Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холистеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ильина, Елена Николаевна

• Ильина, Елена Николаевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ильина, Елена Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений__3

ВВЕДЕНИЕ_:__4

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.__10

1.1. Особенности структурной организации молекулы пХЭ; ее биологические и иммунологические свойства.__11

1.2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности

кДНК пХЭ; организация гена пХЭ.__19

1.3. Роль пХЭ в нормальных физиологических условиях и в патологии

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.__32

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия в

Е. coli иммуногенного белка - С-терминального участка пХЭ человека

3.2. Локализация линейной антигенной детерминанты пХЭ в пролин-богатых повторах.__58

3.3. Разработка ИФА для определения антител к пХЭ в сыворотке человека и животных.____61

3.4. Выявление антител к пХЭ человека у больных с кистами головки

поджелудочной железы____65

ЗАКЛЮЧЕНИЕ__70

ВЫВОДЫ______74

Список работ, опубликованных по теме диссертации__76

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.____78

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

BSA - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфорно-буферная смесь

SDS - додецил сульфат Na

TBS - трис-буферная смесь

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - ДНКовая копия мРНК

мРНК - матричная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

пХЭ - панкреатическая холестеролэстераза

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холистеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител»

ВВЕДЕНИЕ

Начиная с середины текущего столетия в связи с внедрением достижений биологической науки в практику здравоохранения произошли существенные изменения в структуре заболеваний человека. Изменился спектр инфекционных заболеваний за счет широкого применения антибиотиков и вакцинации населения против наиболее опасных микроорганизмов, возросла доля внутренних болезней, обусловленных нарушением нормальных физиологических процессов, протекающих в человеческом организме. Согласно данным, опубликованным в ежегодном докладе Всемирной Организации Здравоохранения, число онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и ряда других хронических болезней, ежегодно уносящих жизни 24 миллионов людей на планете, возрастет и достигнет в следующем тысячелетии сотен миллионов. Среди них отдельно следует выделить патологические процессы, связанные с нарушением обмена веществ (эндокринные заболевания) и онкологические заболевания. Так, ожидается, что в течение ближайших 25 лет количество заболеваний раком в большинстве стран мира удвоится. Диагностика внутренних болезней, особенно превентивная диагностика, весьма затруднительна, так как клиническая картина болезни наблюдается при уже значительных поражениях органов и тканей.

Одной из основных задач клинической биохимии является поиск новых гуморальных маркеров для дифференциальной диагностики различных заболеваний внутренних органов и прогнозирования их осложнений и тяжести течения. Такого рода маркерами могут служить

антитела, вырабатываемые к наиболее иммуногенным белкам органов и тканей. Эти же белки могут играть существенную роль в этиопатогенезе патологического процесса.

Представляемое исследование является частью общей научной работы, проводимой в лаборатории молекулярной эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН с использованием ткани инсулиномы человека после хирургической резекции опухоли. Основным направлением этой работы является выявление наиболее иммуногенных белков, экспрессируемых клетками инсулиномы человека, создание их бактериальных продуцентов и разработка методов тестирования аутоантител при использовании рекомбинантных белков в качестве антигена.

В качестве объекта исследования были выбраны клетки инсулиномы человека, как возможный продуцент маркеров сахарного диабета. Можно предположить, что аутоантитела образуются к наиболее иммуногенным белкам. Таким образом, выявление этих белков могло бы привести к открытию новых гуморальных маркеров инсулин зависимого сахарного диабета или других заболеваний.

С другой стороны, так как инсулинома - это опухоль, в ее клетках экспрессируются белки, характерные для опухолевых тканей организма. Как правило, опухолевые белки являются сильными антигенами. Учитывая этот факт можно было предполагать, что в ходе данной работы мог бы быть выявлен рекомбинантный клон, экспрессирующий опухолевый антиген. Результаты такого рода исследования могли бы быть использованы для направленной иммунотерапии раковых клеток.

В рамках этого общего направления исследований была создана библиотека кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе риЕХ1, из которой методом нуклеотидного скрининга извлечен рекомбинантный клон, кодирующий полноразмерный белок препроинсулина в составе гибридного белка с р-галактозидазой [6].

Целью представляемой диссертационной работы было создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека и разработка на его основе методов тестирования антител с использованием существующей клонотеки кДНК из инсулиномы человека.

Конкретными задачами исследования являлись:

• получение иммунологически активной антисыворотки морской свинки к суммарным белкам инсулиномы человека, содержащей антитела к панкреатической холестеролэстеразе;

• проведение с помощью последней иммуноскрининга клонотеки кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе рЦЕХ! и выявление иммунопозитивных рекомбинантных клонов; идентификация иммунопозитивных белков;

® установление локализации антигенной детерминанты в структуре иммунопозитивного фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, используя методы молекулярного клонирования, секвенирования и иммуноферментного анализа; в выделение гибридных белков, вырабатываемых созданными генно-инженерными продуцентами;

• использование рекомбинантных белков в качестве антигена в разработке лабораторного варианта твердофазного иммуноферментного метода выявления антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотке человека и морской свинки;

• проведение скрининга больных с различными нарушениями функции поджелудочной железы с целью выявления у них аутоантител к панкреатической холестеролэстеразе человека и установления корреляции с определенными видами патологии.

Представляемое научное исследование проводилось на базе лаборатории молекулярной эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН с использованием созданной ранее клонотеки кДНК из инсулиномы человека [6] и выделенных параллельно из того же биологического материала суммарных белков инсулиномы.

Первая часть диссертационной работы посвящена выявлению и идентификации иммунопозитивных рекомбинантных клонов. Предложена методика получения антисыворотки для иммуноскрининга клонотеки -иммунизация морских свинок суммарным раствором белков инсулиномы. Оригинальность этого подхода состоит в том, что для создания клонотеки кДНК и получения антисыворотки был использован один и тот же биологический материал. Единый образец ткани инсулиномы человека был подвергнут биохимической обработке, в результате которой был выделен пул мРНК, послуживший основой для создания клонотеки кДНК, и суммарные белки инсулиномы, в дальнейшем использованные для иммунизации морских свинок. Этот подход позволил получить антисыворотку, специфичную к сильному иммуногенному белку -

панкреатической холестеролэстеразе. Иммунопозитивный рекомбинантный клон, содержащий кДНК вставку 3' концевого фрагмента панкреатической холестеролэстеразы, был выявлен традиционным методом иммуноскрининга. Идентификацию вставки кДНК проводили с помощью рестрикционного анализа и частичного определения нуклеотидной последовательности методом Сенгера. Аналогичный подход может быть использован для обнаружения антигенов любых других органов и тканей.

Вторая часть работы заключалась в изучении природы иммуногенности панкреатической холестеролэстеразы человека, выявлении локализации антигенной детерминанты в структуре молекулы белка. Эта задача решена на генетическом уровне путем клонирования субфрагментов фермента, создания их бактериальных продуцентов и тестирования иммунологических свойств экспрессируемых гибридных белков. В результате этого исследования установлена локализация антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека в пролин-богатых повторах фермента. Таким образом, экспериментально показана неизвестная ранее функция уникальной белковой структуры - пролин-богатых повторов панкреатической холестеролэстеразы человека.

Третья часть иллюстрирует практическое применение созданных бактериальных продуцентов в качестве источников антигенов для иммуноферментного тестирования наличия антител к панкреатической холестеролэстеразе в сыворотках человека и морской свинки. Ценность разработанного метода представлена результатами клинической апробации, которая показала возможность оценки наличия антител к панкреатической

холестеролэстеразе человека для дифференциальной диагностики кист поджелудочной железы.

% ^ эК

Автор выражает огромную благодарность Юрию Александровичу Панкову за мудрое научное руководство и предоставленную возможность выполнить настоящее исследование. Искренняя признательность Чехрановой М.К., Шуваловой Е.Р., Яцышиной С.Б за непосредственную помощь в выполнении поставленных задач, а также сотрудникам Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии Садокову В.М. и Винокуровой A.B. за предоставление клинического материала и помощь в интерпретации полученных данных с точки зрения практикующих врачей. Вклад соавторов отражен в совместных публикациях.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В состав панкреатичекого сока млекопитающих входят два важнейших липолитических фермента, участвующих в переваривании пищевых жиров: панкреатическая липаза и панкреатическая холестеролэстераза. Оба фермента относятся к классу эстераз и расщепляют сложноэфирные связи между углеводородными остатками жирных кислот и глицерином или его заместителями (холестерин, фосфатидилхолин и т.д.). Панкреатическая липаза (триацилглицерол липаза, К.Ф. 3.1.1.3) [50, 72] отвечает за расщепление три-, ди- и моно-ацилглицеролов, основных компонентов пищевых липидов. В 1981 году была установлена аминокислотная последовательность панкреатической липазы свиньи [19], а позднее - аминокислотная последовательность и кристаллическая структура панкреатической липазы человека [50, 72]. Помимо панкреатической липазы секрет поджелудочной железы содержит другой липолитический фермент, который гидролизует не только триацилглицеролы, но и другие, реже встречающиеся пищевые жиры, включая фосфолипиды, эфиры холестерина и жирорастворимых витаминов [46, 67]. Для проявления своей активности этот фермент требует присутствия солей желчных кислот. По аналогии с панкреатической липазой он был назван панкреатической холестеролэстеразой (пХЭ) [46]. На ранних этапах исследования продуктов секреции поджелудочной железы помимо этих двух панкреатических эстераз выделяли еще лизофосфолипазу. В дальнейшем было показано, что как самостоятельная единица этот фермент не существует, а функции

лизофосфолипазы в организмах человека, крысы, быка выполняет пХЭ [23, 36, 40]. В настоящее время доказано, что пХЭ идентична неспецифической липазе из молочной железы человека, активируемой солями желчных кислот (bile salt activated lipase) [35, 53]. Представляется весьма затруднительным определить код этого фермента по международной классификации ферментов в связи с его широкой субстратной специфичностью. ПХЭ проявляет свойства карбоксилэстеразы [К.Ф. 3.1.1.1], арилэстеразы [К.Ф. 3.1.1.2], триацилглицерол липазы [К.Ф. 3.1.1.3], лизофосфолипазы [К.Ф. 3.1.1.5], холестеролэстеразы [К.Ф. 3.1.1.13], ацилглицерол липазы [К.Ф. 3.1.1.23] и фосфолипазы А [К.Ф. 3.1.1.32]. В прошлом этот фермент разные исследователи называли по-разному: лизофосфолипаза [30], холестеролэстераза [17], карбоксилэстер гидролаза [9, 46], карбоксилэстер липаза [68], липаза, стимулируемая (активируемая) солями желчных кислот [10, 11, 53] и липаза, зависимая от солей желчных кислот [8].

В настоящей работе, чтобы подчеркнуть связь этого фермента с поджелудочной железой, ее экскреторной функцией, он будет называться панкреатическая холестеролэстераза (пХЭ).

1.1. Особенности структурной организации молекулы пХЭ; ее биологические и иммунологические свойства.

ПХЭ синтезируется в ацинарных клетках поджелудочной железы и поступает в просвет двенадцатиперстной кишки в составе панкреатического сока [46]. У человека полноценный синтез пХЭ

наблюдается только во взрослом состоянии, тогда как новорожденный получает этот фермент с молоком матери [62]. Содержание пХЭ составляет около 4% от общей белковой массы секрета поджелудочной железы [17]. Как известно, протеазы, входящие в состав сока поджелудочной железы, секретируются в неактивной форме в виде зимогенов и подвергаются химической модификации (активации) уже в просвете двенадцатиперстной кишки. Эстеразы (панкреатическая липаза и пХЭ) синтезируются сразу в виде белка, обладающего базальной активностью. Но для резкого увеличения своей активности эти ферменты требуют присутствия солей желчных кислот [11, 32, 67]. Недавно появились данные свидетельствующие, что пХЭ человека частично специфически связана с мембранами эндоплазматического ретикулума зимогенных гранул [13], причем процесс диссоциации этого комплекса является энергетически зависимым и требует присутствия АТФ [55]. Как известно, в процессе секреции содержимое гранул выходит в секреторные протоки, а мембрана вливается в цитоплазматическую мембрану клетки. Таким образом, пХЭ может играть роль молекулярного маркера ацинарных клеток [13]. Показано существование двух форм этого фермента у крысы: секреторной формы, которая выходит в просвет протоков поджелудочной железы, и формы, частично встроенной в эндоплазматическую мембрану, представленной на поверхности зимогенных гранул и обладающей преимущественно фосфолипазной и лизофосфолипазной активностями [73]. Эти две формы пХЭ имеют разную молекулярную массу (70 кДа и 92 кДа, соответственно), что, по мнению авторов, связано с разной степенью гликозилирования свободной и встроенной форм фермента.

ПХЭ человека - гликопротеин с молекулярной массой примерно 100 кДа [17, 32, 67]. Аминокислотный состав пХЭ человека был установлен в 1981 году [32], а в 1988 году проведен N-концевой аминокислотный секвенс молекулы пХЭ [68]. В 1990-1991 годах получена полноразмерная кДНК этого фермента [10, 35, 53, 57] и на ее основе выведена аминокислотная последовательность, которая включает 20 аминокислотных остатков сигнального пептида и 722 аминокислотных остатков структурной части белка, что соответствует белку с молекулярной массой примерно 77 кДа.

Молекула пХЭ имеет уникальную структуру. При сравнении первичной структуры белков пХЭ человека с пХЭ других видов животных (крысы, быка, кролика) [16, 30, 36, 40] наибольшее сходство выявлено между N-концевыми участками белков (14 - 505 а.о.), а основные различия приходятся на С-конец (рис. 1). Сходная картина наблюдается и при сравнении родственных ферментов (панкреатическая липаза, адетилхолинэстераза, пХЭ) внутри одного вида [15].

Трехмерная структура пХЭ человека, в отличие от панкреатической липазы [72], до настоящего времени полностью не изучена. Созданы компьютерные модели молекул пХЭ человека и крысы, экспериментально пока не подтвержденнные [25]. Ведутся активные работы по рентгеноструктурному анализу пХЭ быка [71). Установлено существование 2-х доменов пХЭ быка: глобулярный N-домен и С-домен, структура которого представляет р-складчатый слой. Оба эти домена соединены между собой подвижной петлей, которая принимает фиксированное положение при активации солями желчных кислот.

HUMAN mgrlqlvvlgltcCWAVASAAKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTK 60

RAT mgrlevlflgltcCLAAACAAKLGAVYTEGGFVEGWKKLSLLGGDSVDIFKGIPFATAK 60

BOVIN lgasrlgpspg—CLAVASAAKLGSVYTEGGFVEGVNKKLS LFGDSVDIFKGIPFAAAPK 58

RABBIT mgrleltvlglacLLDSGACGDLGPVYTEGGFVEGENKKLSLLGDDSVDIFKGIPFATPA 60

HUMAN ALENPQPHPGWQGTLKAKNFKKRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPV 120

RAT TLENPQRHPGWQGTLKATDFKKRCLQATITQDDTYGQEDCLYLNIWVPQGRKQVSHDLPV 12 0

BOVIN ALEKPERHPGWQGTLKAKS FKKRCLQATLTQDSTYGNEDCLYLNIWVPQGRKEVSHDLPV 118

RABBIT ILENPQRHPGWQGTLKAKDFKKRCLQATLTQDSTFGDQDCLYLNIWVPQGRKEVSHNLPV 120

HUMAN MIWIYGGAFLMGSGHGANFLNNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPG 18 0

RAT MVWIYGGAFLMGSGQGANFLKNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPG 18 0

BOVIN MIWIYGGAFLMGASQGANFLSNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDSNLPG 17 8

RABBIT MIWIYGGAFLMGSSQGANFLSNYLYDGEEIATRGNVI\A/TFNYRVGPLGFLSTGDANLPG 18 0

HUMAN NYGLRDQHMAIAWVKRNIAAFGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQS 240

RAT N FGLRDQ HMAIAWVKRNIAAFGGDPDNITIFGESAGAASVS LQT LS PYNKGLIRRAISQS 240

BOVIN NYGLWDQHMAIAWVKRNIEAFGGDPDNITLFGESAGGASVS LQTLS PYNKGLIKRAISQS 238

RABBIT NYGLRDPHMAIAWKANIAAFGGDPDNITIFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQS 24 0

HUMAN GVALSPWVIQKNPLFWAKKVAEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYP 300

RAT GVALSPWAIQENPLFWAKTIAKKVGCPTEDTAKMAGCLKITDPRALTLAYRLPLKSQEYP 300

BOVIN GVGLCPWAIQQDPLFWAKRIAEKVGCPVDDTSKMAGCLKITDPRALTLAYKLPLGSTEYP 298

RABBIT GVALSPWDIQKNPLFWAKKIAEKVGCPLDYTATMAQCVKITDPHSLTLAYNFPLAGLAYP 300

HUMAN MLHYVGFVPVIDGDFIPADPINLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVT 360

RAT IVHYLAFIPWDGDFIPDDPINLYDNAADIDYLAGINDMDGHLFATVDVPAIDKAKQDVT 360

BOVIN KLHYLS EVPVIDGDFIPDDPVNLYANAADVDYIAGTNDMDGHLFVGMDVPAINSNKQDVT 358

RABBIT MVHYLGFI-WDGDFLPEDPIILYGNAADIDYLAGTNDMDGHLFATVDMPAIDKSYKDIS 35 9

HUMAN EEDFYKLVSEFTITKGLRGAKTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIA 42 0

RAT EEDFYRLVSGHTVAKGLKGTQATFDIYTESWAQDPSQENMKKTWAFETDILFLIPTEMA 420

BOVIN EEDFYKLVSGLTVTKGLRGANATYEVYTEPWAQDSSQETRKKTMVDLETDILFLIPTKIA 418

RABBIT DQDFYKLVSGMTVTKGSEGAQATYSIYTESWAQDSSQQNKKKTV-DLETDILFLIPTEIA 418

HUMAN LAQHRANAKSAKTYAYLFSHPSRMPVYPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTV 480

RAT LAQHRAHAKSAKTYSYLFSHPSRMPIYPKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTV 480

BOVIN VAQHKSHAKSANTYTYLFSQPSRMPIYPKVJMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTV 478

RABBIT LAQHRANSSTAKTYAYLFSHPSRMPIYPSWMGADHADDLHDIFGKPFATPTGYRPQDRTV 47 8

HUMAN SiCAMIAYWTNFAKTGDPNMGDSAVPthwepyttensgyleitkkmgsssmkrslrtnflr 54 0

RAT SKAMIAYT/JTNFAKSGDPNMGNSPVPthwypyttengnyldinkkitstsmkehlrekflk 54 0

BOVIN SKAMIAYWTNFARTGDPNTGHSTVPanwdpytleddnyleinkqmdsnsmklhlrtnylg 538

RABBIT SKTLIAYRTNFARTGDPNTGFRKCPplgalhpgerqlpgdqqedesglhevppekqlpaa 538

HUMAN ywtltylalptvtdqeatpvpptgdseatpvpptgdsetapvpptgdsgappvpptgdsq 600

RAT fwavtfemlptvvgdhtppeddseaapvpptddsqggpvpptddsqttpvpptdnsqagd 600

BOVIN fwtqtyqalptvtsagasllppednsqaspvppadnsgaptepsagdsevaqmpvvigf- 597

RABBIT scssgpdlqalpvvledvpvpptddaepspgarddsstppadasvaaqmpmaigf----------593

HUMAN appvpptgdsgappvpptgdsgappvpptgdsgappvpptgdsgappvpptgdsgappvp 660

RAT sveaqmpgpigf------------------------------------------------------------------------------------------------612

BOVIN ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------597

HUMAN ptgdagpppvpptgdsgappvpptgdsgappvtptgdsetapvpptgdsgappvpptgds 720

HUMAN eaapvpptddskeaqmpavirf 742

Рис. 1 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей пХЭ человека, крысы, быка и кролика. Гомологичный участок обозначен заглавными буквами. Уникальные пролин-богатые повторы выделены жирным шрифтом.

N-концевой участок молекулы пХЭ человека (538 а.к.) гомологичен типичным эстеразам, содержит два дисульфидных мостика Cys 64-Cys 380 и Cys 246-Cys 257, поддерживающих пространственную структуру белка, сходную со структурой панкреатической липазы, и определяет все основные функции пХЭ как фермента. На этом участке локализованы гепарин-связывающий домен, сайт N-гликозилирования (Asn 187) и активный центр фермента (Ser 194) [21, 64], входящий в состав каталитической триады: Ser 194, Asp 320, His 435 (рис. 2).

Центр N-гликозилирования

Asn 187 а

NH2

S-S мостик

N-конец

С-конец ->

соон

S-S мостик

Ser 194

i

Asp 320

538

122

Область Пронин-богатых повторов His 435 (16 мотивов типа PVPPTGDSG АР) подчеркнут участок О-глико л ширования

Рис. 2. Схематичное представление молекулы белка пХЭ человека.

С другой стороны, С-концевой участок молекулы (539-722 а.к.) является уникальным для пХЭ человека и состоит из 16 почти идентичных повторов по 11 аминокислотных остатков каждый типа РУРРТОБЗОАР, с единичными заменами отдельных аминокислотных остатков в С-концевых

участках повторов [10]. ПХЭ различных видов млекопитающих сильно отличаются размерами С-кондевого участка, то есть числом и размерами пролин-богатых повторов (рис 3). Так, пХЭ крысы содержит 4 повтора по 89 аминокислот [30, 36], пХЭ быка имеет только 3 повтора по 5 аминокислот [40], кроличья же аналогичной структуры вообще не имеет [16].

1 РУРРГСОЗЕАТ пХЭ крысы 1 НТРРТЕ)08Е

2 РУРРТООЗЕТА 2 РУРРТВОБО

3 РУРРТСтОвСтАР 3 РУРРТВОЭО

4 руррТС.Е)80Ар 4 рурртоыБд

5 РУРРТООЭОАР

6 РУРРТООЭОАР

7 РУРРТООЭОАР пХЭ быка 1 РРЕОЫ

8 РУРРТОВЭОАР 2 РРАЭК

9 РУРРТООЭСхАР 3 РЗАОО

10 РУРРТООЭСтРР

11 РУРРТООЭОАР

12 РУРРТООБОАР

13 РУРРТОЭ Э ЕТА

14 РУРРТООЗОАР

15 РУРРТООЗЕАА

16 РУРРТБОвКЕА

Рис 3. Аминокислотные последовательности повторяющихся мотивов на С-концевом участке пХЭ человека, крысы и быка.

Функции пролин-богатых повторов пХЭ до настоящего времени не выяснены. Доказано, что их полное или частичное отсутствие не влияет на каталитическую активность пХЭ, активацию ее солями желчных кислот,

способность связывать гепарин [12, 22, 31]. Более того, обнаружено, что искусственное уменьшение числа повторов приводит к увеличению активности фермента в условиях дефицита солей желчных кислот по сравнению с нативной формой [31]. В настоящее время показано наличие на С-конце фермента участков О-гликозилирования [69]. Нативный фермент содержит ряд олигосахаридов: фукозу, галактозу, глюкозамин и галактозамин, соединенных с аминокислотными остатками пептида О-гликозидной связью. Учитывая этот факт и то, что примерно каждый третий аминокислотный остаток в белковой структуре С-конца пХЭ является пролином, Wang и соавторы считают, что третичная структура этой части молекулы фермента по своей конформации подобна белку муцину [69]. Предположительно, роль сигнала для О-гликозилирования играет мотив PVPP. Учитывая полную идентичность пХЭ с неспецифической липазой, входящей в состав материнского молока ряда млекопитающих, можно предположить, что, поскольку этот липолитический фермент, поступая в организм детеныша с молоком матери, проходит через желудок и начинает функционировать только в двенадцатиперстной кишке, пролин-богатые повторы, будучи сильно гликозилированным участком, значительно стабилизируют структуру молекулы фермента, защищая ее от протеолитического расщепления в желудке [47]. Влияние наличия пролин-богатых повторов на деградацию белка при прохождении через желудочно-кишечный тракт было исследовано в сравнении воздействия пептидаз (пепсин, трипсин и химотрипсин) на нативную пХЭ и рекомбинантный белок, являющийся по сути пХЭ без пролин-богатых повторов. Причем этот белок обладал всеми основными характеристиками

пХЭ: ферментативная активность, гепарин-связывающая активность, способность к гликозилированию и взаимодействию с солями желчных кислот. В ряде экспериментов доказано, что расщепление пептидазами нативного фермента идет в несколько раз медленнее, чем распад рекомбинантного белка. Этот феномен авторы связывают с наличием пролин-богатых повторов, экранирующих белок от воздействия пептидаз [47]. Существует также версия, что в силу своей гидрофобности С-концевой участок пХЭ может встраиваться в цитоплазматическую мембрану и таким образом представлять молекулу белка на поверхности зимогенных гранул [73]. Недавно показана возможность участия гидрофобного С-конда пХЭ в формировании димеров молекул фермента в ходе активации солями желчных кислот [48].

Иммунологические свойства пХЭ до настоящего момента не были широко исследованы. Первые наблюдения о перекрестном реагировании антител к пХЭ человека и антител к неспецифической липазе из молочной железы человека, активируемой солями желчных кислот, наряду с другими факторами (молекулярная масса, аминокислотный состав) позволили выдвинуть гипотезу об идентичности этих белков [9], что и было позднее подтверждено на уровне ДНК [35, 53]. Интересные данные, касающиеся иммунологических свойств пХЭ человека и различных видов животных, были обнаружены недавно при изучении гепарин-связывающей активности этих ферментов. Оказалось, что поликлональные антитела, полученные на кроликах, против пХЭ человека и быка по-разному реагируют с пХЭ человека и других видов животных в Western Blott. Антитела к пХЭ быка распознают пХЭ человека, быка, собаки, крысы, кролика и мыши, тогда

как антитела к человеческой пХЭ распознают только ферменты человека -пХЭ и идентичную ей неспецифическую липазу из молочной железы. Эти данные свидетельствуют, что у человека эти ферменты содержат структурный элемент, обладающий сильной иммуногенностью и отсутствующий в составе пХЭ других видов животных [64].

1.2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности нДНК нХЭ; организация гена пХЭ.

Первые работы по изучению пХЭ различных видов животных на уровне ДНК начались в конце 80-х годов. В них был использован общий подход, разработанный для изучения нуклеотидной последовательности, кодирующей экспрессируемые белки. Заключался он в создании клонотеки кДНК из соответствующей ткани человека или животного и ее последующем скрининге. Для этого из интересующей ткани выделяли суммарный препарат мРНК и с помощью обратной транскриптазы, используя олиго-dT праймеры, проводили синтез кДНК, которую затем встраивали в плазмидные векторы или бактериофаги и клонировали, чаще всего в Е. coli (рис.4).

Одной из первых была определена последовательность ДНК, кодирующая крысиную лизофосфолипазу (фермента, который позднее стали называть пХЭ). Была создана клонотека кДНК из ткани поджелудочной железы крысы в экспрессирующем бактериальном векторе Xgtl8 [30]. В результате проведения скрининга с нуклеотидным зондом, сконструированным исходя из определенной ранее N-концевой

последовательности белка, извлечен клон, имеющий вставку кДНК размером 2067 п. н., включая 21 п. н. 5'-нетранслируемой и 207 п. н. 3-нетранслируемой областей, и открытую рамку считывания. На основание проведенного анализа нуклеотидной последовательности вставки кДНК этого клона выведена аминокислотная последовательность крысиной лизофосфолипазы, состоящая из 612 аминокислотных остатков, что соответствует белку с молекулярной массой примерно 67 кДа. Структурной особенность этого фермента являются 4 повторяющихся блока по 9 аминокислот, расположенных на С-концевом участке непосредственно перед терминальным кодоном.

мРНК

-АААА

обратная ф транскрипция

<

АААА

ТГГТ

встраивание кДНК в вектор

Клонирование и скрининг библиотеки кДНК

(

Рис. 4. Схема клонирования кДНК эукариотических белков.

В ходе дальнейших исследований липолитических ферментов крысы из клонотеки кДНК поджелудочной железы в (§1:11 с помощью иммуноскрининга антителами к холестеролэстеразе свиньи получен клон, содержащий полноразмерную кДНК пХЭ крысы, и доказана его полная идентичность крысиной лизофосфолипазе [36].

Настоящий бум в изучении пХЭ приходится на начало 90-х годов, когда были заложены основы современных представлений об этом ферменте. Несколько независимых групп исследователей провели клонирование и секвенирование полноразмерных кДНК пХЭ и/или активируемой солями желчных кислот неспецифической липазы из молочной железы человека [10, 35, 53, 57], быка [40], кролика [16]. Результаты этих исследований позволили доказать идентичность лизофосфолипазы и пХЭ быка (аналогично крысиным ферментам), пХЭ и неспецифической липазы из молочной железы человека. Общий подход в изучении кДНК ферментов заключался в создании библиотеки кДНК из клеток поджелудочной железы и/или лактирующей молочной железы. Чаще всего клонирование проводили в (-векторы ^10/^1:11. Клоны, содержащие полноразмерную кДНК пХЭ или ее перекрывающиеся фрагменты были отобраны путем скрининга библиотеки нуклеотидными зондами [35, 57] или антителами к пХЭ [10, 53]. Приведенные разными группами ученых данные о размере кДНК пХЭ и/или неспецифической липазы человека, активируемой солями желчных кислот, отличаются между собой за счет длины 5'-нетранслируемой области. Ее размер варьирует от 73 [35] до 675 [57] п. н., тогда как в структурной части, кодирующей белок, и в 3'-нетранслируемой области таких различий нет. Подобные различия

объясняются существованием альтернативного сплайсинга пХЭ, в результате которого возможны значительные делеции в 5'-нетранслируемой области [58]. Таким образом, последовательность кДНК пХЭ человека содержит по разным данным 2340 - 3018 п. н., из них 2226 п. н. включает структурная часть, кодирующая аминокислотную последовательность из 742 а. о. (20 а. о. сигнальный пептид и 722 а. о. структурная часть пХЭ), 112 п. н. - З'-нетранслируемая область и 14 п. н. - поли (А)-хвост. На 3'-концевом участке кДНК расположена область из 16 повторов по 33 п. н., соответствующая области пролин-богатых повторов молекулы белка. Аналогичные подходы были использованы для определения первичной структуры ДНК, кодирующей пХЭ быка (1900 п. н.) и кролика (1788 п. н.). Сравнительный анализ известных последовательностей кДНК пХЭ человека и различных видов животных (крысы, быка, кролика) позволил выявить высокий процент гомологии между этими структурами, за исключением области, кодирующей пролин-богатые повторы и являющейся уникальной для каждого вида.

В настоящее время наиболее полно исследованы организация и структура генов пХЭ крысы и человека. Крысиная пХЭ, белок с молекулярной массой примерно 74 кДа, кодируется геном, имеющим размер около 8 т. п. н. и состоящим из 10 интронов и 11 экзонов [20, 26]. Размер экзонов варьирует от 83 до 201 п. н., за исключением последнего экзона, длина которого составляет 548 п. н. Последовательность ТАААТА представлена на уровне 31 нуклеотида перед сайтом инициации транскрипции. На генном уровне было показано, что пХЭ крысы имеет три участка гомологии с холинэстеразой и ацетилхолинэстеразой, но

локализованы эти домены на различных экзонах пХЭ [26], что подтверждает гипотезу о расхождении в ходе филогенеза гена пХЭ с генами сериновых протеаз. С точки зрения исследователей наибольший интерес представляет изучение 11 экзона, который является наименее консервативным среди генов пХЭ различных видов. Доказано, что нуклеотидная последовательность этого экзона кодирует участки пХЭ, необходимые для проявления энзиматической активности, причем это не пролин-богатые повторы, которые также кодируются 11 экзоном [20].

В 1992 году двумя группами независимых исследователей была установлена структура и хромосомная локализация гена пХЭ человека [37, 44]. Ген, кодирующий пХЭ человека, включая 1628 п. н. 5'-фланкирующей области, был изолирован и охарактеризован из двух перекрывающихся клонов фага лямбда [44]. Этот ген имеет размер 9832 п. н. и содержит 11 экзонов, разделенных 10 интронами. Размер экзонов колеблется от 88 до 204 п. н., за исключением последнего экзона, длина которого составляет 841 п. н. и который является уникальным для человеческого гена [37]. Нуклеотидная последовательность значащих участков гена пХЭ идентична ранее опубликованной последовательности кДНК пХЭ человека [53]. Последовательность ТАААТА гена пХЭ человека локализована на уровне 26 нуклеотида перед главным сайтом инициации транскрипции. Позднее было установлено, что большой сегмент 5' фланкирующей области между -10 и -930 п. н. обладает промоторной активностью [38] .Таким образом, организация гена пХСЭ человека подобна таковой гена пХЭ крысы, описанной выше. Помимо гена пХЭ, который экспрессируется только в лактирующей молочной железе человека и в поджелудочной железе,

методом гибридизации с различными ДНК зондами было показано существование псевдогена пХЭ [44], невысокий уровень экспрессии которого наблюдается практически во всех тканях. Подобно другим псевдогенам, его размер составляет всего 4846 п. н. за счет отсутствия сегмента размером 4800 п. н., включающего экзоны 2-7 гена пХЭ человека. Несмотря на эти отличия он имеет на З'-нетранслируемой области сайт полиаденилирования и способен транскрибироваться. Было показано, что ген пХЭ и псевдоген имеют одинаковую хромосомную локализацию -9q34-qter [44]. Помимо псевдогена показано также наличие в геноме человека гена, подобного гену пХЭ [37, 54]. Он короче, чем нормальный ген пХЭ за счет стоп-кодона, находящегося в 10-ом экзоне сразу после кодона, кодирующего His 435, входящий в состав каталитической триады фермента. Этот ген также способен транскрибироваться, образуя мРНК размером 1,3-1,6 т. п. н.

1.3. Роль пХЭ в нормальных физиологических условиях и в патологии.

У большинства позвоночных, в частности млекопитающих, липолитическая система секрета поджелудочной железы включает два фермента: панкреатическую липазу и панкреатическую холестеролэстеразу. В нормальных физиологических условиях уровень пХЭ не является лимитирующим фактором для адсорбции пищевых жиров. Так как пХЭ была открыта сравнительно недавно как важная составляющая липолитической активности поджелудочного сока, в прошлом активность

этого фермента считалась частью активности панкреатической липазы. Однако прогресс в идентификации кДНК последовательности пХЭ позволил провести генетический скрининг больных и выявить тех пациентов, у которых синдром пониженной адсорбции пищевых жиров ассоциируется с дефицитом пХЭ [32, 33, 67]. Также оказалось, что не у всех позвоночных панкреатическая липаза играет доминирующую роль в липолитической активности секрета поджелудочной железы. Как показали работы ряда исследователей панкреатическая липаза не определяется в поджелудочной железе тигровой акулы [56], отсутствует у трески [29], тогда как пХЭ присутствовала в обоих случаях. Таким образом, по крайней мере у этих видов рыб, пХЭ может выполнять функцию расщепления пищевых жиров одна, не нуждаясь в присутствии панкреатической липазы. Наличие пХЭ в поджелудочном соке одновременно с панкреатической липазой не только обеспечивает избыточность липолитической системы для расщепления триглицеролов, но и способствует расщеплению важнейших минорных пищевых жиров, таких как жирорастворимые витамины и эфиры холестерина, причем эта стадия является одним из критических моментов в адсорбции пищевого холестерина [17, 59]. В случае детенышей приматов, чья поджелудочная железа еще плохо развита, основным липолитическим ферментом, отвечающим за расщепление пищевых жиров, является неспецифическая липаза, входящая в состав материнского молока, идентичная пХЭ [27, 33]. Довольно долго считалось, что этот фермент присутствует в молоке только у некоторых приматов [26]. В настоящее время установлено присутствие неспецифической липазы в кошачьем молоке [70], что позволило сделать наблюдения за ростом котят в отсутствии

этого фермента (искусственное вскармливание) и в его присутствии (естественное вскармливание или искусственное с добавлением в молочную смесь пХЭ). Было показано, что котята, находящиеся на естественном вскармливании или получавшие дополнительно пХЭ, росли в два раза быстрее, чем их сверстники, получавшие только искусственную пищу. Так была доказана важная роль и необходимость этого фермента для нормального роста детенышей ряда млекопитающих, на ранних этапах их развития.

Помимо пХЭ из секрета поджелудочной железы методом иммунопреципитации выделены еще два белка, обладающие сходными иммунологическими свойствами и имеющие молекулярную массу 22,7 ±1,2 кДа (р23) и 46 ± 2 кДа (р4б) [59]. Первый из них, возможно, является продуктом экспрессии псевдогена, в котором отсутствуют 2-7 экзоны. За исключением различий в размере, этот ген имеет все те же характеристики, присущие экспрессирующему гену пХЭ. В результате транскрипции этого гена образуется мРНК размером 645 п. н., которая может транслировать полипептид с молекулярной массой около 23 кДа. Другой белок может быть продуктом экспрессии гена, подобного гену пХЭ, который имеет стоп-кодон на уровне 10-ого экзона сразу после участка, кодирующего His 435, входящий в состав каталитической триады фермента [37]. Так как Ser 194, являющийся активным центром фермента, кодируется 5-ым экзоном, этот белок способен гидролизовать те же субстраты, что и пХЭ. Размер мРНК, получающейся в результате транскрипции этого гена составляет примерно 1300 - 1600 п. н., что соответствует белку с молекулярной массой около 50 кДа. Наиболее часто иммуноформы пХЭ с молекулярной массой 46 кДа и

48 кДа определяются в секрете поджелудочной железы у больных аденокарциномами.

В эмбриональных и опухолевых тканях показана экспрессия так называемого фетоацинарного белка (fetoacinar protein) - FAP [24, 52, 58]. Его нахождение ассоциируется с онтогенезом, дифференцировкой и онкологической трансформацией экзокринной части поджелудочной железы. Этот белок имеет молекулярную массу 110 кДа, тот же аминокислотный состав и N-концевую последовательность аминокислотных остатков, что и пХЭ. Впервые FAP был выделен из панкреатического сока больных, страдающих раком поджелудочной железы или двенадцатиперстной кишки, путем иммунопреципитации с антителами к пХЭ. Основное отличие FAP от пХЭ заключается в степени гликозилирования и составе олигосахаридов, принимающих участие в этом процессе [52].

В настоящее время достоверно установлено, что у человека основным источником пХЭ в содержимом двенадцатиперстной кишки является поджелудочная железа. Этот вывод сделан на основании отсутствия пХЭ в желчи, слюне и желудочном соке и увеличения концентрации пХЭ в дуоденальном содержимом после стимуляции поджелудочной железы секретином или панкреозимином [7]. Таким образом по секреции пХЭ можно оценивать внешнесекреторную функцию поджелудочной железы, хотя наибольшее распространение получили методы оценки активности других панкреатических ферментов: липазы, амилазы, трипсина. На базе Центрального Научно-исследовательского института гастроэнтерологии МЗ России было проведено широкомасштабное исследование содержания пХЭ

в дуоденальном содержимом у здоровых людей и больных хроническим панкреатитом. При сопоставлении показателей секреции пХЭ у больных хроническим панкреатитом и лиц контрольной группы в базальных условиях не было выявлено статистически достоверного различия. Тогда как в ответ на стимуляцию поджелудочной железы у здоровых и больных хроническим панкреатитом секреция пХЭ изменялась по-разному. У большинства больных (90 %) в ответ на стимуляцию поджелудочной железы секреция пХЭ снижалась, при этом обычно наблюдалось снижение и других панкреатических ферментов: амилазы, липазы, трипсина. Интересно отметить, что была группа больных (5 %), у которых уровень амилазы, липазы и трипсина не был изменен, а единственным показателем, позволившим выявить нарушения внешнесекреторной функции поджелудочной, являлось уменьшение секреции пХЭ. Помимо больных хроническим панкреатитом снижение секреции пХЭ наблюдается у больных с панкреонекрозом, кистами и кальцинозом поджелудочной железы. Таким образом, исследование активности пХЭ в дуоденальном содержимом в динамике показало возможность его применения в качестве критерия тяжести течения и прогрессирования заболевания [7].

Высокую диагностическую ценность имеет измерение уровня пХЭ в сыворотке крови больных. При обследовании больных с аденокарциномой поджелудочной железы, острой или хронической формой панкреатита и заболеваниями печени (цирроз и хронический гепатит) были выявлены определенные закономерности. Так титр пХЭ в крови резко возрастал при остром панкреатите и снижался при аденокарциноме поджелудочной железы, при этом у больных хроническим панкреатитом, хроническим

гепатитом или циррозом уровень пХЭ оставался на том же уровне, что и в контрольной группе [45]. Таким образом, определение концентрации пХЭ в крови помогает провести дифференциальную диагностику и отличить онкологические заболевания поджелудочной железы от острого и хронического панкреатита.

С использованием метода иммуногистохимии показано наличие у больных с ацииарно-клеточной карциномой поджелудочной железы стабильной позитивной реакции на маркеры ацинарных клеток, включая пХЭ, панкреатический секреторный ингибитор трипсина, панкреатическую фосфолипазу А2 [39]. На основании этих данных авторы делают вывод о необходимости выявления в гистологических срезах ферментов панкреатической группы для дифференциальной диагностики ацинарно-клеточного рака поджелудочной железы.

В настоящее время нет литературных данных об обнаружении антител к пХЭ в сыворотке крови при различных патологических процессах. Возможно, что при тяжелых формах заболеваний поджелудочной железы (хронический рецидивирующий панкреатит, киста) в крови больных появляются аутоиммунные антитела к пХЭ, которые усугубляют тяжесть течения болезни. В этом случае выявление таких

антител может иметь диагностическую и прогностическую значимость.

^ % ^

В представленном обзоре литературы изложены современные научные данные о пока еще мало изученном ферменте поджелудочной железы - панкреатической холестеролэстеразе. Анализ работ позволил

нарисовать общую картину структурной организации молекулы фермента пХЭ и гена, ее кодирующего. Большое внимание уделено С-концевой части молекулы белка, уникальной для человеческой пХЭ. Эта структура содержит богатые пролином повторяющиеся участки аминокислотных последовательностей, функция которых до настоящего времени полностью не изучена. Доказано, что именно в этом участке происходит О-гликозилирование белка, в тоже время пролин-богатые повторы не влияют на ферментативную активность пХЭ, Ы-гликозилирование фермента, его способность взаимодействовать с солями желчных кислот. Таким образом, показана возможность существования других, не изученных пока функций пролин-богатых повторов, например, наличия в них антигенной детерминанты белка. Анализ современных молекулярно-биологических подходов к изучению белков, экспрессируемых различными тканями человеческого организма, позволил наметить основные этапы представляемого научного исследования. Практическая значимость изучения пХЭ становится понятна исходя из ее участия в физиологических процессах, протекающих в организме в норме и при патологических процессах, связанных с нарушением функции поджелудочной железы. Показана диагностическая ценность измерения уровня пХЭ в дуаденальном содержимом, в сыворотке крови больных острым и хроническим панкреатитом, онкологических больных с аденокарциномой поджелудочной железы, что дает возможность предположить диагностическую ценность наличия аутоиммунных антител к пХЭ, как реакции организма на хронический избыточный выброс фермента в кровь. Все эти сведения послужили предпосылкой для выполнения третьей части диссертационной

работы, посвященной обнаружению антител к пХЭ у больных с кистами поджелудочной железы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ильина, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Иммуноскринингом клонотеки кДНК из инсулиномы человека в экспрессирующем плазмидном векторе pUEXl антисывороткой к суммарным белкам инсулиномы отобран рекомбинантный клон, синтезирующий белок, идентичный С-концевому фрагменту панкреатической холестеролэстеразы человека, содержащий антигенную детерминанту.

2. Получена иммунологически активная антисыворотка морской свинки к суммарным белкам инсулиномы человека, содержащая антитела к панкреатической холестеролэстеразе.

3. С помощью клонирования фрагментов кДНК панкреатической холестеролэстеразы человека в экспрессирующий плазмидный вектор pUEX, экспрессии гибридных белков в клетках Е. Coli и анализа их иммуноферментными методами установлена локализация антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы в области пролин-богатых повторов.

4. Выделенные рекомбинантные белки, содержащие антигенную детерминанту панкреатической холестеролэстеразы человека, использованы в качестве антигена для разработки твердофазного иммуноферментного анализа наличия антител к панкреатической холестеролэстеразе.

5. Разработан лабораторный вариант иммуноферментного метода, позволяющего выявлять антитела к панкреатической холестеролэстеразе человека в сыворотке крови человека и морской свинки.

6. При проведении клинической апробации разработанного иммуноферментного метода определения антител к панкреатической холестеролэстеразе человека на сыворотках крови больных с нарушением функций поджелудочной железы установлено наличие искомых антител у пациентов с кистами головки поджелудочной железы.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Y.A. Pankov, М.К. Chekhranova, E.R. Schuvalova, A.M. Kutin, E.N. Ilyina, A.B. Valentsova. Utilization of a human insulinoma cDNA library to identify novel proteins of islet cells. Abst. P-17.04.036, p.541 in "Ninth International Congress of Endocrinology" abstracts, France, Nice, 1992.

2. М.К. Чехранова, E.H. Ильина, E.P. Шувалова, Д.Ю .Панков, Ю.А. Панков. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия в Escherichia coli С-концевого участка человеческой холестерол-эстеразы/липазы, содержащего антигенную детерминанту белка. Молекулярная биология, 1994, т. 28, стр. 464-467.

3. М.К. Чехранова, Е.Р. Шувалова, Е.Н. Ильина, Д.Ю. Панков, С.Б. Дябирова, Ю.А. Панков. Исследование структурных генов, экспрессирующихся в инсулиноме человека. Вестник РАМН, 1994, т. 12, стр. 17-19.

4. Y.A. Pankov, М.К. Chekhranova, E.N. Il'ina, E.R. Schuvalova, S.B. Diybirova, D.Yu. Pankov. Proline-rich repeats are the antigenic determinants of human carboxylic ester hydrolase/lipase. Abst. P. 49 in "Third International Symposium on Bioorganic Chemistry" abstracts, Dagomys, 1995.

5. Y.A. Pankov, M.K. Chekhranova, E.N. Il'ina, S.B. Diybirova, E.R. Schuvalova, V.N. Goncharova, V.A. Gorelysheva, O.M. Smirnova. Antibodies to human pancreatic cholesterol esterase as markers of late diabetic complications. P3-866 Reproduction Poster Presentations of 10th International Congress of Endocrinology, San Francisco, USA, 1996.

6. M.K. Чехранова, E.H. Ильина, E.P. Шувалова, C.B. Дябирова, A.B. Винокурова, В.M. Садоков, Ю.А. Панков. Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного метода определения аутоантител. III Всероссийский съезд эндокринологов. Тезисы докладов, стр. 26, 1996.

7. Ю.А. Панков, М.К. Чехранова, E.H. Ильина, Е.Р. Шувалова, C.B. Дябирова. Локализация антигенной детерминанты панкреатической холестеролэстеразы человека в пролин-богатых повторах. Молекулярная биология, 1997, т. 31, стр. 160-162.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Представленное исследование проводилось в рамках общего направления научной работы лаборатории молекулярной эндокринологии ЭНЦ РАМН, посвященного изучению гуморальных маркеров инсулин зависимого сахарного диабета. Объектом была выбрана секретируюгцая инсулинома человека, из ткани которой сконструирована клонотека кДНК в экспрессирующем плазмидном векторе риЕХ1 и выделена суммарная фракция экспрессируемых белков.

На первом этапе диссертационной работы решены проблемы получения антисыворотки морской свинки к суммарным белкам инсулиномы человека и использования ее для скрининга имеющейся клонотеки кДНК. Оригинальность этого подхода состояла в использовании одного и того же образца ткани для конструирования клонотеки кДНК и иммунизации морских свинок. В этом случае можно утверждать, что антитела в организме морской свинки вырабатываются к тем же белкам, чьи кДНК представлены в клонотеке. В результате иммуноскрининга клонотеки кДНК полученной антисывороткой морской свинки выявлен рекомбинантный клон рН1СЕ0.9, содержащий вставку кДНК С-концевого участка пХЭ человека. Эти данные подтверждены на генном уровне с помощью определения нуклеотидной последовательности концевых фрагментов вставки кДНК и построения ее рестриктной карты. Специфичность антисыворотки морской свинки к С-концу пХЭ человека была подтверждена методом иммуноблотта. Дальнейшие этапы диссертационной работы носили как фундаментальный, так и прикладной характер и представляли изучение свойств фрагмента пХЭ человека молекулярно-биологическими, биохимическими и иммунологическими методами.

Фермент поджелудочной железы человека пХЭ до настоящего времени изучен не полностью, возможно, в силу сложности своей организации. Наиболее полно представлены данные о первичной структуре [68], ферментативной активности пХЭ человека [21], процессах К- и О-гликозилирования белка [31, 69]. При этом ряд важных биологических свойств этого фермента остаются не исследованными. Так, однозначно не установлен механизм активации пХЭ солями желчных кислот, нет единого мнения о функциональной значимости С-концевого фрагмента пХЭ человека, содержащего уникальные пролин-богатые повторы. До настоящего времени не установлена трехмерная структура пХЭ человека, хотя существуют данные компьютерного моделирования [25]. Сведения об иммунологической активности пХЭ носят отрывочный характер и ограничиваются наблюдением об уникальности антител, вырабатываемых к пХЭ человека, в отличие от антител к пХЭ быка, собаки, крысы, перекрестно реагирующих между собой [64].

Совокупность полученных на первом этапе работы данных позволили сделать предположение о локализации антигенной детерминанты пХЭ человека в С-концевом домене. Второй этап диссертационного исследования носит фундаментальный характер и направлен на изучение природы иммунногенности пХЭ человека. В результате проведенных на молекулярном уровне экспериментов показана локализация антигенной детерминанты пХЭ человека в области пролин-богатых повторов типа

РУРРТОБЗОАР, и таким образом, однозначно установлена одна из функций этой уникальной белковой структуры. Кроме того, созданы бактериальные штаммы-продуценты, экспрессирующие антигенную детерминанту пХЭ человека в составе гибридного белка с 3-галактозидазой (рН1СЕ0.9, рНГСЕМ).

Последующие разработки носили прикладной характер и иллюстрировали возможность практического использования созданных бактериальных штаммов-продуцентов антигенной детерминанты пХЭ человека. Выделенные гибридные белки, экспрессируемые этими бактериальными клонами, использованы в качестве антигена для разработки твердофазного иммуноферментного метода выявления антител к пХЭ человека. Лабораторный вариант иммуноферментного метода разработан с использованием антисыворотки морской свинки к суммарным белкам инсулиномы, содержащей антитела к пХЭ человека. Специфичность разработанной тест-системы подтверждена истощением иммунопозитивной антисыворотки в результате предыинкубации с белком-антигеном.

Существующие в мировой научной литературе данные об изменении уровня пХЭ в сыворотки крови человека при различных заболеваниях поджелудочной железы (острый и хронический панкреатит, рак) [] позволили сделать предположение о возможном образовании антител к пХЭ у больных с хроническими патологиями поджелудочной железы.

По данным клинической апробация разработанного иммуноферментного метода определения антител к пХЭ на сыворотках больных с различными хроническими патологиями поджелудочной железы, антитела к пХЭ встречаются преимущественно в группе больных хроническим панкреатитом с диагностированными кистами головки поджелудочной железы.

Сейчас в мире возрос интерес к пХЭ в связи с обнаружением экспрессии этого белка в макрофагах и мононуклеарах крови [42], а также эндотелиальных клетках стенки аорты [43]. Последний факт является наиболее интересным, так как служит основанием предполагать наличие связи между уровнем экспрессии пХЭ клетками стенок кровеносных сосудов и развитием атеросклероза. Одновременно исследуются процессы активации пХЭ солями желчных кислот [48], влияние пХЭ на абсорбцию пищевого холестерина [34, 51], предприняты попытки моделирования трехмерной структуры белка [25]. На общем фоне исследований, посвященных пХЭ, представленная диссертационная работа вносит вклад в установление одной из функций пролин-богатых повторов пХЭ человека и изучение иммунологических свойств этого фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ильина, Елена Николаевна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Богер М.М. Методы исследования поджелудочной железы, Новосибирск: Наука, 1982.

2. Горскова В.А. Изучение спектров аутоантител при инсулинозависимом сахарном диабете и стрептозотоциновом диабете крыс. Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М. : Эндокринологический Научный Центр РАМН, 1996.

3. ГловерД. Клонирование ДНК. Методы, М.: Мир, 1988.

4. Малазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. Методы молекулярной генетики и генной инженерии, Новосибирск: Наука, 1990.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М. : Мир, 1984.

6. Чехранова М.К., Шувалова Е.Р., Кутин A.M., Бутнев В.Ю., Валенцова А.Б., Ильина Е.Н., Панков Ю.А. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия кДНК препроинсулина из инсулиномы человека в Escherichia coli.- Молекулярная биология, 1992, т. 26, с. 596-600,.

7. Шибаева Л.О. Оценка внешнесекреторной функции поджелудочной железы по активности холестеролэстеразы в дуаденальном содержимом. Автореф. дис. на соискание степени канд. мед. наук. М. : Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, 1989.

8. Abouakil N., Mas Е., Bruneau N., Benajiba A. and Lombardo D. Bile Salt-Dependent Lipase Biosynthesis in Rat Pancreatic AR-4-2 J-Cells - Essential Requirement of N-Linked Oligosaccharide for Secretion and Expression of a Fully Active Enzyme.- J Biol Chem, 1993, v. 268, p. 25755-25763.

9. Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. and Lombardo D. Purification of pancreatic carboxylic-ester hydrolase by immunoaffinity and its application to the human bile-salt-stimulated lipase.- Biochim Biophys Acta, 1988, v. 961, p. 299-308.

10. Baba T., Downs D.,Jackson K., Tang Y., Wang Ch.-S. Structure of human milk bile salt activated lipase.- Biochemistry, 1991, v. 30, p. 500-510.

11. Blackberg L., Angquist K.A. and Hernell O. Bile-salt-stimulated lipase in human milk: evidence for its synthesis in the lactating mammary gland.-FEBS Letters, 1987, v. 217, p. 37-41.

12. Blackberg L., Stromqvist M., Edlund M., Juneblad K., Lundberg L., Hansson L., and Hernell O. Recombinant human-milk bile-salt-stimulated lipase - Functional properties are retained in the absence of glycosylation and the unique proline-rich repeats.- Eur J Biochem, 1995, v. 228, p. 817821.

13. Bruneau N., Delaporte P.L., Sbarra V. and Lombardo D. Association of bile salt-dependent lipase with membranes of human pancreatic microsomes.- Eur J Biochem, 1995, v. 233, p. 209-218.

14. Chen J.C.H., Miercke L.J.W., Krucinski J., Starr J.R., Saenz G., Wang X., Spilburg C.A., Lange L.G., Ellsworth J.L., Stroud R.M. Structure of Bovine Pancreatic Cholesterol Esterase at 1.6 A: Novel Structural Features Involved in Lipase Activation.- Biochemistry, 1998, v. 37, p. 5107-5117.

15. Christie D.L., Cleverly D.R. and O'Connor C.J. Human milk bile-salt stimulated lipase; Sequence similarity with rat lisophospholipase and homology with the active site region of cholinesterase.- FEBS Lett, 1991, v. 278, p. 190-194.

16. Colwell N.S., Aleman-Gomez J.A. and Kumar B.V. Molecular cloning and expression of rabbit pancreatic cholesterol esterase.- Biochim Biophys Acta, 1993, v. 1172, p. 175-180.

17. Cox D.G., Tom Leung C.K., Kyger E.M., Spilburg C.A. and Lange L.G. Pancreatic cholesterol esterase. 1. Pancreatic cholesterol esterase induction during maturation.- Biochemistry, 1990, v. 29, p. 3842-3848.

18. Deaizpurua H.J., Harrison L.C. and Cram D.S. An ELISA for Antibodies to Recombinant Glutamic Acid Decarboxylase in IDDM.- Diabetes, 1992, v. 41, p. 1182-1187.

19. DeCaro J., Boudouard M., Bonicel J., Guidoni A., Desnuelle P., Rovery M. Porcine pancreatic lipase. Completion of primary structure.- Biochim Biophys Acta, 1981, v. 671, p. 129-138.

20. Dipersio L.P., Carter C.P. and Hui D.Y. Exon 11 of the Rat Cholesterol Esterase Gene Encodes Domains Important for Intracellular Processing and Bile SaltModulated Activity of the Protein.- Biochemistry, 1994, v. 33, p. 3442-3448.

21. Dipersio L.P., Fontaine R.N. and Hui D.Y. Identification of the active site serine in pancreatic cholesterol esterase by chemical modification and sitespecific mutagenesis.- J Biol Chem, 1990, v. 265(28), p. 16801-16806.

22. Downs D., Xu Y.Y., Tang J. and Wang C.S. Proline-rich domain and glycosylation are not essential for the enzymic activity of bile salt-activated lipase. Kinetic studies of T-BAL, a truncated form of the enzyme, expressed in Escherichia coli.- Biochemistry, 1994, v. 33, p. 7979-7985.

23. Duan R.D. and Borgstrom B. Is there a specific lysophospholipase in human pancreatic Juice.- Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1167, p. 326330.

24. Escribano M.J., Imperial S. Purification and molecular characterization of FAP, a feto-acinar protein associated with the differentiation of human pancreas.- J Biol Chem, 1989, v. 264, p. 3780-3787.

25. Feaster S.R., Quinn D.M., Barnett B.L. Molecular modeling of the structures of human and rat pancreatic cholesterol esterases.- Protein Sci, 1997, v. 6, p. 73-79.

26. Fontaine R.N., Carter C.P. and Hui D.Y. Structure of the rat pancreatic cholesterol esterase gene.- Biochemistry, 1991, v. 30, p. 7008-7014.

27. Freed L.M., Berkow S.E., Hamosh P., York C.M., Mehta N.R. and Hamosh M. Lipases in human milk: effect of gestational age and length of lactation on enzyme activity.- Journal of the American College of Nutrition, 1989, v. 8, p. 143-150.

28. Freed L.M., York C.M., Hamosh P., Mehta N.R. and Hamosh M. Bile saltstimulated lipase of human milk: characteristics of the enzyme in the milk of mothers of premature and full-term infants.- Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, 1987, v. 6, p. 598-604.

29. Gjellesvik D.R., Lombardo D., Walther B.T. Pancreatic bile salt dependent lipase from cod (Gadus morhua): purification and properties.- Biochim Biophys Acta, 1992, v. 1124, p. 123-134.

30. Han J.H., Stratowa C., Rutter W.J. Isolation of full-length putative rat lysophospholipase cDNA using improved methods for mRNA isolation and cDNA cloning.- Biochemistry, 1987, v. 26, p. 6077-6081.

31. Hansson L., Blackberg L., Edlund M., Lund berg L., Stromavist M. and Hernell O. Recombinant Human Milk Bile Salt-Stimulated Lipase - Catalytic Activity Is Retained in the Absence of Glycosylation and the Unique Proline-Rich Repeats.- J Biol Chem, 1993, v. 268, p.26692-26698.

32. Hernell O. and Blackberg L. Human milk bile salt-stimulated lipase: Functional and molecular aspects. - J Pediatr 125( 5 Suppl 1994 ; Part 2):S56-S61, 1994.

33. Hernell O., Blackberg L., Chen Q., Sternby B. and Nilsson A. Does the bile salt-stimulated lipase of human milk have a role in the use of the milk long-chain polyunsaturated fatty acids.- Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, 1993, v. 16, p. 426-431.

34. Howies PN, Carter CP, Hui DY Dietary free and esterified cholesterol absorption in cholesterol esterase (bile salt-stimulated lipase) gene-targeted mice.- J Biol Chem, 1996, v. 271, p. 7196-7202.

35. Hui D.Y. and Kissel J.A. Sequence identity between human pancreatic cholesterol esterase and bile salt-stimulated milk lipase.- FEBS Lett, 1990, v. 276, p. 131-134.

36. Kissel J.A., Fontaine R.N., Turck C.W., Brockman H.L. and Hui D.Y. Molecular cloning and expression of cDNA for rat pancreatic cholesterol esterase.- Biochim Biophys Acta, 1989, v. 1006, p. 227-236.

37. Kumar B.V., Aleman-Gomez J.A., Colwell N., Lopez-Candales A., Bosner M.S., Spilburg C.A., Lowe M. and Lange L.G. Structure of the human pancreatic cholesterol esterase gene.- Biochemistry, 1992, v. 31, p. 60776081.

38. Kumar V.B., Sasser T., Mandava J.B., al Sadi H., Spilburg C. Identification of 5' flanking sequences that affect human pancreatic cholesterol esterase gene expression.

39. Kuopio T., Ekfors T.O., Nikkanen V., Navalainen T. Acinar cell carcinoma of the pancreas - report of three cases.- ARMIS, 1995, v. 103, p. 69-78

40. Kyger E.M., Wiegand R.C. and Lange L.G. Cloning of the bovine pancreatic cholesterol esterase/lysophospholipase.- Biochem Biophys Res Commun, 1989, v. 164, p. 1302-1309.

41. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.- Nature, 1970, v. 227, p. 680-685.

42. Li F., Hui D.Y. Modified low density lipoprotein enhances the secretion of bile salt-stimulated cholesterol esterase by human monocyte-macrophages. Species-specific difference in macrophage cholesteryl ester hydrolase.- J Biol Chem, 1997, v. 272, p. 28666-28671

43. Li F., Hui D.Y. Synthesis and secretion of the pancreatic-type carboxyl ester lipase by human endothelial cells.- Biochem J, 1998, v. 329, p. 675679.

44. Lidberg U., Nilsson J., Stromberg K., Stenman G., Sahlin P., Enerback S. and Bjursell G. Genomic organization, sequence analysis, and chromosomal localization of the human carboxyl ester lipase (CEL) gene and a CEL-like (CELL) gene.- Genomics, 1992, v. 13, p. 630-640.

45. Lombardo D., Montalto G., Roudani S., Mas E., Laugier R., Sbarra V., Abouakil N. Is bile salt-dependent lipase concentration in serum of any help in pancreatic cancer diagnosis.- Pancreas, 1993, v. 8, p. 581-588

46. Lombardo D., O. Guy, C. Figarella. Purification and characterization of a carboxyl ester hydrolase from human pancreatic juice.- Biochim Biophys Acta, 1978, v. 527. p. 142-149.

47. Loomes K.M. Structural organisation of human bile-salt-activated lipase probed by limited proteolysis and expression of a recombinant truncated variant.- Eur J Biochem, 1995, v. 230, p. 607-613.

48. Loomes K.M., Senior H.E. Bile salt activation of human cholesterol esterase dose not require protein dimerisation.- FEBS lett, v. 405, p. 369372.

49. Lopez-Candales A., Grosjlos J., Sasser T., Buddhiraju C., Scherrer D., Lange L.G., Kumar V.B. Dietary induction of pancreatic cholesterol esterase: a regulatory cycle for the intestinal absorption of cholesterol.- Biochem Cell Biol, 1996, v. 74, p. 257-264.

50. Lowe M.E., Rosenblum J.L. and Strauss A.W. Cloning and characterization of human pancreatic lipase cDNA.- J Biol Chem, 1989, v. 264, p. 20042-20048.

51. Mackay K., Starr J.R., Lawn R.M., Ellsworth J.L. Phosphatidylcholine hydrolysis is required for pancreatic cholesterol esterase- and phospholipase A2-facilitated cholesterol uptake into intestinal Caco-2 cells.- J Biol Chem, 1997, v. 272, p. 13380-13389.

52. Mas E., Abouakil N., Roudani S., Miralles F., Guycrotte O., Figarella C., Escribano M. J., Lombardo D. Human fetoacinar pancreatic protein - an oncofetal glycoform of the normally secreted pancreatic bile-salt-dependent lipase.- Biochim J., 1993, v. 289, p. 609-615.

53. Nilsson J., Blackberg L., Carlsson P., Enerback S., Hernell O. and Bjursell G. cDNA cloning of human-milk bile-salt-stimulated lipase and evidence for its identity to pancreatic carboxylic ester hydrolase.- Eur J Biochem, 1990, v. 192, p. 543-550.

54. Nilsson J., Hellquist M. and Bjursell G. The human carboxyl ester lipase -like (CELL) gene is ubiquitously expressed and contains a hypervariable region.- Genomics, 1993, v. 17, p. 416-422.

55. Pasqualini E., Caillol N., Mas E,. Bruneau N., Lexa D., Lombardo D. Association of bile-salt-dependent lipase with membranes of human pancreatic microsomes is under the control of ATP and phosphorylation.-Biochem J, 1997, v. 327, p. 527-535.

56. Patton J.S., Warner T.G., Benson A.A. Partial characterization of the bile salt-dependent triacilglycerol lipase from the leopard shark pancreas.-Biochim Biophys Acta, 1993, v. 486, p. 322-330.

57. Reue K., Zambaux J., Wong H., Lee G., Leete T.H., Ronk M., Shively J.E., Sternby B., Borgstrom B., Ameis D. cDNA cloning of carboxyl ester lipase from human ancreas reveals a unique proline-rich repeat unit.-J Lipid Res., 1991, v. 32, p. 267-276.

58. Roudani S., Miralles F., Margotat A., Escribano M.J. and Lombardo D. Bile salt-dependent lipase transcripts in human fetal tissues.- Bba-Gene Struct Express, 1995, v. 1264, p. 141-150.

59. Roudani S., Pasqualini E., Margotat A., Gastaldi M., Sbarra V., Malezetdesmoulin C. and Lombardo D. Expression of a 46 kDa protein in human pancreatic tumors and its possible relationship with the bile salt-dependent lipase.- Eur J Cell Biol, 1994, v. 65, p. 132-144.

60. Rudd E.A., Mizuno N.K. and Brockman H.L. Isolation of two forms of carboxylester lipase (cholesterol esterase) from porcine pancreas.- Biochim Biophys Acta, 1987, v. 918, p. 106-114.

61. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.-Proc Natl Acad Sci USA, 1977, v. 74, p. 5463-5467.

62. Sbarra V., Mas E., Henderson T.R., Hamosh M., Lombardo D., Hamosh P. Digestive lipases of the newborn ferret: compensatory role of milk bile salt-dependent lipase.- Pediatr Res, 1996, v. 40, p. 263-268

63. Singh S. and Gupta J. Some physicochemical properties of human milk bile-salt activated lipase.- Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 1991, v. 28, p. 155-157.

64. Spilburg C.A., Cox D.G., Wang X., Bernat B.A., Bosner M.S., Lange L.G. Identification of a species specific regulatory site in human pancreatic cholesterol esterase.- Biochemistry, 1995, v. 34, p. 15532-15538.

65. Taylor A.K., Zambaux J.L., Klisak I., Mohandas T., Sparker S.R., Schotz M.C., Lusis A.J. Carboxyl ester lipase: a highly polymorphic locus on human chromosome 9qter.- Genomics, 1991, v. 10, p. 425-431.

66. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheet: Procedure and some applications.- Proc Natl Acad Sci USA, 1979, v. 76, p. 4350-4354.

67. Wang C.S. and Hartsuck J.A. Bile salt-activated lipase. A multiple function lipolytic enzyme (review).- Biochim Biophys Acta, 1993, v. 1166, p. 1-19.

68. Wang C.S. Purification of carboxyl ester lipase from human pancreas and the amino acid sequence of the N-terminal region.- Biochem Biophys Res Commun, 1988, v. 155, p. 950-955.

69. Wang C.S., Dashti A., Jackson K.W., Yeh J.C., Cummings R.D. and Tang J. Isolation and characterization of human milk bile salt-activated lipase C-tail fragment.- Biochemistry, 1995, v. 34, p. 10639-10644.

70. Wang C.S., Martindale M.E., King M.M. and Tang J. Bile-salt-activated lipase: effect on kitten growth rate.- American Journal of Clinical Nutrition, 1989, v. 49, p. 457-463.

71. Wang X., Wang C.S., Tang J., Dyda F., Zhang X.C. The crystal structure of bovine bile salt activated lipase: insights into the bile salt activation mechanism.- Structure, 1997, v. 5, p. 1209-1218.

72. Winkler F.K., D'Arcy A. and Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase.- Nature, 1990, v. 343, p. 771-774.

73. Withiam-Leitch M., Rubin P.R., Koshlukova S.E. and Aletta J.M. Identification and characterization of carboxyl ester hydrolase as a phospholipid hydrolyzing enzyme of zymogen granule membranes from rat exocrine pancreas.- J Biol Chem, 1995, v. 270, p. 3780-3787.