Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения и исследование их гибридизационных характеристик тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Боярская, Наталья Петровна

• Боярская, Наталья Петровна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Боярская, Наталья Петровна

Список сокращений.

Введение.

Литературный обзор.

1. Физико-химические свойства пептидно-нуклеиновых кислот.

1.1. Растворимость.

1.2. Химическая стабильность.

1.3. Гибридизационные свойства.

1.3.1. Образование дуплексов.

1.3.2. Образование триплексов.

1.3.3. Образование квадруплексов.

2. Биологические свойства пептидно-нуклеиновых кислот.

2.1. Стабильность ПНК в биологических системах.

2.2. Взаимодействие ПНК с ферментами.

2.3. Проникающая способность ПНК.

2.4. Антиген/антисенс-активность.

2.4.1. Ингибирование репликации.

2.4.2. Ингибирование транскрипции.

2.4.3. Активация транскрипции.

2.4.4. Ингибирование трансляции.

3. Применение «классических» ПНК.

3.1. ПНК как потенциальные терапевтические агенты.

3.1.1. ПНК как противоопухолевые агенты.

3.1.2. ПНК как противовирусные агенты.

3.1.3. ПНК как антибактериальные препараты.

3.1.4. ПНК против паразитических организмов.

3.2. Применение ПНК в молекулярной биологии.

3.2.1. Селективное расщепление последовательностей нуклеиновых кислот.

3.2.2. Очистка и выделение нуклеиновых кислот.

3.2.3. Анализ и определение генетических мутаций.

3.2.4. ПНК как альтернатива Саузерн-блоттингу.

3.2.5. Контроль над ПЦР амплификацией.

3.3. Диагностика.

3.3.1. ПНК-зонды.

Создание Tag-библиотек.

ПИК-FISH технология.

Биосенсоры и микрочипы.

Технология PD-петли.

4. Доставка ПНК.

4.1. Использование неприродных катионных липосом.

4.2. Непептидные векторы.

4.3. Конъюгаты ПНК-пептид.

Теоретическая часть.

1. Синтез тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК различного строения.

1.1. Синтез псевдопептидных фрагментов мономеров отрицательно заряженных ПНК.

1.1.1. Синтез сульфамидных производных псевдопептидных фрагментов.

1.1.2. Синтез вторичных аминов с восстановленной пептидной связью.

1.2. Синтез карбоксиметилированного производного тимина.

1.3. Конденсация вторичного амина с тимин-1-ил уксусной кислотой.

1.4. Удаление аллильной защиты с а-карбоксильной группы.

2. Твердофазный синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения.

3. Исследование гибридизационных свойств отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот.

3.1. Определение стабильности комплексов, образованных между тиминсодержащими декамерами отрицательно заряженных ПНК и олигодезоксирибонуклеотидами.

3.2. Изучение биомолекулярного взаимодействия тиминсодержащих декам еров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Экспериментальная часть.

Выводы.

Список используемой литературы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БФС - краситель-маркер бромфеноловый синий

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ дцДНК - двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота

НК - нуклеиновая кислота

ПНК - пептидно-нуклеиновая кислота

ПТСК - иара-толуолсульфокислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Aeg - аминоэтилглицин

All - аллил

Вос - wpew-бутилоксикарбонил

ВОР-гексафторфосфат-(бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония

CISH - хемолюминесцентная гибридизация in situ

СРР - клеточно-проникающие пептиды

DCC - дициклогексилкарбодиимид

DCM - хлористый метилен

DEAD - диэтилазодикарбоксилат

DhbtOH - 3-гидроксо-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин

DIBAL - диизобутилалюмогидрид лития

DIEA - диизопропилэтиламин

DMAP - N.N'-диметиламинопиридин

DMF - диметилформамид

DMS - диметил сульфид

DISC2 - 3,3'-диэтилтиадикарбоцианин

EDC- 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимид гидрохлорид EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота ESI - электроспрей

ESR - метод электронного спинового резонанса FAM - карбоксифлуоресцеин Fmoc - флуоренилметоксикарбонил

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

HBTU - [гексафторфосфат-0-(бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3 ,-тетраметилурония] 1-HOBt- 1-гидроксибензотриазол

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота

HIV - вирус иммунодефицита человека

IGF1 - инсулиноподобный фактор роста

LC/MS - жидкостная хроматорафия/масс-спеткрометрия

LTR - длинный концевой повтор

MALDI-TOF MS - матричная десорбционно-ионизационная времяпролетная массспектрометрия

MB - молекулярный маяк

МВНА - 4-метилбензгидриламин

NLS - сигнал локализации в ядро

NMM - N-метилморфолин oNBS - ор/ио-нитробензолсульфонил

PRINS - полимеразная реакция in situ

PSA - персульфат аммония

РуВОР - гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трис(пирролидино)фосфония SA - стрептавидин

SNP - полиморфизм одного нуклеотида SPR - поверхностный плазмонный резонанс

TBTU - тетрафторборат-0-(бензотриазол-1-ил)-1,1ДЗ-тетраметилурония TEA -триэтиламин

TEMED - N,N,N', N'- тетраэтилендиамин TFA - трифторуксусная кислота TFMSA - трифторметансульфокислота THF - тетрагидрофуран

TOF-SIMS - времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов VGF - фактор роста тучных клеток

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения и исследование их гибридизационных характеристик»

Синтетические молекулы, которые способны специфично связываться с выбранной мишенью в исследуемой последовательности гена, представляют большой интерес в медицине и биотехнологии. Модификации нуклеиновых кислот направлены на увеличение специфичности связывания с ДНК или РНК, а, следовательно, на создание более быстрых и надежных методов молекулярной биологии, диагностики и лечения генетических заболеваний, основанных на принципах гибридизации с анализируемыми последовательностями нуклеиновых кислот.

Радикальная замена сахаро-фосфатного остова в структуре ДНК на псевдопептидный, построенный из повторяющихся единиц Ы-(2-аминоэтил)глицина, была положена в основу создания полиамидных ДНК-миметиков - пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК) («классические», Aeg ПНК) (Рис. 1Б) - которые сочетают в себе устойчивость к внутриклеточным ферментам и уникальные гибридизационные характеристики [1]. ПНК изначально были разработаны как антиген/антисенс-агенты [2], но ограниченная проникающая способность и растворимость в воде не позволили вывести эксперименты за рамки исследований in vitro и требуют конструирования дополнительных средств доставки. Благодаря способности образовывать высокопрочные дуплексы, триплексы и квадруплексы с комплементарными последовательностями, они нашли свое применение в технологии биосенсоров и микрочипов, систем для селективного расщепления нуклеиновых кислот, определения генетических мутаций и др.

Рис. 1. Структура ДНК (А), «классических» (Б) и отрицательно заряженных (В, Г) ПНК (В= Ade, Gua, Thy, Cyt).

Однако, несмотря на многие преимущества, они также не лишены ряда недостатков. Во-первых, стабильный ПНК/ДНК-комплекс образуется даже в очень коротких сайтах (8-10 пар оснований), которые встречаются достаточно часто и не являются уникальными на всей длине ДНК. Во-вторых, ПНК не подвергаются действию ферментов и не могут быть выведены из организма. В-третьих, ахиральный, незаряженный псевдопептидный остов «классических» ПНК не дает однозначной ориентации при образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами. Простая структура ПНК в сочетании с превосходными свойствами ДНК-миметика позволяет разрабатывать и конструировать новые производные с улучшенными физико-химическими и биологическими свойствами.

Таким образом, разработка, синтез и исследование взаимосвязи структура-активность псевдопептидных аналогов природных нуклеиновых кислот является актуальным направлением поиска ДНК-миметиков, обладающих не только биологической и химической стабильностью, но и адекватным фармакокинетическим действием.

На кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова изучается подобная структурная модификация нуклеиновых кислот - отрицательно заряженные пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис. 1В, Г), содержащие асимметрический атом и анионную группу, представленную боковыми радикалами дикарбоновых аминокислот, в каждом мономерном звене регулярной псевдопептидной последовательности. В последние 10 лет на кафедре проводятся активные исследования в области их синтеза, в частности получены тимин- и аденинсодержащие мономеры отрицательно заряженных ПНК, в которых остатки L- или D-глутаминовой кислоты расположены на С-конце псевдопептидного остова. Наличие отрицательного заряда не только решит проблемы, связанные с растворимостью и самоагрегацией при определенных рН, но таже позволит управлять процессом гибридизации за счет изменения ионной силы раствора и повысит специфичность их связывания с короткими уникальными участками на длинной анализируемой последовательности-мишени, приближая данную структурную модификацию к природным олигонуклеотидам.

В данной работе представлены результаты, полученные в ходе совершенствования синтеза мономеров и декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения, содержащих у- или (3-карбоксильные группы бокового радикала дикарбоновых аминокислот, а также при проведении предварительных исследований гибридизационных свойств декамеров на основе Z-глутаминовой кислоты, глицина и тимин-1-ил уксусной кислоты.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Разработка модифицированных олигонуклеотидов занимает одно из центральных мест в биотехнологии и медицинской химии в виду использования их в качестве терапевтических агентов и инструментов молекулярной биологии. «Классические» пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис. 1Б) представляют собой аналоги нуклеиновых кислот и являются полностью синтетическими ДНК/РНК-распознающими лигандами с нейтральным пептидо-подобным остовом и природными гетероциклическими основаниями. Такие свойства ПНК, как способность образовывать высокопрочные комплексы с нуклеиновыми кислотами даже при низкой ионной силе, биологическая и химическая устойчивость, могут служить основой для усовершенствования обычных, достаточно длительных и трудоемких метдов НК-диагностики.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Боярская, Наталья Петровна

выводы

1. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК на основе остатков L-глутаминовой/1-аспарагиновой кислоты и глицина. Получены два новых тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК с псевдопептидной связью, образованной между остатками защищенной дикарбоновой аминокислоты и глицина: (L-GluyXjly) (16) и (L-AspyGly) (1г), содержащих анионную группировку на iV-конце псевдопептидного остова.

2. Разработан Вос-протокол ручного твердофазного синтеза тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных ПНК, а также условия и методы их выделения и анализа.

3. Синтезированы, выделены и охарактеризованы два новых тиминсодержащих декамера отрицательно заряженных ПНК на основе I-глутаминовой кислоты и глицина. Получены тримерные последовательности отрицательно заряженных ПНК с анионной группой, представленной боковым радикалом I-аспарагиновой кислоты, в различных положениях псевдопептидного остова. В результате синтеза декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе I-аспарагиновой кислоты и глицина показано наличие ряда декамерных последовательностей, в которых аспарагиновая кислота находится в различных изомерных формах.

4. На примере декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе L-глутаминовой кислоты и глицина подобраны условия и проведены исследования их гибридизационных свойств. Показана способность образовывать прочные комплексы с комплементарными последовательностями олигодезоксирибонуклеотидов, а также зависимость прочности комплексов от ионной силы раствора и наличия некомплементарного основания в середине последовательности олигонуклеотида. Исследована зависимость гибридизационных свойств декамеров от расположения анионной группы в псевдопептидном остове.

5. На примере декамера с псевдопептидной связью L-Gluy/Gly с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) впервые получены качественные и количественные характеристики взаимодействия отрицательно заряженных ПНК с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом, иммобилизованным на поверхности чипа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Боярская, Наталья Петровна, 2007 год

1. Nielsen Р.Е., Egholm М., Berg R.H., Buchardt О. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. 1991. - V. 254. - P. 1497-1500.

2. Zamechnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxyribonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 280-284.

3. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D.W. PNA: synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - V. 37. - P. 2796-2823.

4. Hyrub В., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. // Bioorg. Med. Chem. 1996. - V. 4. - P. 5-23.

5. Christensen L., Fitzpatrick R., Gildea В., Petersen К. H., Hansen H.F., Egholm M., Buchardt 0., Nielsen P.E., Coull J., Berg R.H. Solid-phase synthesis of peptide-nucleic acids. // J. Pept. Sci. 1995.-V. 3.-P. 175-183.

6. Gambari R. Peptide-Nucleic Acids (PNAs): a tool for the development of gene expression modifiers. // Curr. Pharmaceutical Design. 2001. - V. 7. - P. 1839-1862.

7. Анцыпович С. И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. - Т. 71, № 1. - С. 81-96.

8. Wittung P., Nielsen Р.Е., Buchardt О., Egholm М., Norden В. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. //Nature. 1994. - V. 368. - P. 561-563.

9. Wittung P., Eriksson M., Lyng R., Nielsen P.E., Norden B. Induced chirality in PNA-PNA duplexes. // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V.l 17, N 41. - P. 1068-1073.

10. Egholm M., Nielsen P.E., Buchardt O., Berg R.H. Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc. -1992.-V. 114.-P. 9677-9678.

11. Igloi G.L. Variability in the stability of DNA-peptide nucleic acid (PNA) single-base mismatched duplexes: real-time hybridization during affinity electrophoresis in PNA-containing gels. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 8562-8567.

12. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Nielsen P.E., Norden B. Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 7781-7791.

13. Tomas S., Sarkar M., Ratilainen Т., Wittung P., Nielsen P.E., Norden В., Craslund A. Ionic effects on the stability and conformation of peptide nucleic acid complexes. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 5544-5552.

14. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids, efficient tools for molecular diagnostics. // Int. J. Mol. Medicine. 2004. - V. 13. - P. 521-525.

15. Kastrup J.S., Pilgaard M., J0rgensen F.S., Nielsen P.E., Rasmussen H. Crystallization and preliminary X-ray analysis of PNA-DNA complex. // FEBS Lett. 1995. - V. 363. - P. 115117.

16. Soliva R., Sherer E., Luque F.J., Laughton C.A., Orozco M. Molecular dynamics simulations of PNA-DNA and PNA-RNA duplexes in aqueous solution. // J. Am.Chem. Soc. 2000. - V. 122.-P. 5997-6008.

17. Rasmussen H., Kustrup J.S., Nielsen J.N., Nielsen J.M., Nielsen P.E. Crystal structure of a peptide nucleic acid (PNA) duplex at 1.7 A resolution. //Nat. Struct. Biol. 1997. - V. 4. - P. 98-101.

18. Eriksson M., Nielsen P. PNA-nucleic acid complexes. Structure, stability and dynamics. // Quarterly Review of Biophysics. 1996. - V. 29, N 4. - P. 369-394.

19. Nielsen P.E., Egholm M., Buchardt O. Evidence for (PNA)2/DNA triplex structure upon binding of PNA to dsDNA by strand displacement. // J. Mol. Recognition. 1994. - V. 7, N 3.-P. 165-170.

20. Egholm M., Christensen L., Dueholm K.L., Buchardt O., Coull J., Nielsen P.E. Efficient pH independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-containing bis-PNA. // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23, N 2. - P. 217-222.

21. Kosaganov Yu.N., Stetsenko D.A., Lubyako E.N., Kvitko N.P., Lazurkin Yu.S., Nielsen P.E. Effect of temperature and ionic strength on the dissociation kinetics and lifetime of PNA-DNA triplexes. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 11742-11747.

22. Wittung P., Nielsen P.E., Norden B. Extended DNA-recognition repertoire of PNA. // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 7973-7979.

23. Nielsen P.E., Christensen L. Strand displacement binding of a duplex forming homopurine PNA to a homopyrimidine duplex DNA target. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 2287-2288.

24. Lohse J., Dahl 0., Neilsen P.E. Double duplex invasion by peptide nucleic acid: a general principle for sequence-specific targeting of double-stranded DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96, N 11. - P. 804-811.

25. Nielsen P.E., Egholm M. Strand displacement recognition of mixed adenine-cytosine sequences in double-stranded DNA by thymine-guanine PNA (Peptide nucleic acid). // Bioorg. & Med. Chem. 2002. - V. 9. - P. 2429-2434.

26. Smolina I.V., Demidov V.V., Soldatenkov V.A., Chasovskikh S.G., Frank-Kamenetskii M.D. End invasion of peptide nucleic acids (PNA) with mixed-base composition into linear DNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33, N 17. - P. el46.

27. Datta В., Sehmitt C., Armituye B.A. Formation of a PNA2-DNA2 hybrid quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2003. - V. 125. - P. 4111-4118.

28. Krishnan-Ghosh Y., Stephens E., Balasubramanian S. A PNA4 Quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126, N. 19. - P. 5944-45.

29. Larsen J.H., Bentin Т., Nielsen P.E. Antisense properties of peptide nucleic acid. // Biochim. Biophys. Acta. -1999. V. 1489. - P. 159-166.

30. Lutz M.J., Benner S.A., Hein S., Breipohl G., Uhlmann E. Recognition of uncharged polyamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerases and reverse transcriptases. // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 3177-3178.

31. Norton J.C., Piatyszek M.A., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids. // Nat. Biotech. 1996. - V. 14. - P. 615-620.

32. Tyler B.M., McCormick D.J., Hoshall C.V., Douglas C.L., Jansen K., Lacy B.W., Cusack В., Richelson E. Specific gene blockade shows that peptide nucleic acids readily enter neuronal cells in vivo. IIFEBS Lett. 1998. - V. 421. - P. 280-284.

33. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. // The FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 1041-1060.

34. Nielsen P.E. Application of peptide nucleic acids. // Current Opinion in Biotechnology. -1999.-V. 10.-P. 71-75.

35. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid. DNA strand displacement loops as artificial transcriptions promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994.-V. 91.-P. 3892-3895.

36. Jakimov D., Cetojevic-Simin D., Kojic V., Mrdanovic J. Peptide nucleic acid (PNA) more than anyone could imagine at the first sight. // Archive of Oncology. - 2000. - V. 8, N 1. - P. 11-14.

37. Mologni L., Nielsen P.E., Gambacorti-Passerini C. In vitro transcriptional and translational block of the bcl-2 gene operated by peptide nucleic acid. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999.-V. 264.-P. 537-543.

38. Villa R., Folini M., Lualdi S., Veronese S., Diadone M.G., Zaffaroni N. Inhibition of telomerase activity by a cell-penetrating peptide nucleic acid construct in human melanoma cells. // FEBS Lett. 2000. - V. 473. - P. 241-248.

39. Mayhood Т., Kaushik N., Pandey P.K., Kashanchi F., Deng L., Pandey V.N. Inhibition of Tat-mediated transactivation of HIV-1 LTR transcription by polyamide nucleic acid targeted to TAR hairpin element. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 11532-11539.

40. Lee R., Kaushik N., Modak M.J., Vinayak R., Pandey V.N. Polyamide nucleic acid targeted to the primer binding site of the HIV-1 RNA genome blocks in vitro HIV-1 reverse transcription. I I Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 900-910.

41. Good L., Nielsen P.E. Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 2073-2076.

42. Kuzuya A., Zhou J.-M., Komiyama M. DNA, PNA and their derivatives for precise genotyping of SNPs. // Mini-Reviews in Organic Chemistry. 2004. - V. 1. - P. 125-131.

43. Wilhelmsson L.M., Norden В., Mukherjee K., Dulay M.T., Zare R.N. Genetic screening using the color change of a PNA-DNA hybrid-binding cyanine dye. // Nucleic Acids Res. 2002. -V. 30, N2. - P. e3.

44. Ye S., Miyajima Y., Ohnishi Т., Yamamoto Y., Komiyama M. Combination of peptide nucleic acid beacon and nuclease SI for clear-cut genotyping of single nucleotide polymorphisms. // Analyt. Biochemistry. 2007. - V. 363. - P. 300-302.

45. Yamamota Y., Komiyama M., Peptide nucleic acid for rapid gap-selective hydrolysis of DNA by Ce(IV)/EDTA complex. // Chem. Lett. 2004. - V. 33, N 1. - P.76-77.

46. Yamamotto Y., Yoshida J., Tedeschi Т., Corradini R., Sforza S., Komiyama M. Highly efficient strand invasion by peptide nucleic acid bearing optically pure lysine residues in its backbone. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2006. - N 50. - P. 109-110.

47. Abibi A., Protozanova E., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D. Specific versus nonspecific binding of cationic PNAs to duplex DNA. // Biophysical J. 2004. - V. 86. - P. 3070-3078.

48. Brandt O., Hoheisel J.D. Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors. // Trends in Biotechnology. 2004. - V. 22, N 12. - P. 617-622.

49. Ohtsuki Т., Kumano C., Manabe Т., Kitamatsu M., Sisido M. RNA isolation using immobilized PNA. //Nucleic Acids Symp. Ser. 2005. -N 49. - P. 263-264.

50. Oram H., Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O., Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. //Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 5332-5336.

51. Igloi G.L. Variability in the stability of DNA-peptide nucleic acid (PNA) single-based mismatched duplexes: real-time hybridization during affinity electrophoresis in PNA containing gel. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 8562-8567.

52. Cetojevic-Simin D., Jakimov D., Mrdanovic J., Bogdanovic V., Kojic V., Andrijevic L., Bogdanovic G. Peptide nucleic acid sequence specific recognition in cancer diagnostics and gene therapy. // Archive of Oncology. - 2001. - V. 9, N 1. - P. 33-37.

53. Stender H., Fiandaca M., Hyldig-Nielsen J.J., Coull J. PNA for rapid microbiology. // J. of Microbiol. Methods. 2002. - V. 48. - P. 1-17.

54. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L., Nordyren S., Svanvik N., Westman G., Kubista M., Sjoback R., Sehlstedt U. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes. // Mol. and Cell. Probes. 2000. - V. 14. - P. 321-328.

55. Svanvik N., Westman G., Wang D., Kubista M. Light-up probes: tiazole orange-conjugatide peptide nucleic acid for detection of target nucleic acid in homogeneous solution. // Analyt. Biochemistry. 2000. - V. 281. - P. 26-35.

56. Leijon M., Mousavi-Jazi M., Kubista M. LightUp probes in clinical diagnostics. // Mol. Aspects of Medicine. 2006. - V. 27. - P. 160-175.

57. Kuhn H., Demidov V.V., Gildea B.D., Fiandaca M.J., Coull J.C., Frank-Kamenetskii M.D. Molecular beacons for double-stranded DNA. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001. -V. 11.-P. 265-270.

58. Seitz O. Solid-phase synthesis of doubly labeled peptide nucleic acids as probes for real-time detection of hybridization. // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 39. - P. 3249-3252.

59. Fiandaca M.J., Hyldig-Nielsen J.J., Gildae B.D., Coull J.M. Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis. // Genome Res. 2001. - V. 11. - P. 609-613.

60. Boll I., Kovbasyuk L., Kramer R., Oeser Т., Mokhir A. Zn2+ dependent DNA binders based on terminally modified peptide nucleic acids. // Bioorg. & Med. Chem. Lett. 2006. - V. 16. -P. 2781-2785.

61. Paulasova P., Pellestor F. The peptide nucleic acids (PNAs): a new generation of probes for genetic and cytogenetic analyses. // Ann. de G6netique. 2004. - V. 47. - P.349-358.

62. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs): introduction to a new class of probes for chromosomal investigation. // Chromosoma. 2004. - V. 112. - P. 375-380.

63. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs), powerful tools for molecular genetics and cytogenetics. // Eur. J. of Human Genetics. 2004. - V. 12. - P. 694-700.

64. Xi C., Balberg M., Boppart S.A., Raskin L. Use of DNA and peptide nucleic acid molecular beacons for detection and quantification of rRNA in solution and in whole cells. // Appl. and Environmental Microbiol. 2003. - V. 69, N 9. - P. 5673-5678.

65. Jensen K.K., Orum H., Nielsen P.E., Norden B. Kinetics for hybridization of peptide nucleic acids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique. // Biochemistry. -1997.-V. 36.-P. 5072-5077.

66. Park S., Song J.B., Kim S. H., Oh S., Hong I., Suh J. DNA hybridisation by Peptide Nucleic Acids attached to controlled pore glass. // Bull. Korean Chem. Soc. 2002. - V. 23, N 9. - P. 1337-1339.

67. Ross P.L., Lee K., Belgrader P. Discrimination of single-nucleotide polymorphisms in human DNA using peptide-nucleic acid probes detected by MALDI-TOF mass spectrometry. // Analyt. Chem. 1997. - V. 69. - P. 4197-4202.

68. Steichen M., Decrem. Y., Godfroid E., Buess-Herman C. Electrochemical DNA hybridization detection using peptide nucleic acids and Ru(NH3)6.3+ on gold electrodes. // Biosensor and Bioelectronics. 2007. - V. 22. - P. 2237-2243.

69. Demidov V.V. PD-loop technology: PNA openers at work. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. -V. 1, N. 3. - P. 343-351.

70. Nielsen P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics and molecular biology. // Curr. Opinion in Biotechnology. 2001. - V. 12. - P. 16-20.

71. Demidov V.V., Kuhn H., Lavrentieva-Smolina I.V., Frank-Kamenetskii M.D. Peptide nucleic acid-assisted topological labeling of duplex DNA. // Methods. 2001. - V. 23. - P.123-131.

72. Autumn School of the LCPPM. // Molecular interactions on a micro- and nanometer scale. // Laboratoire de chimic physique des polymeres et membranes. // September 16-20. 2002.

73. Richard J.P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure В., Gait M.J., Chernomordik L.V., Lableu B. Cell-penetrating peptides. A revolution of the mechanism of cellular uptake. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 585-590.

74. Li X., Zhang Liangren, Lu J., Chen Y., Min J. Zhang Lihe. Signal peptide mimics conjugated to peptide nucleic acid: a promising solution for improving cell membrane permeability. // Bioconjugate Chem. 2003. - V. 14. - P. 153-157.

75. Falkiewicz В., Kolodziejczyk A.S., Liberek В., Wisniewski K. Synthesis of achiral and chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron Lett. -2001.-V. 57.-P. 7909-7917

76. Puschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) with a functional backbone. // Tetrahedron Lett. 1998. - V. 39. - P. 4707-4710.

77. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A., Marchelli R. DNA binding of a D-lysine-based chiral PNA: direction control and mismatch recognition. // Eur. J. Org. Chem. 2000. -P. 2905-2913.

78. Falkiewicz В., Kowalska K., Kolodziejczyk A.S., Wisniewski K., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers by simplified reductive amination method. // Nucleosides & Nucleotides. 1999. - V. 18, N 3. - P. 353-361.

79. Kosynkina L., Wang W., Chyau Liang T. A convenient synthesis of chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers. // Tetrahedron Lett. 1994. - V. 35. - P. 5173-5176.

80. Friedrich-Bochnitschek S., Waldmann H., Kunz H. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glicipeptides. // J. Org. Chem. 1989. - V. 54. - P. 751-756.

81. Mitsunobu 0. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products. // Synthesis. 1981. - N 1. - P. 1-29.

82. Гершкович А.А., Кибирев B.K. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова Думка, 1992.-360 с.

83. Lane C.F. Reduction of organic compounds with diborane. // Chem. Rev. 1975. - V. 76, N 6. - P. 773-797.

84. Stanfield C.F., Parker J.E., Kanellis P. Synthesis of protected amino alcohols: a comparative study. // J. Org. Chem. 1981. - V. 46. - P. 4799-4800.

85. Bland J.M. Synthesis of (R)-(+)-Boc-Iturinic acid (п-Сн) from aspartic acid. // Synth. Commun. 1995. - V. 25, N 4. - P. 467-477.

86. Vearing C.J., Fecondo J.V. A rapid coupling protocol for the synthesis of peptide nucleic acids. // Lett. Pept. Sci. 2002. - V. 9. - P. 211-219.

87. Sarin V.K., Kent S.B., Tarn J.P., Merrifield R.B. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction. // Analyt. Biochemistry. 1981. - V. 117. - P. 147-157.

88. Han S., Kim Y. Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis.// Tetrahedron. 2004. - V. 60. - P. 2447-2467.

89. Stewart J.M., Young J.D. Solid Phase Peptide Synthesis. // Second Edition. Pierce Chemical Company. Rockford Illinois, 1984. 161 p.

90. Tam J.P., Heath W.F., Merrifield R.B. Mechanism for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethansulfonic acid-trifluoroacetic acid-dimethyl sulfide. // J. Am. Chem. Soc. 1986. - V. 108. - P. 5242-5251.

91. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. // Москва: Наука, 1981. 288 с.

92. Stephenson R.C., Clarke S. Succinimide formation from aspartyl and asparaginyl peptides as a model for the spontaneous degradation of proteins. // J. of Biological Chemistry. 1989. -V. 264,N 11. -P. 6164-6170.

93. Benoiton, N. L. Chemistry of peptide synthesis. // CRC Press, 2005. 290 p.

94. Tam J.P., Riemen M.W., Merrifield R.B. Mechanisms of aspartimide formation: the effects of protecting groups, acid, base, temperature and time. // Pept. Res. 1988. - V. 1, N 1. - P. 618.

95. Blake J. Use of cyclopentyl ester protection for aspartic acid to reduce base catalyzed succinimide formation in solid-phase peptide synthesis. // Int. J. Pept. Protein Res. 1979. -V. 13,N4.-P.418-425.

96. Puglisi J.D., Tinoco I.J. Absorbance melting curves of RNA. // Methods in Enzymology. -1989.-V. 180.-P. 305-325.

97. Донос P., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // Москва: «Мир», 1991.-556 с.

98. Vargas-Baca I., Mitra D., Zulyniak H.J., Baneijee J., Sleiman H.F. Solid-phase synthesis of transition metal linked, branched oligonucleotides. // Agnew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 40, N24.-P. 4629-4632.

99. Torreri P., Ceccarini M., Macioce P., Petrucci T.C. Biomolecular interactions by surface plasmon resonance technology. // Ann. I-st Super Sanita. 2005. - V. 41, N 4. - P. 437-441.

100. Пасынский А.Г. Коллоидная химия. // Москва: Высшая школа, 1959. 265 с.