Спектр мутационных повреждений гена рецептора липопротеидов низкой плотности в популяции больных семейной гиперхолестеринемией г. Санкт-Петербурга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Шакир Хамид

• Шакир Хамид
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шакир Хамид

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ-------------------------------------------1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ------------------------------------2

ВВЕДЕНИЕ---------------------------------------------3

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР-------------------------- б

1.1. Семейная гиперхолестеринемия-----------6

1.2. Структура рецептора ЛПНП--------------11

1.3. Структура гена рецептора ЛПНП---------18

1.3.1. Соотношение ген-белок----------------19

1.3.2. Транскрипционная регуляция гена

рецептора ЛПНП----------------------2

1.3.3. Полиморфизмы рецептора ЛПНП---------22

1.4. Сцепление мутационных дефектов РЛПНП с

сг-------------------------------------23

1.5. Классификация мутации в рецепторе ЛПНП

1.6. Общая стратегия изучения СГ----------- 2

1.6.1. Идентификация крупных перестроек в гене РЛПНП-------------------------------31

1.6.2. Первичная идентификаций точечных мутаций-----------------------------31

1.6.3. Молекулярный скрининг охарактеризованных мутаций в популяции-----------35

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ-------------------------37

II. 1. Материалы-----------------------------37

II.2. Характеристика обследованных групп----37

II. 3. Молекулярно-генетические методы-------39

11.3.1. Выделение- ДНК из периферической крови-------------------------------39

11.3.2. Полимеразная цепная реакция(ПЦР)----40

11.3.3. Анализ конформационного полиморфизма

однонитевых фрагментов ДНК--------

11.3.4. Очистка ПЦР-фрагментов для секвенирования--------------------44

11.3.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК по Сенгеру-

11.3.6. Секвенирование с помощью специального набора (AmpliCycle™ sequencing kit)4

II. 3.7. Рестрикционный анализ--------------47

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ-------------------49

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ---------------------61

ЗАКЛЮЧЕНИЕ--------:------------------------------------68

вквОДЫ----4"------'------------------------------------- 7

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ-------------------------------------

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ак

Апо В Апо С апо Е АХАТ

ГМГ-КоА-редуктаза

ИБС

ИГ

ЛП

КДНК

ЛПВП

ЛПНП

ЛПОНП

ПДРФ

ПЦР РЛПНП

сг тг хм хс

ХС ЛПВП ХС ЛПНП ХС ЛПОНП

эхе

ЭФР М-СБР

БЫР БИЕВР

ББСР

аминокислота аполипопротеин В аполипопротеин С аполипопротеин Е

ацил-коА-холестерин-ацилтрансфераза Р-гидрокси, Р -метилглутарил-коэнзим а редуктаза

ишемическая болезнь сердца индекс гетерогенности липопротеины комплементарная ДНК липопротеины высокой плотности липопротеины низкой плотности

■ липопротеины очень низкой плотности полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

полимеразная цепная реакция рецептор липопротеидов низкой плотности семейная гиперхолестеринемия • триглицериды

■ хиломикроны

- холестерин

- холестерин липопротеидов высокой плотности

- холестерин липопротеидов низкой плотности

- холестерин липопротеидов очень низкой плотности

- эфиры холестерина

- эпидермальный фактор роста

- макрофагальный колоний-стимулирующий фактор

- однонуклеотидный полиморфизм

- белок, связывающий стероидный регуляторный элемент

- конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Спектр мутационных повреждений гена рецептора липопротеидов низкой плотности в популяции больных семейной гиперхолестеринемией г. Санкт-Петербурга»

ВВЕДЕНИЕ

Атеросклероз является основной причиной развития ишемической болезни сердца (ИБС) и других сердечно-сосудистых заболеваний, приводящих к инвалидности и ранней смертности в большинстве популяций[1].

Атеросклероз - прогрессирующая болезнь крупных артерий, которая реализуется при взаимодействии генетических и средовых факторов.

Методы классической генетики, и, прежде всего, генеалогический анализ, позволили прийти к заключению о важной роли наследственных факторов в генезе атеросклеротического поражения сосудов. Однако механизмы наследственной предрасположенности к развитию атеросклероза остаются недостаточно изученными.

Холестериновая концепция атеросклероза была предложена H.H. Аничковым более 80 лет тому назад [2]. В 1939 г. Карл Мюллер, продолжая работу Аничкова, выдвинул теорию о том, что в основе увеличенного уровня холестерина в крови, появления ксантом и ряда сердечных заболеваний лежат генетические дефекты.

В течение последних двух десятилетий благодаря эпидемиологическим исследованиям накопилось большое количество информации об ассоциации уровня липопротеидов плазмы с развитием атеросклероза у человека.

! Первоначально было подтверждено, что атеросклероз тесно связан с высокими концентрациями холестерина, особенно

холестерина, входящего в состав липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), и менее связан с холестерином липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеином (а). Последние работы показали также связь между развитием атеросклероза и низким уровнем в крови холестерина липопротеидов высокой плотности[3].

Доказательства того, что генетические факторы могут быть ведущей причиной ускоренного развития атеросклероза, получены в классической серии работ по изучению семейной гиперхолестеринемии М. Brown и J.L. Goldstein [4].

В этих работах был изучен гомеостаз холестерина в организме человека и было показано, чт-о мут-ацжшные повреждения в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (РЛПНП) могут приводить к развитию тяжелой гиперхолестеринемии и инфаркта миокарда уже в раннем возрасте. С этого момента в изучении атеросклеротического процесса наступила новая, молекулярно-генетическая, эра.

В результате интенсивной работы многих исследователей были клонированы, секвенированы и картированы более двадцати генов, участвующих в транспортировке и метаболизме липидов.

Генетическое изучение атеросклероза направлено, в основном, на выявление ассоциации структурных полиморфизмов ряда генов, оперирующих в системе липидного гомеостаза, коагуляционного и ренин-ангиотензинного каскадов, с развитием инфаркта миокарда и инсульта.

При таком подходе выясняется также возможное ген-генное взаимодействие в формировании наследственной предрасположенности к вышеуказанным заболеваниям.

Знание природы молекулярных дефектов является необходимым условием для создания эффективных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистой патологии. Такой подход позволяет прогнозировать частоты наследственной патологии для будущих поколений, а также планировать объем специализированных видов помощи в соответствии с предполагаемым распространением болезни.

В данной работе проводилось исследование некоторых генетических аспектов предрасположенности к атеросклерозу и инфаркту миокарда, в частности, мы занимались определением спектра молекулярных мутационных повреждений в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (РЛПНП), приводящих к развитию семейной гиперхолестеринемии (СГ).

Целью настоящей работы является изучение связи между структурной организацией гена рецептора ЛПНП и проявлениями болезни семейной гиперхолестеринемии.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Семейная гиперхолестеринемия

Семейная гиперхолестеринемия является одним из основных факторов риска развития раннего атеросклероза и инфаркта миокарда. Это моногенное заболевание человека с аутосомно-доминантным типом наследования, соответствует Па типу гиперлипидемии по классификации В. Ргедпскзоп и экспертов ВОЗ [5]. Частота ее встречаемости в популяциях составляет 1 на 500 человек.

Это наиболее серьезная патология в системе метаболизма липопротеидов (ЛП), о чем свидетельствует тот факт, что степень риска развития ИБС у пациентов с этим типом нарушения обмена холестерина возрастает в 10-20 раз по сравнению со здоровыми лицами. В основе данного заболевания лежит снижение скорости катаболизма липопротеидов низкой плотности вследствие количественной недостаточности или дисфункции их специфического рецептора - рецептора липопротеидов низкой плотности (РЛПНП)[6,7,8].

АШе и соав. в 1981 г. доказали, что захват ЛПНП из сыворотки крови при гомозиготной форме СГ осуществляется рецептором-мусорщиком, который экспрессируется в клетках моноцитарно-макрофагальной линии [9,10]. Это приводит к трансформации моноцитов в пенистые клетки. Следует отметить, что моноцитами, в основном, захватываются окисленные ЛПНП, обладающие высокой степенью атерогенности [11,12,13].

В настоящий момент установлено наличие двух типов скевенджер-рецепторов, которые являются результатом

альтернативного сплайсинга мРНК и представляют собой полипептидные тримеры с высокой степенью гликозилирования.

Ген, определяющий структуру этих рецепторов, клонирован и картирован на коротком плече 8 хромосомы [14,15].

Исследования in vitro и in vivo на экспериментальных животных показали, что нарушение метаболизма липопротеинов и их окисление модулируют экспрессию нескольких цитокинов и факторов роста в сосудистых стенках, чем вносят значительный вклад в развитие атеросклероза. Одним из факторов роста, причастным к процессу атеросклероза, является M-CSF- фактор стимулирования колонии макрофагов. M-CSF влияет на рост и функции моноцитов и макрофагов. Окисленные ЛПНП вызывают экспрессию M-CSF в эндотелиальных клетках артерий. M-CSF является также необходимым для жизнедеятельности макрофагов и их превращения в пенистые клетки, как в культуре клеток, так и in vivo, что делает возможным развитие атеросклеротических повреждений и кальцификации стенок артерии[17,18].

Кроме того, окисленные ЛПНП обладают иммуногенными свойствами и могут вызывать формирование аутоантител, роль которых в атеросклеротических повреждениях продемонстрирована у человека, кролика и мыши[16].

Таким образом, Ьовременное представление о холестериновой концепции атеросклероза можно сформулировать так:

модифицированные ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а) являются ответственными за развитие этого патологического процесса, а ЛПВП играют антиатерогенную роль.

Атеросклеротический процесс особенно резко выражен у гомозигот СГ, для которых характерно полное отсутствие функционирующих рецепторов ЛПНП. Содержание ХС обычно превышает 700 мг/дл (>18 ммоль/л), в наиболее тяжелых случаях может достигать 1000 мг/дл (>25 ммоль/л). Гетерозиготы, у которых имеется только половина нормально функционирующих рецепторов, имеют более низкую концентрацию ХС, которая может колебаться в пределах 300-500 мг/дл (8-13 ммоль/л). При этом уровень ТГ остается нормальным или слегка повышенным [19].

Семейная гиперхолестеринемия клинически проявляется картиной ИБС и инфаркта миокарда в сравнительно молодом возрасте, а также появлением бугорчатых ксантом уже в детском возрасте.

У гомозиготных больных все проявления усилены и ускорены. Ранняя смерть от ИБС (в возрасте до 30 лет), как правило, связана с наличием гомозиготной формы СГ. При ангиографии в этом случае выявляются более тяжелые и обширные поражения коронарных сосудов, чем при других вариантах гиперхолестеринемии. Характерно проявление липоидной дуги роговицы в возрасте до 30 лет.

Диагноз ставится на основании анализа липидов и ЛП плазмы крови не только у пациента, но и у родственников первой степени родства. Уровень ХС', превышающий 300 мг/дл (7,8 ммоль/л), перенесенный инфаркт миокарда до 60 лет, а также типичные ксантомы

свидетельствуют о наличии СГ. Болезнь передается аутосомно-доминантно[ 19].

Brown М. и Goldstein J. впервые показали существование на поверхности клеток различного гистогенеза специфического рецептора, узнающего частицы ЛПНП.

В литературе опубликовано немало обзоров, вопросов функционирования ЛПНП-рецепторов в норме и человека и различных видов животных, в том числе рецепторов в развитии гиперхолестеринемий и атеросклероза [18,20,21,22].

Процесс взаимодействия ЛП-частицы с рецептором характеризуется высокой специфичностью.

Общее число рецепторов, приходящихся на одну клетку, колеблется от 15000 до 70000, при этом один рецептор связывает одну частицу ЛПНП. Взаимодействие ЛПНП с рецептором происходит в области специальных образований мембраны, получивших название окаймленных ямок и занимающих около 2% мембранной поверхности с участием мембранного белка клатрина [23].

После связывания частиц ЛПНП специфическими рецепторами окаймленные ямки внедряются внутрь клетки и отрываются, образуя окаймленные эндоцитозные везикулы. Первыми клеточными органеллами, с которыми вступают в контакт окаймленные везикулы, являются мелкие внутриклеточные гладкие везикулы. В результате их слияния происходят образование эндосом, а затем диссоциация комплекса ЛПНП-рецептор вследствие кислой реакции внутри эндосом

касающихся патологии у роли этих

(рН около 5). Освободившиеся рецепторы по неизвестному еще механизму возвращаются в плазматическую мембрану и вновь встраиваются в нее [11].

Эндосомы, поглотившие частицы ЛПНП и сохранившие их нетронутыми, сливаются с лизосомами, где и происходит атака ЛПНП лизосомальными энзимами. При этом белок ЛП расщепляется до аминокислот, а эфиры холестерина (ЭХ С)— до свободного ХС и жирных кислот. Подвергаются расщеплению также триглицериды (ТГ) и фосфолипиды.

Освободившийся ХС, покидая лизосомы, остается в клетке и оказывает на нее многостороннее влияние. Прежде всего, ХС или продукты его окисления угнетают активность (или синтез) Р-гидрокси, р-метилглутарил-коэнзим а редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы) — ключевого энзима биосинтеза ХС, подавляя, следовательно, синтез собственного ХС в клетке. Одновременно при появлении избытка свободного ХС в клетке ингибируется синтез рецепторов ЛПНП, что ведет к уменьшению их количества на мембранах и к уменьшению связывания и захвата новых частиц ЛПНП клеткой. Наконец, свободный ХС активирует микросомальный энзим — ацил-коА-холестерин-ацилтрансферазу (АХАТ), эстерифицирующий ХС (ЭХС), тем самым, способствуя депонированию ЭХС в цитоплазме[23].

Таким сложным путем контролируются, с одной стороны, синтез ХС в клетке и, с другой — проникновение ЛПНП в клетку и доставка ими X С.

Образовавшиеся эфиры ХС в отличие от свободного ХС накапливаются исключительно в цитоплазме в виде мелких жировых капель. При необходимости клетка осуществляет гидролиз ЭХС, и освободившийся неэстер ифицированный ХС используется для построения мембран вновь образующихся клеток, синтеза гормонов.

Таким образом рецептор-опосредуемый захват ЛПНП обеспечивает поддержание уровня ХС и ЛПНП в крови в нормальных пределах, препятствуя тем самым развитию атеросклероза [11,23]. 1.2. Структура рецептора ЛПНП.

Рецептор-ЛПНП является мембранным белком, определяющим захват и транспортировку макромолекул через плазматическую мембрану путем эндоцитоза.

Он представляет собой одноцепочечный гликопротеин с ММ 164 кДа; его изоэлектрическая точка равна 4.6, что свидетельствует о большой концентрации отрицательно заряженных аминокислот в его структуре.

Он синтезируется первоначально как предшественник с ММ 120 КДа, состоящий из 860 аминокислот (ак). В последующем происходит его гликозилирование в аппарате Гольджи.

Рецептор состоит из 839 ак, не считая сигнального гидрофобного участка из 21 ак на аминотерминальном конце, отщепляющегося от основной цепи при встраивании рецептора в мембрану[24].

fi Л Л АПттЧ 1

Ц и п т? i! П п 1

Ц \\ и II и _j

C\\

г. П Г

NH

экзов 2-е

Цистемн

СООН

экзон

7-14

ЭКЭОН 15

Ц

5

экзон

16-17

ЭКЗОН 17-18

Риг 1 '

Схематическая модель ЛПНП-рецептора или апо В.Е-рецептора [no М. Brown, J. Goldstein, 1988].

1 — лигацдсвязывающий домен (292 ак); 2 — домен, гомологичный эпидермальному фактору роста 400 ак); 3 — домен, содержащий О-связанные углеводы (58 ак); 4 — мембранный домен (22 ак); 5 — цитоплазматический домен (50 ак).

На рис.1 представлена схематическая модель зрелого рецептора ЛПНП, состоящего из пяти доменов, осуществляющих следующие функции:

Первый домен является сайтом для связывания лиганда. Физиологическими лигандами рецептора являются все содержащие аполипопротеин В (Mr 513000) или аполипопротеин Е (Mr 34000) частицы (ЛПНП, ЛППП, (ЗЛОНП и ЛПВП апоЕ содержащие) и апоЕ

содержащие протеолипосомы. Поэтому рецептор и называется апоВ/Е-рецептор.

Этот домен белка, обогащенный цистеиновыми остатками, включает 292 И-концевые аминокислоты зрелого рецептора. Он состоит из 7 повторов по 40 аминокислот, каждый из которых содержит по 6 цистеиновых остатков, связанных между собой дисульфидными связями. Каждый повтор кодируется отдельным экзоном, за исключением повторов 4, 5 и 6, кодируемых экзоном 4, утратившим интроны в ходе эволюции. На С-конце каждого повтора имеется высоко консервативная последовательность, обогащенная отрицательно заряженными аминокислотами: А8р-Х-Су5-А5р-01у-8ег-Азр-01и, где X - неконсервативная аминокислота. Наибольшей консервативностью отличается триплет 8ег-Азр-01и.

Эта последовательность имеет ведущее значение для связывания лиганда, несущего на поверхности положительный заряд [8,25,26]. Этот домен характеризуется высокой стабильностью.

Каждые 10 мин. рецептор связывает разные макромолекулы с

высоким сродством при рН 7,4 и освобождает их при рН 5,5, не теряя

при этом свою активность. Связывание лиганда прекращается только в

/~< 2 +

присутствии хилаторов металлов и восстанавливается ионами Са При делеции первого цистеин-богатого повтора рецептор продолжает связывать ЛПНП и Р-ЛПОНП с высоким сродством. Однако рецептор, содержащий только первый повтор, не может связывать липопротеины, что доказывает, что этот повтор не нужен для связывания лигандов. Моноклинальные антитела 1яО-С7 ^0-15С8 связываются с первым

повтором в зависимости от его конформации. Связь теряется при разрушении дисульфидных мостов или отсутствии ионов Са2+. Предполагается, что первый повтор играет некую роль, определяющую нужную конформацию лиганд-связывающего домена.

Fass и соавт. с помощью рентгеноструктурного анализа кристалла рецептора ЛПНП показали, что стабильность и активность домена поддерживается не только дисульфидными связями, но и структурой, в которой находятся ионы Са2+ (рис.2). Они доказали, что каждый повтор содержит один ион Са2 + , с которым он связывается четырьмя консервативными аминокислотами, отрицательно заряженными (с радикалом СОО"), и двумя атомами кислорода скелета рецептора (карбонил СО""). Таким образом, каждый ион Са2+ находится внутри "октаедрической клетки". Мутации, разрушающие "клетку для Са2 + ", приводят к заболеванию СГ, что служит доказательством того, что эта октаедрическая структура необходима для стабильности этого домена[27,28,29,30].

Пятый noBmop Са2+ связи

Повторный Консенсус

Мутации СГ'

1 у 10 I 15^ 20 ^25 3|0 3S \ 40

DSSPCSAFEFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCA

I • I •

-С----F-C----CI-----CD---DC-D-SDE--C-

Y F

К д G N РЕК

6 Q

Рис. 2:

последовательность пядюзо повтора, номера- позиции ак В повторе 5. петля- s-s сВязь.

JB__- Вторичная структура данного участка.

черные кружки (♦) - ак сВязыВающиися с Са2+ через радикал соо-. Вертикальные полосы (|) - ак связывающиеся с Са2+ через карбонильный кислород Со 2-

Аминокислотные остатки 290-690 составляют второй домен РЛПНП, обладающий значительной гомологией с предшественником эпидермального фактора роста [31]. Он включает в себя три цистеин-богатых повтора (А, В и С), так называемого В2 типа, второй и третий из которых разделены спейсерной последовательностью в 280 ак. Этот спейсер через каждые 40-60 аминокислот содержит кластер аминокислотных остатков с общей последовательностью Туг-Тгр-ТЬг-АБр. Каждый из цистеин-богатых повторов кодируется отдельным экзоном. Удивительным обстоятельством является тот факт, что 5 из 9 интронов гена РЛПНП в области гомологии с предшественником эпидермального фактора роста (ЭФР) прерывают кодирующую последовательность на тех же самых аминокислотных остатках, что и интроны самого предшественника ЭФР. Это наблюдение служит

доказательством их общего происхождения вследствие " перетасовки " экзонов. Повторы А, В и С в гене РЛПНП гомологичны также генным последовательностям трех белков системы свертывания крови: фактора X, фактора IX и белка С [32].

Домен РЛПНП, обладающий гомологией с предшественником ЭФР, неоходим для придания правильной пространственной ориентации лиганд-связываюшиму домену РЛПНП. Деления домена приводит к блоку диссоциации лиганда и рецептора в кислой среде эндосом [33].

Анализ этого домена методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) показал, что ионы Са2+ связываются со спейсерными последовательностями между цистеин-богатыми повторами. Предполагается, что в эндосомах конформация этого домена изменяется за счет диссоциации ионов Са2 + [29].

Третий домен белка отвечает за связывание углеводов с рецептором. Он состоит из 58 аминокислотных остатков и обогащен остатками серина и треонина. Этот домен обладает наименьшей степенью гомологии у разных видов животных.

У человека эта область содержит 18 сериновых и треониновых остатков. При созревании РЛПНП за счет о-гликозилирования этих остатков, молекулярный вес белка увеличивается с 120кДа до 160кДа. Делеция этого домена не приводит к каким-либо значительным нарушениям функции рецептора[34].

Трансмембранный домен представлен гидрофобной

последовательностью из 22 аминокислот и кодируется экзонами 16 и

17. Делеция этого участка полипептидной цепи РЛПНП в результате природной мутации приводит к синтезу секретируемого из клетки рецептора [35].

Цитоплазматический домен РЛПНП, содержащий последние 50 из 839 ак зрелого белка, кодируется экзонами 17 и 18 гена РЛПНП. Он содержит высококонсервативную последовательность Авр-Рго-Х-Туг, которая имеется также у множества других рецепторов макромолекул [36,37] и служит универсальным сигналом для кластеризации рецепторов в области окаймленных ямок и их последующего эндоцитоза [38,39,40,41].

Укороченние домена на 22 последних ак, но без потери сигнала кластеризации, не ведет к потере его функции [40].

Аминокислотная последовательность рецептора ЛПНП человека, коровы, кролика, хомячка, крысы и лягушки Хепориз 1аеу1з была определена методом клонирования их кДНК и анализом структуры их нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ первичной структуры белка показал, что ген высоко консервативен. Наиболее консервативным районом является цитоплазматический домен, обладающий гомологией свыше 86% среди 6 видов.

За этим доменом следуют домен предшественник ЭРФ (70-86%), домен связывания лиганда (69-78%) и трансмембранный домен (4662%).

Сигнальный пептид и домен гликозилирования имеют незначительную гомологию среди исследованных видов [42,43].

1.3. Структура гена рецептора ЛПНП.

Современные методы биохимии и молекулярной биологии позволили выделить белок-рецептор ЛПНП из надпочечников быка. Последующее определение аминокислотной последовательности и создание на ее основе синтетических олигонуклеотидов было использовано для клонирования отдельных фрагментов кДНК рецептора ЛПНП быка, а в дальнейшем и человеческого гена [44].

Матричная РНК гена РЛПНП имеет размер 5,3 кб, включая 3' нетранслируемую область - 2,6 кб [45].

Ген РЛПНП протяженностью 45 т.п.н., состоит из 18 экзонов и 17 интронов. Он локализован на коротком плече девятнадцатой хромосомы в районе 19р 13.1-13.3., рядом с генами апоЕ, апоС1, и апоСП (рис.3)[32].

—-/£.

т

т

ЛПНП

рецептор

апоЕ

апоС1

апоС! '

апоСП

• ^Схематическое иЗбраэкеыие кластера генов рецептора ппнп, апоЕ г апоСХ и апоСП

1.3.1. Соотношение ген-белок (рис.1) [37,45].

Первый экзон гена РЛНП кодирует короткий нетранслируемый 5'-концевой участок мРНК и гидрофобную сигнальную последовательность (из 21 аминокислоты), которая отщепляется от основной цепи при встраивании рецептора в мембрану[24].

Экзоны 2-6 гена содержат информацию для синтеза домена белка, осуществляющего связывание лиганда.

Экзоны 7-14 человеческого рецептора кодируют белковую последовательность из 400 ак, имеющую 33% гомологию с человеческим предшественником ЭРФ.

Экзон 15 кодирует домен белка, который подвергается гликозилированию.

Экзон 16 и 5'-конец экзона 17 кодируют трансмембранную область белка.

З'-конец экзона 17 и 5'-конец экзона 18 кодируют 50 ак, формирующие цитоплазматический домен.

Экзон 18, кроме того, кодирует длинную 3'-нетранслируемую последовательность в 2,5 т.п.н. В ней содержатся, перед сайтом полиаденилирования, три копии семейства Alu умеренно повторяющихся в геноме последовательностей [42].

Первая копия (нуклеотиды от 3704 до 3990) имеет все характеристики человеческого консенсуса Alu-последовательности: правый и левый тандемные повторы, прямые повторы, фланкирующие AlU-последовательность, и А-богатая последовательность на З'-конце.

Вторая копия (нуклеотиды от 4049 до 4164) является очень укороченной с 5'-конца А1и-последовательностью.

Третья последовательность (нуклеотиды от 4183 до 4465) не имеет фланкирующих прямых повторов, но имеет А-богатую последовательность на З'-конце.

Вся эта область фланкируется двумя последовательностями, похожими, но не идентичными, сигналам сплайсинга. Возможный 5'-сигнал находится в положении 3538 кДНК (САО/§и§ас), а возможный З'-сигнал находится в положении 4650 кДНК (tcccccccag/T) [42,43].

В длинной, около 2 т.п.н, 3 '-нетранслируемой области мРНК РЛПНП быка и бабуина отсутствуют какие-либо повторяющиеся последовательности, а у шимпанзе и гориллы они имеются. Обычно А1и-последовательности содержатся в интронах генов и являются "горячими точками" рекомбинации [46], однако их функция в мРНК остается недостаточно ясной[47].

1.3.2 Транскрипционная регуляция гена РЛПНП

При анализе структурной организации промоторной области гена РЛПНП было обнаружено существование трех прямых повторов между нуклеотидами -110 и -40, из 16 нуклеотидов каждый[50]. Первый и третий повторы являются А/Т-богатыми последовательностями, с которыми связывается транскрипционный фактор Бр1 [51,52]. Однако это связывание недостаточно для максимальной транскрипции гена или ее регуляции в ответ на присутствии стероидов. Предполагается, что средний ЬовтЬр, содержащий стероидный регуляторный элемент из 10

нуклеотидов, названный 8ЯЕ-1 [53], опознается другим ядерным фактором: БКЕВР с ММ 68 кДа. В отсутствие стероидов, ЗЯЕВР действует одновременно с фактором транскрипции Бр1 для активации транскрипции гена рецептора ЛПНП [54,55]. 8ЯЕ-1 теряет свою активность в присутствии стероидов. Было доказано, что неактивная форма БКЕВР-факторов (ММ 125 кДа) связывается с мембранами ядра и эндоплазматического ретикулума. Под действием протеаз И-конец БКЕВР освобождается и связывается с БКЕ-1-содержащими промоторами. Надо подчеркнуть, что промотор гена ГМГ-КоА-синтетазы содержит две копии БЛЕ-!, а промотор ГМГ-КоА редуктазы содержит один элемент, очень похожий на 8ЯЕ-1 [56].

Работы по изучению экспрессии гена рецептора ЛПНП показали, что транскрипция генов рецептора и ГМГ-КоА-редуктазы индуцируется одновременно разными органическими соединениями (цитокинами). Конститутивная экспрессия двух генов поддерживается неким регуляторным белком с коротким периодом полураспада. Индукция РЛПНП и ГМГ-КоА-редуктазы опосредуется ферментом протеин-киназой С путем инактивации регуляторного белка. Известно также, что экспрессия рецептора модулируется и циклическим АМФ [57].

Увеличение числа рецепторов на поверхности клеток происходит за счет набора внутриклеточной доли рецепторов и увеличения экспрессии гена рецептора, что коррелирует с увеличением уровня его мРНК [58].

Общая структура промотора рецептора сходна у мыши, хомяка и приматов. Надо подчеркнуть, что у больных с СГ в этой области была найдена лишь одна мутация[59].

1.3.3. Полиморфизмы рецептора ЛПНП.

После клонирования кДНК рецептора были идентифицированы различные полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов. Полиморфизмы перекрывают весь рецепторный локус. Шесть из них (Э 1, Нтс II, Ауа11 + ХЬа1, МБр1, Ысо1 и (ёТА)п) находятся в экзонах, один из которых (Бит! в восьмом экзоне) появился вследствие аминокислотной замены, которая не имеет явного влияния на функцию рецептора. Десять из обнаруженных полиморфизмов были использованы для выявления гаплотипов в локусе рецептора в 20 американских семьях. Было охарактеризовано 123 гаплотипа с частотой от 0,8% до 29,3%.

Гаплотипы, полученные комбинацией пяти отселектированных эндонуклеотидных рестриктаз (ВвпЛ в 5'-фланкирующей области, БрЫ в интроне 6, Ауа11+ХЬа1 в экзоне 13, АраП+ВатЫ в интроне 15 и АраП+ВатЫ в 3'-фланкирующей области гена) были информативными. Индекс гетерозиготности (ИГ) составляет от 84% до 86%[61].

Анализ гаплотипов может быть использован для определения сегрегации отдельных гаплотипов с диагнозом СГ в отдельных семьях. Попытки использовать ПДРФ для определения общих аллелей, влияющих на уровень холестерина плазмы в общей популяции, не дали ожидаемых результатов [61-69].

1.4 Сцепление мутационных дефектов РЛПНП с СГ.

Модели животных с дефицитным или гиперактивным рецептором, а также функциональный, биохимический и генетический анализы рецептора ЛПНП способствовали выявлению наследственной основы СГ.

Генный дефект рецептора ЛПНП ярко проявляется у выведенной в Японии линии кроликов, названной WHHR (Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits) [70,71,72]. Выраженная СГ, характерная для таких животных, передавалась по наследству как аутосомно-рецессивный признак. При изучении молекулярных механизмов нарушения липидного обмена было установлено, что их природа у кроликов линии WHHR обусловлена одним из вариантов генных дефектов апоВ,Е-рецептора, выявленных и у пациентов с семейной гиперхолестеринемией. При этом рецептор нормально синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме, но очень медленно гликозилируется, медленно перемещается к плазматической мембране, и вследствие этого ЛПНП-рецепторная активность в клетках печени, надпочечников и других тканей практически отсутствует.

Мутация гена, кодирующего синтез рецептора, у этих кроликов, проявляется в делеции 12 нуклеотидов, что приводит к потере 4 ак в сформировавшемся белке[73]. Важно подчеркнуть, что у кроликов линии Watanabe взаимодействие клеточных рецепторов с ремнантами ХМ проявляется в той же степени, что и у нормальных кроликоб, и

указывает на сохранение активности апоЕ-рецепторов, в отличие от апоВ,Е -рецепторов.

Кроме WHHR кроликов, были идентифицированы несколько членов семейства Rhesus обезьян с дефицитным рецептором ЛПНП. Эти обезьяны были гетерозиготными по нонсенс-мутации в остатке Тгр-284 [74,75].

Нокаутирование гена рецептора ЛПНП у мышей (LDLr-/- mice) доказало прямое сцепление с болезнью. LDLr-/- мыши страдали тяжелой формой СГ, характеризующейся аккумуляцией адгезирующих и мигрирующих лейкоцитов в посткапиллярных венулах и артериолах. Кормление этих мышей нормальной или богатой холестерином диетой сопровождалось накапливанием частиц ЛПНП, окисленных ЛПНП и продуктов их окисления таких как, например, лизофосфатидилхолин [76].

Было показано, что лизофосфатидилхолин является химическим фактором, инактивирующим NO (N0 - ингибитор адгезии лейкоцитов к стенке сосудов) и ингибирующим его образование и/или его освобождение. Все это приводит к блокированию эндотелиально-зависимой вазорелаксации [77]. Такая диета сопровождается также гиперактивацией воспалительного ответа в виде выделения факторов LTB4 (leukotriene В4), PAF (platelet-activating factor) и TNF-a (tumor necrosis factor - а), повышающих аккумуляцию прилипающих и мигрирующих лейкоцитов на стенках крупных и даже мелких кровеносных сосудов. Последнее, как известно, является черезвычайно важным фактором риска развития атеросклероза [76].

С другой стороны, были созданы трансгенные мыши, с высокой экспрессией гена рецептора ЛПНП. Высокий уровень катаболизации ЛПНП приводил к очень низкому уровню ЛПНП плазмы.

Атерогенная диета с высокой концентрацией холестерина и насыщенных жиров у этих мышей не приводила к увеличению концентрации ЛПНП в плазме. Поэтому, было сделано предположение, что для зашиты от СГ и атеросклероза нужно лишь увеличить экспрессию РЛПНП [78].

У человека среди многочисленных мутаций в гене рецептора ЛПНП, обнаруженных и охарактеризованных к настоящему времени (более 200 вариантов), большая часть обусловлена крупномасштабными делециями или перегруппировками. Остальные являются результатом делеции одной или нескольких пар нуклеотидов, реже инсерции, или представляют собою точечные нуклеотидные замены [79,80]. Все они приводят к нарушениям катаболизма ЛПНП.

Многочисленность мутаций, приводящих к СГ свидетельствует о том, что нет одного центра возникновения дефектного гена, откуда бы он распространился по всему миру. Более вероятно, что в разное время в различных регионах возникали независимые мутации, приводящие к СГ. Эти мутации могут быть как давнего, так и недавнего происхождения. В литературе описана мутация у ребенка, при отсутствии ее у его родителей. Так же описана мутация Trp792Stop de novo, возникшая во французской популяции у двух больных с СГ, не являющихся родственниками. Проведенный анализ гаплотипов,

ассоциированных с каждой мутацией, показал, что эта мутация возникла дважды в разных семьях независмо друг от друга [81].

Столь высокая частота перестроек в гене РЛПНП обусловлена высоким содержанием А1и-повторов в его интронах. Они встречаются со средней частотой одна копия на 1,6 т.п.н. В то же время, в среднем по всему геному человека один А1и-повтор приходится на 5 т.п.н.

Ген РЛПНП, таким образом, обогащен А1и-элементами, играющими роль горячих точек рекомбинации [45,46].

Описаны несколько крупных делеций, инсерций и дупликаций, происходящих в результате рекомбинации между А1и-повторами[82-86].

Гомологичная рекомбинация может также осуществляться между ДНК-последовательностями, кодирующими цистеин-богатые повторы Ы-конца белка, или между последовательностями, кодирующими повторы в центре рецепторного белка.

Мутации в гене РЛПНП, приводящие к СГ, имеют «семейный характер», т.е. каждая семья с СГ имеет свою собственную мутацию. Эффект "основателя", при котором одна мутация определяет большой процент больных с СГ, очень редкий и характерен для замкнутых популяций. В подобных популяциях СГ встречается с высокой частотой (до 1 на 50 человек), например, как у белого населения ЮАР [87,88,89], ливанских христиан [90,91], франкоязычных канадцев [92,93,94], финов [95], евреев Ашкенази [96] и у норвежцев [97].

В 1984 году была охарактеризована мРНК, а в 1985 году был клонирован хромосомный ген рецептора ЛПНП. С тех пор увеличилось

число работ, посвященных характеристике полиморфизма гена РЛПНП и мутаций в этом локусе. Так, были охарактеризованы различные мутантные аллели РЛПНП, что позволило понять механизмы функционирования рецептора. Число новых идентифицированных генетических дефектов продолжает расти.

1.5 Классификация мутации в рецепторе ЛПНП.

Все многообразие мутаций в гене рецептора ЛПНП по их влиянию на функционирование рецептора подразделяют на 5 основных классов.

Первую разновидность составляют мутации, при наличии которых не образуется иммуноопределяемый белок. Это так называемые нуль-аллели. Значительная часть нуль-аллелей отличается пониженной концентрацией мРНК рецептора ЛПНП в клетках больных. Встречаются также пациенты, в клетках которых соответствующая мРНК вообще не образуется.

Мутации второго класса приводят к замедленному транспорту рецепторного белка из эндоплазматического ретикулума к мембране клетки. Это связано с нарушением превращения незрелого белка с ММ 120 кДа в зрелую форму с ММ 160 кДа. Дефектный белок имеет неправильную пространственную укладку полипептидной цепи и не достигает при процессинге аппарата Гольджи, деградируя в эндоплазматическом ретикулуме [98,99,100,101].

При мутациях третьего класса рецептор нормально синтезируется и транспортируется на клеточную поверхность, но обладает пониженной способностью связывать лигайд (ЛПНП). Чаще всего эта

мутация обусловлена делецией, которая удаляет первый и второй повторы из лиганд-связывающего домена гена рецептора ЛПНП. Удаление одной аминокислоты в консервативном триплете цистеинбогатого повтора (Бег-Двр-ОЫ) этого домена дает такой же эффект, как и делеция целого повтора [25].

Для обеспечения максимального взаимодействия рецептора с ЛПНП необходимо нормальное функционирование не только лиганд-связывающего домена, но и соседнего с ним домена, который влияет на пространственную ориентацию первого. При делециях во втором домене также понижается способность рецептора связывать ЛПНП [102].

Для мутаций четвертого класса характерно образование дефектного рецептора, который не обладает способностью формировать кластеры в окаймленных клатрином ямках, что препятствует интернализации внутрь клетки связанных с рецепторами ЛПНП. В эту группу входят, в частности, мутантные аллели, определяющие синтез укороченного рецептора без

цитоплазматического и трансмембранного доменов. Последнее препятствует его удержанию на клеточной поверхности и способствует секреции рецептора из клетки.

При пятой разновидности мутаций образуется укороченный белок ЛПНП-рецептора, который утрачивает способность освобождать лиганды в эндосомах, что приводит к деградации рецептора. Мутации этого класса локализованы, как правило, во втором домене,

обладающем гомологией с предшественником эпидермального фактора роста.

Как указывает А. Роипе, скорость деградации рецептора при мутациях 5-го класса, обнаруженных у жителей Южной Африки, может возрастать в 5-10 раз, что приводит к значительному уменьшению количества рецепторов на поверхности клетки[103,1 04].

С накоплением фактического материала появилась возможность проведения прямой и косвенной ДНК-диагностики, основанной на изучении сегрегации ассоциированных с геном РЛПНП полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)[105]. В настоящее время ДНК-диагностика проводится в ряде высокоразвитых стран.

1.6. Общая стратегия изучения СГ.

Классическим методом диагностики СГ является определение способности фибробластов больного в культуре клеток связывать и катаболизировать частицы ЛПНП. Помимо количественного измерения способностей рецепторов, определяются и последующие этапы деградации ЛПНП, а именно уровень супрессии ГМГ-КоА-редуктазы и стимуляции синтеза ЭХС посредством АХАТ фермента [106,107,108,109]. Однако вследствие высокой стоимости подобных исследований они могут производится лишь в специализированных центрах. Вместе с тем, методы ДНК-диагностики имеют свои преимущества. Они не требуют приготовления культуры фибробластов кожи больного.

Кроме того, методы ДНК-диагностики характеризуются большой скоростью и надежностью получаемых результатов. При необходимости они могут производиться пренатально (например, при подозрении на гомозиготную форму СГ)[110].

На первом этапе осуществляется поиск крупных геномных перестроек и точечных мутаций в локусе РЛПНП у больных с СГ. Далее проводят секвенирование преобладающих в данной популяции аллелей.

Охарактеризованные мутации воспроизводят с помощью мутагенеза in vitro в плазмиде, несущей экспрессирующий ген РЛПНП. С помощью этих мутантных ДНК получают стабильные клоны фибробластов, исходно дефектных по гену РЛПНП. Сравнивая экспрессирующие белки в фибробластах с нормальной и дефектной кДНК РЛПНП, анализируют влияние воспроизведенной мутации на функционирование рецептора[106,108].

На следующем этапе разрабатывается наиболее простая процедура для скрининга и определения частоты распространения каждой из этих мутаций в группе больных с СГ.

Выявление косегрегаций заболевания с наличием найденной мутации в какой-либо области гена может быть осуществлено следующим образом: сначала доказывается отсутствие других мутаций во всех остальных областях гена РЛПНП, затем - отсутствие найденной мутации в большой выборке здоровых людей. Этот подход получил широкое применение благодаря низкой затрате времени и относительно небольшой стоимости[111].

Также используются полиморфизмы ДНК в локусе гена РЛПНП для проведения косвенной ДНК-диагностики, основанной на изучении косегрегации заболевания и сцепленных с геном РЛПНП ПДРФ-маркеров.

1.6.1 Идентификация крупных перестроек в гене РЛННП.

Исторически сложилось так, что первыми охарактеризованными мутациями в гене РЛПНП были крупные делеции. Действительно, крупномаштабные перестройки в генетическом локусе, а также мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов, могут быть легко выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях генетического анализа, предшествующих молекулярному клонированию гена РЛПНП.

Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном гелях.

1.6.2 Первичная идентификация точечных мутаций

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем секвенирования кДНК или ДНК отдельных экзонов гена РЛПНП, амплифицированных посредством полимеразной цепной реакций с олигонуклеотидами, комплементарными экзон-интронным стыкам.

При мутациях гена, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагментов остаются постоянными, однако, некоторые физико-химические свойства мутантных молекул ДНК меняются. С учетом этих особенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Ведущими методами являются: метод анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), температурный градиентный гель-электрофорез (TGGE), метод гетеродуплексного анализа (НА), метод химического расщепления некомплементарных сайтов (CMC) и секвенирование фрагментов ДНК[112].

SSCP(Single Strand Conformation polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложенный М. Орита и соавт.[113,114,115], быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обнаруживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.н. составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.н., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

Метод SSCP основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул. Метод включает амплификацию специфических фрагментов ДНК, обычно в присутствии

меченых dNTP, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле[116].

Для лучшего разделения ДНК и однозначной идентификации полос используют специальные гели, а также более чувствительные, по сравнению с бромидом этидия, методы окрашивания, такие как окраска нитратом серебра. На процесс конформации оказывают влияние различные внешние параметры: температура, концентрация акриламида и глицерина или полиэтиленгликоля в геле, ионная сила буферных растворов[ 117,11 8,119]. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять однонитевые фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид.

DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза - основан на зависимости свойств плавления небольших двунитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее, от соотношения А-Т и G-C-nap в исследуеммых фрагментах[120,121]. Градиент денатурации достигается разницей температур (TGGE - метод температурного градиентного гель-электрофореза), из-за различной концентрации мочевины или формальдегида в гелях. Плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК.

Метод годен для крупных амплифицированных фрагментов до 600 п.н. и его эффективность достигает 95 %.

Используется также анализ гетеродуплексов, образовавшихся путем слияния нормального и мутантного фрагментов. При форезе гетеродуплекс мигрирует со скоростью меньшей, чем оба гомодуплексных фрагмента ДНК (нормальный и мутантный), полученных с помощью ПЦР, за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов.

При анализе фрагментов ДНК менее 300 п.н. вероятность идентификации точечных мутаций может достигать 80-90%[112].

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического расщепления некомплементарных сайтов - основан на способности некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания [122,123].

Современные модификации метода CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций[124]. Большими преимушествами этого метода являются: возможность исследовать протяженные участки ДНК до 2 тпн. и способность одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в одном фрагменте ДНК.

Описанные методы обнаружения мутаций предполагают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни.

1.6.3 Молекулярный скрининг охарактеризованных мутаций

в популяции.

После описания мутации появляется возможность ее анализа простыми методами, не требующими секвенирования, для массовой диагностики или пренатальной диагностики в группах повышенного риска, а также для медико-генетического консультирования.

Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.

Из миссенс-мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз. Они выявляются по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.

Разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелах дикого типа - метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза [125].

Концептуально близким к этому варианту является метод, получивший название "амплификация рефрактерной мутационной системы" -amplification refractory mutation system-ARMS. В основе метода лежит неспособность термофильной полимеразы Taql к амплификации фрагмента при наличии несоответствия между матричной ДНК и З'-концом одного из олигопраймеров.

Методы детекции состояния гена, основанные на лигировании синтетических олигонуклеотидных зондов - OLA (oligonucleotide

ligation assay). При проведении этих реакций специфические ДНК- или РНК-последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов[126].

При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигирования, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит [112].

Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов -ASO, который включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот-гибридизацию с меченными аллель-специфическими

олигонуклеотидами [127,128,129].

Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом сканирования точечных мутаций является модифицированный вариант ASO, так называемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation) [130]. Метод позволяет одновременно скринировать сразу много точечных мутаций и доступен автоматизации [112].

Заключение диссертации по теме «Генетика», Шакир Хамид

ВЫВОДЫ.

1. В группе больных семейной гиперхолестеринемией г. Санкт-Петербурга нами выявлены четыре мутационных повреждения гена рецептора липопротеидов низкой плотности - Cysl27Trp, Cys 1 39Gly, DeltaG 197 и Glu397Stop.

2. Впервые выявлены мутации Cysl27Trp, Cysl39Gly, и Glu397Stop, характерные только для российской популяции. А мутация DeltaG197 характерна только для пробандов еврейской национальности.

3. Обнаруженные мутации позволяют идентифицировать природу молекулярного дефекта 30% больных семейной гиперхолестеринемией, находящихся под нашим наблюдением.

4. В 10 экзоне гена рецептора липопротеидов низкой плотности обнаружен нейтральный полиморфизм Arg 540 AGG/AGA.

5. Отработаны методы легкого обнаружения описанных мутаций в гене рецептора липопротеидов низкой плотности среди группы лиц с повышенным риском возникновения семейной гиперхолестеринемии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все 4 выявленные нами мутации сопровождаются высоким уровнем холестерина в крови больных и являются прямыми причинами СГ.

Каждая мутация была обнаружена в отдельной семье и только одна с!еИа0197 была выявлена в двух изолированных (неродственных) семьях. Эти данные указывают на чрезвычайную гетерогенность молекулярного дефекта при СГ.

Семейный характер мутаций Суз127Тгр, Суз13901у и 01и39781:ор, а так же их редкая встречаимость свидетельствуют о недавнем их возникновении, чего нельзя сказать о мутации ёеИа0197.

Следует отметить, что две широко распространенные мутации среди финских пациентов (РН-НеЫпЫ - большая делеция и РН-МогЧЬ КогеНа - делеция 7 пн в экзоне 6) не были обнаружены среди пациентов Санкт-Петербурга[95]. С другой стороны, среди финских пациентов не была найдена ни одна из наших мутаций, включая с!еИа0197.

Это наблюдение показывает, что две сравниваемые популяции, несмотря на географическую близость, имеют значительные генетические различия.

ЗБСР-анализ некоторых семей не выявил генетических дефектов в гене РЛПНП, что может быть связано с некоторыми ограничениями данного метода. Это также может быть обусловлено нахождением молекулярных дефектов не в самом гене РЛПНП, а в одном из генов

811ЕВР1 и 811ЕВР2, контролирующих его транскрипцию[54,55,150], или в гене апоВ-100 [151].

В настоящей работе были обнаружени ранее неописанные мутации среди популяции больных СГ в г. Санкт-Петербурге и было показано, что генетические факторы могут быть фактически, единственной причиной развития болезни.

Очевидно, что скрининг популяции на выявление носителей дефектов гена РЛПНП благодаря внедрению молекулярно-генетических методов в диагностику СГ скоро станет реальностью[152].

Это является необходимым условием для создания эффективных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистой патологии.

Кроме того, точное знание природы мутаций позволит проводить пренатальную диагностику в семьях с высоким риском заболевания и предсказывать возникновение болезни с раннего возраста.

Чрезвычайно важным аспектом в изучении молекулярных основ СГ является анализ взаимосвязи между типом мутационного повреждения и характером течения атеросклеротического процесса.

С другой стороны, при одном и том же мутационном повреждении начало заболевания и его манифестация протекают по-разному (у отдельных больных). В этой связи, СГ является хорошим объектом для изучения роли ген-генных взаимодействийразличныхклинических проявлений патологического процесса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шакир Хамид, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Thorn, Т. J., Epstein, F. H., Feldman, J. J., and Leaverton, P.E: Trends in total mortality and morbidity from heart disease in 26 countries from 1950 to 1978// Int. J. Epidimiol. 1985;14:510-20.

2. Аничков, H. H., Новые данные по вопросу о патологии и этиологии

атеросклероза// Русский Врач,- 1915.8:184-186; 9:202-211.

3. Mahley, R. W., et al. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function// J. Lipid Res. 1984;25:1277-1294.

4. Goldstein, J. L., Brown, M. S., Anderson, R. G. W., Russell, D. W., Schneider, W. J. Receptor mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system// Ann. Rev. Cell Biol. 1985;1:1-39.

5. Beaumont, J. L., Carlson, L. A., Cooper, G. R. et al. Classification of

hypercholesterolemias and hyperlipoproteinemias// Bull. Wld. Health Org. 1970;43:891-915.

6. Khachadurian, A. K. The inheritance of essential familial hypercholesterolemia. // Am. J. Med. 1964;37:402-7.

7. Goldstein, J. L., Brown, M. S. The LDL: receptor locus and the genetics of familial hypercholesterolemia// Ann. Rev. Genet. 1979;13:259-89.

8. Vega, G. L., Grundy, S. M. In vivo evidence for reduced binding of low density lipoproteins to receptors as a cause of primary moderate hepercholesterolemia// J. Clin. Invest. 1986;78:1410-1414.

9. Attie, A. D., Pittman, R. C., Watanabe, Y., Steinberg, D. Low density

lipoprotein receptor deficiency in cultured hepatocytes of the

WHHL rabit: further evidence of two pathways for catabilism of exogenous protein// J. Biol. Chem. 1981;256:9789-92.

10. Slack, J. Inheritance of familial hypercholesterolemia// Atheroscler. Rev. 1979; 5:35-66

11. Brown, M. S., Kovanen, P. T., Goldstein, J. L. Regulation of plasma

cholesterol by lipoprotein receptors// Science. 1981;212:628-63 5

12. Brown M. S. Goldstein J. L. Scavenging for receptors// Nature. 1990;343:508-509.

13. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science 1986; 232:34-47.

14. Brown, M. S., and Goldstein, J. L., How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis// Sci. Amer. 1984;251:58-66.

15. Kodama, T., Freeman, M., Rohrer, L. et al. Type I macrophage scavenger receptor contains a-helical and collagen-like coiled coils// Nature. 1990;343:53 1-53 5.

16. Daniel Steinberg, Low density lipoprotein oxydation and its pathobiological significance// J. Biol. Chem. 1997;272:20963-66.

17. Clinton, S. K., et al. Macrophage colony-stimulating factor gene expression in vascular cells and in experimental and human atherosclerosis// A. J. P. 1992;140:301-316

18. Rosenfeld, M. E., et al. Macrophage colony-stimulating factor mRNA

and protein in atherosclerotic lesions of rabbits and humans// A. J. P. 1992;140:291-300.

19. А. Н. Климов, Н. Г. Никульчева,. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. - СПб: Питер Пресс, 1995. - 304 с - (Сурия <<Практическая Медицина>>) ISBN 5-88782-008-Х.

20. Goldstein, J. L., Kita, Т., Brown, M. S. Defective lipoprotein receptors and atherosclerosis: Lessons from an animal counterpart of familial hypercholesterolemia// New Engl. J. Med. 1983;309:288-95

21. Russell, D. W., Esser, V., Hobbs, H. H. Molecular basis of familial hypercholesterolemia// Atherosclerosis. Suppl. 1989;9:8-13.

22. Steinberg, D., S. Parthasarathy, Т. E. Carew, J. C. Khoo, and J. I. Witztum. Beyond cholesterol: modifications of low density lipoprotein that increase its atherogenicity// N. Engl.J. Med. 1989;230:915-924,

23. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor mediated control of cholesterol

metabolism// Science -1976;191:150-154.

24. Vassilis I. Zannis, Dimitris Kardassis, and Eleni Economou Zanni, Advances in human genetics: Genetic mutations affecting human lipoproteins, their receptors, and their enzymes, V 21, edited by Henry Harris and Kurt Hishborn, Plenum Press, New York, 1993.

25. Russell, D. W., Brown, M. S., Goldstein, J.L., Different combinations of cystein-rich repeats mediate binding of low density lipoprotein receptor to two different proteins// J. Biol. Chem. 1989;264:21682-88.

26. Hobbs, H; H., Brown, M. S., Goldstein, J. L., russell, D. W. Deletion

of exon encoding cystein-rich repeat of low density lipoprotein

receptor alters its binding specificity in a subject with familial hypercholesterolemia// J. Biol. Chem. 1986;261:131 14-20.

27. Leitersdorf, E., Hobbs, H. H., Fourie, A. M., Jacobs, M., van der Westhuyzen, D. R., Coetzee, G. A. Deletion in the first cystein-rich repeat of low density lipoprotein receptor impairs its transport but not lipoprotein binding in fibroblasts from a subject with familial hypercholesterolemia// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988;85:7912-16

28. Van Driel, I. R., Goldstein, J. L., Sudhof, T. C., Brown, M. S. First cysteine-rich repeat in ligand binding domain of low density lipoprotein receptor binds Ca2+ and monoclonal antibodies, but not lipoproteins//J. Biol. Chem. 1987; 262:17443-49.

29. Fass, D., Blacklow, S., Kim, P. S., and Berger, J. M., Molecular basis of familial hypercholesterolemia from structure of LDL receptor module// Nature 1997;388:691-693.

30. Brown, M. S., Herz, J., Goldstein, J. L., Calcium cages, acid baths and recycling receptors// Nature 1997;388:629-630.

31. Sudhof, T. C., Russell, D. W., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Sanchez-Pescador, R., Bell, G. I. Cassette of eight exons shared by genes for LDL receptor and EGF precursor// Science 1985;228:893-95.

32. Sudhof, T. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Russell, D. W., The LDL receptor: A mosaic of exons shared with different proteins// Science 1985;228:815-22.

33. Davis, C. G., Goldstein, J. L., Sudhof, T. C., Anderson, R. G. W., Russell, D. W., Brown, M. S. Acid dependent ligand association and

recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region// Nature 1987;326:760-65.

34. Davis, C. G., Elhammer, A., Russell, D. W., Schneider, W. J. Kornfeld, S., et al. Deletion of clustered O-linked carbohydrates does not impair function of low density lipoprotein receptor in transfected fibroblasts// J. Biol. Chem. 1986;261:2828-38.

35. Lehrman, M. A., Russell, D. W., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Duplication of seven exons in LDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject with familial hypercholesterolemia// Cell 1987;48:827-35.

36. Herz J., Hamann U., Rogne S. et al. Surface location and high affinity for calcium of a 500-Kd liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological role as lipoprotein receptor// EMBO J. 1988;7,13:4119-4127.

37. Chen, W.-J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic tails, is required for coated pit-mediated internalization of the low density lipoprotein receptor// J. Biol. Chem. 1 990;265:3 1 16-1 23.

38. Davis, C. G., lehrman, M. A., Russell, D. W., Anderson, R. G. W., Brown, M. S., Goldstein, J. L. The J. D. Mutation in familial hypercholesterolemia: Amino acids substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors// Cell 1986;45:15-24.

39. Aalto-setala, K., Helve, E., Kovanen, P. T., Kontula, K. Finnish type

of low density lipoprotein receptor gene mutation (FH-Helsinki)

deletes exons encoding and carboxy-terminal part of the receptor and creates an internalization-defective phenotype// J. Clin.Invest. 1989;84:499-505.

40. Davis, C. G., van Driel, I. R., Russell, D. W., Brown, M. S., Goldstein, J. L. The LDL receptor: identification of amino acids in cytoplasmic domain required for rapid endocytosis// J. Biol. Chem. 1987;262:4075-82.

41. Lehrman, M. A., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Russell, D. W., Schneider, W. J. Internalization-defective LDL receptors produced by genes with nonsense and frameshift mutations that truncate the cytoplasmic domain// Cell 1985;41:735-43.

42. Lee, L. Y., Mohler, W. A. Schafer, B. nolly, N., et al. Nucleotide sequence of the rat low density lipoprotein receptor cDNA// Nucleic Acids Res. 1989;17:1259-60.

43. Russell, D. W., Schneider, W. J., Yamamoto, T., Luskey, K. L., Brown, M. S., Goldstein, J. L., Domain map of the LDL receptor: sequence homology with the epidermal growth factor precursor// Cell 1984;37:577-85

44. Russell, D. W., Yamamoto, T., Schneider, W. J., Slaughter, C. J., Brown, M. S., Goldstein, J. L., cDNA cloning of the bovine low density lipoprotein receptor: Feedback regulation of a receptor mRNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983;80:7501-7505.

45. Yamamoto, T., Davis, C. G., Brown, M. S., Schneider, W. J., Casey, M. L., et al. The LDL receptor: A cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA// Cell 1984;39:27-38.

46. Hobbs, H. H., Lehrman, M. A., Yamamoto, T., Russell, D. W. Polymorphism and evolution of Alu sequences in the human low density lipoprotein receptor gene// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985;82:7651-55.

47. Wilson G.M., Vaza M.Z. and Dealey R.G. Stabilization and cytoskeletal association of LDL receptor mRNA are mediated by distinct domains in its 3' untranslated region// Journal of lipid research - 1998;39:1025-1032.

48. Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of mevalonate pathway//. Nature; 1990:343:425-30.

49. Sudhof, T. C., Russell, D. W., Brown, M. S., Goldstein, J. L. 42-bp element from LDL receptor gene confers end-product repression by sterols when inserted into viral TK promoter// Cell 1987;48:1061-69

50. Smith, J. R., Osborne, T. F., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Identification of nucleotides responsible for enhancer activity of sterol regulatory element in low density lipoprotein receptor gene// J. Biol. Chem. 1990;265:23 06-10

51. Briggs, M. R., Yokoyama, c., wong, X., Brown, M. S., Goldstein, J. P. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence// J. Biol. Chem. 1993;268:14490-96.

52. Wong, X. Et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization//J. Biol. Chem. 1993;268:14497-14504.

53. Wong, X., et al. SREBP-1, a membrane-bound transcription Funke factor released by sterol-regulated proteolysis// Cell. 1994;77:5362.

54. Hua, X., Goldstein, JL., Brown, MS., Hobbs, HH. Structure of the human gene incoding sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP1) and localization of SREBP1 and SREBP2 to chromozomes 17p 11.2 and 22q 13// Genomics 1995;25:667-673.

55. Yokoyama, C., Wong, X., Briggs, MR,. Admon, A., Wu, J., Hua, X., Goldstein, JL., Brown, MS. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controles transcription of the low density lipoprotein receptor gene// Cell 1993;75:1 87-197.

56. Hua, X., et al. SREBP-2, a second basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that stimulates transcription by binding to a sterol regulatory element// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993;90:1 160311607.

57. Middleton, B., and Middleton, A. Cyclic AMP stimulates the synthesis and function of the low-density lipoprotein receptor in human vascular smooth-muscle cells and fibroblastes// Biochem. J. 1992;286:853-861.

58. Takagi, K. et al. Control of low density lipoprotein receptor gene promoter activity// J. Biol. Chem. 1989;264:12352-57.

59. Armand V. Peeters et al. A 3-baise pair deletion in repeat 1 of the LDL receptor promoter reduces transcriptional activity in a South African Pedi// Journal of Lipid Research 1998;39:1021-1024.

60. Top, B. et al. Absence of mutations in the promoter region of the low

density lipoprotein receptor gene in a large number of familial

hypercholesterolaemia patients as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis// Hum. Genet. 1992;89:561-565.

61. Daga, A., Fabbi, M.,Mattioni, T., Bertolini, S., Corte, G. Pvu II polymorphism of low density lipoprotein receptor gene and familial hypercholesterolemia// Study of italians. Atherosclerosis 1988;8:845-50

62. Funke, H., Klug, J., Frossard, P., Coleman, R., Assmann, G. Pst I RFLP close to the LDL receptor gene// Nucleic acids res. 1986;14:7820

63. Geisel, J., Weisshaar, B., oette, K., Mechtel, M., doerfler, W. Double Msp I RFLP in the human LDL receptor gene// Nucleic acids res. 19 87 ; 15:3 943

64. Geisel, J., Weisshaar, B., oette, K., doerfler, W. A new Apa LI restriction fragment length polymorphism in the low density lipoprotein receptor gene// J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988;26:429-33

65. Hegele, R. A., Emi, M., Nakamura, Y., Lalouel, J.-M., White, R. Three RFLPs upstream of the low density lipoprotein receptor (LDLR) gene// Nucleic acids Res. 1989;17:470.

66. Kotze, M. J., Langenhoven, E., Dietzsch, E., Retief, A. E. A RFLP associated with the low density lipoprotein receptor gene (LDLR)// Nucleic Acids Res. 1987; 15:376

67. Leitersdorf, E., Chakravarti, A., Hobbs, H. H. Polymorphic DNA haplotypès at the LDL receptor locus// Am. J. Hum. Genet. 1989;44:409-21

68. Leitersdorf, E., Hobbs, H. H. Human LDL receptor gene: Hinc II polymorphism detected by gene amplification// Nucleic Acids Res. 1 9 88; 16:72 1 5

69. Taylor, R., Jeenah, M., Seeds, M., Humphries, S. Four DNA polymorphisms in the LDL receptor gene: their genetic relationship and use in the study of variation at the LDL receptor locus// J. Med. Genet. 1988;25:653-59.

70. Kondo, T., Watanabe, Y. A heritable hyperlipidemic rabbit// Exp. Anim. 1975;24:89-94.

71. Watanabe, Y. Serial imbreeding of rabbits with hereditary hyperlilidemia (WHHL-rabbit). Incidence and development of atherosclerosis and xanthoma// Atherosclerosis 1980;36:261-68

72. Schneider, W. J., Brown, M. S., Goldstein, J. L., Kinetic defects in the processing of the low density lipoprotein receptor in fibroblasts from WHHL rabbits and a family with familial hypercholesterolemia// Mol. Biol. Med. 1983;1:353-67

73. Havel, R. J. et al. Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit. Animal

model for familial hypercholesterolemia// Atherosclerosis. Suppl. 1989;9:33-38.

74. Hummel, M., Li, Z., Pfaffinger, D., Neven, 1., Scanu, A. M. Familial

hypercholesterolemia in a rhesus monkey pedigree: Molecular basis of LDL receptor deficiency// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990;87:3122-26

75. Scanu, A. M., Khalil, A., Neven, L., Tidore, M., Dawson, G., et al. Genetically determined hypercholesterolemia in a rhesus monkey

family due to a deficiency of the LDL receptor// J. Lipid Res. 1988;29:1671-81

76. Hemminger, D. D., Gerritsen, M. E., Granger, D. N., Low-density lipoprotein receptor Knockout mice exhibit exagerated microvascular responses to inflammatory stimuli// Circ. Res. 1997;81:274-281.

77. Gauther, T. W., Scala, R., Murohara, T., Guo, J-P., Lefer, A. M. Nitric oxide protects against leukocyte-endothelium interactions in the early stages of hypercholesterolemia// Arterioscler Thromb Vase Biol.1995;15:1652-1659

78. Masayuki Yokode, Robert E. Hammer, Shun Ishibashi, Michel S. Brown, Joseph L. Goldstein. Diet-induced Hypercholesterolemia in mice: Prevention by overexpression of LDL receptors// Science 250:1273-1275,1990.

79. Hobbs, H. H. et al. Molecular genetics of the receptor gene in familial hypercholesterolemia// Human. Mutation. 1992;1:446-466.

80. Soutar, A. K. familial hypercholesterolemia and LDL receptor mutations// J. Intern. Med. 1992;231:63 3-641.

81. Loux, N., Benlian, P., Pastier, D., Boileau, c., Cambou, J. P., Monnier, L., Percheron, C., and Junien, C., Recurrent mutation at aa 792 in LDL receptor gene in a French patient// Hum. Genet. 1991;87:373-375

82. Armand V. Peeters et al. Mutational and genetic origin of LDL

i

receptor gene mutations detected in both Belgian and Dutch familial hypercholesterolemics// Hum. Genet. 1997;100:266-270.

83. Horsthemke, B., Beisiegel, U., Dunning, A., Havinga, J. R., Williamson, R., Humphries, S. Uniqual crossing-over between two Alu-repetiti ve DNA sequences in the low-density lipoprotein receptor gene. A possible mechanism for the defect in a patient with familial hypercholesterolemia. Eu. J. Biochem. 1987;164:77-81

84. Lehrman, M. A., Russell, D. W., Goldstein, J. L., Brown, M. S. AluAlu recombination deletes splice acceptor sites and produces secreted low density lipoprotein receptor in a subject with familial hypercholesterolemia// J. Biol. Chem. 1987;262:3354-61

85. Lehrman, M. A., Russell, D. W., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Exon-Alu recombination deletes 5 kilobases from the low density lipoprotein receptor gene, producing a null phenotype in familial hypercholesterolemia// Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1986;83:3679-83

86. Lehrman, M. A., Schneider, W. J., Sudhof, T. C., Brown, M. S. Goldstein, J. L., Russell, D. W. Mutation in LDL receptor: Alu-Alu recombination deletes exons encoding transmembrane and cytoplasmic domains// Science 1985; 227:140-10.

87. Leitersdorf, E., van der Westhuyzen, D. R., Coetzee, G. A., Hobbs, H. H. Two common low density lipoprotein receptor gene mutations cause familial hypercholesterolemia in Africaners// J. Clin. Invest. 1989;84:954-61.

88. Seftel, H. C., Baker, S. G., Jenkins, T., Mendelsohn, D. Prevalence of familial hypercholesterolemia in Johanesburg Jews// Am. J. Med. Genet. 1989;34:545-47

89. Henderson, H. E., Berger, G. M. B., Marais, A. D. A new LDL receptor gene deletion mutation in the South African population// Hum. Genet. 1988;80:371-74.

90. Lehrman, M. A., Schneider, W. J., Davis, C. G., Elhammer, A., et al. The Lebanese allele at the low density lipoprotein receptor locus: nonsense mutation produces truncated receptor that is retained in endoplasmic reticulum// J. Biol. Chem. 1987;262:401-410.

91. Oppenheim, A. Et al. Hypercholesterolemia in five Israeli christian-arab kindreds is caused by the "Lebanese" allele at the low density lipoprotein receptor gene locus and by an additional independent major factor// Hum. Genet. 1991;88:75-84

92. Beterd, C., et al. Molecular genetic evidence for a founder effect in familial hypercholesterolemia among French Canadians// Hum. Genet. 1992;88:529-536.

93. Hobbs, H. H., Brown, M. S., russell, D. W., Davignon, J., Goldstein, J. L., Deletion in the gene for the low density lipoprotein receptor in a majority of French Canadians with familial hypercholesterolemia// New Eng. J. Med. 1987;3 17:734-737

94. Jomphe, M., Bouchard, G., Davignion, J., De Braekleer, M., Gradie, M., et al. Familial hypercholesterolemia in Franch-Canadians: Geographical distribution and centre of origin of an LDL-receptor deletion mutation. Am. J. Hum. Genet. 1988; 43(supp):86la.

95. Kontula, K., Koivisto, U-M. ,Koivisto, P., and Turtola, H., Molecular genetics of familial hypercholesterolemia: common and

rare mutations of the low density lipoprotein receptor gene// Annals of Medecine. 1992;24:3 63-367.

96. Meiner, V. et al. A common Lithuanian mutation causing familial hypercholesterolemia in Ashkenazi jews// Am. J. Hum. Genet. 1991;49:443-449.

97. Leren, T. P. et al. Two founder mutations in the LDL receptor gene

in Norwegian familial hypercholesterolemia subjects// Atherosclerosis. 1994; 1 1 1:175-1 82.

98. Esser, V., Russell, D. W., Transport -deficient mutations in the low density lipoprotein receptor: alterations in the cysteine-rich and cysteine-poor regions of the protein block intracellular transport// J. Biol. Chem. 1988;263:13276-81.

99. Esser, V., Limbird, L. E., Brown, M. S., Goldstein, J. L., Russell, D.

W. Mutational analysis of the ligand binding of the low density lipoprotein receptor// J. Biol. Chem. 1988;263:13282-90.

100. Pathak, R. K. et al. Immunocytochemical localization of mutant low density lipoprotein receptors that fail to reach the golgi complex// J. Cell. Biol. 1988;106:1831-41.

101. Knight, B. L., Gavigan, S. J. P., Soutar , A. K., Patel, D. D. Defective processing and binding of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from a familial hypercholesterolemic subject//Eur. J. Biochem. 1989;179:693-98

102. Soutar, A. K., Knight, B. L., Patel, D. D. Identification of a point mutation in growth factor repeat C of the low density lipoprotein-receptor gene in a patient with homozygous familial

hypercholesterolemia that affects ligand binding and intracellular movement of receptors// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989;86: 416670.

103. Fourie, A. M., Van der Westhuyzen, D. R., Coetzee, G. A. LDL receptor mutations in South African FH patients. Atherosclerosis IX. Ed. By O. Stein, S. Eisenberg, Y. Stein. Tel Aviv, Israil:R.a.L. creative communications Tld. 1992. P.153-156.

104. Miyake, Y., Tajima, S., Finahashi, T., Yamamoto, A. Analysis of a recycling-impaired mutant of the low density lipoprotein receptor in familial hypercholesterolemia// J. Biol. Chem. 1989;264:16584-90

105. Russell, D. W., Lehrman, M. A., Sudhorf, T. C., Yamamoto, T., Davis, C. G., et al. The LDL receptor in familial hypercholesterolemia: Use of the human mutations to dissect a membrane protein// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1987;51:811-819.

106. Joseph L. Goldstein and Michael S. Brown, Binding and degradation of low density lipoproteins by cultured human phybroblasts: Comparaison of cells from a normal subject and from a patient with homozygous familial hypercholesterolemia// The Journal of Biological Chemistry -1974;249,16:5 1 53-5 162.

107. Bruce Middleton and Alya Middleton, Cyclyc AMP stimulates the synthesis and function of the low density lipoprotein receptor in human vascular smooth-muscle cells and fibroblasts// Biochem J -1992;282:853-861.

108.Soph ie Delattre et al. LDL receptor deficiency determined on Epstein-Barr virus transformed lymphocytes// Methods in Molecular and Cellular Biology -1991- 2:221-227.

109. Paola Lombardi et al. Characterisation of the LDL receptor in Epstein-Barr virus transformed lymphocytes// Biochimica et Biophysica acta -1990;1044:127-132.

110. Savolinen, M. J., et al. Screening for a prevalent LDL receptor mutation in patients with severe hypercholesterolemia// Hum. Gen. 1991;87:125-128.

111. Gundersen, К. E. Two novel missence mutations in the LDL receptor gene causing familial hypercholesterolemia// Clin Genet 1996;49:85-87.

112. В. H. Горбунова, В. С. Баранов ВВедение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.-СПб.:<<Специальная Литература>>, 1997.-287 е.: илл.

ISBN 587685-076-4.

113. Orita, М., Iwahana, Н., Kanazawa, Н., Hayashi, К., and Sekiya, Т. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms// Proc. Natl.Acad. Sci. USA.1989; 86:2766-70.

114. Orita, M., Suzuki, Y., Sekiya, Т., and Hayaki,K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction// Genomics. 1989;5:874.

115. Hayashi, K., PCR-SSCP: A simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA// PCR Methods Appl., 1 991 ; 1:34

116. Koga n S. C., Doherty M., GetscheierJ. An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplifiad DNA sequences// New England J. Med -1987;15:985-990.

117. Leren,T. P., et al. Evaluation of running conditions for SSCP analysis: application of SSCP for detection of point mutations in the LDL receptor gene// PCR Methods Appl. 1 993;3:1 59.

118. Glavac D., Dean M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations// Hum.Mutat. - 1 993;2,5 :404-41 4.

119. Markoff, A. et al. Optimization of single-strand conformation polymorphism analysis in the presence of polyethylene glycol// Clinical Chemistry. 1997; 43:30-33.

120. Fodde, R., Losekoot, M. Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis// Hum Mutât. 1 994;3 :83-94.

121. Nissen, H. et al. Genetic diagnosis with the denaturing gradient gel electrophoresis technique improves diagnostic precision in Familial hypercholesterolemia// Circulation. 1995;91:1641-46.

122. Cotton, R. G. H. detection of mutations in DNA and RNA by chemical cleavage// Methods in Molecular biology. 1990;7:3-12.

123. Cotton, R. G. H., Malcolm A.D.B. Mutation detection// Nature. 1991;353:582-583.

124. Grompe, M., The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids// Nature Genet. 1993;5:111-116.

125. Ngo, I.S.L., Pace, R., Richard, M.V. et al. Methods for analysis of multiple cystic fibrisis mutations// Hum Genet. 1991;87:613-617.

126. Landgren, U.N. ligation-based DNA diagnosis// BioAssays. 1993;15:761-765.

127. Reiss J. Polymerase chain reaction and its potential role in clinical diagnostics and research// J. Intern. Med. 1991;230:391-395.

128. Iitia, A. Et al. Detection of a point mutation using short oliginucleotide probes in allele-specific hybridisation// Biotechniques. 1994;17:566-573.

129. Kimmo Kontula, Ulla-Maija Koivisto, Helena Miettinen, The use of PCR in diagnosing lipoprotein disorders// Ann Med 24:195-199.

130. Saiki R.K. et al. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989;86:6230-6234.

131. Denisenko A.D., Kuznetsov A.S., Vinogradov A.G., Parfenova N.S., Magracheva Eya, Dizhe E.B., Pivovarova Yu.I., Sitnicova O.D., Noskin V.A., Vavrin R.Z., Voziyan P.A., Omel'yanenko V.G., Sungurov A.Yu., krivoruchenko I.V., Klimov A.N. Low density lipoproteins of patients with ischemic heart disease. Certain physico-chemical and biological properties// Phys. Chem. Biol. Med. 1993;1:37-44.

132. Lahiri D.K., Bye S., Nürnberger J.I.Jr. et al. // J. Biol.Chem. and Biophys. Methods. 1992;25:193-205.

133. Hobbs H.H., Brown M.S., Goldstein J.L., Molecular genetics of the LDL receptor gene in familial hypercholesterolemia// Hum Mutation 1992;1:445-466.

134. J. Sambrook, E. F. Fritsh, T. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1992.

135.R. Boom, C. J. A. Sol, M. M. M. Salimans, C. L. Jensen, P. F. E. Wertheim-van Dillen, andJ. Van der NOORDAA, Rapid and simple method for purification of nucleic acids// Journal of Clinical Micribiology, 1990;28,3:495-503.

136.Michael A. Innis, Kenneth B. Myambo, David H, Gelfand and Mary Ann D. Brow. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988;85:9436-9440.

137. Mandelshtam, M. J., Lipovetskyi, В. M., Schwartzman, A. L., Gaitskhoki, V. S. A novel deletion in the low density lipoprotein receptor gene in a patient with familial hypercholesterolemia from Petersburg// Hum Mutations. 1993;2:256-260.

138. Бочков И. П. Перспективые медицинской генетики. Совместное издание СССР-НРБ-ВНР-ГДР-ПНР-ЧССР. - Медицина, 1982, 400 е., ил.

139.Kimberly A. Dirlam-Schatz and Alan D. Attie, Calcium induces a conformational change in the ligand binding domain of the low density lipoprotein receptor// J. Lipid Res. 1998;39:402-411.

140. Chakir Kh., Natalia A. Skobeleva, Sergei P. Shevtsov, Vladimir O. Konstantinov, Alexander D. Denisenko, and Eugene Shwartz, Two

novel Slavic point mutations in the low-density lipoprotein receptor gene in patients with familial hypercholesterolemia from St-Petersburg, Russ ia// Molecular Genetics and Metabolism 1998, 63:31-34.

141 .Bonne-Tamir B., Ashbel S., Kenett R. (1979) Genetic markers: benign and normal traits of Ashkenazi Jews. In: Goodman RM, Motulsky AG (eds) Genetic diseases among Ashkenazi Jews, Raven, New York, pp59-76.

142. 142. Ankori Z.(1979) Origins and hystory of Ashkenazi Jewry (8th to 18th century) In: Goodman RM, Motulsky AG (eds) Genetic diseases among Ashkenazi Jews, Raven, New York, ppl9-46.

143. Gar J. (1971) Lithuania. In: Berman MM, Carlebach (eds) Judaica encyclopedia. Keter, Jerusalem, pp362-390.

144. Mikhail Mandelshtam, Khalid Chakir, Sergei Shevtsov, Valéry Golubkov, Natalia Skobeleva, Boris Lipovetsky, Vladimir Konstantinov, Alexander Denisenko, Vladimir Gaitskhoki, and Eugene Schwartz, Prevalence of lithuanian mutation among St-Petersburg Jews with familial hypercholesterolemia// Human Mutation 1998,12:255-258.

145.Simon N. et al. Phenotypic variation in homozygous familial hypercholesterolemia. A comparison of Chinese patients with the same or similar mutations in the LDL receptor gene in China or Canada.// Artherioscler Thromb Vase Biol. 1998;1 8:309-315.

146.Kimiko Yamakawa-kobayashi et al., Four new nucleotide sequence polymorphisms in the LDL receptor gene detected by SSCP analysis// Hum Genet 1993;92:76-78.

147. Warnich, L., Kotze, M. J., Langenhoven, E., Retief, A. E. Detection of a frequent polymorphism in exon 10 of the low-density lipoprotein receptor gene. Hum Genet. 1992;89:362.

148. Newton S.R. et al., Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutetion system (ARMS)// N.A.R. 1989;17:2503-2516.

149. David G. Wang et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome// Science 1998,280:1077-1081.

150. Robert S.J. Makar, Peter E. Lipsky, and Jennifer A. Cuthbert, Sterol-independent, Sterol respense element-dependent, regulation of low density lipoprotein receptor gene expression// J. Lipid Res. 1998;39:1647-1654.

151. Innerarity, T. L., Weisgraber, K. H., Arnold, K. S. Et al. Familial defective apolipoprotein B-100: low density lipoproteins with abnormal receptor binding. Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1987;86:6919-23.

152. Hubert Shuster, Friedrich C. Luft, Clinical criteria versus DNA diagnosis in heterozygous familial hypercholesterolemia. Is molecular diagnosis superior to clinical diagnosis? // Arterioscler Thrömb Vase Biol. 1998;1 8:33 1-332.