НСООСНз чсоосн3 ООН

20в:Я- МНСООСНз

СООСНз он он

Аналоги оснований, которые не различают А, Т, й и С в комплементарной цепи, могут рассматриваться как «универсальные» [29, 48]. Они представляют большой интерес при конструировании олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов, для которых в целевом олигонуклеотиде не известна точная последовательность [48], и могут использоваться для различных технологий, использующих рекомбинантные ДНК, например, при создании геномных библиотек, мечении с помощью рандомизированных олигонуклеотидов, случайной терминация цепи. Способность с одинаковой эффективностью имитировать все четыре основания ДНК разупорядочивает стандартное уотсон-криковское спаривание, что важно в рамках фундаментальных вопросов, связанных со стабильностью дуплексов и точностью репликации [30, 48]. К настоящему времени синтезирован большой ряд «универсальных» оснований [29]. Но среди них найдено немного аналогов, которые могут гибридизоваться без дестабилизации дуплекса. При конструировании таких универсальных оснований большое внимание уделяется стэкинг-взаимодействию оснований, так как оно в значительной степени обеспечивает стабилизирующий эффект [10].

ОН ОН ОН ОН ОН

21а (ГСБ) 216 (МКЗ) 21в(5М1С5) 12а (Р1М) 12б(Р1С5)

В качестве «универсальных оснований» синтезированы соединения 12а,б и 21 (а-в) [23, 24, 48]. Введение их в олигонуклеотидный дуплекс приводит к незначительной деформациии спирали, при этом кетогруппа располагается в малой бороздке и может образовывать водородную связь с растворителем. Данные об устойчивости дуплексов, содержащих «универсальные основания», представлены в таблице 3.

Таблица 3. Температуры плавления дуплексов, содержащих соединения 12а,б и 21 (а-в) [23,24,48].

II II 21а (ICS) 216 (MICS) 21в (5MICS) 12а (PIM) 126 (PICS) А т G С

21а (ICS) 59,3

216 (MICS) 61,6 62,3 61,8 54,2 51,9 55,2 51,2

21в (5MICS) 55,3 54,6 51,6 54,2 49,9

12а (Р1М) 60,9 62,3 66,3 65,2

126(PICS) 58,8 62,6

А 55,1 53,6 55,7 55,1 55,5 52,7 58,7 52,3 48,8 т 53,0 55,1 55,5 54,7 53,7 59,2 49,8 52,8 47,2

G 52,2 54,8 54,3 56,2 51,4 55,4 53,5 50,5 61,8

С 51,0 54,8 55,5 53,4 54,4 48,4 45,0 60,7 44,8

5-gcgatgxgtagco

- для получения температур плавления использовали Змкм J'-cgctacycatcgc дуплексы в 10 мМ PIPES, 10 MgCIj, 100 мМ NaCI, рН7, используя Сагу 300 Bio UV/Vis спектрофотометр. Нагревали в интервале от 16 до 80°С со скоростью 0,5°С/мин. I

O^N •Ы. Jy

59.34:

O^N у

61.6°С й

62.3°С

О N

61.8°С У

58.8°С

N^o O^N 62.3 "С

N^-O O^N ^ 60.ГС >

N^O O^N У

62.6'с >

65.2°С

N'^o О N >

66.3°С

Ч-ДТт = -0.7 - 0.2°С ДТт =3.6 -4.3°С Y

ДТт = 2.1 -3.0°С J Y

ДТт-=0.5-|.4°С J

Рис. 6. Взаимосвязь между структурой модифицированных нуклеозидов и стабильностью содержащих их дуплексов [23, 24,48].

Из рисунка б и таблицы 3 видно, что олигонуклеотиды, содержащие пару модифицированных оснований, наименее стабилизирующую дуплекс (21а:21а), плавятся при температуре, сравнимой с немодифицированными олигонуклеотидами (например, содержащими пару с1А:с1Т), 59,3°С и 59,2°С соответственно. Добавление метильной группы к одному или обоим нуклеозидным аналогам в паре увеличивает Тт содержащих их дуплексов на 2,1-3,0 и 2,6-3,4°С соответственно. Введение пропинильной группы в один аналог либо незначительно стабилизирует либо дестабилизирует дуплексы (например, при переходе от пары 216: 216 к 12а: 216 Тт не изменяется, а от21а:21а к 126:21а или от 216:21а к 12а:21а Тт уменьшается на 0,5-0,7°С). Однако введение пропинильной группы в оба аналога значительно стабилизирует содержащие их дуплексы (на 3,4-4,0°С). При введении и • метильной и пропинильной в оба аналога наблюдается максимальная стабилизация дуплексов (Тт дуплекса, содержащего пару 12а:12а, на 4,5°С выше дуплекса, содержащего с!С:с1С).

Из таблиц 4 и 5 видно, что введение в олигонуклеотидную цепь соединений 2 и 3 (структура соединений приведена на стр. 9) стабилизирует дуплексы. Максимальная стабилизация достигается в случае, когда модифицированные нуклеозиды находятся во втором с 5'- или З'-конца положении олигонуклеотида (табл. 4). Уменьшение стабилизирующего эффекта при введении соединения 3 в середину цепи связано с тем, что оно нарушает трехмерную структуру дуплекса. Однако на концах цепей такое нарушение менее заметно и фактор стабилизации за счет стэкинг-взаимодействий увеличивается. Как и следовало ожидать, дуплексы, содержащие два модифицированных основания на концах, дополнительно стабилизированы (табл. 5). Если модифицированные нуклеозиды находятся на разных цепях дуплекса, величина стабилизации равна приблизительно сумме стабилизации одним модифицированным основанием. Но если два модифицированных основания находятся на одной цепи дуплекса, такого суммирования не наблюдается.

Таблица 4. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания X = 3 (Я= СНзНП].

Дуплекс Т14/А|4 З'-ТХТи 5'-Т5ХТЦ 5'-Т}ХТ» 5'-Т,ХТ7 5'-Т,ХТ5 5'-ТпХТ3 5'-Т,5ХТ т14/

Ам /Ам /Ам /Ам /Ам /Ам /Ам 5'-АХА,3

Тт,.° с 31 40 36 34 34 34 34 37 40

- Тт измерена в буферном растворе (100 мМ ЫаС1, 10 мМ ЫагНРОд, 10 мМ ЭДТА, рН 7) при концентрации олигомеров 2 мМ.

Таблица 5. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания [И].

Гш'(приХ=), °С Дуплекс А 2 3, Я = СНз

5'-САСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАСА 42

5■-СХАСТСАТСТСТ 31-ССАСТАСАСА 40 (-2)2 47(+5) 50 (+8)

51-САСТСАТСТСХТ 3'-СТСАСТАСАСА 40 (-2) 46 (+4) 49 (+7)

51-САСТСАТСТСТ 3'-СХТСАСТАСАСА 43 (+1) 44 (+2)

5'-САСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАСХА 48 (+6) 48 (+6)

5'-СХСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАХА 53 (+11) 55(+13)

5'-САСТСАТСТХТ 3'-СХСАСТАСАСА 46 (+4) 51 (+9)

5'-СХСТСАТСТХТ 3'-СТСАСТАСАСА 47 (+5)

5•-САСТСАТСТСТ 3'-СХСАСТАСАХА 46 (+4)

- Т„ измерена в буферном растворе (100 мМ №С1, 10 мМ Ыа2НР04, 10 мМ ЭДТА, рН 7) при концентрации олигомера 2 мМ. 2 - Величина в скобках указывает разницу температуры плавления дуплекса с температурой плавления немодифицированного дуплекса.

Аннелированные нуклеозиды

Под аннелированными нуклеозидами понимаются конденсированные многоядерные гетероциклические системы, являющиеся аналогами природных нуклеозидов, способные образовывать водородные связи.

В таблице 6 представлены данные по термической стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих нуклеозид 22, и их флуоресцентные свойства. При спаривании пиридопиримидинового кольца (соединение 22) с гуанином ДНК-дуплексы стабилизируются сильнее, чем при СС-спаривании [49]. Однако при замене в на другие основания стабильность дуплексов уменьшается. При этом в наиболее стабильных дуплексах наблюдается наибольшее гашение флуоресценции пиридопиримидина. О

Таблица 6. Данные по термической стабильности дуплексов, состоящих из самокомплементарных олигонуклеотидов, содержащих нуклеозид 22, и их флуоресцентные свойства [49].

22 Ятшх, HM Тт, °С Интенсивность флуоресценции (%)

330, 250 100

5 '-dGGG A ACGTTCCC-3 ' 257 50,5 0

5 '-dGGG А АТАТТССС-3 ' 258 47,9 0

5'-dGGGAA22TTTCCC-3' 333,258 25,3

5 '-dGGG А А2 2 СТТССС-3 ' 333,258 21,0

5'-dGGGAA22ATTCCC-3' 341,257 39,4 1,7

5'-dGGGAA22GTTCCC-3' 338, 255 58,4 <1,0 измерена при pH 7 в присутствии

При введении в олигонуклеотидную цепь соединений 23 и 24 стабильность дуплексов уменьшается (табл. 7). Авторы статьи [50] полагают, что это происходит из-за того, что эти модифицированные основания образуют только две водородные связи с гуанином. Хотя водород при N7 соединения 23 может образовывать и третью водородную связь с О6 (Ю, однако она очень слабая из-за не оптимальной ориентации. Поэтому пара 23:(Ю дестабилизирует дуплекс по сравнению с (1С:(Ю. К сожалению, таких данных для пары (1А:(1Т авторы [50] не приводят.

ОН

ОН

J I .H'VN' 3 t°

X.H-N-H но

Nf6 о

-О он он

24

Таблица 7. Данные по термической стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих модифицированное основание 23 [50].

Цепь А 5' XTY AXA AXY ATX YYA YYA XXY AAY YAY X 3' Цепь Б 3' YAX TYT TYX TAY XXT XXT YYX TTX XTX Y 5'

Цепь А Цепь Б Tmx (°C) Уменьшение T„ на одно модифицированное основание

X Y X Y

С G С G 75,6 0

23 G С G 70,6 0,71

С G 23 G 72,0 0,38

23 G 23 G 69,6 0,35

- Tm измерена в буферном растворе TNM (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ EDTA, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCI2), при концентрации олигомеров 2 мкМ.

Трициклические нуклеозиды 7, 8, 25, 26 стабилизируют содержащие их олигонулеотидные дуплексы и проявляют характерные флуоресцентные свойства. В таблицах 8 и 9 приведены данные по термической стабильности таких модифицированных дуплексов.

Таблица 8. Сравнение стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих трициклические нуклеозиды (X).

Нуклеотидная последовательность X T I о p * m 9 ^ АT„ на 1 заместитель Ссылка

Целевая РНК: 3' AGAGGGAGAGAAAA

5' dTCTCXCTCTCTTTTT 7a2 70,0 + 1,0 21

5' dTCTCXCTCTCTTTTT 7b2 71,0 + 2,0 21

5' dTXTCCCTXTX 1ТПТ 7a 76,0 + 2,3 21

5' dTXTCCCTXTXTTTTT 7b 75,5 + 2,2 21

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 7a 81,0 + 4,0 21

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 7b 84,0 + 5,0 21

5' dTCTCCCTCTCTTTTT 82 69,0 22

5* dTCTCXCTCTCTTTTT 8 70,0 + 1,0 22

5' dTXTCCCTXTXTTTTT 8 71,5 + 0,8 22

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 8 77,0 + 2,6 22

5' dTCTCXCTCTCT 5-метилцитозин (Cm) 50,5 - 51

5' dTCTCXCTCTCT 7b 57,0 + 6,5 51

5' dTCTCXCTCTCT 253 68,5 + 18,0 51

5' dTCTCXCTCTCT 263 51,5 + 1,0 51 - Тт измерена в буферном растворе, содержащем 140 мМ KCl, 5мМ Na2HP04, 1 мМ MgCl2, pH 7,2 при концентрации олигомеров 2 мкМ, 2 - структура соединений приведена на с.П, 4 - структура соединения приведена на рис. 8, с.31

Увеличение термической стабильности (табл. 8) дуплексов олигодезоксинуклеотид-РНК, где трициклические гетероциклы находятся рядом, можно объяснить максимальным перекрыванием я-облаков соседних ароматических оснований [21]. На рисунке 7 показано, каким образом два дополнительных ароматических кольца обеспечивают большее перекрывание. Когда два феноксазиновых кольца находятся в спирали рядом, второе кольцо одного трициклического остатка перекрывается с третьим кольцом соседнего основания, что невозможно для аналогов с меньшим числом ароматических колец. В то же время видно, что два цитидиновых основания не перекрываются друг с другом.

Рис. 7. Перекрывание соседних оснований в А-дуплексах [21] (комплементарные основания не показаны).

А - перекрывание феноксазинов В - перекрывание цитозинов В n4

Таблица 9. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания [20].

Нуклеотидная последовательность ъ "О -- И т„, °С X = А т„, °с х = т т„, °С х = с

Целевая ДНК: З'-АОАОХОАОАОААААА

5,-ТСтТСтСтСп>ТС,,>ТСтТПТТ Ст контроль 57,5 45,0 44,5 43,0 мах (-12,5) (-13,0) (-14,5)

5'-ТСтТСтТСпуГС',>ГСтТТТТТ Т (контроль) 49,0 53,5 46,0 44,0

Рг(52) (-4,5) мах (-7,5) (-9,5)

5,тспугстррспугсп»тспугтттт 59,0 58,0 49,0 50,0 мах (-1,0) (-10,0) (-9,0)

5'-ТСтТСтСтС',>ГСгпТСпуГ Ст-контроль 50,5 32,0 30,0 29,0 мах (-18,5) (-20,5) (-21,5)

5,-тспугстгсттсп>тстт 7Ь5 57,0 44,5 42,0 33,0 мах (-12,5) (-15,0) (-24,0) з'-тстс'гстстст 254 68,5 45,5 41,0 40,0 мах (-23,0) (-27,5) (-28,5)

- Т„ измерена в буферном растворе, содержащем 140 мМ КС1, 5мМ Ыа2НР04, 1 мМ М§С12, рН 7,2 при концентрации олигомеров 2 мкМ, 2 - структура соединения приведена на с. 10, 3 - структура соединения приведена на с. II,4- структура соединения приведена на рис. 8, с. 31.

Из таблицы 9 видно, что неприродные гетероциклические аналоги 5, 7Ь, 25 в составе оликонуклеотидов при гибридизации специфичны к гуанозину. При этом тетрафторфеноксазин (5) специфичен также к аденину. Это может быть вызвано практически нулевым изменением свободной энергии при переходе от амино- (как С) к имино- (как Т) таутомерной форме основания 5 [21]. В тоже время исходный феноксазин (7Ь) более устойчив в амино- (как С) форме, что доказано селективной гибридизацией его с в [21]. Другой возможной причиной комплементарности тетрафторзамещенного производного феноксазина (5) как к А, так и к С, является увеличение стэкинг-взаимодействия этого гетероцикла с соседними основаниями [20, 21]. Возможность существования гетероциклов в двух таутомерных формах, находящихся в равновесии, обусловлена наличием электроотрицательных заместителей в третьем кольце. Поэтому введение различных заместителей в кольцо феноксазина может привести к созданию новых аналогов, специфичных к А.

Исследования в этом направлении привели к созданию соединений 25 и 26 [51]. Замена 5-метилцитидина в составе нуклеотидной цепи на соединение 25 приводит к значительному увеличению стабильности двойной спирали. Это связано с возрастанием числа водородных связей соединения 25 с в из-за удобного расположения доноров и акцепторов водородной связи в паре С-с1атр - в (рис. 8). Поэтому соединение 25 обладает значительной специфичностью при гибридизации с гуанозином (табл. 9). Взаимодействие протонированой аминогруппы с О6 гуанина в ДНК-дуплексах имеет прецедент также в комплексах ДНК с белком [51]. А В Я

ОМА

Сошр1ешеп1

ОН ,—ч

С-с1ашр 25 Я = о-26 Я = но^о

Рис. 8. А. Структура цитозиновых аналогов. В. Модель взаимодействия С-с1ашр - й в спирали ДНК.

Исследовано влияние на стабильность триплексов при замене тимина на хиназолин-, бензо[§]хиназолин- и бензо[Г|хиназолин-2,4-дион-(1#,3//)дионовые нуклеозиды (27-29) [5254]. Оказалось, что при замене тимидина на бензо[£]хиназолин-2,4-дион и бензо[Пхиназолин-2,4-дион стабильность дуплексов слегка понижается [53, 54]. Соединения 27-29 имеют большую л-поверхность, чем тимидин, поэтому можно сделать вывод о том, что этот фактор не является основным для стэкинг-взаимодействий [53]. Более существенное значение здесь имеет конформация нуклеозида. Для образования водородных связей между соединениями 27-29 и (1А необходимо, чтобы хиназолиновые нуклеозиды имели анти-конформацию. Си//-конформация более энергетически выгодна, поскольку в ней отсутствует стерическое загромождение арильной группой. Наблюдаемая дестабилизация дуплексов в этом случае может означать, что и в структуре образующихся триплексов отсутствует возможность максимального перекрывания л-облаков модифицированного основания и соседних оснований. Или наоборот, стэкинг-взаимодействия между бензохиназолиновым основанием и соседними основаниями настолько сильные, что параметры образующейся жесткой структуры не согласуются с параметрами триплекса, вызывая его дестабилизацию

Бензохиназолиновые нуклеозиды 28,2 9 также интересны своими флуоресцентными свойствами, которые позволяют детектировать изменения в их микроокружении. Флуоресцентные свойства бензо^]хиназолин-2,4-диона 29 в составе олигонуклеотидного дуплекса практически не изменяются по сравнению со свойствами нуклеозида. При введении бензо[§]хиназолин-2,4-диона в хугстиновскую цепь наблюдается значительное уменьшение интенсивности и сдвиг максимума эмиссии флуоресценции в коротковолновую область. А когда бензо[£]хиназолин-2,4-дион является участником уотсон-криковской пары при образовании триплекса, сдвиг максимума эмиссии также наблюдается, однако, уменьшение интенсивности флуоресценции незначительное. Из этого можно сделать вывод, что во

52]. втором случае в стэкинг-взаимодействиях участвует большая часть я-поверхности молекулы, чем в третьем [52].

ОН

27

ОН

28

ОН

29 содержащих качестве

Синтезирован ряд амидофосфитных реагентов, гетероциклического основания птеридин (30-32) [55]. Соединения, в которых расположение карбонильной и аминогруппы аналогично гуанозину ЗОа-в имеют высокий квантовый выход флуоресценции (0,70-0,88), в то время как аналоги аденозина (31а-в) - низкий (табл. 10). 2хУх"'

30а - в

30а Яррибоза, Я2-СН3, Я3-Н 306 Ярдезоксирибоза, Яг-Н, Я3-СН3 ЗОв Я|-рибоза, Я2-Н, Я3-Н N Л гмн2

Ух

31а - в

31а Яррибоза, Я2-РЬ, Я3-Н 316 Иррибоза, Я2-Н, Я3-РЬ 31в Ирдезоксирибоза, Иг-Н, И3-Н

N1' рибоза 32

СН3 СН3

Таблица 10. Флуоресцентные свойства птеридиновых оснований [55]

Соединение Х„, нм Хет, нм О

30а 348 430 0,88

306 340 431 0,70

ЗОв 348 430 0,87

31а 354 444 0,41

316 358 440 0,16

31в 334 443 0,27

32 336 400 0,54

Спектры регистрировали в Тт'НС! буфере, рН 7,5 при комнатной температуре; Х„ - длина волны возбуждения; Хеш - максимум эмиссии; () - квантовый выход флуоресценции, измеренный относительно сульфата хинина (квантовый выход 0,51).

При введении птеридиновых оснований 30а и 306 в олигонуклеотидную цепь наблюдается гашение флуоресценции, что говорит об их участии в стэкинг-взаимодействиях [55]. Максимальное тушение обнаружено при положении флуорофора рядом с пуриновым основанием. Степень гашения в дуплексах по сравнению с одноцепочечным олигонуклеотидом увеличивается незначительно (табл. 11).

Таблица 11. Флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих птеридиновые основания [55]

Олигопуклеотидная последовательность X Число цепей Тушение, %

5'-ACT GCT AXA GAT ТТТ CCA САСТ' 32а i 96

5'-АСТ GCT AXA GAT TTT CCA САС-3' 32а 2 96

5'-АСТХСТ AGA GATTTTCCA САС-3' 32а 1 64

5'-ACTXCTAGAGATTTT ССА САС-3* 32а 2 68

5*-ACTGCTAXA GATTTTCCA САС-3* 326 I 96

5'-ACT GCT AXA G AT TTT ССА САС-3* 326 2

5*-АСТХСТ AGA GAT TTT ССА САС-3* 326 J 56

5*- ACT ХСТ AG A G AT TTT ССА САС-3* 326 2 64

Степень тушения флуоресценции дана относительно дезоксирибонуклеотидного птеридинового мономера. Квантовый выход соединений 30а и 306 даны в таблице 10.

Изучение стабильности дуплексов, содержащих птеридиновые основания 30а и 306, показало, что соединение 30а не участвует в спаривании с комплементарным олигонуклеотидом, так как уменьшение Тт приблизительно равно уменьшению Тт в дуплексах, содержащих пропуск одной пары оснований (табл. 12). В то время как Тт дуплексов, содержащих 306, почти такая же как Тт немодифицированных дуплексов. Из чего следует, что это основание принимает участие в образовании дуплекса.

Таблица 12. Температуры плавления олигонуклеотидных дуплексов, содержащих птеридиновые основания [55]. и » 'm » ^

Олигопуклеотидная последовательность

Х=30а Х=30б Одна пара оснований пропущена

Комплементарная последовательность

5*-АСТ GCT AGA GAT TTT ССА САС-3*

5*-GTX TGG AAA АТС TCT AGC AGT-3* 56,0

5*-GTG TXG AAA АТС TCT AGC AGT-3' 55,6

5'-GTG TGX AAA АТС TCT AGC AGT-3' 53,8 63,6 54,4

5'-GTG TGG AAA АТС TCT AXC AGT-3* 52,0 54,4

5*-GTG TGG AAA АТС TCT AGC AXT-3* 58,8 62,6

Комплементарная последовательность

5'-GTG TGG AAA АТС TCT AGC AGT-3*

5'-ACT GCT AGA ХАТ TTT CCA CAC-3* 58,4

5'-ACT GCT AXA GAT TTT CCA CAC-3' 50,4 61,6

5 '-ACT XCT AGA GAT TTT CCA CAC-3 ' 54,6 - Tm измерена в 10 мМ Tris-HCl буфере, 10 мМ NaCI, pH 7,5,1 -модифицированных оснований равна 63,2°С Тт контрольного дуплекса, не содержащего

Заключение

В связи с активным развитием области науки, связанной с технологиями антисмысловых нуклеиновых кислот, встает вопрос о разработке модифицированных олигонуклеотидов, образующих более стабильные по сравнению с немодифицированными дуплексы, триплексы и более сложные системы [56]. Поскольку стэкинг-взаимодействия гетероциклов в нуклеиновых кислотах вносят значительный вклад в стабилизацию таких систем, для создания комплексов с повышенной стабильностью стремятся обеспечить максимальные стэкинг-взаимодействия путем химической модификации нуклеиновых оснований. Полученные таким образом высокостабильные структуры представляют интерес для изучения регуляции генной экспрессии путем образования специфичного к последовательности дуплекса с целевой мРНК т у/уо (антисмысловой подход) [21]. Для диссоциации прочных дуплексов требуется большее энергичное воздействие клеточных ферментов, например, РНКазы, поэтому время жизни таких дуплексов увеличивается [23].

Комплементарные олигонуклеотиды, связанные стильбендикарбоксамидным мостиком, могут служить низкомолекулярными моделями участков ДНК и оказаться полезными в качестве продолжения двойной спирали, которое стабилизирует вторичную структуру полинуклеотидов. Такие линкеры используют и для присоединения олигонуклеотидов к специфическим регуляторным белкам [57].

Для доставки антимысловых олигонуклеотидов в клетки применяются различные приемы, например, использование липосом, содержащих катионные липиды [58]. Однако использование катионных липидов для этих целей ограничено из-за малоэффективной доставки в животные клетки. Эту проблему можно решить, используя короткие олигонуклеотиды, содержащие с качестве одного или нескольких оснований феноксазин [17, 18].

В последнее время были опубликованы новые интересные сведения по спектральным свойствам флуоресцентных ПАУ, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами [59-64].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Дюбанкова, Наталья Николаевна

выводы

1. Разработан ряд нуклеотидных (на основе рибо- и я/?абшш-уридин-2'-карбаматов) и ненуклеотидных (на основе Я- и З'-энантиомеров 2,4-дигидроксибутирамидов) флуоресцентных реагентов (амидофосфнты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

2. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения флуоресцентных меток (пирена, 1-фенилэтинилпирена, 9,10-бис(фенилэтинил)антрацена) в состав олигонуклеотидов. Синтезирован ряд олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки флуоресцентно-меченных нуклеозидов и псевдонуклеозидов в заданных положениях.

3. 2'-Карбаматная модификация арабипо-уритиз. представляет собой новый способ введения репортерных или функциональных групп в большую бороздку ДНК-дуплекса. Расположение заместителей в большой бороздке подтверждено образованием пиренового эксимера.

4. Изучены флуоресцентные свойства полученных конъюгатов; показана возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации ДНК в растворе и структурного исследования нуклеиновых кислот по изменению соотношения интенсивности мономерной и эксимерной флуоресценции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своим родителям Дюбанковым Татьяне Павловне и Николаю Филипповичу за терпение и поддержку во время выполнения работы; В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой; своим коллегам из Лаборатории химии нуклеиновых кислот (К. Р. Бирих и И. А. Прохоренко) за постоянную поддержку и ценные советы; руководителю лаборатории В.А. Ефимову за интерес к данной работе и полезное обсуждение; 3. О. Шенкареву за регистрацию 'Н-ЯМР-спектров; П. Е. Волынскому за вычисления молекулярной динамики дуплексов; своим коллегам из Alma-mater (М. А. Маслову и М. Мансуровой) за моральную поддержку и помощь при написании работы. Автор признателен коллегам из группы Майкла Гейта (Лаборатория Молеулярной Биологии, Кембридж, Великобритания) за предоставленную возможность воспользоваться великолепной приборной базой (УФ- и флуоресцентный спектрометры, MALD1 масс-спектрометр).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Дюбанкова, Наталья Николаевна, 2004 год

1. KoolE.T., Morales J.C., Guckian KM. Mimicking the structure and function of DNA: insights into DNA stability and replication. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39,990-1009.

2. Gould I.R., Kollman P.A. Theoretical investigation of the hydrogen bind strengths in guanine-cytosine and adenine-thymine base pairs. J. Am. Chem. Soc., 1994,116,2493-2499.

3. Martin F.H., Castro M.M., Aboul-ela F., Tinoco Jr. I. Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design. Nucleic Acids Res., 1985,13, 8927-8938.

4. Rotello V.M., Vitani E.A., Deslongchamps G., Murray B.A., RebekJ., Jr. Molecular recognition in water: new receptors for adenine derivatives. J. Am. Chem. Soc., 1993,115,797-798.

5. Petersheim M„ Turner D.H. Base-stacking and base-pairing contribution to helix stability: thermodynamics of double-helix formation with CCGG, CCGGp, CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp. Biochemistry, 1983, 22,256-263.

6. Schweitzer B.A., Kool E.T. Hydrophobic, non-hydrogen-bonding bases and base-pairs in DNA. J.Am.Chem.Soc. 1995,117, 1863-1872.

7. Gellman S.H., Haque T.S., Newcomb L.F. New evidence that the hydrophobic effect and dispersion are not major driving forses for nucleotide base stacking. Biophys. J. 1996, 71, 35233525.

8. Friedman R.A., Honig B. Response to S.H. Gellman, T.S. Haque, L.F. Newcomb. Biophys. J. 1996, 71,3525-3526.

9. Guckian K.M., Schweitzer B.A., Ren R.X.-F., Shells C.L., Tahmassebi D.C., Kool E.T. Factors contributing to aromatic stacking in water: evaluation in the context of DNA. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 2213-2222.

10. Bischofberger N., Matteucci M.D. Synthesis of novel policyclic nucleoside analogues, incorporation into oligodeoxynucleotides and interaction with complementary sequences. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3041-3046.

11. Bischofberger N. Matteucci M.D. Synthesis of novel polycyclic nucleoside analogs. Nucleotides & Nucleosides, 1989, 8, 859-862.

12. Lin K.-L., Matteucci M. D. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners. US Pat. 6007992, 1999.

13. Lin K.-L., Matteucci M. D. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same. US Pat 6028183,2000.

14. Matteucci M. D., Jones R.J., Lin K.-L. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners. US Pat 5502177, 1996.

15. Matteucci M.D., Jones R.J., Lin K.-L. Pyrimidine derivatives. US Pat 6005096, 1999.

16. Burg C.A., Matteucci M.D., Froehler B.C. Synthesis of tetracyclic 2'-deoxyadenozine analog. Tetrahedron Lett. 1999,40, 8969-8970.18,1920,21,22,23,24,25,26,27.28,29,3031,32,3334,35,

17. Flanagan W.M., Wagner R.W., Grant D., Lin K.-L., Matteucci M.D. cellular penetration and antisense activity by a p henoxazine-substituted heptanucleotide. Nature Biotechnology, 1999, 17,48-52.

18. Matteucci M. D., Krosigk U. Hybridization properties of oligonucleotides bearing a tricyclic 2'-deoxycytidine analog based on a carbazole ring system. Tetrahedron Lett. 1996,37, 5057-5060

19. Froehler B„ Matteucci M. D. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines. Pat. USA 5594121,1997.

20. McMinn D. L., Ogawa A. K, Wu Y., Liu J., Schultz P. G., Romesberg F. E. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. J. Am. Chem. Soc., 1999,121,11585-11586.

21. Berger M., Ogawa A. K, McMinn D. L., Wu Y, Schultz P. G., Romesberg F. E. Stable and selective hybridization of oligonucleotides with unnatural hydrophobic bases. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39,2940-2942.

22. Wang Z., Rizzo C. J. Regioselective synthesis of P-Nl- and P-N3-alloxazine nucleosides. Org. Lett., 2000, 2, 227-230.

23. Neilands O., Liepinsh V., Turovska B. Synthesis of novel tetratiafylvene system containing redox-active ridonucleoside and oligoribonucleotide. Org. Lett., 1999,1, 2065-2067.

24. Hunter C.A., Sanders J. K. M. The nature of 71-71 interactions. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5525-5537.

25. Gucian K.M., Krugh T.R., Kool E.T. Solution structure of a DNA duplex containing a replicable difluorotoluene-adenine pair. Nature Struct. Biol., 1998, 5, 954-959.

26. Hunter C.A. Sequence-depend DNA structure. The role of base interactions. J Mol. Biol. 1993, 230. 1025-1054.

27. Moran S., Ren R.X.-F., Rumney IV S., Kool E.T Difluorotoluene, a nonpolar isostere for thymine, codes specifically and efficiently for adenine in DNA replication. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 2056-2057.

28. Matray T.J., Kool E.T. Selective and stable DNA base pairing without hydrogen bonding. J.Am. Chem.Soc. 1998,120, 6191-6192.36,37.