Состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы при его повреждениях и воздействии некоторых лекарственных веществ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Маслов, Олег Владимирович

• Маслов, Олег Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маслов, Олег Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иа+-Са2+ обменная система в сердечной мышце в норме и при патологии.

1.1.1. Роль Иа -Са обмена в электромеханическом сопряжении миокарда.

1.1.2. Структура и локализация №+-Са2+ обменника.

1.2. Регуляция активности Ыа+-Са2+ обменника.

1.2.1. Конкуренция между, ионами и Са2+ в сарколемме кардиомиоцитов.

1.2.2. Аллостерическая регуляция № -Са обмена внутриклеточным Са2+.

1.3. Связь электрической активности сердца с процессом Ыа+-Са2+ обмена и его участие в высвобождении Са2+ из саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов.

1.3.1. Электрогенный характер обмена ионов Ыа+ и Са2+ при Ка - Са обмене и его связь с величиной мембранного потенциала клеток.

1.3.2. Участие Ыа -Са обменника в высвобождении

Са2+ из саркоплазматического ретикулума.

4- 241.4. Активность 1Ма -Са обменника при патологических состояниях сердца.

4" 2+

1.4.1. Роль N3 -Са обменной системы в патогенезе повреждений сердца при гипоксии, реоксигенации, ишемии и реперфузии.

1.4.3. Роль митохондрий в удалении избытка Са"

4" 24* при реверсии № -Са обмена.

4- 9.41.4.4. Участие № -Са обменного механизма в нарушении электрической активности сердца.

1.5. Влияние некоторых кардиотропных веществ на процесс № -Са обмена в сердце.

1.6. Методы регистрации № -Са~ обмена в тканях животных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методика перфузии изолированного сердца крысы.

2.3. Методика регистрации поглощения ионов кальция в оттекающем от сердца перфузате.

2.4. Изучение электрической активности сердца.

2.5. Моделирование пероксидного.окисления липидов.

2.6. Модель создания гипоксии, ишемии-реперфузии.

2.7. Регистрация скорости поглощения кислорода изолированным сердцем крысы.

2.8. Методика получения митохондрий из сердца крысы и регистрация скорости поглощения митохондриями кислорода.

2.9. Использованные реактивы.

2.10. Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. Характеристика натрий-зависимого противотранспорта ионов кальция в изолированном сердце крысы.

3.1. Динамика поглощения Са2'1' изолированным сердцем крысы при повторных снижениях внеклеточной концентрации ионов натрия.

3.2. Влияние ингибиторов Ыа -Са" обмена на процесс поглощения Са2+, индуцируемого снижением внеклеточной концентрацией ионов натрия.

3.3. Влияние ингибитора Ыа^Н4^ обмена на процесс поглощения ионов Са2+ при снижении трансмембранного градиента ионов натрия.

3.4. Влияние рН на интенсивность реверсного Ыа -Са" обмена.

43.5. Зависимость скорости № -Са" обмена от внеклеточной концентрации ионов натрия в изолированном сердце крысы.

3.6. Влияние внеклеточной концентрации ионов калия на процесс Иа+Са2+ обмена в сердце крыс.

ГЛАВА 4. Участие митохондрий в поддержании физиологического уровня Са в сердце при избыточном поступлении его в кардиомиоциты вызванном реверсией Ыа+-Са2+ обмена.

4.1. Измерение скорости поглощения сердцем кислорода при натрий-зависимой аккумуляции Са2т изолированным сердцем крысы.

4.2. Участие митохондрий в активном поглощении ионов Са2+ при его поступлении в сердце посредством № -Са." обмена.

4.3. Окислительное фосфорилирование в митохондриях сердца крысы при активации реверсного потока ионов Са2+, вызванного снижением внеклеточного уровня натрия.

ГЛАВА 5. Натрий-зависимое поглощение ионов кальция в изолированном сердце крысы при гипоксии и реперфузии после ишемии и связь этого процесса с возникновением аритмии сердца.

5.1. Влияние гипоксии и ишемии на Ыа -Са обмен в изолированном сердце крысы.

5.2. Влияние активации пероксидного окисления липидов на активность №+-Са2+ обменной системы.

5.3. Состояние электрической активности сердца крысы при реверсии Кат-Са2+ обмена и в условии его ингибирования.

ГЛАВА 6. Влияние некоторых лекарственных веществ на процесс Иа -Са" обмена в изолированном сердце крысы.

6.1. Особенности № -Са обмена в сердце крысы при воздействии некоторых лекарственных препаратов.

4- 246.2. Параметры селективности № -Са ионообменной системы изолированного сердца к изменению внеклеточной концентрации натрия в различных условиях перфузии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы при его повреждениях и воздействии некоторых лекарственных веществ»

Актуальность. Для осуществления постоянной и бесперебойной механической активности сердечной мышцы природа наделила ее несколькими дублирующими механизмами, каждый из которых обеспечивает проникновение в миоплазму определенного количества Са2+, вызывающего сокращение сердца. Среди них в последнее десятилетие особое внимание привлекает ученых так называемая система Ыа -Са обмена. Пока она мало известна среди физиологов и кардиологов и до сих пор не созданы лекарственные средства, способные напрямую регулировать этот процесс. Изучение Ыа+-Са2+ обмена в настоящее время пока ограничивается простейшими объектами исследования - фрагментами сарколеммы, изолированными кардиомиоцитами или полосками миокарда. Вышеизложенный научный экспериментальный подход дал большую информацию о строении транспортного переносчика, осуществляющего Иа+-Са2+ обмен, механизме его регуляции, участии в электромеханическом сопряжении сердца.

Сейчас, однако, назрела необходимость в совершении следующего шага исследований для изучения этого важнейшего механизма на более сложных объектах, например на целом сердце в условиях изолирования его из организма, или на целом животном. Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что исследования на данных объектах единичны. И они пока не отражают особенность работы, регуляции Ыа -Са обменного механизма в целостном органе.

Трудности выполнения подобных работ обусловлены крайне незначительными изменениями внутриклеточной и внеклеточной у, концентрации Са , который транспортируется через мембрану сарколеммы в процессе Иа -Са обмена. Поэтому для количественной оценки этого процесса используют косвенные методики - измерение сопротивления мембраны, применение Са2+-селективных биолюминесцентных реагентов, а также микроэлектроды, вводимые внутрь клеток. Однако подобные процедуры невозможно использовать на интактном, целостном органе.

В этой связи возникла необходимость в разработке новой методики, позволяющей изучать натрий - зависимые потоки ионов Са" через мембраны кардиомиоцитов (ТЧа+-Са2+ обмен) в целом сердце. Овладение такой методикой дает широкий простор для изучения состояния Ыа+-Са2+ обмена при различных заболеваниях сердца, а также использования известных и новых лекарственных препаратов с целью регуляции этого транспортного

24* механизма с лечебной целью. Поскольку Ыа -Са обмен сопровождается изменением потенциала на мембране, то было важно определить связь активации этого обмена с возникновением электрической нестабильности сердца, завершающейся его аритмией.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось изучение состояния Иа+-Са2+ обменной системы изолированного сердца крысы в норме и при патологиях, определение её роли в возникновении фибрилляции миокарда, а также при воздействии некоторых лекарственных веществ.

Задачи работы предусматривали:

1. Разработать методику для исследования натрий-зависимого транспорта ионов кальция в изолированном сердце крысы.

4- ^4

2. Изучить особенности Ыа -Са" обмена в изолированном сердце крысы. Оценить доли потоков ионов Ыат, обеспечивающих Ыа и Иа -Са^ обмены при снижении внеклеточного уровня

3. Определить роль Ыа -Са" обмена в возникновении фибрилляции желудочков сердца.

4. Выявить участие митохондрий сердца в поглощении ими избыточно поступающего в сердце Са2+ через систему Ыа+-Са2+ обмена. Оценить при этом их способность к окислительному фосфорилированию.

5. Установить влияние различных концентраций калия, рН, гипоксии, реперфузии после ишемии и пероксидного окисления липидов на Са2+ обмен в сердце крысы.

6. Изучить влияние некоторых кардиотропных лекарственных веществ на процесс №+-Са2+ обмена в изолированном сердце крысы.

Научная новизна. Впервые № -Са обмен изучен путем непосредственного измерения динамики изменений концентрации Са2+ во внеклеточной среде в интактном изолированном сердце крысы. Рассчитан ряд параметров в условиях нормы и при повторных инициациях этого процесса. Новизна нового метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности патентом и товарным знаком о признании представленного изобретения с выдачей патента ((19)1Ш

11)2400825(13)С1).

Разработанная нами методика позволила сопоставить кинетику аккумуляции Са2+ сердцем при Ыа+-Са2+ обмене с состоянием электрической активности сердца. Установлено, что фибрилляция желудочков возникает в момент наибольшей скорости поглощения Са сердечной мышцей при функционировании Ыат-Са2+ обменника. Блокирование этого процесса предупреждает ее возникновение.

Выявлена активация поглощения кислорода митохондриями, происходящая в момент аккумуляции ими избыточно поступающего в сердце ионов Са2+ через систему Ыа+-Са2+ обмена. При этом наблюдается необратимое нарушение процесса окислительного фосфорилирования.

Изучена особенность протекания Иа+-Са2+ обмена в целом сердце при гипоксии, реперфузии после ишемии, при активизации пероксидного окисления липидов и изменении рН. Установлена одна из причин побочного негативного влияния некоторых лекарственных средств на сердечную деятельность. Получены данные о механизме действия верапамила и кофеина на обмен Са2+. Предложен новый тест для оценки селективности действия различных факторов и веществ на

I 2 ц. процесс № -Са обмена, протекающего в режиме реверсии.

Практическая значимость. Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздравсоцразвития России и утверждена на заседании Ученого Совета педиатрического факультета ВГМА (протокол №5 от 24.12.2006г.), номер Государственной регистрации 01.200.202014.

В результате выполненнения экспериментальной работы была разработана новая экспериментальная методика для изучения №+-Са2+ обмена непосредственно в изолированном сердце крысы, с помощью которой производилось прямое измерение изменяющегося внеклеточного уровня Са . Новый способ позволил одновременно регистрировать Ыа -зависимые потоки Са2+ и функциональное состояние целого изолированного сердца в эксперименте.

4*

Установлена прямая взаимосвязь между интенсификацией № -Са обмена и возникновением фибрилляции желудочков сердца.

Новые данные об особенностях протекания Ыа -Са обмена в реверсном режиме при изменениях рН, гипоксии, реперфузии после ишемии, активировании пероксидного окисления липидов могут быть использованы клиническими кафедрами для понимания патогенеза развития осложнений в сердце при различных его заболеваниях.

Новая модель исследования влияния ряда кардиотропных лекарственных веществ позволяет уточнить причину их побочных эффектов, наблюдаемых в клинической практике.

Материалы исследования используются во время лекций и практических занятий по биохимии, нормальной физиологии, патофизиологии и фармакологии Воронежской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на II Международной научной конференции молодых учёных-медиков (Курск, 2008); I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине». (Курск, 2008); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009); Российской конференции, посвящённой 80 - летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); III Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Воронеж, 2009); IV Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Курск, 2010)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, и получен один патент на изобретение №2400825.

На защиту выносятся следующие положения:

1. С помощью созданного изобретения, позволяющего регистрировать , 1ч[а+-Са2+ обмен, можно количественно изучать этот процесс на изолированном сердце крысы.

2. Активизация 1Ча -Са обмена в реверсном режиме сопровождается аккумуляцией избытка Са2+ митохондриями, в результате чего происходит нарушение в них процесса окислительного фосфорилирования.

3. При непродолжительной гипоксии, в отличие от ишемических факторов воздействия, наблюдается возрастание скорости накопления ионов Са2+ в сердце крысы через систему 1Ма+-Са2+ обмена.

4. Активизация процесса поступления Са2+ в сердце путем Ыа+-Са2+ обмена (в реверсном режиме) сопровождается резкими нарушениями электрической активности сердца и возникновением фибрилляции его желудочков.

5. Побочные кардиодепрессивные свойства некоторых лекарственных средств (доксорубицин, верапамил, ноотропил, новатрон ) могут быть обусловлены непосредственным влиянием их на Ыа -Са обменник в сердце.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста и включает 14 таблиц и 23 рисунка. Состоит из "Введения", 6 глав, "Заключения", "Выводов". Список литературы содержит 221 источник, из них 24 отечественных и 197 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Маслов, Олег Владимирович

ВЫВОДЫ ] I

1. Разработана методика регистрации натрий-зависимого поглощения ионов кальция изолированным сердцем крысы. Новизна нового метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о признании представленного I! изобретения с выдачей патента. | р' ;

I3

2. Снижение внеклеточного уровня № сопровождается активацией | поглощения кислорода изолированным сердцем крысы. Ослабление скорости поглощения сердцем кислорода ингибитором транспорта Са2+ в митохондриях указывает на их участие в аккумуляции избыточного Са2*, проникающего в миокард во время Ка+-Са2+ обмена. Это приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования. 1

3. Показано, что внеклеточный уровень ионов калия оказывает существенное влияние на скорость поглощения Са2" изолированным сердцем

4* 24" крысы при № -Са обмене. Результаты отражают электрогенный ха переноса ионов Са2+ и Иа+ через сарколемму кардиомиоцитов, а объясняют причину усиления реверсного пути поступления ионов Ьа2Г <; помощью Ыа+-Са2+ обменника в ишемизированном миокарде. 1 1

41 рактер 1*1 также ' 1 N

I Г 'А !

4. Выявлено значительное влияние на активность №+-Са2+ обменника !в сердце крысы изменений рН (в пределах от 6,5 до 8,5), гипоксии, реперфузии1 ' после 15 минутнои ишемии и активизации пероксидного окисления липидов!

5. Выявленно, что между активизацией поступления Са2+ в сердечные 2+ ' клетки через систему Ыа -Са обменника и возникновением фибрилляции желудочков сердца существует непосредственная взаимосвязь. 1

6. Установлено, что некоторые кардиотропные лекарственные вещества

Г'! доксорубицин, верапамил, ноотропил) существенно изменяют активность

4" 24*

Ыа -Са обменника в интактном миокарде.

7. При использовании более сложного объекта исследования ^

1!! изолированного сердца крысы, появилась возможность рассчитывать параметры селективности №+-Са2^ ионообменной системы к изменению I внеклеточной концентрации натрия в условиях воздействия изучаемых кардиотропных средств. ( ,

8. Установлено, что некоторые лекарственные препараты, обладающие I существенным побочным действием на миокард, обладают свойством изменять взаимодействие натрий-кальциевого обменника с ионами натрия. ;

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маслов, Олег Владимирович, 2010 год

1. A.c. 893205 СССР, МПК А61В10/00 Способ моделирования фибрилляции желудочков сердца у крысы. В.В. Алабовский, М.И. Р' Кужман; Воронеж. Мед. ин-т.; Заявл. 05.05.1980 ; Опубл 30.12.1981 Бюл. № 48 .i {

2. Алабовский В.В. Зависимость контрактуры миокарда при «кальциевомi 11 ' sпарадоксе» от энергетических ресурсов / В.В Алабовский, A.A. Винокуров // Российский физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2004. — Т. 90, №12.-С. 1530-1541.

3. Алабовский В.В. Зависимость повреждений сердца от внеклеточной концентрации К+ при «кальциевом парадоксе» /В.В. Алабовский, В.В. Хамбуров, A.A. Винокуров // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2003. Т. 89, № 12. - С. 1538-1550.

4. Алабовский В.В. Некоторые механизмы защитного действия1' Üаденозина при «кальциевом парадоксе» / В.В. Алабовский^! В.В.ii ■

5. Хамбуров, A.A. Винокуров // Российский физиол. Журн. им. И.М: Сеченова. 2004. -Т.90, №7. -Р. 889-901. ''

6. Алабовский В.В. Участие митохондрий в регуляции трансмембранного тока Са2+ внутрь клеток миокарда / В.В. Алабовский, В.И. Кобрин//Успехи физиол. наук. 1985.-Т. 16, № 1. - С. 3-20.

7. Аритмии сердца. Механизмы, диагностика, лечение: в 3 т. / под ред. Дж. Мандела. М.: Медицина, 1996, -Т. 2. - С. 373-403.1 ! j

8. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов-/1. N im

9. M.B. Биленко. М.: Медицина, - 1989. - 368с. ¡;| |1|- !>"121 I'1..

10. Болдырев A.A. Биохимические аспекты электромеханического, сопряжения / A.A. Болдырев. М.: Изд-во МГУ, 1977. - 208с. '

11. Булгаков В.Г. Состояние перикисного окисления липидов .ип1ферментной системы транспорта Са2+ в саркоплазматическог^ретикулуме ишемизированного миокарда / В.Г. Булгаков, М.В*

12. Биленко // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1988, - Т. 106;'^9. С. 272-274. '(

13. Влияние диэтиламинового аналога этмозина на функциональное состояние миокарда (клинико-экспериментальное исследование) / Л.В' Розенштраух и др. // Кардиология. 1982. - Т.22, №6. - С.72-78.1 - ''

14. Голиков А.П. Антиоксидант эмоксипин: влияние на формирований1. I'очага некроза и репаративные процессы при инфаркте миокарда / А.П!Ж

15. Голиков, А.Л. Овчинников, В.Ю. Полумисков // Кардиология. 1£90¡к