Создание ферментных препаратов нового поколения на основе мицелиального гриба Penicillium verruculosum для применения в кормопроизводстве тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Шашков, Игорь Александрович

• Шашков, Игорь Александрович
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Шашков, Игорь Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 1

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ-КАРБОГИДРАЗЫ, ИХ СВОЙСТВА И 11 ПРИМЕНЕНИЕ

1.1. Общие представления о карбогидразах 1

1.2. Использование карбогидраз в качестве кормовых добавок

1.3. Микроорганизмы-продуценты карбогидраз

1.4. Характеристика реципиентного штамма Pénicillium verruculosum 537

1.5. Оптимизация процесса культивирования микроорганизмов для наиболее 35 эффективного биоиосинтеза ферментов

1.6. Культивирование микроорганизмов, получение сухих форм ферментных 38 препаратов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы 4

2.1.1. Штаммы P.verruculosum 4

2.1.2. Ферментные препараты 4

2.1.3. Субстраты 4

2.1.4. Реактивы

2.1.5. Составы питательных сред

2.2. Методы 4

2.2.1. Амплификация и клонирование целевых генов

2.2.2. Трансформация реципиентного штамма P.verruculosum 537

2.2.3. Культивирование рекомбинантных штаммов в качалочных колбах 4

2.2.4. Определение активности ферментов

2.2.5. Определение концентрации белка

2.2.6. Проведение электрофореза в денатурирующих условиях 5

2.2.7. Определение компонентного состава ферментных препаратов

2.2.8. Исследование влияния белковых ингибиторов ржи на активность 50 ксиланаз

2.2.9. Метод гидролиза целлюлозы хлористым водородом и серной кислотой 5

2.2.10. Определение индекса кристалличности разных видов МКЦ 5

2.2.11. Методика определения реакционной способности МКЦ при

ферментативном гидролизе

2.2.12. Определение состава и концентрации сахаров, экстрагируемых из МКЦ 53 в водной среде

2.2.13. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

2.2.14. Культивирование штаммов P.verruculosum на ферментационной 54 установке КФ-104/3

2.2.15. Высушивание супернатанта культуральной жидкости 5 5 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 5

3.1. Получение рекомбинантных штаммов P.verruculosum и ферментных 57 препаратов серии EX

3.1.1. Амплификация генов целевых ферментов, создание генетических 57 конструкций для трансформации реципиентного штамма P.verruculosum

537

3.1.2. Трансформация штамма-реципиента P.verruculosum 537

3.1.3. Селекция активных рекомбинантных штаммов в качалочных колбах

3.1.4. Стабильность продукции целевых ферментов рекомбинантными 63 штаммами серии P.verruculosum EX

3.1.5. Культивирование штаммов-продуцентов серии P.verruculosum ЕХв 63 лабораторных ферментерах

3.1.6. Сравнительный анализ активности и компонентного состава ферментных 67 препаратов штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 и штамма-реципиента P.verruculosum

3.1.7. Свойства рекомбинантных ферментных препаратов

3.2. Выбор вида микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) для процесса

культивирования штаммов P.verruculosum EX13 и EX35

3.2.1. Индекс кристалличности разных видов МКЦ

3.2.2. Реакционная способность различных видов МКЦ при ферментативном 79 гидролизе

3.2.3. Состав и концентрация сахаров, экстрагируемых из МКЦ в водной среде 8

3.3. Культивирование штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 на питательной 86 среде с разными видами МКЦ

3.4. Оптимизация процесса культивирования штаммов P.verruculosum ЕХ13 и 96 ЕХ35

3.4.1. Выбор рН ферментационной среды для штамма P. verruculosum ЕХ13 9

3.4.2. Влияние снижения концентрации МКЦ в ферментационной среде на 98 результативность процесса культивирования P.verruculosum EX13

3.4.3.Изменение концентрации дрожжевого экстракта в ферментационной среде 10

3.4.4. Замена кристаллической глюкозы и дрожжевого экстракта на глюкозную 102 патоку и смесь кукурузного экстракта и соевой муки

3.4.5. Замена соевой муки на мочевину 1 0

3.4.6. Культивирование штамма P.verruculosum EX35 в 3-л ферментёрах в 111 оптимальных для штамма P.verruculosum EX13 условиях

3.5. Применение штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 в производственных 113 Условиях

3.6. Испытания промышленных ферментных препаратов, полученных с 117 помощью штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 в кормлении поросят

и цыплят-бройлеров

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1

ПРИЛОЖЕНИЯ 1 3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БГ - Р-Глюкозидаза

ВС - восстанавливающие сахара

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭ - дрожжевой экстракт

ИК - индекс кристалличности

ИС - инокулятная питательная среда

КМЦ - Ка-соль карбоксиметилцеллюлозы

КЖ - культуральная жидкость

Ксил - ксиланаза

КУК - кукурузный экстракт

КФ - классификация ферментов (код фермента)

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

МФС - модифицированная ферментационная среда

НПС - некрахмальные полисахариды

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПФС - промышленная ферментационная среда

РНК - рибонуклеиновая кислота

РС - реакционная способность

СКК - питательная среда для качалочных колб

СМ - соевая мука

СП - степень полимеризации

СФС - стандартная ферментационная среда

ФП - ферментный препарат

ЦБГ - целлобиогидролаза

ЦСД - целлюлозо-связывающий домен

ЦСМ - целлюлозосодержащие материалы

ЭГ - эндоглюканаза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание ферментных препаратов нового поколения на основе мицелиального гриба Penicillium verruculosum для применения в кормопроизводстве»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Активное применение ферментных препаратов (ФП) в животноводстве началось в 80-е годы прошлого века, на сегодняшний день они являются обязательным компонентом практически всех комбикормов, использующихся при кормлении моногастричных животных (птицы и свиней). Главной причиной добавления ферментов в комбикорма является их способность эффективно расщеплять так называемые антипитательные вещества, содержащиеся в этих кормах, в основном некрахмальные полисахариды (НПС), которые состоят из целлюлозы, арбиноксиланов, Р-глюканов и различных олигосахаридов и могут находиться как в растворимой, так и нерастворимой в водной среде форме. Содержание НПС в основных компонентах комбикормов (в России это пшеница, ячмень, овёс, рожь) колеблется в диапазоне от 8% по сухим веществам (пшеница) до 25% (овёс). Кроме того, что НПС не перевариваются в желудочно-кишечном тракте свиней и птицы из-за отсутствия собственных ферментов, они значительно ухудшают переваривание и всасывание основных питательных веществ, повышают вязкость химуса и замедляют транзит корма в пищеварительном тракте. Помимо вышеперечисленных проблем, непереваренные остатки корма, оказавшись в нижнем отделе кишечника, способствуют размножению патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что негативно сказывается на здоровье и продуктивности животных.

Эффективным способом снизить отрицательное влияние НПС на усвоение корма является добавление в него ФП карбогидраз, содержащих целлюлазы, Р-глюканазы и ксиланазы. Рядом авторов показано, что добавление высокоактивных кормовых ФП в количестве 50-100 г/т приводит к существенному улучшению конверсии корма и его усвояемости.

При создании эффективных в практическом применении кормовых ФП нового поколения необходимо выполнить ряд важных условий: обеспечить высокую активность ферментов по отношению к НПС; максимально увеличить содержание в составе ФП эндодеполимераз, которые способны расщеплять входящие в состав НПС полисахариды с уменьшением их вязкости, и снизить содержание балластных ферментов (экзодеполимераз); добиться высокой термостабильности ферментов, учитывая, что одна из стадий производства комбикормов - грануляция, проходит при 80°С и ферменты должны сохранять в этих условиях свою активность; обеспечить устойчивость ферментов, в первую очередь ксиланаз, к белковым ингибиторам злаков.

Отметим, что далеко не все существующие на рынке кормовые ФП отвечают сформулированным выше требованиям. В связи с этим актуальной и важной задачей является создание микроорганизмов-продуцентов карбогидраз для их применения в

5

промышленном производстве кормовых ФП нового поколения. Для реализации этого необходимо: использовать секреторные возможности экспрессионной системы на основе штамма-реципиента РетсШтт уетгиси1о$ит и вектора с применением промотора целлобиогидролазы 1 (ЦБГ1) Р.уеггиси1о$ит для обеспечения высокого уровня биосинтеза целевых ферментов; подобрать в качестве целевых высокоактивные эндодеполимеразы (эндо-Р1,4-глюканазу, эндо-Р1,4-ксиланазу), способные эффективно разрушать НПС зерна злаков, имеющие высокую стабильность (в частности, в условиях гранулирования комбикормов) и не подверженные негативному влиянию белковых ингибиторов злаков; методами генетической инженерии встроить целевые гены в штамм-реципиент и отобрать рекомбинантные штаммы с наиболее высоким уровнем экспрессии целевых ферментов; использовать эти штаммы для промышленного производства кормовых ФП нового поколения.

Целью исследования являлось создание на основе штамма-реципиента мицелиального гриба Р.увггиси^ит 537 (niaD-) рекомбинантых штаммов-продуцентов внеклеточных карбогидраз для применения в качестве кормовых добавок нового поколения в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы.

В соответствии с поставленной целью исследования были сформулированы следующие задачи:

• Создать на основе штамма-реципиента P.verruсulosum 537 (niaD-) новые рекомбинантные штаммы-продуценты гетерологичной ксиланазы Е (КсилЕ) Р.сапе$сет, а также гомологичной эндоглюканазы 2 (ЭГ2) и КсилЕ.

• Оптимизировать состав питательной среды и условия культивирования новых рекомбинантных штаммов Р^еггисиОит - продуцентов ЭГ2 и КсилЕ в лабораторных ферментёрах.

• Исследовать возможность замены коммерческой импортной микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), как одного из наиболее дорогостоящих компонентов питательной среды, на отечественные аналоги.

• Получить на основе новых штаммов-продуцентов ферментные препараты, изучить их состав и свойства.

• Провести в производственных условиях наработку кормовых ферментных препаратов на основе новых штаммов-продуцентов.

• Испытать эти препараты в кормлении бройлеров и поросят.

Методы исследования. При выполнении работы были использованы следующие методы: методы генетической инженерии (амплификация и клонирование целевых генов,

трансформация), селекция и культивирование микроорганизмов в качалочных колбах, культивирование микроорганизмов в лабораторных 3-л ферментёрах, получение сухих форм ФП на лиофильной и распылительной сушилках, метод Лоури для определения концентрации белка, метод Шомоди-Нельсона для определения сахаров, глюкозооксидазно-пероксидазный метод для определения глюкозы, электрофорез в денатурирующих условиях, анионообменная и гидрофобная хроматография, MALDI-TOF масс-спектрометрия.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые для получения новых штаммов-продуцентов комплекса карбогидраз для трансформации реципиентного штамма Р.verruсulosum 537 (niaD-) был успешно использован шаттл-вектор pCBH1, содержащий гены egl2 и ху1Е, кодирующих ферменты ЭГ2 и КсилЕ.

Впервые, используя методы генной инженерии, на основе штамма-реципиента РуеггисиОит 537 (niaD-) были созданы новые штаммы-продуценты ферментов ЭГ2 и КсилЕ (Р.verruсulosum ЕХ13) и КислЕ (Рverruсulosum ЕХ35). Изучен состав и свойства новых ФП - ЕХ13 (на основе штамма Р.verruсulosum ЕХ13) и ЕХ35 (на основе Рverruсulosum ЕХ35). Новые ФП содержат в своём составе 58-64% целевых ферментов -эндодеполимераз, разрушающих НПС, которые проявляют активность и стабильность в широком диапазоне рН и температуры, в том числе обладают высокой стабильностью при 80°С (температуре гранулирования комбикормов); при этом КсилЕ не ингибируется белковыми ингибиторами злаков.

Изучено влияние физико-химических свойств МКЦ, таких как индекс кристалличности и реакционная способность при ферментативном гидролизе, на биосинтез ЭГ2 и КсилЕ штаммами Р.verruсulosum ЕХ13 и ЕХ35, показана возможность замены коммерческой импортной МКЦ на отечественные аналоги при культивировании новых штаммов-продуцентов кормовых ферментов.

Изучено влияние основных компонентов ферментационной питательной среды на биосинтез целевых ферментов новыми штаммами Р.verruсulosum ЕХ13 и ЕХ35, проведена оптимизация состава питательной среды и условий культивирования, в результате которой предложена модифицированная среда, обеспечивающая значительное увеличение выхода целевых ферментов ЭГ2 и КсилЕ.

Практическая значимость работы. Созданы рекомбинантные штаммы-продуценты Рverruсulosum ЕХ13 и Р.verruсulosum ЕХ35, на основе которых получены ФП с высоким содержанием эндодеполимераз (ЭГ2, КсилЕ), обладающих способностью к эффективной деструкции НПС.

В лабораторных условиях оптимизирован состав питательной среды и условия процесса культивирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35; полученные данные были успешно применены в условиях завода ООО «Агрофермент» (Тамбовская обл.) для получения промышленных партий ФП Агроксил Премиум (ЕХ13) и Агроксил Плюс (ЕХ35).

ФП Агроксил Премиум и Агроксил Плюс были успешно испытаны в качестве кормовой добавки в ФНЦ ВНИИТИП РАН (Сергиев Посад, 2017 г.) на бройлерах кросса «Кобб 500», а также во ВНИИФБиП (филиал ФНЦ ВИЖ РАН, Боровск, 2017 г.) на помесных поросятах мясных пород. Эти ФП оказывали положительное влияние на конверсию кормов, продуктивность и физиологическое состояние животных и птицы, качественные показатели мяса; показана экономическая целесообразность использования ФП в качестве кормовых добавок.

Представленные в данной работе результаты имеют большое практическое значение для последующего применения в промышленном производстве отечественных кормовых ФП нового поколения, способных эффективно замещать импортные аналоги. Научно-практическая новизна технических решений подтверждена патентом РФ. Положения, выносимые на защиту.

1. Созданы методами генетической инженерии на основе штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) стабильные высокоактивные рекомбинантные штаммы P.verruculosum ЕХ13 - продуцент ферментного комплекса с преобладанием ЭГ2 и КсилЕ и P.verruculosum ЕХ35 - ферментного комплекса с преобладанием КсилЕ.

2. Состав новых ФП, полученных на основе этих штаммов, изменился в сторону существенного увеличения содержания эндодеполимераз, разрушающих НПС; содержание экзодеполимераз (целлобиогидролаз) значительно уменьшилось.

3. Новые ФП проявляют КМЦ-азную (ЭГ2) и ксиланазную (КсилЕ) активность в широком диапазоне рН и температуры; ЭГ2 и КсилЕ обладают высокой стабильностью при температурах от 50 до 80°С; КсилЕ практически не ингибируется белковыми ингибиторами ржи. Эти свойства новых ФП являются важными положительными факторами при их использовании в качестве кормовых добавок.

4. МКЦ как дорогостоящий и импортируемый компонент питательной среды для культивирования штаммов P.verruculosum EX13 и EX35 можно заменить на отечественные аналоги без потери (или с увеличением) продуктивности штаммов целевых ферментов.

5. Оптимизированные состав питательной среды и условия культивирования штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 в лабораторных ферментёрах позволяют

8

значительно повысить продуктивность этих штаммов - в случае P.verruculosum ЕХ13 выход ЭГ2 увеличился в 1,3, КсилЕ - в 1,9 раза; в случае P .verruculosum ЕХ35 выход КсилЕ увеличился в 1,2 раза.

Личный вклад диссертанта. Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование, сбор и обработку данных, оформление и публикацию результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии). Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3, 4 и 11 паспорта специальности биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

Степень достоверности результатов проведенных исследований. Все исследования, представленные в данной работе, проводили с использованием современных методик, опубликованных в научных изданиях. Допущенные предположения, утверждения и выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены данными в виде таблиц и рисунков. Все расчёты проведены корректно, статистическая погрешность рассчитывалась в программе Microsoft Office Excel 2013 составила 8%.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде тезисов и докладов на следующих всероссийских и международных научных конференциях: V съезде физиологов СНГ, V съезде биохимиков России, Сочи, 2016 г.; V Международной конференции «Биотехнология: наука и практика», Ялта, 2017 г.; Международном форуме "Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2018 г.; Международном научно-практическом форуме «Перспективные технологии в агропромышленном комплексе», Краснодар, 2018 г.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, из которых 4 - в журналах, индексируемых в Web of Science, Scopus и RSCI, 4 представлены в сборниках научных статей и материалах конференций. Получен 1 патент РФ.

Связь работы с государственными программами. Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2014-2020 годы» Минобрнауки РФ в рамках соглашения о субсидии (идентификационный номер проекта RFMEFI60716X0159, 2016-

2018 гг.), а также с использованием научного оборудования ЦКП «Промышленные биотехнологии» и АЦКП «Биоинженерия» ФИЦ Биотехнологии РАН.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, 4 приложений, списка цитируемой литературы, включающего 201 ссылку. Диссертация изложена на 137 страницах печатного текста, включает 31 рисунок и 46 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫХ ИСТОЧНИКОВ

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ-КАРБОГИДРАЗЫ, ИХ СВОЙСТВА И

ПРИМЕНЕНИЕ

1.1. Общие представления о карбогидразах

Карбогидразы или гликозил-гидролазы - обширная группа ферментов, относящаяся к классу гликозидаз и катализирующих гидролитическое расщепление О-гликозидной связи в различных гликозидах, олиго- и полисахаридах, а также в углеводсодержащих соединениях [1]. Гены, которые кодируют синтез карбогидраз, были обнаружены практически у всех прокариот и эукариот, за исключением ряда архей и некоторых паразитических одноклеточных эукариот. В целом, на гликозил-гидролазы и их близкие гомологи приходится порядка 1 % всех известных генов [2,3].

Эволюционно близкородственные карбогидразы отличаются друг от друга своей субстратной специфичностью, а среди гомологов гликозил-гидролаз обнаружены ферменты, имеющие сродство к субстратам, нехарактерным для карбогидраз, а также белки, которые не являются ферментами [2,4-6].

Многие карбогидразы обладают сложной доменной структурой, причём разные домены одного белка часто могут иметь независимую эволюционную историю. При этом один белок может содержать в себе два и более гомологичных или негомологичных каталитических домена [7-9].

На данный момент существует два типа классификации гликозил-гидролаз -традиционная (энзиматическая) классификация, и иерархическая классификация, основанная на гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурной особенности доменной организации белка [5,8].

Традиционная классификация карбогидраз (КФ 3.2.1.Х) основана на их субстратной специфичности. В этом случае определяющим является только тот субстрат, который наиболее предпочтителен для данного фермента [10]. В настоящее время насчитывается 206 ферментативных активностей (с КФ 3.2.1.1 по КФ 3.2.1.206 [http://www.enzyme-database.ors/contents.php]). Определённые проблемы традиционной классификации заключаются в том, что многие гликозил-гидролазы имеют широкую субстратную специфичность [8,11], что затрудняет их однозначную классификацию. Например, в работах [12-14] описаны случаи, когда гликозидазы вместе с гликозил-гидролазной активностью (КФ 3.2.1.Х) проявляют и трансгликозилазную активность (КФ 2.4.1.У), что формально может позволить рассматривать их как представителей другого

11

класса ферментов - трансфераз [14]. Трудности в определении класса фермента только по субстратной специфичности, вынудили искать другой, более надёжный тип классификации.

Иерархическая классификация основана на сравнении первичных аминокислотных последовательностей и особенностей организации каталитических доменов. Близкородственные по аминокислотным последовательностям белки образуют семьи (на данный момент насчитывается 149 семейств), эволюционно близкие семейства сгруппированы в подсемейства (56 подсемейств), которые, в свою очередь, на более высоком иерархическом уровне формируют кланы (17 кланов) [http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html]. Таблица 1 иллюстрирует современные представления о классификации гликозил-гидролаз на основе структуры каталитических доменов.

Таблица 1 - Современная классификация гликозил-гидролаз на основе данных [2,9,14-49]

Название клана Структура каталитического домена Номер семейства гликозил-гидролаз

ШН-Л (Р/а)8 - бочонок 1,2,5,10,17,26,30,35,39,42,50,51, 53,59,72,79,86,113,128,147,148

2^Н-Б Р-сэндвич 7,16

3^Н-С Р-сэндвич 11,12

(Р/а)8 - бочонок 27,31,36

5^Н-Б б-лопастной Р-пропеллер 33,34,83,93

б^Н-Р 5-лопастной Р-пропеллер 43,62

(а/а)б - бочонок 37,63,100,125

8^Н-Н (Р/а)8 - бочонок 13,70,77

9^Н-1 а+Р - лизцим 24,80

10^Н-1 5-лопастной Р-пропеллер 32,68

1ШН-К (Р/а)8 - бочонок 18,20,85

12^Н-Ь (а/а)б - бочонок 15,65

13^Н-М (а/а)б - бочонок 8,48

14^Н-К (Р)э - соленоид 28,49

15^Н-0 (а/а)б - бочонок 52,16

16^Н-Р (а/а)б - бочонок 127,146

(а/а)б - бочонок 94,149

В этой главе будут рассмотрены свойства целлюлаз (целлобиогидролаз, эндоглюканаз и Р-глюкозидаз) семейств 5-10, 12, 26, 44, 45, 48, 61 и 74 (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/), а также ксиланаз, которые являются ферментами, необходимыми для эффективного расщепления целлюлозы и полисахаридов, формирующих клеточную стенку растений (НПС). На рисунках 1 и 2 представлены структура клеточной стенки растений и механизм ферментативного гидролиза целлюлозы целлюлолитическим ферментным комплексом.

Рисунок 1 - Структура клеточной стенки растений [50,51]

Рисунок 2 - Механизм ферментативного гидролиза молекулы целлюлозы ферментным комплексом, где R и NR - восстанавливающие и невосстанавливающие концы молекулы целлюлозы, соответственно. Crystalline - кристаллические участки субстрата,

Amorphous - аморфные [52]

Целлобиогидролазы (ЦБГ) характеризуются способностью последовательно отщеплять остатки целлобиозы с конца полимерной молекулы целлюлозы. Основное отличие целлобиогидролаз от остальных целлюлаз заключается в их способности гидролизовать кристаллические участки целлюлозы [53,54].

Практически все целлобиогидролазы, секретируемые микроскопическими грибами (Aspergillus, Penicillim, Trichoderma и др.) относятся к 6-м и 7-м семействам гликозил-гидролаз, и называются ЦБГ1 и ЦБГ2, соответственно [55].

Молекулярные массы целлобиогидролаз варьируют в диапазоне от 40 до 70 кДа, изоэлектрические точки составляют от 3,3 до 7,7 [56]. Оптимальные значения рН находятся в кислой области между рН 4,0-5,5, однако, например, ЦБГ2 гриба Humiclola insolens, проявляют максимальную активность при рН 9,0 [57]. Оптимальные значения температуры для целлобиогидролаз составляют 40-50°С.

В таблице 2 представлены физико-химические свойства целлобиогидролаз мицелиального гриба P.verruculosum.

Таблица 2 - Физико-химические свойства целлобиогидролаз P. verruculosum (по данным

работ [55-61])

Фермент ЦБГ1, 55 кДа ЦБГ1, 66 кДа ЦБГ2 45 кДа ЦБГ2, 50 кДа

Семейство гликозил- 7 7 6 6

гидролаз

М, кДа 55 66 45 50

р1 3,7 4,6 3,6 4,6

рН-оптимум (рН50%) 3,5 (24,5) 4 (2-5,5) 4 (2-5,5) 4 (2-5,5)

Т-оптимум (Т50%), °С 65 (45-65) 65 (45-65) 70 (50-80) 80 (55-85)

Доля от секретируемого белка, % 20 18 11 10

Остаточная активность

после 3 ч инкубации, % 100 100 100 100

50°С, рН 5

Остаточная активность

после 3 ч инкубации, % 80 90 90 90

50°С, рН 6

Остаточная активность

после 20 с инкубации, % 20 47 75 83

80°С, рН 5

Продуктом гидролиза целлюлозы под действием целлобиогидролаз является целлобиоза [54,62-64]. В некоторых случаях, как показано в работах [65,66], кроме

14

целлобиозы могут в небольших количествах образовываться глюкоза, целлотетраоза и целлогексоза.

Целлобиоза является сильным конкурентным ингибитором целлобиогидролаз. При использовании целлоолигосахаридов или хромогенных производных дисахаридов в качестве субстратов, константы ингибирования целлобиозой находятся в диапазоне 0,022,5 мМ [57,66,67]. Среди грибных целлобиогидролаз наиболее подвержена ингибированию ЦБГ1 T.reesei - Ki составляет 0,02-0,0034 мМ [68].

Эндоглюканазы (ЭГ) - это ферменты, которые способны расщеплять ß-глюканы и растворимые производные целлюлозы, содержащие ß-l^-связи (например, КМЦ), с образованием целлоолигосахаридов [53,56]. Эндоглюканазы эффективно гидролизуют аморфную часть целлюлозы, в то время как активность к её кристаллической части по сравнению с целлобиогидролазами у них достаточно низка [56,65,69].

Молекулярные массы эндоглюканаз грибов, в основном, находятся в диапазоне 2070 кДа [56]. Однако, встречаются как низкомолекулярные эндоглюканазы (у некоторых видов Aspergillus обнаружены эндоглюканазы массой около 11 кДа [70]), так и высокомолекулярные (многие бактериальные эндоглканазы имеют молекулярную массу около 100 кДа [71]). Изоэлектрические точки эндоглюканаз варьируют от 3,3 до 7,7. Большинство грибных эндоглюканаз имеют рН-оптимум 4,0-5,5 [53,56], при этом, известны случаи проявления максимальной активности этого фермента как при более кислом рН - 2,5-3,0 [72,73], так и при более щелочном рН (H.insolens продуцирует комплекс эндоглюканаз ЭГ 2, 3, 4 и 5 у которых рН оптимум составляет 6,5-7,5 (для ЭГ2-4) и 7,0-9,0 для ЭГ5) [57].

Грибные эндоглюканазы стабильны при температуре, не превышающей 50°С и рН 4-5,5 [53,56]. Исключения оставляют ферменты из термофильных грибов, например, из Chrysosporium lucknowense, которые способны сохранять активность при температуре 65-70°С [74]. В таблице 3 приведены физико-химические свойства эндоглюканаз гриба рода P. verruculosum.

Практически все грибные эндоглюканазы не способны гидролизовать целлобиозу, лишь небольшая их часть гидролизует целлотриозы. В качестве примера можно указать на эндоглюканазы, продуцируемые грибами родов T.reesei и H.insolens, из которых только ЭГ1 из 7 семейства гликозил-гидролаз способна гидролизовать целлотриозу [55,57,69,75], а из пяти эндоглюканаз P.pinophilum только ЭГ3 и ЭГ4 обладают аналогичным свойством [65].

Однако, большинство эндоглюканаз могут расщеплять целлоолигосахариды, чья степень полимеризации (СП) превышает 3. При этом скорость, с которой фермент

15

гидролизует субстрат, возрастает по мере увеличения СП олигосахарида [57,69,75]. Исключения составляют, ЭГ1 и ЭГ5, продуцируемые P.pinophilum, которые не способны к гидролизу целлотетраозы, а ЭГ1 в не может гидролизовать целлоолигосахариды с СП ниже 6 [76].

Таблица 3 - Физико-химические свойства эндоглюканаз P. verruculosum (по данным работ

[53, 56, 57, 72-74])

Фермент ЭГ1 52 кДа ЭГ2 36 кДа ЭГ2 33 кДа ЭГ3 25 кДа

Семейство гликозил-гидролаз 7 5 5 12

М, кДа 52 36 33 25

р1 3,6 2,0 4,1 5,6

рН-оптимум (рН50%) 4 (3-6) 4 (3-6,5) 3,5 (3-6,5) 4,5 (3-5,5)

Т-оптимум (Т50%), °С 65 (50-70) 65 (40-85) 60 (40-85) 55 (35-65)

Доля от секретируемого белка, % 2-3 1,5-2 1,5-5 1,5-2

Остаточная активность после 3 ч инкубации, % 50°С, рН 5 85 85 90 90

Остаточная активность после 3 ч инкубации, % 50°С, рН 6 60 70 80 70

Остаточная активность после 20 с инкубации, % 80°С, рН 5 9 99 87 19

Эндоглюканазы способны расщеплять Р-1,4-глюкозидные связи не только в целлюлозе, но и в Р-глюканах, ксиланах и ксилоглюканах (напрмер, ЭГ 1 / Се17В T.reesei) [55,65,77].

При воздействии ЭГ1 (Се17В) на МКЦ и аморфную целлюлозу конечными продуктами гидролиза являются глюкоза и целлобиоза. ЭГ2 (Се15А), при взаимодействии с теми же субстратами, дополнительно образует целлотриозу, а в случае с ЭГ5 (Се145А) вместо глюкозы и целлобиозы основным продуктом является целлотетраоза (целлотриоза и целлопентоза являются минорными продуктами) [69].

Некоторые из эндоглюканаз ингибируются целлобиозой. Например, в работе [78] показано, что целлобиоза является конкурентным ингибитором двух растительных эндоглюканаз.

Р-Глюкозидазы (БГ) - ферменты, которые гидролизуют гликозидные связи у нередуцирующих остатков у Р-О-глюкозидов и олигосахаридов с высвобождением глюкозы.

Р-Глюкозидазы грибов по сравнению с эндоглюканазами и целлобиогидролазами имеют сравнительно высокую молекулярную массу, которая лежит в диапазоне 35-350 кДа; р1 варьирует от 3,5 до 5,9 [53,56]. Зачастую Р-глюкозидазы являются субъединичными ферментами с массой субъединиц от 41 до 170 кДа. Например, Р-глюкозидаза из Botryodiplodia theobromae является октамером с массой 350 кДа [79]. В таблице 4 приведены физико-химические свойства Р-глюкозидазы гриба рода P. verruculosum.

Таблица 4 - Физико-химические свойства Р-глюкозидазы 116 кДа P.verruculosum (по

данным работ [58-61,80])

М, кДа 116

р1 4,6

рН-оптимум (рН50%) 5,5 (4,5-6,5)

Т-оптимум (Т50%), °С 60 (40-80)

Доля от секретируемого белка, % 4-6

Остаточная активность после 3 ч инкубации, % 50°С, рН 5 100

Остаточная активность после 3 ч инкубации, % 50°С, рН 6 70

Остаточная активность после 20 с инкубации, % 80°С, рН 5 34

Интересная особенность Р-глюкозидаз заключается в том, что они могут быть как внеклеточными, так и внутриклеточными ферментами (либо связанными с клеточной стенкой) [81-84].

Оптимальные значения рН и температуры Р-глюкозидаз, как правило, находятся в области от рН 4,0 до 5,5 и 40-50°С [56, 85].

Все Р-глюкозидазы можно разделить по их субстратной специфичности на три группы [85-89]:

- целлобиазы - вид Р-глюкозидаз, способных гидролизовать только целлобиозу;

- арил-Р-глюкозидазы - ферменты способные расщеплять исключительно глюкозиды, чьими агликонами являются фенолы;

- ß-глюкозидазы с широкой специфичностью к агликонной части, гидролизующие арилглюкозиды, целлобиозу и целлоолигосахариды.

Многие ß-глюкозидазы способны к деструкции целлоолигосахаридов, при этом чем выше СП олигосахарида, тем ниже каталитическая активность ß-глюкозидаз [86,90]. Некоторые ß-глюкозидазы, кроме расщепления ß-1,4 связей, способны к гидролизу ß-1,1-связи (трегалоза), ß-1,2-связи (софороза), ß-1,3-связи (ламинарбиоза), ß-1,6-связи (гентиобиоза). Примером такого фермента является ß-глюкозидаза A.phoenicis [90].

ß-Глюкозидаза ингибируется продуктом реакции глюкозой, Ki составляет от 0,5 до 16,4 мМ [85,90]. ß-Глюкозидазы могут катализировать реакции трансгликозилирования, где в качестве акцепторов могут выступать сахара, фенолы, спирты и ряд других соединений [91-93].

Ксиланазы (Ксил) представляют собой ферменты, способные катализировать гидролиз арабиноглюкуроноксиланов, арабиноксиланов, глюкуроноксиланов и 4-О-метилглюкуроноксиланов. Ксилан имеет линейную структуру, которая состоит из остатков ß-D-ксилозы и имеет боковые группы, состоящие из a-L-арабинофуранозы, которая связанна с мономерными остатками ксилозы а-1,3-связью, и D-глюкуроновой кислоты (в некоторых случаях 4-О-метил-О-глюкуроновая кислота), соединённой с основной цепью а-1,2-связью. Ксилан может быть ацетилирован (обычно в положении 3 ксилозидного мономерного остатка) [94].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шашков, Игорь Александрович, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Naumoff D.G. Development of a hierarchical classification of the tim-barrel type glycoside hydrolases // Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. - 2006. - Vol.1 - P. 294—298.

2.Наумов Д.Г. Иерархическая классификация гликозил-гидролаз // Биохимия. - 2011. -Т.76. - В.6. - С.764 - 780.

3. Henrissat B., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - P. 637-644.

4. Sinnott M.L. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer // Chem. Rev. - 1990. - Vol. 90. - 1171-1202.

5. Хорлин А.Я. // В книге «Структура и функции активных центров ферментов». - 1974. -Изд-во Наука. - Москва - С.39-69.

6. Хорлин А.Я. // В книге «Химическая энциклопедия, том 1». - 1988. - Изд-во Советская энциклопедия. - Москва. - С.575-576.

7. Barrett A.J. Classification of peptidases. // Methods Enzymol. - 1994. - Vol. 244. - P.1-15.

8. Красиков В.В., Карелов Д.В., Фирсов Л.М. а -Глюкозидазы (обзор). // Биохимия. - 2001.

- T.66. - C.332-348.

9. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. - С. 355 - 373.

10. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов // Биохимия. - 2002. - T.67. - C. 1026-1050.

11. Tymowska-Lalanne Z., and Kreis M. The plants invertases: physiology, biochemistry and molecular biology // Adv.Botanical Res. - 1998 - Vol.28. - P.71-117.

12. Watt G.M., Lowden P.A.S., and Flitsch, S.L. Enzyme - catalyzed formation of glycosidic linkges. // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997 - Vol.7. - P.652-660.

13. Sinnott M.L. The cellobiohydrolases of Trichoderma reesei: a review of indirect and direct evidence that their function is not just glycosidic bond hydrolysis // Biochem. Soc. Trans. - 1998

- Vol.26. - P.160-164.

14. Juers D.H., Huber R.E., and Matthews B.W. Structural comparisons of TIM barrel proteins suggest functional and evolutionary relationships between beta-galactosidase and other glycohydrolases // Protein Sci. - 1999. - Vol.8 - P. 122-136.

15. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии - 2000. - T.40. - P.205-266.

16. Tomme P., Warren R.A.J., and Gilkes N.R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi // Adv. Microb. Physiol. - 1995. - Vol.37. - P.1-81.

17. Mian, I.S. Sequence, structural, functional and phylogenetic analyses of three glycosidase families // Blood Cells Mol. Dis. - 1998. - Vol.24. - P.83-100.

18. Henrissat B., and Davies G. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases // Curr. Opin. Struct.Biol. - 1997. - Vol.7 - P.637-644.

19. Nagano N., Porter C.T., and Thornton J.M. The (Pa)s glycosidases sequence and structure analyses suggest distant evolutionary relationship // Protein Eng. - 2001. - Vol.14. - P.845-855.

20. Vasella A., Davies G.J., and Bohm M. Glycosidase mechanisms // Curr. Opin. Chem. Biol. -2002. - Vol.6. - P.619-629.

21. White A., and Rose D.R. Mechanism of catalysis by retaining beta-glycosyl hydrolases // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - Vol.7. - P.645-651.

22. Zechel D.L., and Withers S.G. Glycosidase mechanisms: anatomy of a finely tuned catalyst // Acc. Chem. Res. - 2000. - Vol.33. - P.11-18.

23. Rye C.S., and Withers S.G. Glycosidase mechanisms // Curr. Opin. Chem.Biol. - 2000. -Vol.4. - P.573-580.

24. Beguin P. Molecular biology of cellulose degradation // Ann. Rev. Microbiol. - 1990. -Vol.44. - P.219-248.

25. Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller Jr. R.C., and Warren R.A.J. Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families // Microbiol. Rev. - 1990. - Vol.55. - P.303-315.

26. Henrissat, B., Claeyssens, M., Tomme, P., Lemesle, L., and Mornon, J.-P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis // Gene. - 1989. - Vol.81. - P.83-95.

27. Henrissat, B., and Bairoch, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. - 1993. - Vol.293. - P.781-788.

28. Himmel M.E., Karplus P.A., Sakon J., Adney W.S.,Baker J.O., and Thomas, S R. Polysaccharide hydrolase folds diversity of structure and convergence of function // Appl. Biochem. - 1997. - Vol.63-65. - P.315 - 325.

29. Henrissat B., Callebaut I., Fabrega S., Lehn P., Mornon, J - P., and Davies G. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. - 1995. - Vol.92. - P.7090-7094.

30. Rigden D.J., Jedrzejas M.J., and de Mello L.V. Identification and analysis of catalytic TIM barrel domains in seven further glycoside hydrolase families // FEBS Lett. - 2003. - Vol.544. -P.103-111.

31. Jenkins J., Leggio L.L., Harris G., and Pickersgill R. Beta-glucosidase, beta-galactosidase, family A cellulases, family F xylanases and two barley glycanases form a superfamily of enzymes with 8-fold beta/alpha architecture and with two conserved glutamates near the carboxy-terminal ends of beta-strands four and seven // FEBS Lett. - 1995. - Vol.362. - P.281-285.

32. Pickersgill R., Harris G., Leggio L.L., Mayans O., and Jenkins J. Superfamilies: the 4/7 superfamily of beta alpha-barrel glycosidases and the right-handed parallel beta-helix superfamily // Biochem. Soc. Trans. - 1998. - Vol.26 -P. 190-198.

33. St John F.J., Gonzalez J.M., and Pozharski E. Consolidation of glycosyl hydrolase family 30: a dual domain 4/7 hydrolase family consisting of two structurally distinct groups // FEBS Lett. -2010. - Vol.584. - P.4435-4441.

34. Rigden D.J. Analysis of glycoside hydrolase family 98: catalytic machinery, mechanism and a novel putative carbohydrate binding module // FEBS Lett. - 2005. - Vol.579. - P.5466-5472.

35. Lo Leggio L., and Larsen S. The 1.62 A structure of Thermoascus aurantiacus endoglucanase: completing the structural picture of subfamilies in glycoside hydrolase family 5 // FEBS Lett. - 2002. - Vol.523. - P.103-108.

36. Stam M.R., Blanc E., Coutinho P.M., and Henrissat B. Evolutionary and mechanistic relationships between glycosidases acting on alpha- and beta-bonds // Carbohydrate Research. -2005. - Vol.340. - P.2728-2734.

37. Dagnall B.H., Paulsen I.T., and Saier Jr.M.H. The DAG family of glycosyl hydrolases combines two previously identified protein families // Biochem. J. - 1995. - Vol.311. - P.349-350.

38. Moller P.L., Jorgensen F., Hansen O.C., Madsen S.M., and Stougaard P. Intra- and extracellular beta-galactosidases from Bifidobacterium bifidum and B. infantis: molecular cloning, heterologous expression, and comparative characterization // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol.67. - P.2276-2283.

39. Henrissat B., Teeri T.T., and Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell walls of plants // FEBS Lett. - 1998. - Vol.425. -P.352-354.

40. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen T., Ruchonen L., Pettersson G., Knowles J.K.C., Teeri T.T., and Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei // Science. - 1994. - Vol.265. - P.524-528.

41. Torronen A., Kubicek C.P., and Henrissat B. The Streptomyces lividans family 12 endoglucanase: construction of the catalytic cre, expression, and X-ray structure at 1.75 A resolution // FEBS Lett. - 1993. - Vol.321. - P.135-139.

42. Margolles-Clark E., Tenkanen M., Luonteri, E., and Penttila M. Three alpha-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast // Eur. J. Biochem. - 1996. - Vol.240.

- P. 104-111.

43. Liebl W., Wagner B., and Schellhase J. Properties of an alpha-galactosidase, and structure of its gene galA, within an alpha-and beta-galactoside utilization gene cluster of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. // System. Appl. Microbiol. - 1998. -Vol.21. - P.1-11.

44. Crennell S.J., Garman E.F., Laver W.G., Vimr E.R., and Taylor G.L. Crystal structure of a bacterial sialidase (from Salmonella typhimurium LT2) shows the same fold as an influenza virus neuraminidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol.90. - P.9852-9856.

45. Ferretti J.J., Gilpin M.L., and Russell R.R.B. Nucleotide sequence of a glucosyltransferase gene from Streptococcus sobrinus MFe28 // J. Bacteriol. - 1987. - Vol.169. - P.4271-4278.

46. MacGregor E.A., Jespersen H.M., and Svensson B. A circularly permuted alpha-amylase-type alpha/beta-barrel structure in glucan-synthesizing glucosyltransferases // FEBS Lett. - 1996.

- Vol.378. - P.263-266.

47. MacGregor E.A., Janecek S., and Svensson B. Relationship of sequence and structure to specificity in the alpha-amylase family of enzymes // Biochim. Biophys. Acta. - 2001. -Vol.1546. - P.1-20.

48. Mooser G., Hefta S.A., Paxton R.J., Shively J.E., and Lee T.D. Isolation and sequence of an active-site peptide containing a catalytic aspartic acid from two Streptococcus sobrinus alpha-glucosyltransferases // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol.266. - P.8916-8922.

49. Pons T., Olmea O., Chinea G., Beldarrain A., Marquez G., Acosta N., Rodriguez L., and Valencia A. Structural model for family 32 of glycosyl-hydrolase enzymes // Proteins. - 1998. -Vol.33. - P.383-395.

50. Alberti A., Braga C.M., Jaster H., Nogueira A. Dissolved oxygen content in apple must: technological implications in cider processing // J. Inst. Brew. -2014. -Vol. 120. -P. 65-70.

51. Lund S.T., Bohlmann J. The molecular basis for wine grape quality - a volatile subject // Science. -2006. -Vol. 311. -P. 804-805.

52. Klyosov A.A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation // Biochem.

- 1990. - Vol.129. - P.10577-10585.

53. Рабинович М.Л., Черноглазов В.М., Клесов А.А. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия // В сборнике «Биоконверсия целлюлозы: микробиология и биохимия» - 1988. - Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. - ВИНИТИ - М.11. - С.8-149.

54. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases // Trends Biotechnol. - 1997. - Vol.15. - P. 160-167.

55. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat B., Schulein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases // Eur. J. Biochem. - 1993. - Vol. 217. - P.947-953.

56. Clarke A.J. Biodegradation of cellulose // Enzymology and biotechnology. - 1997. -Technomic Publishing Company Inc. - Lancaster. - P.272.

57. Schulein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens // J. Biotechnol. -

1997. - Vol. 57. - P.71-81.

58. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. - 2006. - M. - МГУ. - 170 C.

59. Кастельянос О., Ермолова О.В., Синицын А.П., Попова Н.Н., Окунев О.Н., Кернс Г., Куде Е. // Схема очистки ферментов целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum, исследование их биохимических свойств и специфичности. - 1995. - Биохимия. - T.60. -C.925-943.

60. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. -

1998. - M. - МГУ. - 156 C.

61. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Penicillium verruculosum методом иммуноафинной хроматографии // Биохимия. - 1996. - T.61 -C.1658-1663.

62. Wood T.M., McCrae S.I. The purification and properties of the C1 component of Trichoderma koningii cellulose. - 1972. - Biochem. J. - Vol.128. - P.1183-1192.

63. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and properties of a cellobiohydrolase from Penicillium pinophilum // Carbohydr. Res. - 1986. - Vol.148. - P.331-344.

64. Wood T.M., McCrae S.I. Cellulase from Fusarium solani. Purification and properties of the C1 component // Carbohydr. Res. - 1977. - Vol.57. - P.117-133.

65. Марков А.В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei // Диссертация на соискание ученой степени кандидата хим. наук. - 2003. - M. - МГУ. - 201 C.

66. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii // Biochim. biophys. acta. - 2002. - Vol.1596. - P.366-380.

67. Munoz I.G., Ubhayasekera W., Henriksson H., Szabo I., Pettersson G., Johansson G., Mowbray S.L., Stahlberg J. Family 7 cellobiohydrolases from Phanerochaete chrysosporium: crystal structure of the catalytic module of Cel7D (CBH58) at 1.32 A resolution and homology models of the isozymes // J. Mol. Biol. - 2001. - Т.314. - Р.1097-1111.

68. McCarthy J.K., Uzelac A., Davis D.F., Eveleigh D.E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-P-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P.11495-11502. 41.

69. Karlson G., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzimatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cel12A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei // J. Biotechnol. - 2002. - Vol.99. - P.63-68.

70. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов // Учебное пособие. - 1995. - М. - МГУ. - 224 С.

71. Рабинович М.Л. Окрашенный субстрат целлюлаз - области применения // Биоорган. Химия. - 1985. - Рабинович М.Л., Савицкене Р.Ю., Герасимас В.Б., и др. - Т.11. - С.1330 -1342.

72. Murao S., Sakamoto R., Arai M. Cellulases of Aspergillus aculeatus // Methods Enzymol. -1988. - Vol.160. - P.274 - 299.

73. Tong C.C., Cole A.L., Shepherd M.G. Purification and properties of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus auranticus // Biochem. J. - 1980. - Vol.191. - P.83-94.

74. Шульга Т.Н. Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. - 2008. -M. - МГУ. - 125 C.

75. Biely P., Vranska M., Clayssens M., Mode of action of Trichoderma reesei P-1,4-glucanases on cellooligosaccharides In: Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases (Suominen P., Reinikainen, T., eds.) // Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research -1993. - Helsinki. - Finland. - P.99-100.

76. Bhat KM., Hay A.J., Clayssens M., Wood T.M. Study of the mode of action and sitespecificity of the endo-1,4-D-glucanases of the fungus Penecillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligisaccharides // Biochem. J. - 1990. - Vol.266. - P.371-378.

77. Vincken J.-P., Beldman G., Voragen A.G.J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? // Carbohydr. Res. - 1997. - Vol. 298. - P.299-310.

78. Wong Y., Fincher G.B., McLachlan G.M. Kinetic Properties and substrate specificities of two cellulases from Auxin treated Pea Epicolyls // J. Biol. Chem. - 1977. - Vol.252. - P.1402-1407.

79. Shewale J.D., Sadana J. Purification, characterization and properties of P-glucosidase enzymes from Sclerotium rolfsii // Arch. Biochem. Biophys. - 1981. - Vol.207 - P.185-196.

80. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. Наук. - 1997. - M. - МГУ. - 116 C.

81. Chen H., Hayn M., Esterbauer H. Purification and characterization of two extracellular P-glucosidases from Trichoderma reesei // Biochim Biophys. Acta. - 1992. - Vol.1121. - P.54-60.

82. Gong C.-S., Ladisch M.R., Tsao G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism // Biotechnol. Bioeng. - 1977. - Vol.19. - P.959-981.

83. McHale A., Coughlan M.P. The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purufication and characterization of the extracellular and intracellular P-glucosidases // Biochim. Biophys. Acta - 1981. - Vol.662 - P.152-159.

84. Hash J.H., King K.W. Some properties at an aril-P-glucosidase from culture filtrates of Myrothecium verrucaria // J. Biol. Chem. - 1958. - Vol.232 - P.395-402.

85. Umezurike G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of P-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat // Biochim. Biophys. Acta - 1975. - Vol.397. - P.164-178.

86. Румянцева Г.М., Родионова Н.А., Мартинович Л.И. Очистка и характеристика двух типов Р-глюкозидаз: целлобиазы и арил-Р-О-глюкозидазы // В сборнике «Целлюлазы микроорганизмов» (рад. В.Л. Кретович). - 1981. - М. - Наука. - C.83-93.

87. Woodward J. Fugal and other P-D-glucosidases - their properties and applications // Enzyme Microb. Technol. - 1982. - Vol.4. - P.73-79.

88. Woodward J., Arnold S.L. The inhibition of P-glucosidase activity in T. reesei C30 cellulase by derivatives and isomers of glucose // Biotechnol. Bioeng. - 1981. - Vol.23. - P.1553-1562.

89. Ghose T.K., Sachden R.K. Kinetics of immobilized P-glucosidase for hydrolysis of cellobiose to glucose // J. Molec. Catal. - 1979. - V.6. - P.99-109.

90. Ladish M.R., Lin K.W., Voloch M., Tsao G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass // Enzyme Microb. Technol. - 1983. - Vol.5 - P.82-102.

91. Гусаков А.В. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы) // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. - 1984. - М. - МГУ. - 192 C.

92. Galbe M., Zacchi G. A review of the production of the ethanol from softwood // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - Vol.59. - P.618-628.

93. Швыдков А.Н., Мартышенко А.Е., Ланцева Н.Н., Чебаков В.П., Кобцева Л.А. Исследование ферментативных свойств кормовых добавок // Успехи современного естествознания. - 2014. - Т.11(2). - С. 49-53.

94. Polizeli ML., Rizzatti A.C., Monti R., Terenzi H.F., Jorge J.A., Amorim D.S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications // App. Microbiol. and Biotech. - 2005. - Vol. 67(5). - P.577-591.

95. Ahmed S., Riaz S., Jamil A. Molecular cloning of fungal xylanases: an overview // App. Microbiol. and Biotechn. - 2009. Vol. 84(1). - P.19-35.

96. Chavez R., Bull P., Eyzaguirre J. The xylanolytic enzyme system from the genus Penicillium // Journal of Biotechnology. - 2006. - Vol. 123 (4). - P.413-33.

97. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review // App. Microbiol. and Biotech. - 2001. - Vol. 56. - P.326-338.

98. Alves-Prado H.F., Pavezzi F.C., Leite R.S., de Oliveira V.M., Sette L.D., Dasilva R. Screening and production study of microbial xylanase producers from Brazilian Cerrado // App. Microbiol. and Biotech. - 2010. Vol.161. P.333-346.

99. Chen J. Improvement of wheat - straw pulp properties with an alkali - tolerant xylanase from Pseudomonas sp. G6-2 // Enzymes for Pulp and Paper Processing. - 1996. - Ed: Jeffties Th., Viikari L. - ACS. - Washington DC. - P.308 - 317.

100. Simonson H. An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotoga [Text] / Simonson H., Haufler U., Daniel R. // Biochem .J. - 1991. - Vol.277. -P.413 - 417.

101. Устинов Б.Б., Антонов А.И., Гришутин С.Г., и др. Возможности применения ксиланаз Chrysosporium lucknowense в целлюлозно-бумажной промышленности и в качестве кормовой добавки // Материалы II междунар. конг. «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 2005. - М. - 218 С.

102. Трейманис А.П., Громов В.С., Кампусе А.А. Роль субмикроскопических капилляров целлюлозы в процессе переосаждения ксилана // Химия древесины. - 1975. - №.4. - С.22 -29.

103. Nakamura S., Wakabayashi K., Nakai R., Horikoshi K. Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkalophilic Bacillus sp. Strain 41V-1 // App. Env. Microbiology. -1993. - Vol.59. - P.2311 - 2316.

104. Nair S., Sindhu R., Shashidhar S. Purification and biochemical characterization of two xylanases from Aspergillus sydowii SBS 45 // App. Biochem. Biotech. - 2008. - Vol.149 (3). -P.229 - 243.

105. Берлин А.Х. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei // Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. - 1999. - М. - МГУ. - 179 С.

106. Wasserman B.P. Thermostable enzyme production // Food Technol. - 1984. - Vol.38. -P.78-98.

107. Чернышев Н.И., Панин И.Г., Шумский Н.И., Гречишников В.В. Антипитательные факторы кормов // Учебное пособие. - 2013. - Воронеж. - Воронежская областная типография - 206 С.

108. Food Outlook. Biannual report on global food markets // Foodand Agriculture Organization of the United Nations - 2016. - 133 Р.

109. Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты— гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем // Комбикорма. - 2012. - № 6. - С. 105—106.

110. Фаритов Т. А. Корма и кормовые добавки для животных // Учебное пособие. - 2010. -СПб. - Лань - 304 С.

111. Choact M., McNab J.M., Boorman K.N., ed. Non starch polysaccharides effect on nutritive value // Poultry Feedstuffs Supply, Composition and Nutritive Value. - 2002. - Cromwell Press. Trowbridge. - P.221—226.

112. Синицын А.П., Рубцова Е.А., Шашков И.А., Рожкова А.М., Синицына О.А., Кондратьева Е.Г., Зоров И.Н., Мерзлов Д.А., Осипов Д.О., Матыс В.Ю. Получение и свойства новых биокатализаторов, предназначенных для разрушения некрахмальных растительных полисахаридов // Катализ в промышленности. - 2017. - Т.17(4). - С.331-338.

113. Синицын А.П., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Синицына О.А., Короткова О.Г., Осипов Д.О., Шашков И.А., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Кондратьева Е.Г., Волчок А.А. Новые ферменты для кормового применения // Материалы международного форума «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - 2018. - М. - С.742-743.

114. Смирнова И.А, Середа А.С., Костылёва Е.В., Цурикова Н.В., Бушина Е.В., Рожкова А.М., Синицын А.П. Новый ферментный препарат с высокой активностью пенициллопепсина на основе штамма-продуцента Penicillium canescens // Прикл. Биохим. и Микробиол. - 2015. - Т.51 (6). - С.584 - 591.

115. Околоева Т.М., Мансуров Р.Ш., Гаврилов С.Н., Кержнер М.А. Российские ферментные препараты для импортозамещения // Птицеводство - 2016. - №1. - С.30 - 33.

116. Токарь В., Файнов А., Гейнель В., Панин А. «Агроцелл» удешевит рационы и ускорит рост поголовья // Свиноводство. - 2015. - №2. - С.29 - 30.

117. Кшникаткина А.Н., В.А. Гущина, А.А. Галиуллин и др. Нетрадиционные кормовые культуры // Учебное пособие. - 2005. - Пенза. - РИО ПГСХА. - 240 С.

118. Синицын А., Синицына О., Короткова О., Мосеев П., Кержнер М., Ферментные новшества // Агробизнес. - 2016. - №4. - С.88 - 92.

119. Синицын А.П., Короткова О.Г., Синицына О.А., Рожкова А.М и др. Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии // Катазиз в промышленности. - 2015. - Т. 15(6) - С.78-83.

120. Kubicek C.P. Systems biological approaches towards understanding cellulase production by Trichoderma reesei // J.Biotechnol. - 2013. - Vol. 163(2). - P.133-142.

121. Волков П.В., Рожкова А.М., Правильников А.Г., Андрианов Р.М и др. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Penicillium canascens с высокой способностью к гидролизу растительного сырья // Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. - T. 48(1). - C.66 - 73.

122. Синицын А.П., Синицына О.А., Кондратьева Е.Г, Плохов А.Ю. Активность ферментных препаратов - важнейший критерий их свойств // Птицеводство. - 2014. -№15. - С.36 - 40.

123. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Компонентный состав коммерческих ферментных препаратов, полученных с помощью грибов рода Trichoderma и предназначенных для биоконверсии растительного сырья // Биотехнология. - 2013. - №3. - С.58 - 68.

124. Синицын А.П., Короткова О.Г., Синицына О.А., Рожкова А.М и др. Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии // Катазиз в промышленности. - 2015. - Т.15(6). - С.78 - 83.

125. Suwannarangsee S., Bunterngsook B., Arnthong J., Paemanee A., Thamchaipenet A., Eurwilaichitr L., Laosiripojana N., Champreda V. Optimisation of synergistic biomass-degrading enzyme systems for efficient rice straw hydrolysis using an experimental mixture design // Bioresour. Technol. - 2012. - Vol.119. - P.252 - 261.

126. Мерзлов Д.А., Зорова И.Н., Доценко Г.С., Денисенко Ю.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Еондратьева Е.Г., Синицын А.П. Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile // Биохимия. - 2015. - T. 20(4). - C.556 -567.

127. Денисенко Ю.А., Мерзлов Д.А., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Синицына А.П. Сравнительная характеристика ксиланаз XylA и XylE из гриба Penicillium canescens // Вестник московского университета. - 2015. - Серия 2. Химия. - T. 56(6). - C.348 - 353.

128. Morgana N.K., Wallaceb A., Bedfordc M.R., Choct M. Efficiency of xylanases from families 10 and 11 in production of xylo-oligosaccharides from wheat arabinoxylans // Carbohydrate Polymers. - 2017. - Vol.167. - P.290 - 296.

129. Околелова Т.М., Румянцев С.Д., Кулаков А.В., Морозов А.М., Иевлев С.А. Корма и биологически активные добавки для птицы // Учебное пособие. - 1999. - М. - Колос. - 96 С.

130. Goncalves T.A., Damasio A.R.L., Segato F., Alvarez T.M., Bragatto J., Brenelli L.B., Citadini A.P.S., Murakami M.T., Ruller R., Paes Leme A.F., Prade R.A., Squina F.M. Functional characterization and synergic action of fungal xylanase and arabinofuranosidase for production of xylooligosaccharide // Biores. Technol. - 2012. - Vol.119. - P.293-299.

131. Polizeli M.L., Rizzatti A.C., Monti R., Terenzi H.F., Jorge J.A., Amorim D.S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005. - Vol. 67. - P.577-591.

132. Короткова О.Г., Синицына А.О, Кондратьева Е.Г., Кержнер М.А., Моссев П.А., Синицын А.П. Активность ферментов, предназначенных для деструкции некрахмальных полисахаридов // Птцеводство. - 2016. - № 5. - С. 8 - 13.

133. Лагутин В. Обзор рынка: кормовые ферменты // Ценовик. - 2015. - №6. - С. 63 - 66.

134. Bedford Michael R., Partridge Gary G. Enzymes in farm animal nutrition // CAB International. - 2001. - 313 Р.

135. Wu D., Swick R.A., Liu Y.G., Wu S.B. and Choct M. Carbohydrases improve performance of broilers fed both nutritionally adequate and downspec wheat diets // Aust. Poult. Sci. Symp. -2013.

136. Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin // J. Biotechnol. - 2004. - Vol.107. - P.65-72.

137. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов // Учебное пособие. - 1981. - М. - С.40-73.

138. Kumar R., Singh S., Singh O.V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives // J. Ind Microbiol. Biotechnol. - 2008. - Vol.35. - P.377-391.

139. Jehanipour A., Taherzadeh M.J. Ethanol production from cotton-based waste textiles // Bioresour. Technol. - 2009. - Vol.100. - P.1007-1010.

140. Клесов А.А. Современное состояние проблемы ферментативной переработки целлюлозы в сахара и спирт за рубежом // Прикл. биохим. микробиол. - 1985. - Т.21(2). -С.269-283.

141. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикл. биохим. микробиол. - 2002. - Т.38, (4). - С.355-373.

142. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов // Учебное пособие. - 2000. - М. - Изд-во Элевар. - С. 13-288.

143. Demain A.L. Mutation and production of secondary metabolites // Adv.Appl. Microbiol. -1973. - Vol.16 - P.177-202.

144. Berlin A., Maximenko V., Gilkes N., Saddler J. Optimization of enzyme mixtures for lignocellulose hydrolysis // Biotechnol. Bioeng. - 2007. - Vol.97. - P.287-296.

145. Boisset C., Peterquin C., Chanzy H., Henrissat B., Schulein M. Optimized mixtures of recombinant Humicola insolens cellulases for the biodegradation of crystalline cellulose // Biotechnol. Bioeng. - 2001. - Vol.72. - P.339-345.

146. McLean D., Podruzny M. F. Further support for feed-batch production of cellulases // Biotechnol. Lett. - 1985. - Vol.7. - P.683-687.

147. Hendy N. A., Wilke C. R., Blanch H. W. Enhanced cellulase production in feed-batch culture of Trichoderma reesei RUT-C30 // Enzyme Microbiol. Technol. - 1984. - Vol.6. - P.73-77.

148. Beguin P., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. Jr., O'Neill G.P., Warren R.A.J. Cloning of cellulase genes // CRC Critical Reviews in Biotechnology. - 1987. - Vol.6 (2). - P.129-163.

149. Беккаревич А.О., Немашкалов В.А., Кошелев А.В и др. Культивирование нового мутанта Trichoderma longibrachiatum TW 1-59-27 - продуцента целлюлаз и ксиланаз, получение ферментного препарата и исследование его свойств // Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. - Т.51(2). - С.229-235.

150. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.Г., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А. и др. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium canascens // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - Т.7. - С.37-39.

151. Salinasa A., Vega M., Lienqueoa M.E., Garciab A., Carmonab R., Salazara O.O. Cloning of novel cellulases from cellulolytic fungi: Heterologous expression of a family 5 glycoside hydrolase from Trametes versicolor in Pichia pastoris // Enzyme Microb. Technol. - 2011. -Vol.49. - P.485- 491.

152. Knowles J.K.C., Lehtovaara P., Murray M., Sinnot M. L. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei // J. Chem. Soc. Chem. Commun. - 1988. - Vol.21. - P.1401-1402.

153. Nisizawa K. Mode of action of cellulases // J. Ferment. Technol. - 1973. - Vol.51. - P.267-304.

154. Соловьева И.В., Окунев О.Н., Вельков В.В., Кошелев А.В., Бубнова Т.В., Кондратьева А.А., Скомаровский А.А., Синицын А.П. Получение и свойства мутантов Penicillium verruculosum - суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз // Микробиология. - 2005. - Т.74 (2). - С.172-178.

155. Chung K.C., Kawai K., Yashima S., Eguchi Y. Purification of cellulolitic enzymes by Penicillium verruculosum // Hakkokogaki-kaishi. - 1982. - Vol.60. - P.363-367.

156. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, и b-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillius japonicas // Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. - 2004. - МГУ. -177 С.

157. Biely P., Vrsanska M., Claeyssens M. The endo-1,4-ß-glucanase I from Trichoderma reesei. Action on ß-1,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose // Eur. J. Biochem. - 1991. - Vol.200. - P.157-163.

158. Tangnu S. K., Blanch H. W., Wilke C. R. Enhanced production of cellulase, hemicellulase and ß-glucosidase by Trichoderma reesei RUT-C30 // Biotechnol. Bioeng. - 1981. - Vol.23. - P. 1837-1845.

159. Денисенко Ю.А., Мерзлов Д.А., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Синицын А.П. Сравнительная характеристика ксиланаз XylA и XylE из гриба Penicillium canascens // Вестн. Моск. Ун-та. - 2015. - Т.56. - Сер.2.Химия. - №6. - С.348-353.

160. Синицына О.А., Федорова Е.А., Правильников А.Г., Рожкова А.М., Скомаровский А.А., Матыс В.Ю., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства ксилоглюканаз Penicillium sp. // Биохимия. - 2010. - Т.75(1). - С.52-62.

161. Федорова Т.В., Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Майсурадзе И.Г., Трофимов А. А., Зоров И.Н., Хотченков В.П., Поляков К.М., Беневоленский С.В., Королева О.В., Ламзин В.С. Получение, биохимическая характеристика и структура рекомбинантной эндо-1,4^-ксиланазы XylE // Биохимия. - 2012. - Т.77 (10). - С.1433.

162. Monod J. in Dawson P.S.S. // Microbiol. Growth. - 1974. - Halsred Press. - Dowden. -Hutchinson and Ross Inc. - Strandsburg. - Penn. - Р.88-110.

163. Button D.K. Kinetics of nutrient-limited transport and microbial growth // Microbiol.Rev. -1985. - Vol.49. - P.270-297.

164. Skoog K., Hahn-Hägerdal B. Xylose fermentation // Enz. and Microb. Technol. - 1988. -Vol.10 (2). - P.66 - 80.

165. Greenman J., Holland K.T. Effects of dilution rate on biomass and extracellular enzyme production by three species of cutaneous propionibacteria grown in continuous culture // Gen J. Microbiol. - 1985. Vol.31. - P.619-1624.

166. Emanuilova E.I, Toda K. a-Amylase production in batch and continuous cultures by Bacillus caldolyticus // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1984. - Vol.19. - P.301-305.

167. Frankena J., Koningstein G.M., van Verseveld H.W., Stouthamer A.H. Effect of different limitations in chemostat cultures on growth and production of exocellular protease by Bacillus licheniformis // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1986. - Vol.24. - P.106-112.

168. Bailey J.E. Reflections on the Scope and the future of metabolic engineering and its connections to functional genomics and drug discovery // Metab. Eng. - 2001. - Vol.3 - P.111-114.

169. Varma A., Palsson B. Metabolic flux balancing: basic concepts, scientific and practical use // Biotechnology. - 1994. - Vol.12. - P.994-998.

170. Pirt S.J. Principles of microbe and cell cultivation // Blackwell Scientific Publ. - 1975. -Oxford. - 274 P.

171. Rehm H.J. Industrielle Mikrobiologie // 2-nd Ed. - 1980. - Springer Verlag. - Berlin. - 742 P.

172. Кислухина О., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья // Учебное пособие. - 1997. - Каунас. - Изд-во Технология. - С.73-169.

173. Panagiotou G., Kekos D., Macris B.J., Christakopoulos P. Production of cellulytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation // Ind. Crops Products. - 2003. - Vol.18. - P.37-45.

174. Latifian M., Hamidi-Esfahani Z., Barzegar M. Evaluation of culture conditions for cellulase production by two Trichoderma reesei mutants under solid-state fermentation conditions // Bioresource Technol. - 2007. - Vol.98. - P.3634-3637.

175. Yang Y.H., Wang B.C., Wang Q.H., Xiang L.J., Duan C.R. Research on solid state fermentation on rice chaff with a microbial consortium // Colloid Surf. - 2004. - Vol.34. - P.1-6.

176. Awafo V.A., Chahal D.S., Simpson B.K. Evaluation of combination treatments of sodium hydroxide and steam explosion for the production of cellulose systems by the Trichoderma reesei mutants under solid-state fermentation conditions // Bioresource Technol. - 2000. - Vol. 73. - P.235-245.

177. Jecu L. Solid state fermentation of agricultural wastes for endoglucanase production // Ind. Crops. Products. - 2000. - Vol.11. - P.1-5.

178. Chanal D. S. Solid-state fermentation with Trichoderma reesei for cellulase production // Appl. Environ. Microbiol. - 1985. - Vol.49. - P.205-212.

179. Abo-State M.A.M., Swelim M., Hammad A.I., Gannam R.B. Some critical factors affecting cellulase(S) production by Aspergillus terreus Mam-F23 and Aspergillus flavus Mam-F35 under

135

Solid-state fermentation of wheat straw // World App. Sciences J. - 2010. - Vol.9. - P.1171-1179.

180. Isil S., Nilufer A. Investigation of factors affecting xylanase activity from Trichoderma harzianum 1073 D3 // Braz. arch. biol. technol. - 2005. - Vol.48. - P.187-193.

181. Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. Penicillium canescens host as the platform for development of a new recombinant strain producers of carbohydrases // In: Kamm B., editor. Microorganisms in Biorefineries. - 2015. - Berlin: Springer-Verlag. - Р.1-19.

182. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars // Journal of Biological Chemistry. - 1952. - Vol.195. - P.19-23.

183. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars // Journal of Biological Chemistry. - 1944. - Vol.153. - P.375-379.

184. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биокнверсия лигноцеллюлозных материалов // Учебн.пособие. - 1995. - М.: Изд-во МГУ. - 224 C.

185. Sinitsyna O.A., Bukhtoyarov F.E., Gusakov A.V., Okunev O.N., Bekkarevitch A.O., Vinetsky Y.P., Sinitsyn A.P. Isolation and properties of major components of Penicillium canescens extracellular enzyme complex // Biochemistry (Moscow). - 2003. - Vol.68 (11). -P.1200-1209.

186. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1952. - Vol. - 193. - P.265-275.

187. Чухчин Д. Г., Малков А. В., Тышкунова И. В., Майер Л. В., Новожилов Е. В. Способ дифрактометрического определения степени кристалличности веществ // Кристаллография. - 2016. - Т.61(3). - С.1-5.\

188. James, P., ed. Proteome Research: Mass Spectrometry - Principles and Practice // Heidelbeg. - 1991. - Springer-Verlag. - 274 P.

189. Gusakov A.V., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. Mass spectrometry in the study of extracellular enzymes produced by filamentous fungi // Journal of Analytical Chemistry - 2010. - Vol.65 (14) - P.1446-1461.

190. Wilkins M. R., Lindskog I., Gasteiger E., Bairoch A., Sanchez J.-C., Hochstrasser D. F. and Appel R. D. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool // Electrophoresis. - 1997. - Vol.18. - P.403-408.

191. Волчок А.А., Короткова О.Г., Кондратьева Е.Г., Крюков В.С., Синицына О.А., Синицын А.П., Шашков И. А. Активность глюканаз и ксиланаз кормовых ферментных препаратов в ЖКТ птицы // Птицеводство. - 2018. - №4. - С.39-45.

192. Vahjen, W., Simon O. Biochemical characteristics of non-starch polysaccharide hydrolyzing enzyme preparations designed as feed additives for poultry and piglet nutrition // Animal Nutrition. - 1998. - Vol.52. - №1. - P.1-14.

193. Jacob J.P., Pescatore A.J. Barley P-glucan in poultry diets // Annals of Translational Medicine. - 2014. - Vol.2. - №2. - doi:10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.02.

194. Синицын А.П., Зоров И.Н., Короткова О.Г., Мерзлов Д.А. Метод определения степени ингибирования ксиланаз белковыми ингибиторами злаков // Птицеводство. -2016. - №1. - С.19-24.

195. Немашкалов В.А. Биосинтез карбогидраз гриба Penicillum verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах // Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук - 2012. - ИБФМ - Пущино - 119 С.

196. Аутлов С.А., Базарнова Н.Г., Кушнир Е.Ю. Микрокристаллическая целлюлоза: структура, свойства и области применения // Химия растительного сырья - 2013. - №3. -С.33-41.

197. Доценко Г.С., Чекушина А.В., Кондратьева Е.Г., Правильников А.Г., Андрианов Р.М., Осипов Д.О., Синицына О.А., Короткова О.Г., Степанов В.И., Новожилов Е.В., Ачильдиев Е.Р., Константинова С.А., Синицын А.П. Реакционная способность различных целлюлозосодержащих материалов при ферментативном гидролизе // Лесной вестник. -2012. - №8. - С.129-135.

198. Ilmen, M., A. Saloheimo, M. L. Onnela, and M. E. Penttila. Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. -Vol.63. - P.1298-1306.

199. Mach-Aigner A.R., Pucher M.T., Mach R.L. D-Xylose as a Repressor or Inducer of Xylanase Expression in Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) // Applied and Environmental Microbiology. - 2010. - Vol 76(6). - P.1770-1776.

200. Синицын А.П., Осипов Д.О., Рожкова А.М., Бушина Е.В., Доценко Г.С., Синицына О.А., Кондратьева Е.Г., Немашкалов В.А., Матыс В.Ю., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Получение высокоэффективных ферментных комплексов целлюлаз и гемицеллюлаз для гидролиза растительного сырья на основе штамма Penicillum verruculosum // Биотехнология. - 2013. - №5. - С.50-53.

201. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии // Учебное пособие. - 2004. -М.: КолосС. - 296 С.