Синтез мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот и их олигомеризация тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Прохоров, Денис Игоревич

• Прохоров, Денис Игоревич
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Прохоров, Денис Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Синтез мономеров «классических» пептидно-нуклеиновых кислот.

1.1.1. Синтез аминоэтилглицинового остова.

1.1.2. Синтез карбоксиметильных производных гетероциклических оснований.

1.1.3. Способы создания амидной связи в ходе синтеза мономеров ПНК.

1.2. Олигомеризация мономеров «классических» мономеров ПНК.

1.2.2. Синтез ПНК-олигомеров с использование Fmoc-стратегии.

1.2.3. Синтез ПНК-олигомеров с использованием Mmt-acyl-стратегии.

1.3. Модификации «классических» ПНК.

1.3.1. Модификации, основанные на увеличении количества СНг-звеньев в структуре «классических» мономеров ПНК.

1.3.2. «Обращенные» ПНК.

1.3.3. Хиральные ПНК.

1.3.4. Другие модификации ПНК.

1.4. Свойства пептидно-нуклеиновых кислот.

1.4.1. Гибридизационные свойства.

1.5. Применение ПНК.'.

1.6. Доставка ПНК в клетки.

1.6.1. Использование катионных липосом.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Синтез мономеров отрицательно-заряженных ПНК.

2.1.1. Синтез карбоксиметилированных производных гетероциклических оснований.

2.1.2. Синтез псевдопептидного фрагмента с восстановленной пептидной связью.

2.1.3. Конденсация псевдопептидных фрагментов с карбоксиметилированными гетероциклическими основаниями и последующее удаление защитных групп.

2.2. Синтез тримерной последовательности ОЗПНК.

2.2.1. Твердофазный синтез тримера ОЗПНК.

2.2.2. Синтез тримера ОЗПНК в растворе.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот и их олигомеризация»

В настоящее время синтетические аналоги ДНК привлекают к себе повышенное внимание благодаря своим уникальным свойствам. Они способны к связыванию с молекулами ДНК и РНК, тем самым влияют на процесс экспрессии генов. Этот принцип получил название антисенс- и антиген-ингибирования биосинтеза белка [1,2, 3].

Однако для того, чтобы антисенс- и антигентехнологии нашли свое применение на практике, соответствующие олигонуклеотиды должны обладать некоторыми важными свойствами:

- устойчивостью при физиологических условиях;

- способностью проникать через клеточные мембраны;

- высокой специфичностью связывания с молекулами нуклеиновых кислот;

Поскольку фрагменты природных НК или же синтетические олигонуклеотиды быстро разрушаются нуклеазами [1], существует значительный интерес к синтетическим аналогам олигонуклеотидов и их миметикам, которые достаточно устойчивы при условиях in vivo [4]. Среди последних наиболее интересными соединениями являются пептидно-нуклеиновые кислоты, структура которых впервые была предложена П. Нильсеном с сотр. [5].

Пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК, II) - это аналоги ДНК, в которых нуклеиновые основания присоединены через карбоксметильный линкер к нейтральному, ахиральному остову, состоящему из ]М-(2-аминоэтил)глицшювых звеньев (Рис. 1). и (ПНК)-» R = н

III (ОЗПНК)-*- R = (СН2)2СООН

I (ДНК) В = Thy, Cyt, Ade, Gua

Рисунок 1. Структура ДНК I, «классических:» II и отрицательно-заряженных ПНК III на основе глутаминовой кислоты.

Проведенные исследования показали, что ПНК обладают способностью распознавать комплиментарную последовательность нуклеотидов в цепи ДНК или мРНК и прочно связываться с ней [6, 7, 8, 9], они не разрушаются нуклеазами и их относительно легко синтезировать на основе стандартных методик твердофазного пептидного синтеза.

Начиная с 1991 г, интерес к ПНК непрерывно возрастает в первую очередь благодаря их уникальным гибридизационным свойствам. Они нашли широкое применение в биохимических, генно-инженерных, а также медицинских исследованиях [10, 11, 12, 13, 14]. ПНК могут использоваться как терапевтические агенты нового поколения, позволяющие избирательно воздействовать на внутриклеточные процессы. Олигомеры ПНК являются потенциальными ингибиторами клеточного роста. Особенно перспективным направлением использования ПНК является создание эффективных методов диагностики и детекции генетических мутаций.

Однако следует заметить, что структура «классических» ПНК с N-(2-аминоэтил)глициновым остовом II (Рис. 1) не всегда удовлетворяет всем требованиям, которые ставятся перед современными ДНК-миметиками.

Так, например, не всегда удается достичь эффективного прохождения этих ПНК через клеточные мембраны. Кроме того, ПНК, предложенные П. Нильсеном, недостаточно хорошо растворимы в воде, что также ограничивает их использование in vivo. В этой связи во многих научно-исследовательских лабораториях создаются новые ПНК с усовершенствованной структурой, призванной улучшить способности ПНК к специфическому связыванию с комплементарными нуклеиновыми кислотами [15, 16].

Так, например, для построения цепи ПНК было предложено использование хиральных аминокислот, что также обеспечивало введение определенных функциональных групп в структуру ПНК-олигомера. Такая модификация привела к значительному улучшению растворимости и проницаемости через клеточные мембраны [17].

На наш взгляд несомненный интерес представляет структурная модификация ПНК, в каждом мономере которой содержится отрицательный заряд, представленный карбоксильной группой III (Рис. 1). По нашему мнению отрицательный заряд в структуре олигомеров ПНК будет способствовать увеличению их растворимости в воде и уменьшению самоагрегации последних за счет сил электростатического отталкивания. С другой стороны, введение заряда предоставит возможность влиять на стабильность дуплексов ПНК с природными НК, например, за счет изменения ионной силы раствора.

К настоящему времени известен ряд синтетических стратегий для получения мономеров и олигомеров ПНК различного строения, в том числе и несущих гидрофильные остатки [18]. Однако следует отметить, что описанные процедуры синтеза не являются удовлетворительными для получения ПНК, содержащих в своем составе отрицательный заряд.

Таким образом, в настоящей работе основные усилия были направлены на разработку препаративного метода синтеза мономеров отрицательно-заряженных ПНК, а также проверку возможности олигомеризации таких мономеров стандартными методами пептидной химии.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Первые упоминания о химерных молекулах, сочетающих в себе свойства и структурные особенности пептида и нуклеиновой кислоты, а именно аминокислотах с гетероциклическими основаниями в боковом радикале относятся к середине 70-х годов. Затем неоднократно предпринимались попытки создания полиамидных миметиков нуклеиновых кислот, имеющих регулярную структуру и способных к комплиментарному взаимодействию.

За последние 15 лет было описано более десятка полиамидных ДНК-миметиков самого различного строения. Из всех описанных структур уникальные гибридизационные свойства проявили пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК), созданные группой датских ученых под руководством Нильсена 1991 г (Рис. 1) [5].

Пептидно-нуклеиновые кислоты являются аналогами нуклеиновых кислот (НК) в которых сахаро-фосфатный остов заменен на псевдопептидную последовательность. Мономерные звенья классических ПНК содержат в своем составе N-(2-аминоэтил)глициновый (Aeg) фрагмент и гетероциклическое (пиримидиновое или пуриновое) основание, соединенные между собой ацетильным спейсером. Образование полимерной цепи ПНК из отдельных мономерных остатков осуществляется с помощью амидных связей. Таким образом, основными синтетическими задачами при получении мономеров и олигомеров ПНК являются: а) образование N-алкильной связи в ходе синтеза псевдопептидного фрагмента и при получении карбоксиметилированных гетероциклических оснований; б) выбор метода конденсации гетероциклического основания с псевдопептидным остовом (образование N-ацильной связи); г) образование N-ацильной связи при олигомеризации мономеров ПНК.

Как в зарубежной, так и в отечественной литературе уже был продемонстрирован опыт систематизации по синтезу и свойствам ПНК [19, 20,21,22,23].

Следует отметить, что практически все ПНК мономеры содержат в своем составе N-алкильные и N-ацильные связи, поэтому мы считаем необходимым, провести систематизацию основных методов синтеза и продемонстрировать весь арсенал возможностей для получения ПНК самого различного строения. Кроме того, протокол для синтеза ПНК олигомеров (Вое- или Fmoc-) как правило, вносит определенные ограничения в выборе того или иного метода конденсации и определяет набор используемых защитных групп и способ удаления с полимерного носителя.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Прохоров, Денис Игоревич

выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот на основе глутаминовой кислоты.

2. На основании значений удельных углов оптического вращения для мономеров ОЗПНК, синтезированных исходя из L-и D-глутаминовой кислоты, сделан вывод о стереоспецифичности предлагаемого метода синтеза.

3. Впервые осуществлен синтез аденинсо держащего мономера отрицательно-заряженных ПНК.

4. Проведен тест-синтез тримера ПНК, содержащего тимин и отрицательный заряд в каждом мономерном звене в твердофазном и классическом варианте.

5. Осуществлен классический синтез в растворе тримерной последовательности отрицательно-заряженных ПНК.

6. Оптимизирована процедура получения псевдопептидных фрагментов с восстановленной пептидной связью, при этом показано преимущество реакции Мицунобу по сравнению с классическим методом образования псевдопептидной связи - реакции N-восстановительного алкилирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Прохоров, Денис Игоревич, 2005 год

1. Milligan J. F., Matteucci M. D., Martin J. C. Current concepts in antisense drug design // J. of Med. Chem., 1993, v. 36, n. 14, p. 1923-1937.

2. Nielsen P. E., Egholm M., Berg R. H., Buchardt O. Peptide nucleic acids (PNA). Potential antisense and antigene agents // Anti-Cancer Drug Design, 1993, v. 8, p. 53-63.

3. Mesmaeker A. D., Altmann К. H., Waldner A., Wendeborn S. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems // J. of Struct. Biol., 1995, v. 5, p. 343-355.

4. Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., Buchardt, O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide// Science. 1991. v. 254, p. 1497-1500.

5. James W. Towards gene-inhibition therapy: a review of progress and prospects in the field of antiviral antisense nucleic acids and ribozymes // Antiviral Chem. And Chemotherapy, 1991, v. 2, n. 4, p. 2796-2823.

6. Giesen U., Kleider W., Berding C., 0rum H., Nielsen P. E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, p. 16011620.

7. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Haaima G., Christensen L., Nielsen P. E., Norden B. Hybridization of peptide nucleic acid //Biochemistry, 1998, v. 37, 12331-12342.

8. Geiger A., Laster A., Kleiber J., Orum H. PNA array technology in molecular diagnostics//Nucleosides&Nucleotides, 1998, v. 17, n. 9-11, p. 1717-1724.

9. Demers D. В., Curry E. Т., Egholm M., Sozer A. C. Enhanced PCR amplification of VNTR locus D1S80 using peptide nucleic acid (PNA) // Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, p. 3050-3055.

10. Perry-O'Keeffe H., Yao X.-W., Coull J. M., Egholm M. Peptide nucleic acid pre-gel hybridization: an alternative to Southern hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 14670-14675.

11. Demidov V., Frank-Kamenetskii M. D., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E. Sequence specific double strand DNA cleavage by peptide nucleic acid (PNA) targeting using nuclease SI //Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, p. 2103-2107.

12. Koppelhus U., Zachar V., Nielsen P. E., Liu X., Eugen-Olsen J., Ebbesen P. Efficient in vitro inhibition of HIV-1 gag reverse transcription by peptide nucleic acid (PNA) at minimal ratios of PNA/RNA //Nucl. Acids Res., 1997, v. 25, n. 11, p. 2167-2173.

13. Lee R., Kaushik N., Modak M. J., Vinayak R., Pandey V. N. Polyamide nucleic acid targeted to the primer binding site of the HIV-1 RNA genome blocks in vitro HIV-1 reverse transcription// Biochemistry, 1998, v. 37, p. 900-910.

14. Good L., Nielsen P. E. Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 2073-2076.

15. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A. DNA Binding of D-Lysine-Based Chiral PNA: Direction Control and Mismatch Recognition // Eur. J. Org. Chem., 2000, p. 29052913.

16. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D. W. PNA: Synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. v. 37, p. 2796-2823.

17. Hyrup В., Nielsen P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, v. 4, n. 1, p. 5-23.

18. Norden В., Ray A. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical application and promise for the future. // FASEB J. 2000. v. 14, p. 1041-1060.

19. Gambari R. Peptide-nucleic acids (PNAs): a tool for the development of gene expression modifiers. // Curr. Pharm. Des. 2001. v. 7, p. 1839-1862.

20. Анципович С.И. Пептидо-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. т. 71, № I, с. 81-95.

21. Ferrer E., Eisenhut M., Eritia R. A convenient route for the preparation nucleic acid monomers carrying acid-labile groups for the protection of the amino function. // LUWER/ESCOM. Letters in peptide science. 1999. V. 6. P. 209-219.

22. Thomson S. A., Josey J. A., Cadilla R., Gaul M. D., Hassman C. F., Luzzio M. J., Pipe A. J. Reed K. L., Ricca D. J., Wiethe R. W., Noble S. A. Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids. // Tetrahedron 1995, V. 51, P. 6179-6194.

23. Stetsenko D. A., Lubyako E. N., Potapov V. K., Azhikina T. L., Sverdlov E. D. New approach to solid phase synthesis of polyamide nucleic acids analogues (PNA) and PNA-DNA conjugates. // Tetrahedron Lett., 1996, v. 37, p. 3571-3574.

24. Breipohl G., Knolle J., Langner D., O'Malley G., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids (PNAs) using a novel Fmoc/Mmt protecting-group combination. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, v. 6, p. 665-670.

25. Will D.W., Breipohl G., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids using a novel monomethoxytrityl protecting-group strategy. // Tetrahedron 1995, v. 51, p. 12069-12082.

26. Dueholm K. L., Egholm M., Buchardt O. An efficient synthesis of Boc-aminoacetaldehyde and its application to the synthesis of N-(2-Boc-aminoethyl)glycine esters. // Org. Prep. Proced. Int., 1993, v. 25, n. 4, p. 457-461.

27. Finn P. J., Gibson N. J., Fallon R., Hamilton A., Brown T. Synthesis and properties of DNA-PNA chimeric oligomers // Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, n. 17, p. 3357 3363.

28. Falkiewicz В., Kolodziejczyk A. S., Liberek В., К. Wisniewski. Synthesis of achiral and chiral nucleic acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron, 2001, v.57, p.7909-7917.

29. Kosynkina L., Wang W., Chyan Liang T. A convenient synthesis of peptide nucleic acid (PNA) monomers. //Tetrahedron Lett. 1994, v. 35, n. 29, p. 5173 -5176.

30. Breipohl G., Will D.W., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. Innovation and perspectives in solid phase synthesis (Ed.: Epton R.), Mayflower, Birmingham, UK, 1996, S. 6164.

31. Watkins В. E., Kiely J. S., Rapoport H. // Synthesis of oligodeoxyribonucleotides using N-benzyloxycarbonyl -blocked nuclesides // J. Am. Chem. Soc., 1982, v. 104, p. 5702.

32. Konig W., Geiger R. // Chem. Ber. 1970,103, 788-790.

33. Coste J., Le-Nguyen D., Castro B. PyBOP®: a new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. // Tetrahedron Lett., 1990, v. 31, n. 2, p. 205-208.

34. Egholm M., Buchardt О., Nielsen P. E., Berg R. H. Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogues with an achiral peptide backbone. // J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, p. 1895-1897.

35. Гершкович А. А., Киберев В. К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова Думка, 1992.-360.

36. Egholm М., Buchardt О., Nielsen P. Е., Berg R. H.Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, p. 9677-9678.

37. Christensen L., Fitzpatric R., Gildea В., Petersen К. H., Hansen H. K., Koch Т., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E., Coull J., Berg R. H. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids //J. Peptide Science, 1995, v. 3, p. 175-183.

38. Koch Т., Hansen H. K., Andersen P., Larsen Т., Batz H. G., Otteson K., Orum H. Improvement in automated PNA synthesis using Boc/Z monomers. // J. Peptide Res., 1997, v. 49, p. 80-88.

39. Scarfi S., Giovine M., Gasparini A., Damonte G., Millo E., Pozzolini M., Benatti U. Modified peptide nucleic acids are internalized in mouse macrophages RAW 264.7 and inhibit inducible nitricoxide synthase. // FEBS Lett., 1999. v. 451, p. 264-268.

40. Tyler-McMahon В. M. Et al. Altering behavioral responses and dopamine transporter protein with antisense peptide nucleic acids. // Biochem. Pharmacol., 2001, v. 62. p. 929-932.

41. Aldrian-Herrada G., Rabie A., Wintersteiger R., Blugidou J. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acid (PNA). Monomers and their oligomerization using disulphide anchoring linker. // J. Peptide Science, 1998, v. 4, p. 266-281.

42. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Boc Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 34-86.

43. Cantin M., Schutz R., Leumann J. Synthesis of the monomeric building blocks of Z-olefinic (Z-OPA) containing the bases adenine and thymine // Tetrahedron Lett., 1997., v. 38, n. 24, p. 4211-4214

44. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Fmoc Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 86-112.

45. Timar Z., Kovacs L., Kovacs G., Schmel Z. Fmoc/acyl protecting groups in the synthesis of polyamide peptide nucleic acid monomers. // J. Chem. Soc. Perkin Trans.I, 2000, v. l,p. 19-26.

46. Sonveaux E. In Protocols for Oligonucleotides Conjugates, Methods in Molecular Biology, v. 26, (Ed. S. Agrawal), Humana Press, Totowa, 1994, p. 1-12.

47. Atherton E. In Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. (Practical Approach Series). (Eds Atherton E., Sheppard R. C.). Oxford University Press, Oxford, 1989. p. 117.

48. Rietman В. H., Peters R. F., Tesser G. I. On the stability of S-(alkylsulfanyl)cysteine derivatives during solid-phase synthesis. // Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 1995, v. 114, n. 1, p. 1-5.

49. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Mmt Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 116-145.

50. Hyrup В., Egholm M., Nielsen P.E., Wittung P., Norden В., Buchardt O. Structure-activity studies of the binding of modified peptide nucleic acids (PNAs) to DNA. // J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, p. 7964-7970.

51. Krotz A. H., Buchardt O., Nielsen P. E. Synthesis of 'Retro-Inverso' Peptide Nucleic Acids: 1. Characterization of the Monomers. // Tetrahedron Lett., 1995, v.36, p. 6937-6940.

52. Li Y., Jin Т., Liu K. Synthesis and binding affinity of a chiral PNA analogue. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. v. 20. n. 9. p. 1705-1721.

53. Lioy E., Kessler H. Synthesis of a new chiral peptide analogue of DNA using ornithine subunits and solid-phase peptide synthesis methodologies // Liebigs Ann., 1996, p. 201-204.

54. Puschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P. E. Peptide nucleic acids (PNAs) with functional backbone // Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, p. 4707-4710.

55. Sforza S., Haaima G., Marchelli R., Nielsen P. E. Chiral peptide nucleic acids (PNAs): helix handedness and DNA recognition // Eur. J. Org. Chem., 1999, p. 197-204.

56. Falkiewicz В., Kowalska K., Kolodziejczyk A. S., Wisniewski K., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral nucleic acid (PNA) monomers by a simplified reductive amination method // Nucleosides & Nuleotides, 1999, v. 18, n. 3, p. 353-361.

57. Mitsunobu O. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products // Synthesis, 1981, n. 16, p. 1-29

58. Hyrup В., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E. // A flexible and positively charged PNA analogue with an ethylene-linker to the nucleobase: synthesis and hybridization properties // Bioorg. & Med. Chem. Lett., 1996, v. 6, n. 10, p. 1083-1088.

59. Wittung P., Nielsen P. E., Buchardt O., Egholm M., Norden B. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. // Nature. 1994. v. 368. p. 561-563.

60. Demidov V. V., Potaman V. N., Frank-Kamenetskii M. D., Egholm M., Buchard O., Sonnichsen S. H., Nielsen P. E. Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. // Biochem Pharmacol. 1994. v. 48. p. 1310-1313.

61. Mollegaard N. E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P. E. Peptide nucleic acid-DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. v. 91. p. 3892-3895.

62. Nielsen P.E., Hyrup B. Peptide Nucleic Acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. // Bioorganic & Medical Chemistry. 1996. v. 4, v. 5-23.

63. Larsen H.J., Bentin Т., Nielsen P.E. Antisense properties of peptide nucleic acid. // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. v. 1489, p. 159-166.

64. Lutz M.J., Benner S.A., Hein S., Breipohl G., Uhlmann E. Recognition of uncharged poliamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerases and reverse transcriptases. // J. Am. Chem. Soc. 1997. v. 119, p. 3177-3178.

65. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid-DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. v. 91, p. 3892-3895.

66. Orum H, Nielsen P. E., Egholm M, Berg R. H., Buchardt O, Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. // Nucleic Acids Res. 1993, v. 21, p. 53325336.

67. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L., Nordyren S., Svanvik N., Westman G., Kubista M., Sjoback R., Sehlstedt U. Rapid and specific detection of PCR products using light-up propes. // Molecular and cellular probes. 2000. v. 14. p. 321-328.

68. Li X., Zhang Liangren, Lu J., Chen Y., Min J. Zhang Lihe. Signal peptide mimics conjugated to peptide nucleic acid: a promising solution for improving cell membrane permeability. // Bioconjugate Chem. 2003. v. 14. p. 153-157.

69. Richard J.P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure В., Gait M.J., Chernomordik L.V., Lableu B. Cell-penetrating peptides. A revolution of the mechanism of cellular uptake. // J. of Biological Chemistry. 2003. v. 278. p. 585-590.

70. Прохоров Д.И. Синтез тиминосодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК. // Магистерская диссертация. М.: МИТХТ, 2002.

71. Friedrich-Bochnitschek S., Waldmann H., Kunz H. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glicipeptides. // J. Org. Chem. 1989. v. 54. p. 751-756.

72. Sarin K., Kent В., Tarn J., Merrifield R. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by ninhydrin reaction. // J. Anal. Biochem., 1981, v. 117, p. 147-157.1. БЛАГОДАРНОСТИ

73. Автор работы выражает свою благодарность к.х.н. Кирилловой Ю.Г. за непосредственное руководство работой, участие в проведении эксперимента и в обсуждении результатов; д.х.н., проф. Звонковой Е.Н. за консультирование и помощь в выполнении диссертации.