Создание и тестирование миниатюрных однодоменных антител на основе тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки против онкомаркера CD47 и их применение для терапии опухолей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Ратникова Наталья Михайловна

• Ратникова Наталья Михайловна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Ратникова Наталья Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

2. Цели и задачи исследования

3. Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

4. Апробация результатов работы

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика одноцепочечных антител

1.1.1. Структура одноцепочечных антител

1.1.2. Практическое применение одноцепочечных антител

1.1.3. Разработка УИИ антител для терапии опухолей

1.2. Рецептор CD47 и его место в развитии раковых заболеваний

1.2.1. Структура CD47

1.2.2. Взаимодействие CD47 с лигандами

1.2.2.1. Взаимодействие CD47 с Б1КРа

1.2.2.2. Взаимодействие CD47 с ТБР-1

1.2.2.3. Взаимодействие CD47 с интегринами

1.2.3. Роль CD47 на эритроцитах

1.2.4. CD47 и апоптоз

1.2.5. Терапевтические возможности блокирования CD47

1.3. Методы получения рекомбинантных антител

1.3.1. Особенности метода фагового дисплея

1.3.2. Особенности технологии рибосомного дисплея

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Основные реактивы и ферментные препараты

2.2. Используемые клеточные линии и антитела

2.3. Используемые буферные растворы и среды

2.4. Буферы для выделения плазмид

2.5. Иммунизация животного

2.6. Выделение РВМС из крови методом экстракции в градиенте фиколла

2.7. Методы работы с РНК

2.7.1. Выделение РНК из РВМС методом тризольной экстракции

2.7.2. Синтез кДНК

2.8. Методы работы с ДНК

2.8.1. ПЦР с праймерами, специфичными к УИ-УЬ и УИИ участкам

2.8.2. Гнездовая ПЦР для наработки препаративного количества фрагмента

2.8.3. Электорофоретическое разделение фрагментов ДНК

2.8.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

2.8.5. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.8.6. Лигирование последовательностей антител в фагмидный вектор63

2.8.7. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК

2.8.8. Секвенирование плазмид

2.9. Методы работы с бактериями Е.соН

2.9.1. Получение компетентных клеток

2.9.2. Трансформация компетентных клеток Е.соН плазмидной ДНК

2.10. Рестрикционный анализ отобранных УИИ

2.11. Методы работы с фагами

2.11.1. Подготовка клеток и бактериофага

2.11.2. Приготовление фаговой библиотеки

2.11.3. Паннинг

2.11.4. Наращивание фага для следующего раунда паннинга

2.12. Методы работы с белками

2.12.1. Экспрессия рекомбининтных VHH в аналитическом и

препаративном вариантах

2.12.2. Лизис клеток и очистка белка

2.12.3. Электрофоретический анализ белков

2.12.4. Вестерн-блот анализ белков

2.12.5. Измерение концентрации белков

2.13. Иммуноферментный анализ

2.14. Методы работы с эукариотическими клетками

2.14.1. Культуры клеток, использованные в работе

2.14.2. Замораживание клеток

2.14.3. Размораживание клеток

2.14.4. Ведение культуры прикрепленных клеток

2.14.5. Ведение суспензионных клеточных культур

2.14.6. Ведение гибридомы для наработки моноклонального антитела B6H12

2.14.7. Оценка жизнеспособности клеток

2.15. Тестирование на апоптоз

2.16. Тестирование на фагоцитоз

2.16.1. Выделение моноцитарной фракции из PBMC

2.17. Тест на мышиной модели ксенографта опухоли

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение фаг-дисплейной библиотеки вариабельных фрагментов тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки

3.2. Дизайн праймеров

3.3. Модификация фагмиды pHEN2 patent для клонирования последовательностей VHH

3.4. Отбор из полученной библиотеки фрагментов высокоаффинных вариантов УНН к рецептору CD47 и получение рекомбинантных форм этих антител в

чистом виде

3.5. Препаративное получение УИИ антител к СБ47

3.6. Оценка блокирующей способности антител в конкурентном замещении лиганда SIRPa

3.7. Получение биотинилированных УИИ антител

3.8. Экспрессия и очистка биотинилированных УИИ антител

3.9. Измерение констант диссоциации УИИ методом поверхностного плазмонного резонанса

3.10. Тестирование функциональной активности УНН к рецептору CD47

3.10.1. Индукция апоптоза

3.10.2. Фагоцитоз опухолевых клеток

3.11. Исследование влияния антител на мышиной модели ксенографта линии

и937

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность

ДСН - додецилсульфат натрия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПТГ - Изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозид

кДНК - комплементарная ДНК

КЗЦ- комплемент зависимая цитотоксичность

мАТ - моноклональные антитела

мРНК - матричная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

ППР - поверхностный плазмонный резонанс

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РСК - раковых стволовых клетках

ТМБ - тетраметилбензидин

ФС - фосфатидилсерин

cAMP (cyclic adenosine monophosphate) - циклический аденозин монофосфат

CDR (complementarity determining region) - гипервариабельные домены

c-Met (tyrosine-protein kinase Met) - тирозинкиназа Met

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) - ростовая среда Игла,

модифицированная Дульбекко

DMSO (dimethyl sulfoxide) - диметил сульфоксид

EGFR (epidermal growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста

Fab (antigen-binding fragment) - антиген-связывающий фрагмент

FACS (fluorescence-activated cell sorting) - метод проточно-цитометрической селекции клеток, основанной на их флуоресценции

FITC (fluorescein isothiocyanate) - флуоресцеин изотиоцианат, зеленый

флуоресцентный краситель

Fc - Fc домен антитела

FR - константный участок антитела

Fv - вариабельный домен одной цепи

HcAb (heavy chain antibody) - антитело, состоящее из одной тяжелой цепи HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) - рецептор эпидермального фактора роста 2 человека

IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium) - среда Дульбекко

модифицированная по Искову

IgG (Immunoglobulin G) - иммуноглобулин G

LB - (lysogeny broth) - литическая среда

MHCI - молекула первого класса гистосовместимости

PBMC (peripheral blood mononuclear cell) - мононуклеарные клетки периферической крови

RFP (red fluorescent protein) - красный флуоресцентный белок

ROS (reactive oxygen species) - реактивные формы кислорода

TNFa (Tumor necrosis factor alpha) - фактор некроза опухоли альфа

VHH (variable heavy-heavy) - вариабельный участок одноцепочечного

антитела Верблюжьих

VH (variable heavy) - вариабельный участок тяжелой цепи

VL (variable light) - вариабельный участок легкой цепи

His (histidine) - аминокислота гистидин

siPHK (short interfering) - короткая интерферирующая РНК

scFv (single chain variable region fragment) - одноцепочечный вариабельный

фрагмент

SH2 (Src Homology 2 domain) - домен, гомологичный спектрину 2 SHP (Src homology region 2 domain-containing phosphatase) - фосфатаза, содержащая домен, гомологичный спектрину

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание и тестирование миниатюрных однодоменных антител на основе тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки против онкомаркера CD47 и их применение для терапии опухолей»

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В середине 90-х годов у млекопитающих семейства Camelidae (верблюды, ламы, альпаки), наряду с традиционными антителами типа IgG, были обнаружены антитела, антигенсвязывающий карман которых представлен вариабельным участком тяжелой цепи и отсутствием как таковой легкой. Такие антитела были обозначены как VHH. Главное их отличие от классических антител состоит в том, что они обладают одним антиген-распознающим участком, гомологичным CDR в IgG Vh домена и представленным структурой из в - слоев и трех петель. Длина петли CDR3 у VHH может превышать 20 аминокислотных остатков, что существенно больше типичной длины вариабельных участков обычных антител (мышиных - 9 и человеческих - 12). В целом длина петель CDR3, как и способ их связывания, может сильно варьировать, благодаря чему молекула VHH способна связывать скрытые и не вызывающие иммуногенности для обычных антител эпитопы.

VHH антитела имеют ряд преимуществ по сравнению с одноцепочечными антителами, полученными из обычных молекул IgG. Они заключаются в простоте генетических манипуляций, лучшей экспрессии в различных системах, хорошей растворимости и более высокой стабильности в широком диапазоне условий. К слову, вариабельные домены VHH антител достаточно миниатюрны, для того чтобы проникать в большинство тканей, и настолько стабильны, что в некоторых случаях могут даже эффективно усваиваться из кишечника. Фрагменты VHH антител могут быть легко экспрессированы в бактериальных клетках-

продуцентах, что позволяет существенно снизить стоимость производства терапевтического препарата на их основе.

Уникальные свойства УНН антител определяют удобство их использования в конструировании и применении иммунных фаговых библиотек. Их особенности открывают большие возможности для высокоточной инженерии антител. Вариабельные домены УНН антител могут быть использованы в качестве каркаса при дизайне синтетических библиотек, поскольку у УНН антител только три CDR-фрагмента необходимы для высокоаффинного связывания.

С открытия одноцепочечных антител и до сегодняшнего момента активно селектируются и производятся рекомбинантные формы фрагментов УИИ к различным мишеням. УИИ в качестве биотерапевтических препаратов находят применение для терапии широкого ряда заболеваний, включая гематологические, воспалительные, онкологические и легочные. Такие терапевтические УНН антитела представляют собой технологию следующего поколения, семь препаратов из их числа в настоящий момент проходят клинические испытания, а для лечения ревматоидного артрита уже существует доказавший эффективность своего действия препарат на основе УИИ ^ога^итаЬ), состоящий из двух молекул УНН антител к Т№а ^ога^итаЬ) и альбуминсвязывающего домена, доказавший эффективность своего действия. УНН очень схож со структурой участка УН иммуноглобулина человека, результаты первой фазы испытаний препаратов указывают на низкий уровень иммуногенности УИИ.

Однодоменная природа УНН антитела существенно упрощает их селекцию при помощи фагового дисплея, благодаря чему можно быстро получить высокоспецифичное антитело к любому интересующему белку. В контексте противоопухолевой терапии УНН могут использоваться для нацеливания терапевтических препаратов на раковые клетки и/или

сосудистую систему опухоли за счет связывания со специфическими мишенями. Поскольку одноцепочечные антитела не способны непосредственно связываться с мембраной клетки, обычно мишенями являются внеклеточные молекулы - опухолевые неоантигены либо рецепторные лиганды или трансмембранные белки, гиперэкспрессируемые по сравнению с нормальными клетками.

Высокоспецифичные агенты на основе УНН антител имеют потенциал в ближайшие годы стать одним из основных классов терапевтических противоопухолевых средств, в том числе предотвращающих рецидив опухоли за счет их специфичной нацеленности на раковые стволовые клетки (РСК). Медицинское применение таких препаратов в сочетании с традиционными терапевтическими подходами позволит существенно улучшить средний прогноз пяти- и десятилетней выживаемости пациентов, перенесших в частности рак молочной железы, и другие распространенные виды рака.

В рамках такой нацеленной иммунотерапии, изучение вовлеченных в патогенез новых рецепторов на поверхности клетки также становится одной из важных задач современных исследований, поскольку именно поверхностные рецепторы выступают в роли ключевых молекул, участвующих в передаче сигналов, коммуникации между клетками и межклеточным пространством, поддержке гомеостаза организма. В то же время количество «истинных» опухолевых антигенов - неоантигенов, не встречающихся или чрезвычайно редких для нормальных клеток, относительно невелико. Для каждого из таких антигенов уже создано или находится в процессе создания одно или несколько терапевтических антител.

Одним из активно исследуемых опухоль-ассоциированных рецепторов является белок CD47, экспрессирующийся на поверхности многих клеток

организма. В нормальном состоянии CD47 на клетке выполняет роль ее защиты от фагоцитоза клетками иммунной системы, в ходе старения клетки количество CD47 на ее поверхности снижается, тем самым в организме происходит удаление устаревших клеток. Эту систему защиты используют в своих целях и раковые клетки, в том числе стволовые, гиперэкспрессируя CD47 на своей поверхности. Таким образом злокачественные опухоли «уходят» от воздействия иммунной системы. Развернув такой механизм действия CD47 в обратную сторону, можно добиться элиминации опухоли и улучшения прогнозов выживаемости в ходе терапии. Поиск высокоспецифичного блокирующего агента, направленного CD47 все еще остается актуальным, поскольку существующие мышиные моноклональные антитела к CD47 не в полной мере соответствуют клиническим требованиям.

2. Цели и задачи исследования

Целью работы являлось получение одноцепочечных VHH антител, обладающих высокой аффинностью к рецептору CD47, и тестирование их в экспериментах in vitro и in vivo на способность блокировать этот рецептор с целью их дальнейшего использования в качестве терапевтических агентов. Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить фаг-дисплейную библиотеку вариабельных фрагментов тяжелой цепи иммуноглобулина альпаки из материала иммунизированного животного.

2. Отобрать из полученной библиотеки фрагментов высокоаффинные варианты к рецептору CD47 и получить рекомбинантные формы этих антител в растворимом виде.

3. Провести оценку констант связывания антител.

4. Провести оценку способности отобранных фрагментов антител

блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPa в опытах in vitro.

5. Провести тесты на функциональную активность антител в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих маркер CD47.

6. Оценить действие антител на мышиных моделях ксенографтов опухолей.

3. Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые была создана библиотека вариабельных фрагментов VHH из материала лимфоузлов и клеток крови иммунизированного против CD47 животного альпаки. Был получен ряд VHH фрагментов антител к рецептору CD47, определена их аминокислотная последовательность и константы связывания. Впервые показано апоптотическое действие полученных вариантов VHH антител в отношении моноцитарной лимфомной линии клеток U937. В экспериментах на фагоцитоз впервые показано увеличение показателя фагоцитированных клеток линии рака молочной железы MCF7 при блокировании CD47 VHH антителом в сравнении с контрольными культурами, а также моноклональным антителом B6H12.2. Впервые показано опухолесупрессивное действие VHH антител на мышиной модели ксенографта U937. Впервые создана четырехвалентная молекула стрептабоди для удлинения периода действия блокирующего VHH антитела в организме при интраперитонеальном введении.

4. Апробация результатов работы

Основные результаты диссертационной

- организации FEBS-EMBO

(Париж, 2014 г.) и 2-ой конференции молодых ученых «Наука будущего» (Казань, 2016 г.) и совместном коллоквиуме Группы экспрессии белковых

факторов роста и дифференцировки и Лаборатории пролиферации клеток в Институте Молекулярной Биологии имени В.А.Энгельгардта (май 2017). По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 тезиса международных конференций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика одноцепочечных антител 1.1.1. Структура одноцепочечных антител

Изучение свойств одноцепочечных антител началось в середине 90-х годов, когда их впервые обнаружили у животных семейства Camelidae (верблюжьи). Для этих животных характерно наличие особого класса антител - мини-антител, лишенных легкой цепи, т.н. VHH (variable heavy-heavy). При детальном изучении таких антител оказалось, что они обладают другими структурными особенностями в сравнении с классическими молекулами IgG. Как видно на Рисунке 1, главное отличие состоит в том, что антигенсвязывающий участок таких антител представлен только одним фрагментом - VHH - и к тому же участок, соединяющий константный и вариабельный домены, является более длинным. Структура VHH также как и VH в классических антителах имеет общие константные участки FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2, в то время как CDR3 более протяженный, за счет чего достигается вариабельность антигенраспознающих участков.

Общая картина вариабельных участков иммуноглобулинов животных семейства верблюжьих представлена на Рисунке 2.

Рисунок 1 - строение классических и одиоцеиочечных антител [1].

За счет наличия единственного вариабельного домена, в составе тяжелой цепи иммуноглобулина, обладающего большей протяженностью, чем у обычных антител, VHH антитела отличаются высокой аффинностью к своим лигандам, а также весьма просты в плане создания иммунных библиотек вариабельных фрагментов, для последующего отбора высокоспецифичных вариантов антител при помощи фагового или рибосомального дисплея.

VHH домены состоят из в - слоев с тремя петлями в участке, гомологичном CDR в IgG Vh доменов. Длина петли CDR3 у VHH может превышать 20 аминокислотных остатков, что существенно больше типичной длины вариабельных участков обычных антител (мышиных - 9 и человеческих - 12). В целом длина петель CDR3, как и способ их связывания, может сильно варьировать, благодаря чему молекула VHH способна связывать скрытые и не вызывающие иммуногенности для обычных антител эпитопы. Классические антитела чаще связываются с линейными или плоскими эпитопами, в то время как VHH связывают вогнутые и прерывистые эпитопы, формирующиеся только в сложенном белке. Это свойство делает фрагмент одноцепочечного антитела ценным инструментом для зондирования конформационных состояний белка мишени как in vitro, так и в клетке.

дез

(Ь)

"Нг

3 СРЯ1 сов* 1

СРЯЗ I FW4

FW1 ]| СРШ FW2 1 СРЯ2 FWЗ СРЙЗ FW4

Г». 1Л го т тг Ш 1Э

V Р

Л' ^ 1

т7ч >гД)

'ад*

Рисунок 2 - а) Схематичное изображение антител в сыворотке верблюжьих. 1^01: классические тяжелоцепочечные антитела (ИСЛЬб), образованные доменами УИ, СИ1, петля, СИ2, СИЗ, 1§02, 1§03: два типа гомодимерных тяжелоцепочечных антител, содержащих только И-цепи, представленные доменами УИН, петля, СИ2 и СИЗ. 1§02, 1§03 различаются длиной участка петли. б) Структура последовательностей УИ и УИН с консенсусными (Б^) и комплементраспознающими доменами (СЭЯ),

отмечены некоторые аминокислотные остатки и Б-Б связь между СЭМ и СБЯЗ (желтым). с) 3-0 структура УИ и УИИ доменов [2].

1.1.2. Практическое применение одноцепочечных антител

В настоящее время вариабельные фрагменты одноцепочечных антител находит широкое применение в лечении многих заболеваний [3], включая те, которые связаны с эффективностью их действия в ядре клетки, цитоплазме и ЭПР [4]. Также они могут использоваться для нейтрализации антигенов в клетке [5]. Недостаток использования обычных антител связан с их низкой стабильностью и высокой стоимостью производства, что преодолевается в случае использования УИИ, так как ввиду их небольшого размера они легко могут быть экспрессированы как в прокариотах, так и в эукариотах [6]. Ввиду высокой специфичности для УИИ характерна низкая иммуногенность и токсичность и пониженная склонность к агрегации в сравнении с одноцепочечными антителами [7].

Вариабельные домены УНН-антител достаточно миниатюрны, для того чтобы проникать в большинство тканей, и настолько стабильны, что в некоторых случаях могут даже эффективно усваиваться из кишечника. scFv-фрагменты УНН антител могут быть легко экспрессированы в бактериальных клетках-продуцентах, что позволяет существенно снизить стоимость производства терапевтического препарата на их основе. С начала открытия одноцепочечных антител до сегодняшнего момента стало перспективным получать рекомбинантные формы фрагментов УИИ к различным мишеням.

Можно выделить несколько основных преимуществ рекомбинантных УИИ антител:

• Малый размер (15 - 30 кДа)

• Высокая специфичность к антигену

• Стабильность в широком диапазоне условий (способны связываться с антигеном при температурах до 90С, разворачивание при высоких концентрациях денатурантов)

• Мономерная форма

• Хороший уровень экспрессии в бактериях или дрожжах

УИИ в качестве биотерапевтических препаратов находят применение для терапии широкого ряда заболеваний, включая гематологические, воспалительные, онкологические и легочные. Такие терапевтические УНН антитела представляют собой технологию следующего поколения, семь препаратов из их числа в настоящий момент проходят клинические испытания, а для лечения ревматоидного артрита уже существует доказавший эффективность своего действия препарат на основе УИИ ^огаШитаЬ), состоящий из двух молекул УНН антител к Т№а ^огаШитаЬ) и альбуминсвязывающего домена, доказавший эффективность своего действия [8].

Также УИИ могут быть использованы в качестве вспомогательных элементов при кристаллизации сложных белков (мембранные рецепторы, переносчики) [9-11]. Наноантитела с известными сайтами связывания могут использоваться для картирования отдельных доменов белков в криоэлектронной микроскопии [12], либо при случае необходимости нарушения взаимодействия между доменами [13].

Способность идентифицировать специфические конформации белков с использованием УИИ используется для выяснения механизмов клеточных процессов рецептор опосредованной передачи сигнала, перемещения и сборки комплекса. Яркий пример в этом плане представляет обнаружение неактивной конформации гетеродимера БОБЯ [14-16]. Существуют УИИ, способные задержать белок мишень в определенном состоянии

конформации и может использоваться для управления его активностью в клетке, что в свою очередь может быть полезным образом использовано при разработке концептуально новых терапевтических стратегий [17]. УИИ могут использоваться как шапероны для кристаллизации трудносворачиваемых белков, амилоидов, антитоксинов [18].

1.1.3. Разработка УИИ антител для терапии опухолей

Существующие терапевтические средства на основе УИИ подразделяются на несколько видов: в качестве антагонистов рецепторов либо компонентов, нацеленных на эффекторный домен или в качестве узнающей части, нагруженной на препарат наночастиц.

В сравнении с размером молекулы моноклонального антитела (мАТ), который составляет порядка 150 кДа с разрешением 14.2 х 8.5 х 3.8 нм вследствие чего антитело обладает низкой проницаемостью в опухоль и медленным распространением, УИИ - вариабельный участок ИеЛЬ, ответственный за связывание с антигеном - в настоящее время является самым маленьким природным антиген связывающим фрагментом, полностью сохраняющим функциональную активность.

Как уже было отмечено выше, УНН изучены достаточно хорошо в отношении их молекулярного строения, и неоспоримыми преимуществами таких молекул при разработке агентов для терапии опухоли являются размер, стабильность, растворимость, легкая продукция в бактериях, дрожжах или эукариотах, что создает условия для производства с минимальными затратами. Помимо этого, УНН очень схож со структурой участка УН иммуноглобулина человека, результаты первой фазы испытаний препаратов указывают на низкий уровень иммуногенности УИИ.

При поиске антитела УИИ к новому рецептору необходимо учитывать несколько фактов. В первую очередь это касается аффинности. Наиболее

целесообразно получать высокоаффинные молекулы, чтобы избежать низкого сродства из-за небольшой поверхности взаимодействия паратопа и эпитопа антигена. Кроме того следует учитывать эффект сопряжения случайных остатков лизина, так как это может повлиять на связывающие свойства антитела, однако эта проблема решается с помощью сайт направленного слияния с С-концевым цистеином.

Однодоменная природа VHH антитела существенно упрощает их селекцию при помощи фагового дисплея, благодаря чему можно быстро получить высокоспецифичное антитело к любому интересующему белку. В контексте противоопухолевой терапии VHH могут использоваться для нацеливания раковых клеток и/или сосудистой системы опухоли за счет связывания со специфическими мишенями. Поскольку одноцепочечные антитела не способны непосредственно связываться с мембраной клетки, обычно мишенями являются внеклеточные молекулы - опухолевые неоантигены либо рецепторные лиганды или трансмембранные белки, гиперэкспрессируемые или экспрессируемые в единственном числе по сравнению с нормальными клетками. Поэтому изначально при отборе из библиотеки фрагментов, кодирующих VHH, используют либо рекомбинантную форму белка, иммобилизованного на твердой поверхности, либо очищенные компартменты клетки, экспрессирующие нужный антиген, либо непосредственно клетки, на поверхности которых представлена мишень.

С помощью отбора по технологии фагового дисплея были получены VHH к рецепторам тирозиновых киназ EGFR, HER2 и c-Met. Такие молекулы рассматриваются как антагонисты, предотвращающие связывание лиганда и соответственно активацию сигнальных путей, происходящей вследствие конформационных изменений при взаимодействии рецептора и агониста. Что касается in vivo исследований, то ингибирование роста

опухоли было продемонстрировано на примере тривалентного бипаратопного конструкта anti EGFR 7D12-9G8-Alb, где третьей составляющей является VHH, связывающийся с альбумином. Такая молекула способна продержаться в кровотоке в течение 2-3 дней вместо 1 -2 часов. Полного уничтожения опухоли не наблюдалось несмотря на то, что использовали различные комбинации VHH - либо биваленты, либо бипаратопы, что может быть в первую очередь связано с тем, что у препарата с VHH антителами отсутствует Fc домен, ответственный за АЗКЦ и за КЗЦ [19].

Есть примеры антител, которые служат аллостерическими ингибиторами, способными модулировать ферментативную активность белка мишени (CAIX) [20]. В случае когда один лиганд ответственен за активацию соответствующего рецептора, могут использоваться VHH, непосредственно связывающиеся с лигандом. Примером этого является VHH, направленный на ингибирование тирозинкиназного рецептора c-Met за счет связывания с его лигандом HGF - фактором роста гепатоцитов. Такой альтернативный путь воздействия VHH затрагивает внеклеточные мишени - хемокины, функционирующие внутри опухоли [21]. Хемокины играют большую роль в иммунном ответе, воспалительных процессах и вовлечены в развитие рака. Таким образом, терапевтический эффект VHH зависит от мишени и модели опухоли.

Резюмируя вышесказанное, VHH как противоопухолевый агент может быть представлен в виде:

1. антагонист - мономер VHH

2. VHH, сшитые с эффекторным доменом

3. VHH на поверхности наночастиц с цитотоксическими препаратами: липосом, мицелл, полиплексов альбуминовых наночастиц.

Конъюгирование VHH с наночастицами проводят с помощью SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate) модификации, после чего они взаимодействуют с малеимидными или сульфгидрильными группами на наночастицах. Такая модификация наночастиц способствует улучшению связывания с клеткой-мишенью. Выпуск препарата из частицы можно осуществить путем утечки или механического разрушения ультразвуком или внутриклеточной деградацией. Последние два случая способствуют снижению токсичности препарата в опухоли [22, 23].

Эффекторные домены могут быть представлены Fc доменом, так как Fc фрагмент способствует развитию антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [24], токсином Pseudomonas exotoxin A [25, 26]. Такие конъюгаты VHH-препарат могут быть сшиты с линкером, расщепляемым протеазой в строме опухоли или в клетке. За счет Fc фрагмента мАТ могут вызывать АЗКЦ привлечением белков комплемента или эффекторных клеток иммунной системы защиты к месту опухоли.

Особое внимание в последнее время уделяется биспецифичным препаратам VHH, благодаря чему достигается более эффективное действие на опухоль за счет ингибирования нескольких сигнальных путей в клетках. Примером этого является вариант, в котором между собой сшиты VHH к EGFR и лиганду TRAIL [27]. Помимо биспецифичных молекул предложено использовать и мультивалентные комплексы. В частности, так называемая молекула стрептабоди, состоящая из стрептавидина и биотинилированных антител с одной стороны обладает большей аффинностью, с другой стороны за счет размера продлевает период полужизни антител [28]. Также возможны форматы мультипаратопных молекул - разные эпитопы на одной мишени и мультиспецификов - разные мишени. Это позволяет достигнуть те мишени или пути, которые сложнодоступны для обычных терапевтических антител. За счет

вышеупомянутых модификаций антител, а также сливания с ПЭГом [29], альбумином [30], можно влиять на их фармакокинетические свойства. С помощью этих технологий можно продлить период полужизни молекул с часов до дней. Помимо этого, риск иммуногенности таких конструктов тоже можно уменьшить за счет гуманизирования последовательности. Это дает большое преимущество в лечении болезней человека, поскольку VHH изначально проявляют высокую степень гомологии с вариабельными доменами тяжелых цепей человека (80-90%) при сравнении участков фреймворка.

Тем не менее для каждого вида препарата на основе VHH способ распространения и система доставки могут отличаться и эффективность этого процесса напрямую влияет на эффективность лечения. Доставка агентов может быть оральной, внутривенной, интраперитонеальной или внутриопухолевой. Для VHH применимы все виды доставок. Однако каждый из способов имеет свои требования, начиная от устойчивости в экстремальных условиях желудка, расщеплению протеазами до сохранения стабильного состояния в сыворотке крови. В случае когда VHH соединяется с препаратом или наночастицами также стоит иметь ввиду их различный уровень устойчивости, в обратном случае может произойти преждевременный выпуск препарата, что может привести к сильному побочному эффекту. Наиболее распространенным методом введения препарата VHH на сегодняшний день является внутривенное и интраперитонеальное введение. В этих случаях стоит учитывать период нахождения препарата в кровотоке. Простые антитела вымываются быстро, это снижает их время связывания с мишенью, с другой стороны быстрое вымывание уменьшает риск побочных эффектов, поэтому для успешной терапии необходим баланс между этими факторами. В случае больших форматов VHH с препаратами может произойти опсонизация и

последующее распознавание и поглощение ретикулоэндотелиальной системой, что приводит к печеночному вымыванию этих терапевтических соединений.

1.2. Рецептор СБ47 и его место в развитии раковых заболеваний

Изучение рецепторов на поверхности клетки - одна из важных задач современных исследований, именно поверхностные рецепторы выступают в роли ключевых молекул, участвующих в передаче сигналов, коммуникации между клетками и межклеточным пространством, поддержке гомеостаза организма. Особое внимание привлекают те рецепторы, которые вовлечены в патогенез заболеваний. Одни из них уже хорошо изучены, для других новые функции только начинают исследоваться благодаря развитию методов характеризации белковых взаимодействий. На этом фоне развивается таргетная терапия, которая направлена на изменение функционирования самих рецепторов, что приводит к изменению хода событий - остановке патологических процессов и запуску нормальных. Препаратами для такой терапии служат разного рода биомолекулы: антитела, миРНК, наночастицы с нуклеиновыми кислотами, вирусные частицы, нацеленные на конкретные мишени. Большая часть заболеваний для такой терапии - аутоиммунные либо онкологические.

Один из активно исследуемых в настоящее время рецепторов - СЭ47. Это мультифункциональный белок, вовлеченный во многие клеточные процессы: от передачи сигналов между клетками до участия в сложной цепи иммунных реакций и прогрессии многих видов опухолей. Особенный интерес исследователей связан с тем, что СЭ47 является одним из ключевых маркеров раковых стволовых клеток, но также экспонирован на всех клетках организма, что делает его универсальной мишенью. Уровень экспрессии СЭ47 на нормальных и патологических клетках заметно

отличается - CD47 гиперэкспрессирован на раковых клетках, что может быть использовано в рамках таргетной терапии - такие клетки могут быть сделаны мишенями для иммунной системы. Взаимодействие CD47 с одним из его лигандов - белком SIRPa, ингибиторным мембранным рецептором макрофагов, как раз служит объектом для такого рода исследований. Связывание SIRPa с CD47 запускает каскад сигналов, ведущих к подавлению фагоцитоза. Гиперэкспрессия CD47 на раковой клетке способствует росту опухоли и делает ее неуязвимой перед системой врожденного иммунитета путем передачи макрофагу сигнала «не ешь меня». Нарушив такой способ защиты раковой клетки введением молекул, способных конкурентно блокировать взаимодействие SIRPa с CD47, можно заново направить врожденный механизм защиты организма на элиминацию опухоли. В настоящий момент ведутся активные поиски терапевтических агентов, обладающих таким блокирующим действием: моноклональных антител, миРНК или рекомбинантных белков. CD47 также участвует и в иных клеточных процессах, связанных с апоптозом, пролиферацией, клеточной адгезией, воспалением и иммунитетом, за счет взаимодействия с другими лигандами - TSP-1 интегринами, что также может служить мишенью для новых терапевтических подходов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ратникова Наталья Михайловна, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Vanlandschoot P., Stortelers C., Beirnaert E., Ibanez L.I., Schepens B., Depla E., Saelens X. 2011. Nanobodies(R): new ammunition to battle viruses. Antiviral research. 92, 389-407.

2. Sabir J.S., Atef A., El-Domyati F.M., Edris S., Hajrah N., Alzohairy A.M., Bahieldin A. 2014. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes rendus biologies. 337, 244-249.

3. Kazemi-Lomedasht F., Behdani M., Bagheri K.P., Habibi-Anbouhi M., Abolhassani M., Arezumand R., Shahbazzadeh D., Mirzahoseini H. 2015.

Inhibition of angiogenesis in human endothelial cell using VEGF specific nanobody. Molecular immunology. 65, 58-67.

4. Gray M.A., Tao R.N., DePorter S.M., Spiegel D.A., McNaughton B.R. 2016. A Nanobody Activation Immunotherapeutic that Selectively Destroys HER2-Positive Breast Cancer Cells. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 17, 155-158.

5. Crasson O., Rhazi N., Jacquin O., Freichels A., Jerome C., Ruth N., Galleni M., Filee P., Vandevenne M. 2015. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein engineering, design & selection : PEDS. 28, 451-460.

6. Bruce V.J., Lopez-Islas M., McNaughton B.R. 2016. Resurfaced cell-penetrating nanobodies: A potentially general scaffold for intracellularly targeted protein discovery. Protein science : a publication of the Protein Society. 25, 1129-1137.

7. Braun M.B., Traenkle B., Koch P.A., Emele F., Weiss F., Poetz O., Stehle T., Rothbauer U. 2016. Peptides in headlock--a novel high-affinity and versatile peptide-binding nanobody for proteomics and microscopy. Scientific reports. 6, 19211.

8. Merlot A.M., Kalinowski D.S., Kovacevic Z., Jansson P.J., Lane D.J., Huang M.L., Sahni S., Richardson D.R. 2015. Making a case for albumin - a highly promising drug-delivery system. Future medicinal chemistry. 7, 553-556.

9. Korotkov K.V., Pardon E., Steyaert J., Hol W.G. 2009. Crystal structure of the N-terminal domain of the secretin GspD from ETEC determined with the assistance of a nanobody. Structure. 17, 255-265.

10. Lam A.Y., Pardon E., Korotkov K.V., Hol W.G.J., Steyaert J. 2009. Nanobody-aided structure determination of the EpsI:EpsJ pseudopilin heterodimer from Vibrio vulnificus. Journal of structural biology. 166, 8-15.

11. Park Y.J., Pardon E., Wu M., Steyaert J., Hol W.G. 2012. Crystal structure of a heterodimer of editosome interaction proteins in complex with two copies of a cross-reacting nanobody. Nucleic acids research. 40, 1828-1840.

12. Schotte L., Thys B., Strauss M., Filman D.J., Rombaut B., Hogle J.M. 2015. Characterization of Poliovirus Neutralization Escape Mutants of SingleDomain Antibody Fragments (VHHs). Antimicrobial agents and chemotherapy. 59, 4695-4706.

13. Koromyslova A.D.,Hansman G.S. 2015. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. Journal of virology. 89, 27182730.

14. Gadella T.W., Jr.,Jovin T.M. 1995. Oligomerization of epidermal growth factor receptors on A431 cells studied by time-resolved fluorescence imaging microscopy. A stereochemical model for tyrosine kinase receptor activation. The Journal of cell biology. 129, 1543-1558.

15. Moriki T., Maruyama H., Maruyama I.N. 2001. Activation of preformed EGF receptor dimers by ligand-induced rotation of the transmembrane domain. Journal of molecular biology. 311, 1011-1026.

16. Nevoltris D., Lombard B., Dupuis E., Mathis G., Chames P., Baty D. 2015. Conformational nanobodies reveal tethered epidermal growth factor receptor involved in EGFR/ErbB2 predimers. ACS nano. 9, 1388-1399.

17. Rasmussen S.G., DeVree B.T., Zou Y., Kruse A.C., Chung K.Y., Kobilka T.S., Thian F.S., Chae P.S., Pardon E., Calinski D., et al. 2011. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555.

18. Loris R., Marianovsky I., Lah J., Laeremans T., Engelberg-Kulka H., Glaser G., Muyldermans S., Wyns L. 2003. Crystal structure of the intrinsically flexible addiction antidote MazE. The Journal of biological chemistry. 278, 28252-28257.

19. Schmitz K.R., Bagchi A., Roovers R.C., van Bergen en Henegouwen P.M., Ferguson K.M. 2013. Structural evaluation of EGFR inhibition mechanisms for nanobodies/VHH domains. Structure. 21, 1214-1224.

20. Araste F., Ebrahimizadeh W., Rasooli I., Rajabibazl M., Mousavi Gargari S.L. 2014. A novel VHH nanobody against the active site (the CA domain) of tumor-associated, carbonic anhydrase isoform IX and its usefulness for cancer diagnosis. Biotechnology letters. 36, 21-28.

21. Slordahl T.S., Denayer T., Moen S.H., Standal T., Borset M., Ververken C., Ro T.B. 2013. Anti-c-MET Nanobody - a new potential drug in multiple myeloma treatment. European journal of haematology. 91, 399-410.

22. Heukers R., Altintas I., Raghoenath S., De Zan E., Pepermans R., Roovers R.C., Haselberg R., Hennink W.E., Schiffelers R.M., Kok R.J., et al. 2014. Targeting hepatocyte growth factor receptor (Met) positive tumor cells using internalizing nanobody-decorated albumin nanoparticles. Biomaterials. 35, 601610.

23. Massa S., Xavier C., De Vos J., Caveliers V., Lahoutte T., Muyldermans S., Devoogdt N. 2014. Site-specific labeling of cysteine-tagged camelid singledomain antibody-fragments for use in molecular imaging. Bioconjugate chemistry. 25, 979-988.

24. De Buck S., Nolf J., De Meyer T., Virdi V., De Wilde K., Van Lerberge E., Van Droogenbroeck B., Depicker A. 2013. Fusion of an Fc chain to a VHH boosts the accumulation levels in Arabidopsis seeds. Plant biotechnology journal. 11, 1006-1016.

25. Behdani M., Zeinali S., Karimipour M., Khanahmad H., Schoonooghe S., Aslemarz A., Seyed N., Moazami-Godarzi R., Baniahmad F., Habibi-Anbouhi M., et al. 2013. Development of VEGFR2-specific Nanobody Pseudomonas exotoxin A conjugated to provide efficient inhibition of tumor cell growth. New

biotechnology. 30, 205-209.

26. Tang J., Li J., Zhu X., Yu Y., Chen D., Yuan L., Gu Z., Zhang X., Qi L., Gong Z., et al. 2016. Novel CD7-specific nanobody-based immunotoxins potently enhanced apoptosis of CD7-positive malignant cells. Oncotarget. 7, 34070-34083.

27. Zhu Y., Bassoff N., Reinshagen C., Bhere D., Nowicki M.O., Lawler S.E., Roux J., Shah K. 2017. Bi-specific molecule against EGFR and death receptors simultaneously targets proliferation and death pathways in tumors. Scientific reports. 7, 2602.

28. Cloutier S.M., Couty S., Terskikh A., Marguerat L., Crivelli V., Pugnieres M., Mani J.C., Leisinger H.J., Mach J.P., Deperthes D. 2000. Streptabody, a high avidity molecule made by tetramerization of in vivo biotinylated, phage display-selected scFv fragments on streptavidin. Molecular immunology. 37, 1067-1077.

29. Vugmeyster Y., Entrican C.A., Joyce A.P., Lawrence-Henderson R.F., Leary B.A., Mahoney C.S., Patel H.K., Raso S.W., Olland S.H., Hegen M., et al. 2012. Pharmacokinetic, biodistribution, and biophysical profiles of TNF nanobodies conjugated to linear or branched poly(ethylene glycol). Bioconjugate chemistry. 23, 1452-1462.

30. Tijink B.M., Laeremans T., Budde M., Stigter-van Walsum M., Dreier T., de Haard H.J., Leemans C.R., van Dongen G.A. 2008. Improved tumor targeting of anti-epidermal growth factor receptor Nanobodies through albumin binding: taking advantage of modular Nanobody technology. Molecular cancer therapeutics. 7, 2288-2297.

31. Reinhold M.I., Lindberg F.P., Plas D., Reynolds S., Peters M.G., Brown E.J. 1995. In vivo expression of alternatively spliced forms of integrin-associated protein (CD47). Journal of cell science. 108 ( Pt 11), 3419-3425.

32. Lee E.H., Hsieh Y.P., Yang C.L., Tsai K.J., Liu C.H. 2000. Induction of integrin-associated protein (IAP) mRNA expression during memory consolidation in rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12, 1105-1112.

33. Wu A.L., Wang J., Zheleznyak A., Brown E.J. 1999. Ubiquitin-related proteins regulate interaction of vimentin intermediate filaments with the plasma membrane. Mol. Cell. 4, 619-625.

34. Rebres R.A., Vaz L.E., Green J.M., Brown E.J. 2001. Normal ligand binding and signaling by CD47 (integrin-associated protein) requires a long range disulfide bond between the extracellular and membrane-spanning domains. The

Journal of biological chemistry. 276, 34607-34616.

35. Subramanian S., Parthasarathy R., Sen S., Boder E.T., Discher D.E. 2006. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107, 2548-2556.

36. Ogura T., Noguchi T., Murai-Takebe R., Hosooka T., Honma N., Kasuga M. 2004. Resistance of B16 melanoma cells to CD47-induced negative regulation of motility as a result of aberrant N-glycosylation of SHPS-1. The Journal of biological chemistry. 279, 13711-13720.

37. Parthasarathy R., Subramanian S., Boder E.T., Discher D.E. 2006. Post-translational regulation of expression and conformation of an immunoglobulin domain in yeast surface display. Biotechnology and bioengineering. 93, 159-168.

38. Subramanian S., Boder E.T., Discher D.E. 2007. Phylogenetic divergence of CD47 interactions with human signal regulatory protein alpha reveals locus of species specificity. Implications for the binding site. The Journal of biological chemistry. 282, 1805-1818.

39. Kaur S., Kuznetsova S.A., Pendrak M.L., Sipes J.M., Romeo M.J., Li Z., Zhang L., Roberts D.D. 2011. Heparan sulfate modification of the transmembrane receptor CD47 is necessary for inhibition of T cell receptor signaling by thrombospondin-1. The Journal of biological chemistry. 286, 14991-15002.

40. Suzuki S., Yokobori T., Tanaka N., Sakai M., Sano A., Inose T., Sohda M., Nakajima M., Miyazaki T., Kato H., et al. 2012. CD47 expression regulated by

the miR-133a tumor suppressor is a novel prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma. Oncology reports. 28, 465-472.

41. Junker A., Krumbholz M., Eisele S., Mohan H., Augstein F., Bittner R., Lassmann H., Wekerle H., Hohlfeld R., Meinl E. 2009. MicroRNA profiling of multiple sclerosis lesions identifies modulators of the regulatory protein CD47. Brain : a journal of neurology. 132, 3342-3352.

42. Chuang W.,Lagenaur C.F. 1990. Central nervous system antigen P84 can serve as a substrate for neurite outgrowth. Dev. Biol. 137, 219-232.

43. Comu S., Weng W., Olinsky S., Ishwad P., Mi Z., Hempel J., Watkins S., Lagenaur C.F., Narayanan V. 1997. The murine P84 neural adhesion molecule is SHPS-1, a member of the phosphatase-binding protein family. J. Neurosci. 17, 8702-8710.

44. Fujioka Y., Matozaki T., Noguchi T., Iwamatsu A., Yamao T., Takahashi N., Tsuda M., Takada T., Kasuga M. 1996. A novel membrane glycoprotein, SHPS-1, that binds the SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase SHP-2 in response to mitogens and cell adhesion. Mol. Cell. Biol. 16, 6887-6899.

45. Kharitonenkov A., Chen Z., Sures I., Wang H., Schilling J., Ullrich A. 1997. A family of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 386, 181-186.

46. Saginario C., Sterling H., Beckers C., Kobayashi R., Solimena M., Ullu E., Vignery A. 1998. MFR, a putative receptor mediating the fusion of macrophages. Mol. Cell. Biol. 18, 6213-6223.

47. Sano S., Ohnishi H., Omori A., Hasegawa J., Kubota M. 1997. BIT, an immune antigen receptor-like molecule in the brain. FEBSLett. 411, 327-334.

48. Legrand N., Huntington N.D., Nagasawa M., Bakker A.Q., Schotte R., Strick-Marchand H., de Geus S.J., Pouw S.M., Bohne M., Voordouw A., et al. 2011. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction

is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13224-13229.

49. Sato-Hashimoto M., Saito Y., Ohnishi H., Iwamura H., Kanazawa Y., Kaneko T., Kusakari S., Kotani T., Mori M., Murata Y., et al. 2011. Signal regulatory protein alpha regulates the homeostasis of T lymphocytes in the spleen. J. Immunol. 187, 291-297.

50. Latour S., Tanaka H., Demeure C., Mateo V., Rubio M., Brown E.J., Maliszewski C., Lindberg F.P., Oldenborg A., Ullrich A., et al. 2001. Bidirectional negative regulation of human T and dendritic cells by CD47 and its cognate receptor signal-regulator protein-alpha: down-regulation of IL-12 responsiveness and inhibition of dendritic cell activation. J. Immunol. 167, 25472554.

51. Hagnerud S., Manna P.P., Cella M., Stenberg A., Frazier W.A., Colonna M., Oldenborg P.A. 2006. Deficit of CD47 results in a defect of marginal zone dendritic cells, blunted immune response to particulate antigen and impairment of skin dendritic cell migration. J. Immunol. 176, 5772-5778.

52. Saito Y., Iwamura H., Kaneko T., Ohnishi H., Murata Y., Okazawa H., Kanazawa Y., Sato-Hashimoto M., Kobayashi H., Oldenborg P.A., et al. 2010. Regulation by SIRPalpha of dendritic cell homeostasis in lymphoid tissues. Blood. 116, 3517-3525.

53. Van V.Q., Lesage S., Bouguermouh S., Gautier P., Rubio M., Levesque M., Nguyen S., Galibert L., Sarfati M. 2006. Expression of the self-marker CD47 on dendritic cells governs their trafficking to secondary lymphoid organs. EMBO J. 25, 5560-5568.

54. Barclay A.N.,Van den Berg T.K. 2014. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPalpha) and CD47: structure, function, and therapeutic target. Annu. Rev. Immunol. 32, 25-50.

55. Matozaki T., Murata Y., Okazawa H., Ohnishi H. 2009. Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPalpha signalling pathway. Trends Cell Biol. 19, 72-80.

56. Maile L.A., DeMambro V.E., Wai C., Lotinun S., Aday A.W., Capps B.E., Beamer W.G., Rosen C.J., Clemmons D.R. 2011. An essential role for the association of CD47 to SHPS-1 in skeletal remodeling. J. Bone Miner. Res. 26, 2068-2081.

57. Barclay A.N.,Brown M.H. 2006. The SIRP family of receptors and immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 6, 457-464.

58. Oldenborg P.A., Zheleznyak A., Fang Y.F., Lagenaur C.F., Gresham H.D., Lindberg F.P. 2000. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288, 2051-2054.

59. Van Rooijen N.,Sanders A. 1994. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93.

60. Takada T., Matozaki T., Takeda H., Fukunaga K., Noguchi T., Fujioka Y., Okazaki I., Tsuda M., Yamao T., Ochi F., et al. 1998. Roles of the complex formation of SHPS-1 with SHP-2 in insulin-stimulated mitogen-activated protein kinase activation. J. Biol. Chem. 273, 9234-9242.

61. Lorenz U. 2009. SHP-1 and SHP-2 in T cells: two phosphatases functioning at many levels. Immunol. Rev. 228, 342-359.

62. van Beek E.M., Zarate J.A., van Bruggen R., Schornagel K., Tool A.T., Matozaki T., Kraal G., Roos D., van den Berg T.K. 2012. SIRPalpha controls the activity of the phagocyte NADPH oxidase by restricting the expression of gp91(phox). Cell reports. 2, 748-755.

63. Alenghat F.J., Baca Q.J., Rubin N.T., Pao L.I., Matozaki T., Lowell C.A., Golan D.E., Neel B.G., Swanson K.D. 2012. Macrophages require Skap2 and

Sirpalpha for integrin-stimulated cytoskeletal rearrangement. J. Cell Sci. 125, 5535-5545.

64. Carter-Su C., Rui L., Stofega M.R. 2000. SH2-B and SIRP: JAK2 binding proteins that modulate the actions of growth hormone. Recent Prog. Horm. Res. 55, 293-311.

65. Timms J.F., Swanson K.D., Marie-Cardine A., Raab M., Rudd C.E., Schraven B., Neel B.G. 1999. SHPS-1 is a scaffold for assembling distinct adhesion-regulated multi-protein complexes in macrophages. Curr. Biol. 9, 927930.

66. Veillette A., Thibaudeau E., Latour S. 1998. High expression of inhibitory receptor SHPS-1 and its association with protein-tyrosine phosphatase SHP-1 in macrophages. J. Biol. Chem. 273, 22719-22728.

67. Johansen M.L.,Brown E.J. 2007. Dual regulation of SIRPalpha phosphorylation by integrins and CD47. J. Biol. Chem. 282, 24219-24230.

68. Tsai R.K.,Discher D.E. 2008. Inhibition of "self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J. Cell Biol. 180, 989-1003.

69. Seiffert M., Brossart P., Cant C., Cella M., Colonna M., Brugger W., Kanz L., Ullrich A., Buhring H.J. 2001. Signal-regulatory protein alpha (SIRPalpha) but not SIRPbeta is involved in T-cell activation, binds to CD47 with high affinity, and is expressed on immature CD34(+)CD38(-) hematopoietic cells. Blood. 97, 2741-2749.

70. Ichigotani Y., Matsuda S., Machida K., Oshima K., Iwamoto T., Yamaki K., Hayakawa T., Hamaguchi M. 2000. Molecular cloning of a novel human gene (SIRP-B2) which encodes a new member of the SIRP/SHPS-1 protein family. J. Hum. Genet. 45, 378-382.

71. Dietrich J., Cella M., Seiffert M., Buhring H.J., Colonna M. 2000. Cutting edge: signal-regulatory protein beta 1 is a DAP12-associated activating receptor expressed in myeloid cells. J. Immunol. 164, 9-12.

72. Tomasello E., Cant C., Buhring H.J., Vely F., Andre P., Seiffert M., Ullrich A., Vivier E. 2000. Association of signal-regulatory proteins beta with KARAP/DAP-12. Eur. J. Immunol. 30, 2147-2156.

73. Hatherley D., Graham S.C., Turner J., Harlos K., Stuart D.I., Barclay A.N. 2008. Paired receptor specificity explained by structures of signal regulatory proteins alone and complexed with CD47. Mol. Cell. 31, 266-277.

74. Barclay A.N. 2009. Signal regulatory protein alpha (SIRPalpha)/CD47 interaction and function. Curr. Opin. Immunol. 21, 47-52.

75. Adams J.C.,Lawler J. 2004. The thrombospondins. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36, 961-968.

76. Sick E., Jeanne A., Schneider C., Dedieu S., Takeda K., Martiny L. 2012. CD47 update: a multifaceted actor in the tumour microenvironment of potential therapeutic interest. Br. J. Pharmacol. 167, 1415-1430.

77. Kukreja A., Radfar S., Sun B.H., Insogna K., Dhodapkar M.V. 2009. Dominant role of CD47-thrombospondin-1 interactions in myeloma-induced fusion of human dendritic cells: implications for bone disease. Blood. 114, 34133421.

78. Brown E., Hooper L., Ho T., Gresham H. 1990. Integrin-associated protein: a 50-kD plasma membrane antigen physically and functionally associated with integrins. The Journal of cell biology. 111, 2785-2794.

79. Capo C., Lindberg F.P., Meconi S., Zaffran Y., Tardei G., Brown E.J., Raoult D., Mege J.L. 1999. Subversion of monocyte functions by coxiella burnetii: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. J. Immunol. 163, 6078-6085.

80. Gao A.G., Lindberg F.P., Dimitry J.M., Brown E.J., Frazier W.A. 1996. Thrombospondin modulates alpha v beta 3 function through integrin-associated protein. J. Cell Biol. 135, 533-544.

81. Hermann P., Armant M., Brown E., Rubio M., Ishihara H., Ulrich D., Caspary R.G., Lindberg F.P., Armitage R., Maliszewski C., et al. 1999. The vitronectin receptor and its associated CD47 molecule mediates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23. J. Cell Biol. 144, 767-775.

82. Saumet A., Slimane M.B., Lanotte M., Lawler J., Dubernard V. 2005. Type 3 repeat/C-terminal domain of thrombospondin-1 triggers caspase-independent cell death through CD47/alphavbeta3 in promyelocytic leukemia NB4 cells. Blood. 106, 658-667.

83. Wang X.Q.,Frazier W.A. 1998. The thrombospondin receptor CD47 (IAP) modulates and associates with alpha2 beta1 integrin in vascular smooth muscle cells. Mol. Biol. Cell. 9, 865-874.

84. Chung J., Gao A.G., Frazier W.A. 1997. Thrombspondin acts via integrin-associated protein to activate the platelet integrin alphaIIbbeta3. J. Biol. Chem. 272, 14740-14746.

85. Chung J., Wang X.Q., Lindberg F.P., Frazier W.A. 1999. Thrombospondin-1 acts via IAP/CD47 to synergize with collagen in alpha2beta1-mediated platelet activation. Blood. 94, 642-648.

86. Brittain J.E., Han J., Ataga K.I., Orringer E.P., Parise L.V. 2004. Mechanism of CD47-induced alpha4beta1 integrin activation and adhesion in sickle reticulocytes. J. Biol. Chem. 279, 42393-42402.

87. Yoshida H., Tomiyama Y., Ishikawa J., Oritani K., Matsumura I., Shiraga M., Yokota T., Okajima Y., Ogawa M., Miyagawa J., et al. 2000. Integrin-associated protein/CD47 regulates motile activity in human B-cell lines through CDC42. Blood. 96, 234-241.

88. Koenigsknecht J.,Landreth G. 2004. Microglial phagocytosis of fibrillar beta-amyloid through a beta1 integrin-dependent mechanism. J. Neurosci. 24, 9838-9846.

89. Orazizadeh M., Lee H.S., Groenendijk B., Sadler S.J., Wright M.O., Lindberg F.P., Salter D.M. 2008. CD47 associates with alpha 5 integrin and regulates responses of human articular chondrocytes to mechanical stimulation in an in vitro model. Arthritis Res. Ther. 10, R4.

90. Giancotti F.G.,Ruoslahti E. 1999. Integrin signaling. Science. 285, 10281032.

91. Lindberg F.P., Gresham H.D., Reinhold M.I., Brown E.J. 1996. Integrin-associated protein immunoglobulin domain is necessary for efficient vitronectin bead binding. J. Cell Biol. 134, 1313-1322.

92. Avent N., Judson P.A., Parsons S.F., Mallinson G., Anstee D.J., Tanner M.J., Evans P.R., Hodges E., Maciver A.G., Holmes C. 1988. Monoclonal antibodies that recognize different membrane proteins that are deficient in Rhnull human erythrocytes. One group of antibodies reacts with a variety of cells and tissues whereas the other group is erythroid-specific. Biochem. J. 251, 499-505.

93. Lindberg F.P., Lublin D.M., Telen M.J., Veile R.A., Miller Y.E., Donis-Keller H., Brown E.J. 1994. Rh-related antigen CD47 is the signal-transducer integrin-associated protein. J. Biol. Chem. 269, 1567-1570.

94. Cartron J.P. 1999. RH blood group system and molecular basis of Rh-deficiency. Baillieres Best Pract. Res. Clin. Haematol. 12, 655-689.

95. Dahl K.N., Westhoff C.M., Discher D.E. 2003. Fractional attachment of CD47 (IAP) to the erythrocyte cytoskeleton and visual colocalization with Rh protein complexes. Blood. 101, 1194-1199.

96. Burger P., Hilarius-Stokman P., de Korte D., van den Berg T.K., van Bruggen R. 2012. CD47 functions as a molecular switch for erythrocyte phagocytosis. Blood. 119, 5512-5521.

97. Mateo V., Lagneaux L., Bron D., Biron G., Armant M., Delespesse G., Sarfati M. 1999. CD47 ligation induces caspase-independent cell death in chronic lymphocytic leukemia. Nature medicine. 5, 1277-1284.

98. Yoshida K., Tsujimoto H., Matsumura K., Kinoshita M., Takahata R., Matsumoto Y., Hiraki S., Ono S., Seki S., Yamamoto J., et al. 2015. CD47 is an adverse prognostic factor and a therapeutic target in gastric cancer. Cancer medicine. 4, 1322-1333.

99. Pettersen R.D., Hestdal K., Olafsen M.K., Lie S.O., Lindberg F.P. 1999. CD47 signals T cell death. Journal of immunology. 162, 7031-7040.

100. Manna P.P.,Frazier W.A. 2003. The mechanism of CD47-dependent killing of T cells: heterotrimeric Gi-dependent inhibition of protein kinase A. Journal of immunology. 170, 3544-3553.

101. Manna P.P.,Frazier W.A. 2004. CD47 mediates killing of breast tumor cells via Gi-dependent inhibition of protein kinase A. Cancer research. 64, 10261036.

102. Uno S., Kinoshita Y., Azuma Y., Tsunenari T., Yoshimura Y., Iida S., Kikuchi Y., Yamada-Okabe H., Fukushima N. 2007. Antitumor activity of a monoclonal antibody against CD47 in xenograft models of human leukemia. Oncology reports. 17, 1189-1194.

103. Mateo V., Brown E.J., Biron G., Rubio M., Fischer A., Deist F.L., Sarfati M. 2002. Mechanisms of CD47-induced caspase-independent cell death in normal and leukemic cells: link between phosphatidylserine exposure and cytoskeleton organization. Blood. 100, 2882-2890.

104. Brooke G., Holbrook J.D., Brown M.H., Barclay A.N. 2004. Human lymphocytes interact directly with CD47 through a novel member of the signal regulatory protein (SIRP) family. Journal of immunology. 173, 2562-2570.

105. Lamy L., Ticchioni M., Rouquette-Jazdanian A.K., Samson M., Deckert M., Greenberg A.H., Bernard A. 2003. CD47 and the 19 kDa interacting protein-

3 (BNIP3) in T cell apoptosis. The Journal of biological chemistry. 278, 2391523921.

106. Reinhold M.I., Lindberg F.P., Kersh G.J., Allen P.M., Brown E.J. 1997. Costimulation of T cell activation by integrin-associated protein (CD47) is an adhesion-dependent, CD28-independent signaling pathway. The Journal of experimental medicine. 185, 1-11.

107. Lindberg F.P., Gresham H.D., Schwarz E., Brown E.J. 1993. Molecular cloning of integrin-associated protein: an immunoglobulin family member with multiple membrane-spanning domains implicated in alpha v beta 3-dependent ligand binding. The Journal of cell biology. 123, 485-496.

108. Kikuchi Y., Uno S., Yoshimura Y., Otabe K., Iida S., Oheda M., Fukushima N., Tsuchiya M. 2004. A bivalent single-chain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells. Biochemical and biophysical research communications. 315, 912-918.

109. Grimsley C.,Ravichandran K.S. 2003. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656.

110. McCracken M.N., Cha A.C., Weissman I.L. 2015. Molecular Pathways: Activating T Cells after Cancer Cell Phagocytosis from Blockade of CD47 "Don't Eat Me" Signals. Clin. Cancer Res. 21, 3597-3601.

111. Chao M.P., Weissman I.L., Majeti R. 2012. The CD47-SIRPalpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications. Curr. Opin. Immunol. 24, 225-232.

112. Chao M.P., Jaiswal S., Weissman-Tsukamoto R., Alizadeh A.A., Gentles A.J., Volkmer J., Weiskopf K., Willingham S.B., Raveh T., Park C.Y., et al. 2010. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci. Transl. Med. 2, 63ra94.

113. Obeid M., Tesniere A., Ghiringhelli F., Fimia G.M., Apetoh L., Perfettini J.L., Castedo M., Mignot G., Panaretakis T., Casares N., et al. 2007. Calreticulin

exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature medicine. 13, 54-61.

114. Gardai S.J., McPhillips K.A., Frasch S.C., Janssen W.J., Starefeldt A., Murphy-Ullrich J.E., Bratton D.L., Oldenborg P.A., Michalak M., Henson P.M. 2005. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 123, 321-334.

115. Liu J., Wang L., Zhao F., Tseng S., Narayanan C., Shura L., Willingham S., Howard M., Prohaska S., Volkmer J., et al. 2015. Pre-Clinical Development of a Humanized Anti-CD47 Antibody with Anti-Cancer Therapeutic Potential. PLoS ONE. 10, e0137345.

116. Liu X., Pu Y., Cron K., Deng L., Kline J., Frazier W.A., Xu H., Peng H., Fu Y.X., Xu M.M. 2015. CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction of immunogenic tumors. Nat. Med. 21, 1209-1215.

117. Tseng D., Volkmer J.P., Willingham S.B., Contreras-Trujillo H., Fathman J.W., Fernhoff N.B., Seita J., Inlay M.A., Weiskopf K., Miyanishi M., et al. 2013. Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cell response. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 1110311108.

118. Sharma P.,Allison J.P. 2015. Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combination strategies with curative potential. Cell. 161, 205214.

119. Kim D., Wang J., Willingham S.B., Martin R., Wernig G., Weissman I.L. 2012. Anti-CD47 antibodies promote phagocytosis and inhibit the growth of human myeloma cells. Leukemia. 26, 2538-2545.

120. Edris B., Weiskopf K., Volkmer A.K., Volkmer J.P., Willingham S.B., Contreras-Trujillo H., Liu J., Majeti R., West R.B., Fletcher J.A., et al. 2012. Antibody therapy targeting the CD47 protein is effective in a model of aggressive metastatic leiomyosarcoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 6656-6661.

121. Chao M.P., Tang C., Pachynski R.K., Chin R., Majeti R., Weissman I.L. 2011. Extranodal dissemination of non-Hodgkin lymphoma requires CD47 and is inhibited by anti-CD47 antibody therapy. Blood. 118, 4890-4901.

122. Chao M.P., Alizadeh A.A., Tang C., Jan M., Weissman-Tsukamoto R., Zhao F., Park C.Y., Weissman I.L., Majeti R. 2011. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 71, 1374-1384.

123. Willingham S.B., Volkmer J.P., Gentles A.J., Sahoo D., Dalerba P., Mitra S.S., Wang J., Contreras-Trujillo H., Martin R., Cohen J.D., et al. 2012. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 6662-6667.

124. Majeti R., Chao M.P., Alizadeh A.A., Pang W.W., Jaiswal S., Gibbs K.D., Jr., van Rooijen N., Weissman I.L. 2009. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 138, 286-299.

125. Wang Y., Xu Z., Guo S., Zhang L., Sharma A., Robertson G.P., Huang L. 2013. Intravenous delivery of siRNA targeting CD47 effectively inhibits melanoma tumor growth and lung metastasis. Mol. Ther. 21, 1919-1929.

126. Chen Y., Zhu X., Zhang X., Liu B., Huang L. 2010. Nanoparticles modified with tumor-targeting scFv deliver siRNA and miRNA for cancer therapy. Mol. Ther. 18, 1650-1656.

127. Weiskopf K., Ring A.M., Ho C.C., Volkmer J.P., Levin A.M., Volkmer A.K., Ozkan E., Fernhoff N.B., van de Rijn M., Weissman I.L., et al. 2013. Engineered SIRPalpha variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science. 341, 88-91.

128. Yu Z., Pestell T.G., Lisanti M.P., Pestell R.G. 2012. Cancer stem cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 44, 2144-2151.

129. Theocharides A.P., Jin L., Cheng P.Y., Prasolava T.K., Malko A.V., Ho J.M., Poeppl A.G., van Rooijen N., Minden M.D., Danska J.S., et al. 2012. Disruption of SIRPalpha signaling in macrophages eliminates human acute myeloid leukemia stem cells in xenografts. J. Exp. Med. 209, 1883-1899.

130. Lesley J., Hyman R., Kincade P.W. 1993. CD44 and its interaction with extracellular matrix. Advances in immunology. 54, 271-335.

131. Terstappen G.C., Schlupen C., Raggiaschi R., Gaviraghi G. 2007. Target deconvolution strategies in drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 6, 891-903.

132. Bodelon G., Palomino C., Fernandez L.A. 2013. Immunoglobulin domains in Escherichia coli and other enterobacteria: from pathogenesis to applications in antibody technologies. FEMS microbiology reviews. 37, 204-250.

133. Maass D.R., Sepulveda J., Pernthaner A., Shoemaker C.B. 2007. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). J. Immunol. Methods. 324, 13-25.

134. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

135. Zhu M., Hu Y., Li G., Ou W., Mao P., Xin S., Wan Y. 2014. Combining magnetic nanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detection of influenza H3N2. Nanoscale research letters. 9, 528.

136. Studier F.W. 2014. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in molecular biology. 1091, 17-32.

137. Fairhead M.,Howarth M. 2015. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 1266, 171-184.

138. Chao M.P., Alizadeh A.A., Tang C., Myklebust J.H., Varghese B., Gill S., Jan M., Cha A.C., Chan C.K., Tan B.T., et al. 2010. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell. 142, 699-713.

139. Jaiswal S., Jamieson C.H., Pang W.W., Park C.Y., Chao M.P., Majeti R., Traver D., van Rooijen N., Weissman I.L. 2009. CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis. Cell. 138, 271-285.

140. Sockolosky J.T., Dougan M., Ingram J.R., Ho C.C., Kauke M.J., Almo S.C., Ploegh H.L., Garcia K.C. 2016. Durable antitumor responses to CD47 blockade require adaptive immune stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E2646-2654.