Скрининг микромицетов, продуцирующих соединения гиполипидемического, антибактериального и антиоксидантного действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Пужевская, Татьяна Олеговна

• Пужевская, Татьяна Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пужевская, Татьяна Олеговна

Введение

ОГЛАВЛЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. МИКРОМИЦЕТЫ - ПРОДУЦЕНТЫ

ЦИКЛОДЕПСИПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

1.1. Химические свойства циклодепсипептидов.

1.2. Биологические свойства циклодепсипепттидов.

1.3. Фармакологическая активность циклодепсипептидов.

ГЛАВА 2. АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ 31 СОЕДИНЕНИЙ.

2.1. Перекисное окисление липидов и свободные радикалы.

2.2. Атеросклероз как свободнорадикальная патология.

ГЛАВА 3. БИОПЛЁНКА - ВЫСОКОРГНАНИЗОВАННОЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО

МИКРООРГАНИЗМОВ.

ЧАСТЬ И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Материалы и методы, используемые для культвирования микроорганизмов.

1.2. Методы химического выделения антибиотических комплексов из биомассы продуцентов.

1.3. Оценка антимикробной активности антибиотических комплексов и их отдельных фракций.

1.4. Определение антиоксидантной активности.

1.5. Метод оценки образования биоплёнок.

ГЛАВА 2. ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИССЛЕДУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТОВ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НАТИВНЫХ РАСТВОРОВ И АЦЕТОНОВЫХ ЭКСТРАКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ

КУЛЬТУР.

3.1. Изучение антибиотических свойств нативного раствора и ацетонового экстракта микромицета L. lecanii №169.

3.2. Изучение антибиотических свойств нативного раствора и экстрактов из мицелия, выделенных из культур рода

Beauveria.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МИЦЕЛИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ КУЛЬТУР.

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ АКТИВНЫХ ФРАКЦИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ОТОБРАННЫХ ПРЕПАРАТОВ.

6.1. Химическое выделения активных фракций из биомассы продуцентов.

6.2. Изучение физико-химических свойств микромицета L. lecanii №169.

6.3 Изучение физико-химических свойств экстрактов, выделенных из культур рода Beauveria.

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЁНКИ ШТАММАМОМ Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853.

ГЛАВА 8. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗУЧАЕМЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ДЛЯ БИОСИНТЕЗА ЦИКЛОДЕПСИПЕПТИДОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Скрининг микромицетов, продуцирующих соединения гиполипидемического, антибактериального и антиоксидантного действия»

Актуальность темы. В настоящее время во всем мире уделяется большое внимание скринингу фармакологически активных соединений, перспективных для лечения хронических воспалительных заболеваний, к которым относят атеросклероз, ревматический артрит и другие болезни. Атеросклероз обусловливает примерно половину всех смертных случаев и около 1/3 летальных исходов у лиц в возрасте 35-65 лет (Ройтберг Г. Е., 2007). Развитие атеросклероза сопровождается выраженной гиперлипидемией. В настоящее время группа статинов является наиболее изученной и применяемой для лечения гиперлипидемий и атеросклероза. Результаты контролируемых клинических исследований с использованием статинов свидетельствуют, что эти лекарственные средства оказывают гиполипидемическое действие, снижают сердечно-сосудистую и общую смертность, улучшают качество жизни и прогноз больных ИБС и атеросклерозом (Дейвид Дж., 2000). Несмотря на то, что при любом исходном уровне холестерина статины приводят к его снижению, важно отметить и тот факт, что для них характерен не только гиполипидемический, но и ряд серьезных побочных эффектов, включая противоопухолевый и иммуносупресивный (Muroi М., 1994).

Поиск и создание новых препаратов с гиполипидемической активностью представляют большой интерес для клиники и рассматривается в настоящее время в качестве одной из важнейших задач здравоохранения. В связи с тем, что атеросклероз развивается как сложное заболевание, связанное с нарушением многих функций метаболизма, предполагается, что для его терапии могут представлять интерес лекарственные средства с комплексным лечебным эффектом. Широко исследуется влияние антиоксидантов на стабилизацию клинических проявлений атеросклероза и гиперлипедемии (Панкин В.З., 2004; Kataoka С., 2004; Lusis A.J., 2004).

Поэтому актуальным является скрининг природных соединений 5 комплексного действия, нормализующих уровень липидов в организме и снижающих образование высокореактивных свободных радикалов кислорода.

В последнее время к факторам риска развития атеросклероза причисляют инфекционные болезни (Ramos Р., 1998; Lee А.С., 2002; Kuo Ch.Ch., 2008). Большинство возбудителей инфекционных заболеваний способны образовывать биопленки - ассоциации микроорганизмов с высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам и к воздействию защитных иммунных механизмов макроорганизма (Costerton J.W., 1999; Lewis К., 2001). В составе поверхностной оболочки биопленок выявлено наличие полисахаридов, внеклеточной ДНК и липидов. Показано, что обработка ДНКазой разрушала сформированные биопленки или приводила к уменьшению ее массы в момент образования (Тец Г.В., 2007; Мошкевич И.Р., 2007). Поэтому представляет интерес изучение воздействия различных гиполипидемических соединений на формирование микробных биопленок.

Таким образом, поиск новых соединений комплексного действия, проявляющих гиполипидемические, антибактериальные и антиоксидантные свойства, а также способных ингибировать образование микробных биоплёнок является актуальным микробиологическим направлением современной биотехнологии. Такие соединения перспективны для разработки лекарственных препаратов, используемых в терапии заболеваний как инфекционной, так и патофизиологической природы.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в отборе штаммов микромицетов, продуцирующих соединения с сочетанной гиполипидемической, антибактериальной и антиоксидантной активностью, выделение активных субстанций, изучение их физико-химических свойств и биологической активности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Отобрать штаммы-продуценты с сочетанной гиполипидемической, антибактериальной и антиоксидантной активностью и изучить их морфологические свойства.

2. Наработать комплексные препараты, продуцируемые микромицетами №161, №162, №164, №7 и №169.

3. Разработать схемы выделения фракций и оценить их биологические свойства.

4. Изучить антибактериальную активность комплексных гиполипидемических препаратов и их отдельных фракций.

5. Определить антиоксидантную активность комплексных гиполипидемических соединений и их отдельных фракций.

6. Оценить ингибирующую активность природных гиполипидемических соединений на уровень образования биопленки штаммом Pseudomonas aeruginosa.

7. Наработать чистые фракции препаратов и изучить их биологические свойства

8. Изучить физико-химические свойства и установить структуру выделенных соединений.

Научная новизна результатов.

Отобраны и охарактеризованы продуценты биологически активных соединений, сочетающих антибактериальную, гиполипидемическую и антиоксидантную активности.

Разработаны методы выделения и наработаны природные гиполипидемические соединения из культур микромицетов Beauveria sp. №161, Beauveria bassiana №162, Beauveria sp. №164, Beauveria felina № 7 и Lecanicilium lecanii № 169.

Впервые выявлена антиоксидантная способность природных гиполипидемических соединений, продуцируемых культурами рода Beauveria и микромицетом L. lecanii №169.

Впервые показана способность природных гиполипидемических соединений ингибировать формирование биоплёнок у P. aeruginosa АТСС 27853 и усиливать антимикробное действие гентамицина.

Впервые определено, что культура L. lecanii №169 является продуцентом комплекса депсипептидов (баверилидов и бавериолидов), а копрофильный гриб В. felina № 7 - продуцентом деструксина В и псевдодеструксина С.

Научно-практическая значимость работы.

В результате исследований охарактеризованы микромицеты Beauveria sp. №161, В. bassiana №162, Beauveria sp. №164, В. felina № 7 и L. lecanii №169, являющиеся продуцентами соединений с сочетанной гиполипидемической, антибактериальной и антиоксидантной активностью. Выделены биологически активные соединения, относящиеся к классу циклодепсипептидов, изучены их физико-химические свойства. Показано, что выделенные соединения обладают широким спектром биологического действия и перспективны для создания препаратов с различной фармакологической активностью.

Положения, выносимые на защиту:

1. Отобранные штаммы микромицетов Beauveria bassiana №162, Beauveria felina №7 и Lecanicilium lecanii №169 продуцируют вещества с гиполипидемической, антимикробной и антиоксидантной активностью.

2. Установлены структуры соединений, определяющих гиполипидемическую, антимикробную и антиоксидантную активности: 8

• Beauveria bassiana №162 — продуцент баверицина

• Beauveria felina №7 — продуцент деструксинов

• Lecanicilium lecanii №169 - продуцент баверилидов и бавериолидов.

3. Деструксин В и псевдодеструксин С активно ингибируют формирование биоплёнок у Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и усиливает антибиотическую активность гентамицина в отношении биоплёнок и планктонной культуры.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на IV Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 12-16 марта 2007); на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 28-30 марта 2007 года); на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 11-12 ноября 2008); на V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2-4 декабря 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемом ВАК журнале.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 140 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственного исследования, приложения, выводов, списка литературы, включающего 150 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 37 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Пужевская, Татьяна Олеговна

ВЫВОДЫ:

1. Установлено таксономическое положение штаммов-продуцентов: Beauveria sp. №161, Beauveria bassiana №162, Beauveria sp. №164, Beauveria felina №7 и Lecanicilium lecanii №169.

2. Изучена антимикробная активность комплексных гиполипидемических препаратов в отношении широкого спектра микроорганизмов. Препарат №169 проявил умеренную активностью в отношении всех исследуемых тест-культур. Установлена высокая антимикробная активность препарата №7. Комплексные препараты №№161, 162, 164 обладали близкой активностью.

3. Выявлена антиоксидантная активность комплексных гиполипидемических соединений и их отдельных фракций.

4. Впервые показано, что культура L. lecanii № 169 является продуцентом комплекса депсипептидов (баверилидов и бавериолидов), а копрофильный гриб В. felina № 7 — комплекса деструксинов, мажорными компонентами которого определены деструксин В и псевдодеструксин С.

5. Установлена способность деструксина В и псевдодеструксина С (В. felina №7), а также комплекса баверилидов и бавериолидов (L. lecanii №169) предотвращать начальные стадии атеросклеротических изменений аорты, вызванных ингибитором NO-синтетазы L-NAME. Наибольшей активностью в опытах in vivo обладал псевдодеструксин С.

6. Впервые показана способность природных гиполипидемических соединений ингибировать формирование биоплёнок у Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и усиливать антимикробное действие гентамицина как в отношении планктонной культуры, так и биоплёнок. Наибольшей активностью обладал псевдодеструксин С (В. felina №7).

7. Установлено, что биологическая активность микромицета В. bassiana №162 обусловлена активным соединением — баверицином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящее время во всем мире уделяется большое внимание скринингу фармакологически активных соединений, перспективных для лечения хронических воспалительных заболеваний. К таким процессам все больше относят атеросклероз, ИБС, ревматический артрит и другие болезни. При развитии атеросклероза наблюдается отложение холестерина в субинтимальное пространство артериальной стенки. При свободнорадикальном окислении происходит модификация структуры ЛПНП, вследствии чего они приобретают большую атерогенность и усиленно захватываются макрофагами стенки сосудов (Ланкин В.З., 2004). Атеросклероз развивается как сложное заболевание, связанное с нарушением многих функций метаболизма, предполагается, что для его терапии могут представлять интерес лекарственные средства с комплексным лечебным эффектом. В связи с этим целью проведенного исследования была разработка новых соединений комплексного действия, проявляющих гиполипидемические, антибактериальные и антиокидантные свойства.

Все исследуемые в данной работе культуры ранее были отобраны как продуценты гиполипидемических соединений в лаборатории по изысканию продуцентов новых антибиотиков ФГУП ГНЦА. Установлено, что экстракты из мицелия отобранных культур снижали в крови кроликов уровень общего холестерина, триглицеридов, ЛПНП и повышали уровень ЛПВП. Изучаемые образцы проявляли активность в дозах в 10-100 раз более низких, чем ловастатин, взятый в качестве контроля в стандартной терапевтической дозе (Чмель Я.В., 2004).

Исследования были начаты с таксономического определения изучаемых штаммов-продуцентов №№161, 162, 164, 7 и 169. Данная часть работы проводилась совместно с Александровой А.В.

При изучении макроморфологических признаков продуцента №169, было установлено, что этот микромицет на солодовом агаре образует белую, опушенную, ватообразную колонию с приподнятым центром.

При изучении конидиогененной структуры методом сканирующей микроскопии было установлено наличие типичных разветвленных конидиеносцев с фиалидами. На концах фиалид находились склеенные в капельках конидии. Хламидиоспор не наблюдали. Исходя из полученных результатов, данная культура идентифицирована как Lecanicilium lecanii №169.

При изучении макроморфологических признаков и микроскопировании остальных 4 культур была установлена их принадлежность к роду Beauveria. У штамма №162 при микроскопировании были обнаружены округлые споры с характерным выростом, на основании чего этот штамм был определён как Beauveria bassiana №162. Подобные споры у штаммов №№161 и 164 не обнаружены, в связи с чем определить видовую принадлежность данных штаммов не удалось и в работе они были обозначены как Beauveria sp. №№161 и 164.

Штамм микромицета № 7 резко отличался от других использованных в работе штаммов рода Beauveria характером роста на различных питательных средах. На довольно бедном, бесцветном, паутинообразном мицелии стелющемся по субстрату, образуются плотные, тонкие, неветвящиеся, белые коремии, что позволило определить таксономическую принадлежность этого штамма как Beauveria felina №7.

На следующем этапе исследования был определен спектр антибиотического действия каждого из изучаемых комплексных препаратов, выделенных из мицелия исследуемых культур. Комплексный препарат из мицелия микромицета L. lecanii №169 проявлял умеренную активность в отношении всех исследуемых тест-культур: A. niger 137 а, С. albicans АТСС 885-653, S. aureus АТСС 29213, В. subtilis АТСС 6633, R.

111

Rhodochrous 451, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 9027 Mycobacterium sp.3207 и Nocardia sp.714.

Экстракты из мицелия культур рода Beauveria №№161, 162 и 164 обладали высокой активностью в отношении тест-культуры R. rhodochrous 451, в меньшей степени были активны относительно В. subtillis АТСС 6633 Наибольшей активностью в отношении исследуемых тест-микроорганизмов обладал продуцент В. felina №7, проявляя активность в отношении A. niger 137 а, С. albicans АТСС 885-653, R. rhodochrous 451, P. aeruginosa АТСС 9027 и В.subtillis АТСС 6633.

Комплексный препарат L. lecanii №169, исследовали методом ТСХ в системе растворителей: петролейный эфир:ацетон (1,5:1) на пластинах Silufol 254 UV. Было обнаружено наличие большого количества компонентов в экстракте этого препарата: фракция 9 (жирных кислот), фракция 8 (сходная по хроматографической подвижности (Rf) с витамином Д), фракция 7 («голубой флюоресцирующий компонент»), фракция 6 (эргостерол), фракции, обозначенные нами 1, 2, 4 и 5. При проявлении хроматограммы парами йода была обнаружена фракция 3.

Для определения фракций, определяющих антибиотическую активность комплексных препаратов использовали метод биопроявления пластинок.

Установлена способность подавлять рост тест-организмов для фракции

3, 5 и 7 препарата №169. Фракция 3 подавляла рост Mycobacterium sp. 3207, фракция 5 подавляла рост тест-организмов R. rhodochrous 451, Mycobacterium sp. 3207 и Nocardia sp.714, фракция 7 способна подавлять рост тестгорганизмов R. rhodochrous 451 и Mycobacterium sp. 3207. Фракция

4, идентифицированная в дальнейшем как комплекс циклодепсипептидов, не обладала антибиотической активностью.

При хроматографическом исследовании методом ТСХ комплексных препаратов, выделенных из мицелия культур рода Beauveria, было

112 установлено, что все экстракты содержат компоненты с близкой подвижностью в системе петролейный эфир: ацетон (1,5:1) на пластинах Silufol 254 UV. При этом нижние компоненты продуцентов №№161, 162 и 164, определяющие антибиотическую активность, окрасились в желтоватый цвет на фиолетовом фоне (Rf=0,36). Нижний компонент В. felina №7 на хроматограмме окрасился в светло-серый цвет, что свидетельствовало о различии компонентного состава данного штамма и других продуцентов рода Beauveria.

Таким образом, нами было установлено, что штаммы №№161, 162 и 164 продуцируют близкие соединения как по антибиотической активности комплексных препаратов, так и по подвижности и активности отдельных фракции, что свидетельствовало о химической близости продуцируемых структур. Исходя из полученных результатов, выделение БАВ и дальнейшие исследования были продолжены со штаммом №162.

Методом биопроявления пластинок было установлено, что фракция комплекса №162 (Rf=0,36) проявила слабую активность в отношении С. albicans АТСС 885-653 и высокую активность в отношении бактериальных тест-культур R. rhodochrous 451 и Nocardia sp.714, что соответствует литературным данным.

Высокая антибиотическая активность штамма Beauveria felina № 7 определялась серым пятном с Rf = 0,35. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на выделение и изучение этой активной фракции.

Важной характеристикой гиполипидемических соединений является оценка их антиоксидантных свойств. Изучение антиоксидантных свойств суммарных препаратов и отдельных фракций осуществляли двумя методами. Ацетоновые экстракты изучаемых препаратов №№161, 162, 164, 7 и 169. были исследованы методом разработанным Nishimiki et al для соединений, проявляющих АОА в гидрофильных условиях (Nishikimi М.,1972). Метод

113 основан на восстановлении нитросинего тетразолия в присутствии НАДН, активированного феназинметосульфатом. Из исследуемых комплексных препаратов ингибирующий эффект по способности подавлять образование супероксид аниона наблюдался только у препарата №169 в дозе 400 мкг/мл.

Реакцию подавления перекисного окисления липидов оценивали модифицированным нами методом, основанным на образовании малонового диальдегида при окислении субстрата (льняное масло) в присутствии инициаторов Ре2+/Аскорбат (по реакции Фентона). Анализ накопления продуктов ПОЛ проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Клебанов Г.И., 1988; Schuh J., 1978).

Были отобраны комплексные препараты и отдельные фракции, проявляющие выраженную антиоксидантную активность. Этими свойствами отличались препараты, продуцируемые микромицетами L. lecanii №\69 и В. bassiana №162. Показано, что АОА комплексного препарата №169 в дозе 25 мкг/мл составляла 30%, а АОА комплекса №162 в той же концентрации составляла 46%.

Из комплексных препаратов №169 и №162 были получены чистые фракции, отобранные по хроматографической подвижности. Разделение комплекса №169 позволило отобрать фракцию жирных кислот с АОА 68%; фракцию, сходную по хроматографической подвижности с витамином Д с АОА 70%; фракции 1 и 2, АОА которых составляла 47% и 95% соответственно. Фракция комплесного препарата №162 (баверицин) в концентрации 100 мкг/мл подавляла перекисное окисление липидов на 90%. Контрольный препарат а — токоферол проявлял аналогичную активность в концентрации 500 мкг/мл.

Таким образом, при изучении антиоксидантной активности комплексного гиполипидемического препарата №169 выявлена способность подавлять как образование липидных пероксидов, так и супероксидных анионов. Показано, что АОА комплексного препарата №169 в дозе 25 мкг/мл

114 составляет 30%. При изучении комплексного препарата №169 по способности подавлять образование супероксид аниона, ингибирующий эффект наблюдался только в дозе 400 мкг/мл. Это дает основание предполагать, что фракции препарата №169, отвечающие за АО А, обладают гидрофобными свойствами.

В результате проведенных исследований было установлено, что культуры Beauveria sp. №161, В. bassiana №162, Beauveria sp. №164, В. felina № 7 и L. lecanii №169 продуцируют соединения как с гиполипидемическим, так и антиоксидантным действием.

При проведении дальнейших исследовании были наработаны чистые препараты активных фракций, изучены их физико-химические свойства и проведено определение структуры.

Наиболее выраженные гиполипидемические свойства среди исследованных культур были обнаружены у штамма №169. Комплексный препарат №169 в дозе 100 раз более низкой, чем субстанция ловастатина, проявлял выраженный гиполипидемический эффект на кроликах (Чмель Я.В., 2004). При определении антиоксидантной активности некоторых фракций препарата №169 в опытах in vitro была также выявлена их высокая способность подавлять образование липидных пероксидов. В ходе дальнейших исследований выбор необходимых фракций был проведен по их влиянию на изменение общего содержания активных форм кислорода и способности востанавливать активность липоксигеназ в опытах in vivo. Эта часть работа была проведена совместно с Корыстовым Ю.Н. По этому признаку была отобрана фракция 1, которая в дальнейшем была разделена методом ВЭЖХ на 4 составляющих, наиболее активной из которых оказалась 3. Данные УФ спектра свидетельствовали о наличии пептидных структур в этой составляющей. Структуры этих депсипептидов были определены нами с использованием современных методов расшифровки спектров, полученных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией, соединенной с

115 тандемной масс-спектрометрией и ионизацией в электроспрее (LC-ESIMS/MS) (Sabareesh V., 2007).

По полученным данным установлено соответствие спектров исследуемых веществ десяти известным циклическим депсипептидам: баувериолиду I, бавериолиду VI и баверолидам F, М, Р, R, Q, С, Е, L.

Бавериолиды — 13-членные циклодепсипептиды, состоящие из одной З-гидрокси-4-метил жирной кислоты, двух L-аминокислот и одной D-аминокислоты. По литературным данным именно бавериолид I оказался наиболее сильным ингибитором формирования липидных частиц в мышиные макрофагах (Matsuda D., 2004). В работах Егорова А. с соавт. (группа исследователей из Чехии, Германии и Австрии) показано, что именно присутствие остатков L-фенилаланина и О-лейцина/О-изолейцина в молекуле необходимо для проявления ингибирующей активности (Jegorov

A., 2004). Баверолиды - липофильное нейтральный тетрадепсипептиды, содержащее линейные или ветвистые С9-или СП—остатки оксикислоты (Jegorov А., 2004). Установлено, что все идентифицированные баверолиды содержат остатки аманокислот, необходимые для активации механизма подавления формирования липидных частиц (Matsuda D., 2004). Поэтому наличие бавериолида I и идентифицированных баверолидов в комплексе депсипептидов, выделенных из хлороформенного экстракта L. lecanii №169 является подтверждением того, что данную культуру можно рассматривать как продуцент перспективных гиполипидемических соединений.

Определены активные начала культур В. bassiana №162 и В. felina №7 и

B. bassiana №162. Первичную очистку препарата, полученного из микромицета №162, проводили хроматографически на колонке Kiselgel. Полученные фракции анализировали биологическим путем, тестируя на микроорганизмы Nocardia sp. 714 и R. rhodochrous 451. Активные фракции объединяли, упаривали и растворяли в бензоле. Бензольный раствор упаривали досуха и осаждали гексаном. Выход препарата после очистки

116 сырца составлял 25%. В дальнейшем была проведена очистка на препаративном ВЭЖХ полученного комплексного препарата из экстракта мицелия культуры №162 и выделение из комплексного препарата биологически-активного соединения с дальнейшим определением его структуры. Установлено, что основным активным соединением очищенной фракции №162 является классический баверицин, являющийся по литературным данным высокоактивным ингибитором АХАТ, фермента который катализирует внутриклеточную этерификацию холестерина (Klaric М. S., 2005). Однако баверицин является не только высокоактивным ингибитором АХАТ, но и перспективным противоопухолевым препаратом. В 2007 г. появилось сообщение о способности баверицина ингибировать ангиогенез опухолевых клеток и проявлять высокую активность в отношении клеточной линии рака груди (MDA-MB-231)h простаты (РС-ЗМ) (Zhan J., 2007).

На колонке с кизельгелем проводили первичную очистку препарата, полученного из В. felina №7 с выделением фракции №4-9, обладающей высокой антибактериальной активностью. Дальнейшее разделение и накопление чистых фракций комплексного препарата №7 проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме на хроматографе Gilson оснащенном УФ детектором и препаративной колонкой Zorbax С18.

Установлено, что копрофильный штамм В. felina №7 продуцирует комплекс деструксинов, из которых мажорными компонентами, доступными для выделения и очистки являются деструксин В (фракция 1) и псевдодеструксин С (фракция 3). На модели экспериментального атерогенеза у крыс установлено, что деструксин В и псевдодеструксин С проявляли высокую активность в предотвращении начальных стадий атеросклеротических изменений аорты, вызванных ингибитором NOсинтетазы. Данная часть рыботы проводилась с совместно с Корыстовым Ю.Н.

Впервые было показано, что копрофильный гриб Beauveria felina № 7 является продуцентом деструксина В и псевдодеструксина С. В литературе только в 2008 году был описан псевдодеструксин С, выделенный из В. felina, обитающей в море на водорослях Caulerpa sp. (Fotie J., 2008). Высокая биологическая активность деструксинов способствует поиску новых продуцентов и новых аналогов этих соединений разными лабораториями мира. По литературным данным, деструксины, выделенные из грибной культуры М. anisopliae, проявляют выраженный эффект на секрецию поверхностного антигена вируса в среду культивирования, что может быть использовано для создания новой вакцины против гепатита В (Chen Н.С.,1997; Hamel Е., 2002). К тому же следует отметить, что аналог выделенных нами антибиотиков, деструксин Е ингибировал накопление оксисленных липопротеидов низкой плотности в культуре клеток макрофагов J774 (Naganuma S., 1992).

В последнее время к факторам риска развития атеросклероза причисляютинфекционные болезни (Ramos Р., 1998; Lee А.С., 2002; Kuo Ch.Ch., 2008). Большинство возбудителей инфекционных заболеваний способны образовывать в организме человека биопленки, в которых микроорганизмы приобретают новые свойства: высокая устойчивость к воздействию иммунологических защитных механизмов организма, к действию антибактериальных препаратов (Costerton J.W., 1999; Lewis К., 2001). Именно с наличием возбудителей в составе биопленок связывают распространенность высокоустойчивых клинических изолятов, течение многих хронические воспалительные процессов (Hoiby N.,2000; Juhas М., 2005). Указанное определяет актуальность разработки новых подходов к лечению инфекционных заболеваний и поиска новых соединений, способных ингибировать образование микробных биопленок. В составе

118 биопленок было выявлено наличие полисахаридов, внеклеточной ДНК и липидов, входящих в состав поверхностной оболочки биопленки Показано, что обработка ДНКазой разрушает сформированные биопленки или приводит к уменьшению ее массы в момент образования (Тец Г.В., 2007; Мошкевич И.Р., 2007). Поэтому нами было изучено воздействие на формирование биопленок различных гиполипидемических соединений.

С целью поиска новых соединений, как воздействующих непосредственно на биоплёнки, так и усиливающие действие существующих антибактериальных препаратов, нами был освоен метод получения биопленок в планшетах (Ни J.-F., 2006). С использованием этого метода было показано, что исследуемые комплексные экстракты и их фракции, содержащие жирные кислоты, усиливали интенсивность образования биопленок, возможно, за счет использования этих веществ и/или их компонентов культурами в качестве питательного субстрата, что приводило к экранизации проявления ингибирующей активности отобранных фракций. При изучении чистых фракций препаратов было установлено, что некоторые из них способны ингибировать формирование биопленок штаммом Р. aeruginosa АТСС 27853.

Прежде всего, было установлено, что в условиях эксперимента контрольный препарат гентамицин способен незначительно ингибировать образование биопленок P. aeruginosa АТСС 27853: в концентрации 64 мкг/мл на 27-30%. Следует отметить, что МПК гентамицина для этой же планктонной культуры составла 2 мкг/мл.

Комплексные препараты и их фракции, содержащие жирные кислоты, усиливали интенсивность образования биоплёнок, возможно, за счёт использования этих веществ и/или их компонентов культурами в качестве питательного субстрата, что приводило к экранизации проявления ингибирующей активности отобранных фракций.

В этих же условиях фракции 2 препарата №169 в концентрации 9 мкг/мл снижала уровень образования биопленок тест-культурой на 10%.

Фракции 3 (псевдодеструксин С) и 1 (деструксин В) препарата №7 в концентрации 9 мкг/мл снижали уровень образования биопленок тест-культурой на 30% и 18% соответственно.

Установлен синергизм по ингибированию формирования биопленок тест-культурой гентамицина (64 мкг/мл) с отобранными фракциями (по 9 мкг/мл). Максимальное снижение формирования биопленок — на 47% наблюдалось при совместном воздействии гентамицина и фракции 3, выделенной из комплексного препарата В. felina №7.

Синергизм отобранных фракций и гентамицина наблюдался также в отношении планктонной культуры P. aeruginosa АТСС 27853. В этом случае жизнеспособность бактерий в присутствии препаратов и гентамицина оценивали по оптической плотности раствора после флуоресцентного окрашивания. Совместное применение фракций 1 или 3 (10 мкг/мл) и гентамицина (1 мкг/мл — субингибирующая концентрация) приводило почти к полному исчезновению числа жизнеспособных микробных клеток в планктонной культуре.

Следует подчеркнуть, что на модели образования активных форм кислорода аортой крыс, именно псевдодеструксин С проявлял наиболее выраженную активность в предотвращении начальных стадий атеросклеротических изменений аорты.

Таким образом, отобранные природные препараты ингибируют формирование биоплёнок у P. aeruginosa АТСС 27853 и усиливают антимикробное действие гентамицина в отношении как планктонной культуры, так и биопленок, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этих препаратов.

В связи с перспективностью отобранных соединений для создания фармакологических препаратов оптимизированы условтя биосинтеза

120 прдуцентов. Определены оптимальные физические условия для культивирования глубинных культур: №169 — 14 дней (на 3 дня колбы помещали на качалку при режиме 150 об/мин, а затем оставляли для наращивания биомассы в стоячих условиях) при температуре 24°С, №162 и №7 - рост в течение 14 суток при температуре 24°С на качалке при 150 об/мин.

Установлено, что введение в ферментационную среду источников мальтозы солода оказало отрицательное влияние на образование целевых продуктов, а добавление аминокислот в ферментационную среду (фенилаланин и а L-метионин) стимулировали биосинтез баверицина.

Таким образом, в результате проведенных исследований были выделены биологически активные соединения с гиполипидемической, антибактериальной и антиоксидантной активностью, способные ингибировать образование микробных биопленок. Установлено, что выделенные соединения относятся к классу циклодепсипептидов. Такие соединения перспективны при разработке лекарственных препаратов для терапии инфекционных болезней, атеросклероза и раковых заболеваний (Matsuda D., 2004; Klaric M.S., 2005; Zhan J., 2007).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пужевская, Татьяна Олеговна, 2010 год

1. Барабай В.А., Бездробная J1.K. Изменения прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза у крыс при введении 7,12-диметил-1,2-бензантрацена. Экспериментальная онкология. — 1992. - Т.14. — №1. — С.40-43.

2. Бибикова М.В., Чмелъ Я.В., Сриридонова И.А., Катлинский А.В. Влияние ловастатина на рост и образование эргостерола культурой Tolypocladium inflatum 106. Антибиотики и химиотерапия. — 2004. -№4. С. 3-6.

3. Бибикова М.В., Рыбакова A.M., Вострое С.Н. Изучение условий приготовления вегетативного посевного материала для биосинтеза циклоспорина. Успехи в области изучения и производства антибиотиков. Москва 1991. XX. - С. 27-33.

4. Бибикова М.В., Согонов М.В., Грамматикова Н.Э., Чмелъ Я.В., Тертое В.В. Образование регуляторов синтеза стеролов грибными культурами. Микология и фитопатология. 2003. - Т. 37 - (6). — С.83-86.

5. Верещагин Н.В., М. М. Танашян М.М., Т. Н. Федорова Т.Н., И. Н. Смирнова И.Н. Лечение ОНМК: состояние проблемы. Симпозиум НИИ неврологии РАМН. 2004. - С. 8-12.

6. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах.

7. Соросовкий образовательный журнал, том 6. 2000. - № 12.-е. 1319.

8. Государственная Фармакопея СССР, XI издание. Вып. 2. М.: «Внешторгиздательство». 1991. -398 с.

9. Дейвид Дж. Майрон, Сергио Фазио, МакРаэ Ф. Линтон. Современные перспективы применения статинов. Международный Медицинский Журнал. -2000. №6. - С. 167-169.

10. Ефименко Н.А., Гучев И.А., Сидоренко С.В. Инфекции в хирургии. Фармакотерапия и профилактика. Смоленск. 2000. — 296 с.

11. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. Москва. — 2001. -343 с.

12. Зотова КВ., Затейщиков Д. А., Сидоренко Б. А. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза. Кардиология. — 2003. — С. 24-32.

13. Клебанов Г.И., Бабенкова КВ., Теселкин Ю.О. Оценка антиокислительных свойств плазмы крови с применением желточных липопротеидов. Лабораторное дело. 1988. —3. — С. 59-62.

14. Климов А.Н., Никулъчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Санкт-Петербург. 1999. - С. 291-360.

15. Лабинская А.С., Блинкова Л.П. Ещина А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований.1. Медицина». 2004. - 576 с.

16. Ланкгш В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra. Кардиология. -2004,- 2. -С.72-81.

17. Мошкевич И.Р. Микробные биоплёнки при смешанных инфекциях: Автореф дисс канд мед наук. Санкт-Петербург. 2007.

18. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук JI.M. Практикум по микробиологии. Москва. «Академия». — 2005. — 608 с.

19. Никитин А.В. Влияние химико-терапевтических препаратов на иммунную систему. Антимикробная химиотерапия. — 2002. — С. 6769.

20. Овчинников Ю. А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембраноактивные комплексоны. Москва. — 1974. — 385 с.

21. Ос и с Ю.Г., Формазюк В.Е., Ланкин В.З. и др. Хемилюминесценция липопротеидов разных классов сыворотки крови человека. Вопросы медицинской химии. 1982. - 1. — С.122-126.

22. Ройтберг Г. Е., Струтынский А. В. Внутренние болезни. Сердечнососудистая система. «Бином-пресс». — 2002. — 855 с.

23. Семёнов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: «Агромпромиздат». — 1990. — 34 с.

24. Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в паталогии человека. ГНЦА. Инфекции в хирургии. Москва. 2004. - Т .2. - №3. - С. 1620.

25. Тец Г.В. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биоплёнок с антибиотиками: Автореф дисс канд мед наук. Санкт-Петербург. — 2007.

26. Тец Г.В., Артеменко K.JI. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии. Антибиотики и химиотерапия. — 2006.- 6.-С. 11-14.

27. Формазюк В.Е., Осис Ю.Г., Деее А.И. и др. Изменение белок-липидных взаимодействий при перекисном окислении липопротеидов сыворотки крови. Доклады АН СССР. 1982. - 2. С. 497-500.

28. Формазюк В.Е., Деее А.И., Владимиров Ю.А. Сывороточные липопротеиды человека в норме и патологии. Успехи биологической химии. -1985.-26.- С.218-245.

29. Чмелъ Я. В., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Тертое В.В., Катлинский А. В. Скрининг природных соединений с гиполипидемической активностью. Антибиотики и химиотерапия. Москва 2004. - Т. 49. - № 8-9. - С. 8-12.

30. Шемякин М.М., Хохлов А.С., Антонов В.К. Антибиотики-депсипептиды. Химия антибиотиков. — Т.2. — С. 1161-1172.

31. Шредер Э., Любке К. Пептиды. «Мир». 1969. 386 с.

32. Якубе Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки. — Москва. «Мир». 1985.-304с.

33. Akinobu Tsunoo, Masayuki Kamijo, Naoki Taketomo et al. Roseocardin, a Novel Cardiotonic Cyclodepsipeptide from Trichothecium roseum TT103.1. J.Antib.- 1997.-P. 12.

34. An Y. H., Dickinson R. В., Doyle R. J. Mechanisms of bacterial adhesion and pathogenesis of implant and tissue infections. 2000. — P. 1-27.

35. Aoyagi A., Yano Т., Kozuma S., Takatsu T. Pleofungins, novel inositol phosphorylceramide synthase inhibitors, from Phoma sp. SANK 13899. II. Structural elucidation. J Antibiot. 2007. - 60. - P. 136-42.

36. Ballard C.E., Yu H., Wang B. Recent development in depsipeptide research. Curr Med Chem. 2002. - 9. - P.471-98.

37. Baute R., Deffiewc G., Merlet D. et al. New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungus Isaria felina. I. Production, isolation and insecticidal properties of isariins В, С and D. J Antibiot. 1981. - 34. - P. 12611265.

38. Berliner J.A., Haberland M.E. The role of oxidized low-density lipoprotein in atherogenesis. Curr Opin Lipidol 1993; 4:373-381.49. Yla-Herttuala S. Is oxidized low-density lipoprotein present in vivo? Curr Opin Lipidol. -1998,- 9.- P.337-344.

39. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: the good, the bad and the ugly. Am J Physiol 1996; 271: 1424-1437.

40. Bjarnsholt T. A., Jensen P.A, Rasmussen T.B. Garlic which blocks the P. aeruginosa QS system, promotes rapid clearing of P. aeruginosa infections. J. Cyst. Fibros. 2005. - 4. S47. - P. 174.

41. Boros C., Smith C., Vasina Y. et al. Isolation and Identification of the Icosalides—Cyclic Peptolides with Selective Antibiotic and Cytotoxic Activities. J.Antib. 2006. - 59. - P. 486-489.

42. Breukink E., de Kruijff В. Lipid II as a target for antibiotics. Nat. Rev.

43. Drug Discov. 2006. - 5. - P.321-330.

44. Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: Implications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Ann Rev Biochem. 1983. — 52. — P.223-261.

45. Cai P., Smith D., Katz B. et al. DestruxinA4 chlorohydrin, a novel destruxin from fugus OS-F68576: isolation, structure determination, and biological activity as an inducer of erythropoietin. J. Nat. Prod. - 1998. -61,- P. 290-293.

46. Cald L. Cytotoxic effects of the mycotoxin beauvericin to human cell lines of myeloid origin. Pharmacological Research. 2004. — 49. - P. 73-77.

47. Cerantola V., Guillas I., Roubaty C. et al. Aureobasidin A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositolphosphorylceramides. Mol Microbiol. — 2009.— 71.— P. 1523-37.

48. Che Y., Swenson С, Gloer J. et al. .Pseudodestruxins A and B: new cyclic depsipeptides from the Coprophilous fungus Nigrosabulum globosum. J Nat.Prod. 2001. - 64. - P. 555-558.

49. Costerton J. W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial Biofilms: a Common Cause of Persistent Infections. Science. —1999. 284. - P. 1318-322.

50. Costerton J. W., Z. Lewandowski Z., Caldwell D. E. et al. Microbial biofilms. Annu. Rev.Microbial. 1995. - 49. -P. 711-745.

51. Davis D. Looking for Chinks in the Armor of Bacterial Biofilms. Monroe D PLoS Biology. 2007.- 11.- P. 1371.

52. Dangond D. K., Fernando Y.P. Histone deacetylase inhibitors for the treatment of multiple sclerosis, amyotrophic sclerosis and Alzheimer ' sdisease. 2002. - 7. - P. 345-352.

53. Delden C., Iglewski B. Cell.to.cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections. Emerg. Infect. Dis.- 1998. 4,- P. 551-560.

54. Dongwoo Shin, Yosup Rew, Dale Boger. Total synthesis and structure of the ramoplanin A1 and A3 aglycons: Two minor components of the ramoplanin complex. Proceeding of the N. A. S. 2004. — 101. — P. 11977-11979.

55. Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H., Jurgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Rad Biol Med.- 1992.- 13. P. 341-390.

56. Filloux A., Vallet I. Biofilm: set.up and organization of a bacterial community. Med.Sci. 2003. - 19. - P. 77-83.

57. Fong Q.H., Zhong J.J. Effect of initial pH on production of ganodermic acid and polysaccaharide by subnerged fermentation of Ganoderma lucidum. Process Biochem. 2007. - 37. - P. 769-779.

58. Fotie J., Morgan R. Depsipeptides from microorganisms: a new class of antimalarials. Mini Rev Med Chem. 2008. - 11,- P. 1088-94.

59. Fulco P, Wenzel R. Ramoplanin: a topical lipoglycodepsipeptide antibacterial agent. Expert Rev Anti Infect Ther. — 2006. — 4. — P. 93945.

60. Gibson R.L., Burns J., Ramsey B. Pathophysiology & management of pulmonary infections in CF. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003. -168.- P. 918-951.

61. Gilbert P., J. Das E. and Foley I. Biofilms susceptibility to antimicrobials. Adv. Dent. Res. 1997.- 11.- P. 160-167.

62. Greenberg E.P. The Group behavior of pseudomonas: Learning to fightbacterial biofilm infections in the Genomic Era. Oral report and slide presentation. In: 14th North American cystic fibrosis conference. — 2000. -P. 9-12.

63. Gupta S., Roberts D., Renwick J. Insecticidal cyclodepsipeptides from Metarrhizium anisopliae. J Chem Soc Perkin Trans I . 1989. - P. 23472357.

64. Chen H.C., Chou C.K., Sun C.M. and Yeh S.F. Suppressive effects of destruxin В on hepatitis В virus surface antigene gene expression in human hepatoma cells. Antiviral Res. 1997. - 34. - P. 137-144.

65. Hamano K., Kinoshita M., Furuya K.et al. Leualacin, a novel calcium blocker from Hapsidospora irregularis I. Taxonomy, fermentation, isolation, phsico-chemical and biological properties. J. Antibiot. 1992. -45.- P. 899.

66. Hamel E., Covell D.Antimitotic Peptides and Depsipeptide. Cur. Med. Chem. Anti-Cancer Agents.- 2002.- 2,- P. 19-53.

67. Hatch R. A., Schiller N. L. Alginate lyase promotes diffusion of aminoglycosides through the extracellular polysaccharide of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 1998. — 42. P. 974-977.

68. Heike Brotz-Oesterhelt, Dieter Beyer, Hein-Peter Kroll et al. Dysregulation of bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med. 2005. - 11. - P. 1077-82.

69. Hih-Yung Tang, Yi-Wen Chen et al. Beauvericin activated Ca2+ activated СГ current and deaths in Xenopus oocytes via influx of extracellular Ca2+. Chem.Res.Toxicol. - 2002. - 15. - P. 854-860.

70. Hiltunen Т., Luoma L., Nikkari T. et. al. Circulation. 1995. - 92. - P.3297-3303.

71. Hoiby N. Prospects for the prevention and control of Pseudomonal infection in children with cystic fibrosis. Pediatr. Drugs. 2000. - 2 (6). -P. 451.

72. Ни J.-F., Gar о E., Goering G. Bacterial Biofilm Inhibitors from Diospyros dendo. J.Nat. Prod. 2006. - 69. - P. 118-120.

73. Huang, C.-T., G. James, W. G. Pitt, and P. S. Stewart. 1996. Effects of ultrasonic treatment on the efficacy of gentamicin against established Pseudomonas aeruginosa biofilms. Colloids Surfaces В Biointerfaces. — 1996.-6.-P. 235-242.

74. Isaka M., Palasarn S., Lapanun S., Sriklung K. Paecilodepsipeptide A, an antimalarial and antitumor Cyclohexadepsipeptide from the insect pathogenic fungus Paecilomyces cinnamomeus BCC 9616. J Nat Prod. -2007.-70.-P. 675-8.

75. Jegorov A., Sedmera P., Matha V. Beauverolides L and La from Beauveria tenella and Paecilomyces fumosoroseus. Phytochemystry. -1994.-37.-P. 1300-1303.

76. Jestoi M., Rokka M., Rizzo A. et al. Determination of Fusarium-mycotoxins beauvericin and enniatins with liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS). J.Liq. Chromatogr. and Technol. - 2005. - 28. -P. 369-381.

77. Johansen C., Falholt P., Gram L. Enzymatic removal and disinfection of bacterial biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 1997. - 63. - P. 3724-3728.

78. Joux F., Lebaron P. Use of fluorescent probes to assess physiological functions of bacteria at single-cell level. Microbes and Infection. 2000. — 2.-P. 1523-1535.

79. Juhas M., Eberl L., Tummler B. Quorum sensing: the power of cooperation in the world of Pseudomonas. Environ. Microbiol. — 2005. 7. -P. 459-471.

80. Kaida K., Fudou R., Kameyama T. et al. New cyclic depsipeptide antibiotics clavariopsins A and B, produced by an aquatic hyphomycetes Clavariopsis aquqtica. J.Antibiot. 2001. - 54. - P. 22-28.

81. Kataoka C., Egashira K, Ishibashi M. et al. Novel anti-inflammatory actions of amlodipine in a rat model of arteriosclerosis induced by long-term inhibition of nitric oxide synthesis. 2004. - 286. - P. 768-774.

82. Katoh M, Egashira K, Kataoka C.et al. Am Physiol Heart Circ Physiol. -2001. 280. - P.2306-2312.

83. Kirk P. M., Cannon P. F., Minter D. IV., Stalpers J. A. Ainsworth and Bisby's dictionary of the fungi, 10th ed. UK: CABI-Europe. 2008. - 784 P

84. Klaric M. S., Pepeljinjak S. Beauvericin. Chemical and biological aspects and occurrence Arh. Hig Rada Toxikol. 2005. - 56. - P. 343-345.

85. Kuo Ch.Ch., Grayston J.Т., Lee A. et al. Chlamydia pneumoniae lives in most artheriosclerotic lesions. — 2008. — 32. — P.47-51.

86. Lankin V. Z. Atherosclerosis as a free radical pathology. Excerpta Med Int Congr Ser. 1992. - 98. - P.385-388.

87. LanJdn V.Z. Free radical lipoperoxidation during atherosclerosis. Free Radic Biol Med. 1994. - 8. - 12-16.

88. LeBel C.P., Bondy S.C. Res. Toxicol. 1992. - 5. - P. 227-231.

89. Lee A. C. Moazed Т. C., Kuo Ch. Ch. In mouse models of atherosclerosis and

90. С.pneumoniae infection, macrophages mediate dissemination of C.pneumoniae to atheromas. J. Antibiot. 2002. - 49. - P.27-31.

91. Lee K. Petriellin A, a fungicidal 13-depsipeptide. J. Org. Chem. 1995. -60.-P. 5384-7.

92. Lewis K. Riddle of Biofilm Resistance Antimicrobial agents and Chemotherapy. 2001. - 4. - P. 999-1007.

93. Lira S.P., Vita-Marques A.M., Seleghim M.H. et al. New destruxins from the marine-derived fungus Beauveria felina. J. Antibiot. -2006. — 59. — P.553-563.

94. Lusis A. J., Fogelman A.M., Fonarow G.C. Genetic Basis of Atherosclerosis: Part II. Clinical Implications. Circulation. — 2004. 110.— P. 2066-2071.

95. Matsuda D., Namatame 1., Hiroshi Т., Kobayashi S., Omura S. New Beauveriolides Produced by Amino Acid supplemented fermentation of Beauveria sp. FO - 6979 . The Journal of antibiotics. - 2004. -1. - P. 1-9.

96. Matsuda D., Namatame /., Tomoda H. et al. New Beauveriolides Produced by Amino Acid-supplemented Fermentation of Beauveria sp. FO-6979. J. Antibiotics. 1999. - 57. - P. 1-9.

97. Michael Antolovich, Paul Prenzler. Methods for testing antioxidant activity. The Royal Society of Chemistry. 2002. - 127. - P. 183-198.

98. Mitsiades C.S., Ocio E.M., Pandiella A. et al. Aplidin, a marine organism — deraived compound with potent antimyeloma activity in vitro and in vivo. Cancer Res.-2008. -68.-P. 5216-25.

99. Moretty A., Logrieco A., Bottalico A. Beauvericin production by Fusarium subglutinans from different geographical areas . Mycological Res. 1995. - 99. — P.282-286.

100. Mugnai P. A chemotaxonomic evaluation of genus Beauveria. Merycol.

101. Res. 1989. - №92. - P. 199-209.

102. Muroi, M., Shiragami, N., Takatsuki, A. Destruxin B, a specific and readily reversible inhibitor of vacular-type H+ translocation ATPase. Biochem. Biophys. Res. Com. 1994. - 205. - P. 1555-1563.

103. Nagai K., Woo J. Destruxins, cyclodepsipeptides, block the formation of actin rings and prominent clear zones and ruffled borders in osteoclasts. Bone.-2003.-33. -P. 443-455.

104. Nagamima S., Kuzuya N., Sakai K., et al .Inhibition of the accumulation of lipid droplets in macrophage J774 by bafilomycin B1 and destruxin E. Biochim. Biophys. Acta. 1992. - P. 1126-41.

105. Nam at am e I., Tomoda H., Satoshi O. Antiatherogenic activity of fungal beauveriolides, inhibitors of lipid droplet accumulation in macrophages. J. Antib. 1996. - 49. - P. 73-77.

106. Neuzil J. Weber C., Kontush A. The role of vitamin E in atherogenesis: linking the chemical, biological and clinical aspects of the disease. Atherosclerosis. 2001. - Vol. 157. - P. 257-283.

107. Nishikimi M., Appaji N., Yagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun. 1972. - 46. - P. 849-54.

108. О'Toole, GA, Kaplan, HB, Kolter, R. Biofllm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 2000. -54. - P. 49-79.

109. Oh D.C., Kauffman C.A., Jensen P.R. Induced production of emericellamides A and В from the marine-derived fungus Emericella sp. in competing co-culture. J Nat Prod. — 2007. — P. 515—520.

110. Ohshiro Т., Rudel L., Omura S., Tomoda H. Selectivity of Microbial Acyl-CoA : cholesterol Acyltransferase Inhibitors toward Isozymes. The Journal of Antibiotics. 2007. - 60. - P. 43-51.

111. Pal S, St Leger R.J., Wu L.P. Fungal peptide Destruxin A plays a specific role in suppressing the innate immune response in Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 2007. - 282. - P. 8969-77.

112. Parthasarathy S. Beyond cholesterol. Modification of low density lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med. 1989. - 320. -P. 915-924.

113. Pedras M.S., Zaharia M.L., Ward D.E. The destruxins: synthesis, biosynthesis, biotransformation, and biological activity. Phytochemistry. — 2002.-59.-P. 579-96.

114. Peeters H., Zocher R., Kleinkauf H. Synthesis of beauvericin by a multifunctional enzyme. J Antibiot (Tokyo). 1988. - 41. - P.352-9.

115. Pocsfalvi G., Di Landa G., Ferranti P. Observation of non-covalent interactions between beauvericin and oligonucleotides using electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. — 1997. -11.-P. 265-72.

116. Pohanka A. Antifungal antibiotics from potential biocontrol microorganisms. Doctoral diss. Dept. of Chemistry, SLU. Acta Universitatis agriculturae Sueciae vol. — 2006. — P.47.

117. Potterat O., Wagner K., Haag H. Liquid chromatography-electrospray time-of-flight mass spectrometry for on-line accurate mass determination and identification of cyclodepsipeptides in a crude extract of the fungu

118. Metarrhizium anisopliae. J. Chromatography. — 2000. — 872. — P.85-90.

119. Ramos P., Ortega F., Diaz R. et al. Electron microscopy study about Chlamydia pneumoniae. 4th Intern Conf Macrolides, Azalides, Streptogramins and Ketolides. 1998. - 407. - P.41-44.

120. Robert M., Pharm D., Cosentino F., Ton J. Atherosclerosis and the two faces of endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 1998. — 97. - P. 108-112.

121. Roberts S.K., Bass C., Brading M. H. et al. "Biofilm Formation and Structure: What's New?" BioLine. 1999. - P.15-35.

122. Sabareesh V., Ranganayaki R., Raghothama S. et al. Identification and Characterization of a Library of Microheterogeneous Cyclohexadepsipeptides from the Fungus Isaria. J. of Natural Products. — 2007. Vol.70. - No5. - P.715-729.

123. Sarabia F., Chammaa S., Ruiz A.S. et al. Chemistry and Biology of Cyclic Depsipeptides of Medicinal and Biological Interest. Current Medicinal Chemistry. 2004. - 11. - P. 1309-1332.

124. Sato Т., Ishiyama D., Honda R. et al. Glomosporin, a novel antifungal cyclic depsipeptide from Glomospora sp. 1 .Production, isolation, physico-chemical and biological activities. J Antibiot. — 2000. 53. — P.597-602.

125. Schoni M. Macrolide antibiotic therapy in patients with cystic fibrosis. Swiss. Med.Wkly. 2003. - P. 133-297.127. )Schuh J. Oxygen-mediatel heterogeneity of apolow density lipoprotein. Proc.Natl. Acad. Sci. 1978. -75. -P. 3173-3179.

126. Schulz В., Boyle C., Siegfried D. et al. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycological Research. — 2002. -106.-P. 996-1004.

127. Shigemats N., Ueda H., Takase S. et al. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No. 968. II. Structure determination. J. Antibiot. -1994. 47. - P. 311-314.

128. Song Z., Lee В., Wu H. et al. In vitro effects of Chinese ginseng on Pseudomonas aeruginosa biofilm. J. Cyst. Fibros. 2005. — 4. P. 48.

129. Spoering A., Lewis K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J. Bacterid. 2001. - 183. - P. 6746-6751.

130. Steinberg D. Role of oxydized LDL and antioxidants in atherosclerosis. In: Nutrition and Biotechnology in Heart Desease and Cancer. New York: Plenum Press. 1995. - P. 39-48.

131. Steinbrecher U.P., Parthasarathy S., Leaks D.S. et al. Modification of low density lipoprotein by cells involves lipid peroxidation and degradation low density lipoprotein phospholipids. Proc Natl Acad Sci USA. 1984. — 81.-P. 3883-3887.

132. Stickler D. J., Morris N. S., McLean R. J. Biofilms on indwelling urethral catheters produce quorum-sensing signal molecules in situ and in vitro. Appl. Environ. Microbiol. 1998. - 64. - P.3486-3490.

133. Omura S., Tomoda H., Kim Y. et al. Pyripyropenes, highly potent inhibitors of acyl-CoA-cholesterol асу transferase produced by Aspergillus fumigates J. Antibiot.- 1993.-vol.46 (11). -P. 1168-1169.

134. Tabudravu J.N., Morris L.A., Milne B.F., Jaspars M. Conformational studies of free and Li+ complexed jasplakinolide, a cyclic depsipeptide from the Fijian marine sponge Jaspis splendens. Organic & biomolecularchemistry. 2005. - 3. - P. 745-9.

135. Tappel A L. Measurement of and protection from in vivo lipid peroxidation. Free Rad in Biol. 1980. - 4. - P. 1-47.

136. Tomoda H., Huang XCao J., et al. Inhibition of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase activity by cyclodepsipeptide antibiotics. J. Antib. 1992. -45. -P.1626-1632.

137. Tsunoo A , Kamijo M. Non-Cyclic AMP-Dependent, Positive inotropic cyclodepsipeptides with Negative Chronotropy 1. J. Pharm. Exper. Therap. 1999,- 290.-P. 1006-1012.

138. Vita-Marques de A.M., Lira S.P., Berlinck R.G.S. et al. A multi-screening approach for marine-derived fungal metabolites and the isolation of cyclodepsipeptides from Beauveria feline . QuHm. Nova. 2008. — vol.31. - no.5.- P. 1099-1103.

139. Witz G. Biological interactions of a, J3-unsaturated aldehydes. Free Rad Biol Med. 1989. - 7. - P. 333-349.

140. Witztum J., Steinberg D. Role of oxidized low-density lipoprotein in atherogenesis. J Clin Invest. 1991. - 88. - P. 1785-1792.

141. Xiao Fang, Kittichoat Tiyanont, Yi Zhang et al. The mechanism of action of ramoplanin and enduracidin. Mol. BioSyst. 2006. - 2. - P. 69-76.

142. Yan K, Zhang Y, Huang R. et al. High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment off Natural products and antifungal drug discovery. Methods Mol Med. —2007.-2.-P. 135-149.

143. Yano T, Aoyagi A, Kozumci S. et al. Pleofungins, novel inositol phosphorylceramide synthase inhibitors, from Phoma sp. SANK 13899. I. Taxonomy, fermentation, isolation, and biological activities. J Antibiot. — 2007.-60.-P. 43-51.

144. Zhan J., Burns A., Liu M. et al. Search for cell motility and angiogenesis inhibitors with potential anticancer activity: beauvericin and other constituents of two endophytic strains of Fusarium oxysporum. J. Nat. Prod. 2007. - 70. - P.227-232.

145. Zhong J. J., Tang Y.J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum production ganodermic acid and polysaccaharide. Enzyme Microb. Technol. 2008. - 32. - P. 478-484.