Способы получения, состав и цитостатические свойства искусственных везикул из CAR-T-клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Змиевская Екатерина Анатольевна

• Змиевская Екатерина Анатольевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Змиевская Екатерина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 САЯ-Т терапия

1.1.1 Адоптивная клеточная терапия САЯ-Т

1.1.2 Механизм действия САЯ-Т-клеток

1.1.3 Побочные эффекты САЯ-Т терапии

1.2 Особенности САЯ-Т терапии солидных опухолей

1.2.1 Механизмы ускользания солидных опухолей от иммунного ответа

1.2.2 Особенности САЯ-Т терапии солидных опухолей

1.3 Внеклеточные везикулы

1.3.1 Общие сведения о внеклеточных везикулах

1.3.2 Терапевтический потенциал внеклеточных везикул

1.3.3 Т-клеточные внеклеточные везикулы

1.4 Везикулы из САЯ-Т-клеток как бесклеточный аналог терапии

1.5 Методы индукции образования везикул

1.5.1 Физиологические методы

1.5.2 Химические методы

1.5.3 Физические методы

1.6 Заключение по обзору литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение и экспансия культуры первичных Т-клеток человека

2.2 Работа с клеточными линиями

2.3 Получение САЯ-Т-клеток

2.3.1 Наработка плазмидных конструкций

2.3.2 Очистка плазмидных конструкций

2.3.3 Наработка лентивирусного вектора в культуре НБК293ЕТ методом транзиентной трансфекции

2.3.4 Очистка и концентрирование лентивирусного вектора

2.3.5 Трансдукция Т-лимфоцитов

2.4 Проточная цитометрия

2.5 Получение везикул

2.5.1 Получение естественных внеклеточных везикул

2.5.2 Получение искусственных везикул

2.5.3 Очистка препаратов везикул

2.6 Характеристика везикул

2.6.1 Анализ траектории наночастиц

2.6.2 Атомно-силовая микроскопия

2.6.3 Сканирующая электронная микроскопия

2.6.4 Измерение общего количества белка

2.6.5 Вестерн-блот анализ содержания белков

2.6.6 Флуорометрический анализ

2.7 Оценка цитостатических свойств искусственных везикул

2.7.1 Биосенсорный клеточный анализ в режиме реального времени

2.7.2 ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией

2.8 Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Получение искусственных везикул из Т-лимфоцитов периферической крови здорового донора и оценка их количественных и качественных характеристик

3.1.1 Оценка количественного выхода из первичных Т-лимфоцитов, полученных различными методами индукции

3.1.2 Визуализация искусственных везикул из первичных Т-лимфоцитов, полученных различными методами индукции, с помощью атомно-силовой микроскопии, и исследование их механических свойств

3.1.3 Оценка содержания клеточных компонентов в искусственных везикулах, полученных различными методами из клеток линии БиР-Т1

3.1.4 Оценка содержания функционально значимых белков в искусственных везикулах, полученных различными методами из первичных Т-лимфоцитов

3.2 Получение искусственных везикул из САЯ-Т-клеток с помощью ультразвука и исследование их свойств

3.2.1 Получение САЯ-Т-клеток

3.2.2 Исследование свойств искусственных везикул, полученных из САЯ-Т-клеток с помощью ультразвука

3.2.3 Исследование влияния искусственных везикул, полученных из САЯ-Т-клеток с помощью ультразвука, на пролиферацию опухолевых клеток методом биосенсорного клеточного анализа в режиме реального времени

3.2.4 Исследование уровня экспрессии про-апоптотических генов в опухолевых клетках под действием искусственных везикул, полученных из CAR-T-клеток с помощью ультразвука

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Способы получения, состав и цитостатические свойства искусственных везикул из CAR-T-клеток»

Актуальность работы и степень разработанности темы

В 2021 году в мире было зарегистрировано более 20 млн. новых случаев онкологических заболеваний. При этом злокачественные новообразования остаются одной из лидирующих причин смертности населения, несмотря на успехи в разработке современных методов профилактики, ранней диагностики и терапии [Sung et al., 2021].

Полученные данные акцентируют необходимость разработки и внедрения инновационных терапевтических стратегий, направленных на эффективное противодействие растущей заболеваемости онкологическими патологиями и их устойчивости к существующим методам лечения. Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является клеточная иммунотерапия, которая продемонстрировала значительные достижения в клинической практике [Wagner et al., 2020].

Терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T терапия) - одна из самых перспективных ветвей современной клеточной иммунотерапии. Будучи успешно применяемой в клинической практике для лечения онкогематологических CD19+ и BCMA+ опухолей, в лечении солидных новообразований CAR-T терапия пока показывает существенно более скромные результаты. Для этого существует ряд объективных причин, среди которых можно выделить [Wagner et al., 2020, Киселевский и др., 2019]:

1) ограничение миграции и инвазии Т-клеток в ткань солидных опухолей из-за сложного строения и повышенной плотности опухолевой стромы. В связи с чем предпочтителен поиск клеточных и субклеточных агентов (например, внеклеточные везикулы), способных активнее проникать в плотную опухолевую строму в силу меньшего размера по сравнению с клетками;

2) иммуносупрессивное опухолевое микроокружение (ингибиторные рецепторы, нехватка нутриентов, иммуносупрессивные цитокины и клетки, локальная гипоксия, и т.д.). Данная проблема потенциально может быть

решена применением (суб)клеточного агента, устойчивого к перечисленным факторам, например внеклеточных везикул.

Таким образом, несмотря на значительные достижения в разработке новых подходов в области CAR-T терапии, её применение для лечения солидных опухолей остаётся ограниченным в связи с наличием биологических и физических барьеров, обусловленных особенностями опухолевого микроокружения и сложной структурой опухолевой ткани. В данном контексте актуальность приобретают субклеточные терапевтические агенты. Благодаря своим небольшим размерам, биосовместимости и способности переносить биологически активные компоненты исходных клеток, они рассматриваются как перспективная альтернатива или дополнение к клеточным технологиям. Эти наноразмерные структуры обладают потенциалом для преодоления плотных опухолевых барьеров и сохранении терапевтической активности, что делает их важным инструментом для решения ключевых проблем, связанных с применением CAR-T терапии.

Внеклеточные везикулы (ВВ) - группа различных по механизму образования, составу и свойствам частиц, высвобождаемых клетками, ограниченных липидным бислоем и не способных к самостоятельной реплицикации. Внеклеточные везикулы несут в составе компоненты исходных клеток и играют важную роль в межклеточной коммуникации как в норме, так и при патологии. На сегодняшний день внеклеточные везикулы подробно изучаются как маркеры заболеваний или терапевтические агенты [Yang et al., 2024]. На основании происхождения, структуры и состава внеклеточные везикулы могут подразделяться на множество подтипов, среди которых наиболее распространенной классификацией является разделение на экзосомы, микровезикулы и апоптотические тела. Экзосомы имеют размерность 50-150 нм и внутриклеточное происхождение из эндосом и мультивезикулярных телец. Микровезикулы образуются путем отщепления клеточной мембраны и

достигают 1000 нм. Апоптотические тела образуются в ходе фрагментации клетки при апоптозе и их размер составляет 1000-5000 нм [Kumar et al., 2024].

Исследования терапевтического потенциала внеклеточных везикул составляют большое и активно развивающееся направление биомедицины. Например, микровезикулы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) показали впечатляющие результаты в сфере регенеративной медицины [Phinney et al., 2017]. Достаточно изученным примером в иммунологии являются внеклеточные везикулы, продуцируемые дендритными клетками, способные презентовать антигены Т-клеткам и вызывать развитие адаптивного иммунного ответа [Kowal et al., 2019]. Так, например, в НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта ведутся работы по изучению микровезикул, полученных из NK-клеток и их способности через взаимодействие с эндотелиальными клетками потенцировать формирование сосудов [Markova et al., 2020].

Применение внеклеточных везикул, в частности, например, экзосом, полученных из CAR-T-клеток, представляет большой научный интерес в качестве перспективного терапевтического подхода для лечения солидных новообразований. Так, например, показано, что по сравнению с CAR-T-клетками, CAR-T-экзосомы не экспрессируют PD1, и их противоопухолевый эффект не может быть ослаблен применением препаратов на основе PD-L1. Кроме того, в in vivo модели синдрома высвобождения цитокинов ("синдром цитокиного шторма", СЦШ) ранее было продемонстрировано, что введение CAR-T-экзосом является более безопасным по сравнению с CAR-T терапией [Calvo et al., 2022].

Однако несмотря на то, что ряд разработок на основе ВВ достигли клинических исследований, основным препятствием к внедрению таких препаратов является отсутствие масштабируемой стандартизованной технологии производства. Так, например, при исследовании противоопухолевых везикул in vivo на мышах, применяются дозировки до 2-3 мг/кг веса (по общему белку) или дозы порядка 1012 частиц/кг веса. В клинических исследованиях на сегодняшний день тестируются многократно вводимые дозы в несколько сотен микрограмм или 108-109 частиц

[Gupta et al., 2021]. При этом для Т-лимфоцитов оценка естественного уровня секреции внеклеточных везикул в плазме здорового донора составляет 50-100 частиц на родительскую клетку, что предполагает использование порядка 1010 родительских клеток на 1 кг веса для получения достаточного количества везикулярного препарата [Auber et al., 2022]. В связи с этим, с целью поиска метода получения ВВ с высоким и стабильным выходом исследуется множество способов индукции образования везикул - как естественных (пассивная секреция, активация клеток), так и стрессовых (голод, гипоксия, механическое воздействие, химические агенты, температурный шок) [Xu et al., 2021].

В то же время, все проведенные на сегодняшний день исследования внеклеточных везикул, полученных из CAR-Т-клеток, используют естественно секретированные или физиологически индуцированные микровезикулы или экзосомы, которые технологически сложно получить в достаточном для клинического применения количестве.

Таким образом, актуальной является задача разработки метода получения искусственных CAR-T-везикул с высоким выходом конечного продукта и достаточной функциональной активностью для потенциального применения в качестве противоопухолевого препарата. Термин «искусственные везикулы» принят здесь и далее для обозначения внеклеточных везикул, полученных in vitro с помощью не физиологического, а химического или физического, в том числе разрушающего воздействия, согласно рекомендациям MISEV 2023.

Проблема, на решение которой направлена работа

Научная проблема, на решение которой направлена работа, заключается в отсутствии эффективного метода получения биомедицинского субклеточного препарата, представляющего собой биоподобные искусственные везикулы из CAR-T-клеток с антиген-специфическими цитостатическими свойствами.

Цель: подобрать оптимальный способ получения искусственных везикул из CAR-T-клеток и охарактеризовать их состав и цитостатическую активность.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) Сравнить методы индукции на основе цитохалазина В и ультразвукового воздействия для получения искусственных везикул из T-клеток путем характеристики количественного выхода, размеров и содержания мембранных, ядерных и цитоплазматических белков в составе искусственных везикул;

2) Исследовать содержание функционально значимых T-клеточных белков CD3, Гранзим В, HLA II в составе искусственных везикул, полученных из первичных Т-клеток с использованием методов индукции на основе цитохалазина В и ультразвукового воздействия;

3) Визуализировать искусственные везикулы, полученные из CAR-T-клеток с использованием ультразвуковой индукции, оценить их размер, а также наличие на поверхности везикул белка CAR;

4) Исследовать влияние искусственных CAR-T-везикул на экспрессию про-апоптотических генов и пролиферативную активность линий рака предстательной железы PC3M и эпидермальной карциномы A431, а также линий PC3M (CD19+) и A431(CD19+), эктопически экпрессирующих антиген CD19.

Научная новизна работы

Современные подходы к получению внеклеточных везикул из CAR-T-клеток сталкиваются с существенными ограничениями, которые препятствуют их широкому применению в биомедицине. В частности, естественная секреция везикул, характерная для Т-лимфоцитов, не обеспечивает достаточного уровня выхода продукта, что делает их производство в масштабах, необходимых для клинического применения, крайне затруднительным. Более того, функциональная активность таких везикул остаётся недостаточной для обеспечения их высокой терапевтической эффективности. Задача увеличения количественного выхода везикул до практически значимых показателей, а также оптимизация технологий их полупромышленного и промышленного

производства продолжают оставаться нерешёнными и требуют комплексного научного подхода [Del Vecchio et al., 2021].

В настоящей работе впервые реализованы методы химической индукции образования внеклеточных везикул с использованием цитохалазина В, а также индукции ультразвуковым воздействием для первичных Т-лимфоцитов и CAR-T-клеток. Проведено всестороннее исследование полученных везикул, охватывающее количественный анализ выхода, детальное изучение их состава и функциональных характеристик. Полученные результаты подтверждают возможность создания эффективных и масштабируемых технологий производства высокоактивных внеклеточных везикул из CAR-T-клеток для потенциального клинического применения.

Теоретическая и практическая значимость работы

В рамках настоящего исследования внесён существенный вклад в развитие теоретических основ получения искусственных CAR-T-везикул. Впервые реализованы и апробированы методы химической и ультразвуковой индукции, что позволило углубить понимание механизмов образования внеклеточных везикул и их функциональных свойств. Полученные данные расширяют современные представления о возможностях использования везикулярных препаратов из CAR-T-клеток, дополняя существующие научные знания в области клеточной и бесклеточной терапии.

Практическая значимость работы заключается в разработке и оптимизации эффективных подходов к получению искусственных CAR-T-везикул, что открывает перспективы для их масштабируемого производства. Предложенные методики могут быть адаптированы для создания новых терапевтических препаратов, а также применены в исследованиях, направленных на изучение везикулярных систем. Таким образом, результаты исследования формируют основу для дальнейшего внедрения полученных технологий в производство и клиническую практику.

Методология и методы исследования

В рамках данной работы применены современные методы всесторонней характеристики внеклеточных везикул в соответствии с рекомендациями Международного сообщества внеклеточных везикул (ISEV), изложенными в руководстве MISEV2018 (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018) [Thery et al., 2018].

На первом этапе исследования были протестированы различные подходы к индукции внеклеточных везикул из немодифицированных Т-лимфоцитов: активация анти-CD3/CD28 антителами, химическая индукция цитохалазином В, физическое воздействие ультразвуком, а также их комбинация. Полученные искусственные везикулы подвергались анализу с использованием ряда биохимических и биофизических методов для определения количественного выхода и качественного состава. Для этого использовались методы анализа траекторий наночастиц, атомно-силовая микроскопия, флуорометрический анализ и иммуноблоттинг.

На втором этапе исследования были изучены свойства искусственных везикул, полученных из CAR-T-клеток. Для их характеристики применялись следующие методы: визуализация с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); оценка экспонирования CAR-рецептора методом проточной цитофлуориметрии; исследование антиген-специфических цитостатических свойств с применением биосенсорного клеточного анализа в режиме реального времени; оценка экспрессии проапоптотических генов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в опухолевых клетках, обработанных искусственными везикулами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методы индукции на основе цитохалазина В и ультразвукового воздействия позволяют получить искусственные везикулы из Т-клеток, при этом ультразвуковая индукция приводит к получению наибольшего

количества везикул, содержащих в составе функционально значимые клеточные белки CD3, Гранзим В, HLA II.

2. Искусственные CAR-T-везикулы, полученные методом ультразвукового воздействия, обладают цитостатической активностью в отношении клеток линии рака предстательной железы PC3M(CD19+) и эпидермальной карциномы A431(CD19+), эктопически экпрессирующих антиген CD19.

Достоверность и апробация результатов исследования

Достоверность полученных результатов обеспечена

воспроизводимостью экспериментов, а также применением современных методов статистической обработки данных для их анализа.

Результаты исследования были представлены на ряде научных мероприятий, включая Всероссийскую конференцию «III Объединённый научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов», 2-й саммит разработчиков лекарственных препаратов «Сириус.Биотех», 3-ю Всероссийскую школу-конференцию с международным участием «Биохимия - основа наук о Жизни» памяти В. Г. Винтера.

Проект был высоко оценён профессиональным сообществом и стал победителем конкурса CoLaborator (Russia) фармацевтической компании Bayer в 2021 году, что подтверждает его научную и практическую значимость.

Публикация результатов исследования

По теме исследования опубликовано 7 печатных работ, из них 4 статьи, индексируемых Scopus и Web of Science, и 3 тезисов докладов в сборниках международных и всероссийских конференций.

Место выполнения и личный вклад диссертанта

Диссертационная работа выполнена на базе научно-исследовательских лабораторий «Индустриальная биофармацевтика», «Биомедицинские технологии» и кафедры биохимии, биотехнологии и фармакологии Института фундаментальной медицины и биологии, а также с привлечением специалистов и оборудования Химического Института им. А.М. Бутлерова

(для исследования везикул методом анализа траектории наночастиц) и Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» (для проведения атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии везикул) Казанского (Приволжского) федерального университета. Автор лично планировала и проводила экспериментальные исследования (лично -получение Т- и CAR-T-клеток, индукция образования везикул, проведение флуорометрического анализа, проточная цитометрия, биосенсорный клеточный анализ в режиме реального времени, ОТ-ПЦР-РВ; в составе коллектива - получение лентивирусного вектора, вестерн-блот анализ, пробоподготовка образцов для микроскопии), осуществляла статистическую обработку данных и анализировала полученные результаты, принимала активное участие в написании статей.

Связь работы с базовыми научными программами

Настоящее исследование выполнено в рамках программы стратегического академического лидерства «Приоритет-2030» Казанского (Приволжского) федерального университета. Полученные результаты послужили основой для развития смежного направления исследований, поддержанного грантом Российского научного фонда №23-24-00224 «Исследование свойств микровезикул из Т-регуляторных лимфоцитов в контексте рассеянного склероза». Это подчеркивает вклад работы в расширение фундаментальных знаний и междисциплинарных исследований, направленных на изучение внеклеточных везикул и их терапевтического потенциала.

Структура и объем диссертационной работы

Работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, список сокращений и список литературы. Текст изложен на 140 страницах, включает 40 рисунков, 6 таблиц и 149 источника литературы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 CAR-T терапия

1.1.1 Адоптивная клеточная терапия CAR-T

Наряду с классическими методами терапии онкологических заболеваний, такими как хирургия, химиотерапия, радиотерапия и таргетная терапия, иммунотерапия на сегодняшний день признается «пятым столпом» онкотерапии. Спектр иммунотерапевтических препаратов широк, и включает в себя, например, ингибиторы контрольных точек, противоопухолевые вакцины и CAR-T терапию. Клеточная иммунотерапия прошла путь развития от начала лечения лейкемии трансплантацией костного мозга в 1960г, через использование лимфокин-активированных киллеров для терапии метастаз в 1984г, с началом генетической модификации лимфоцитов в 1992г, до одобрения применения в клинике первого CAR-T препарата для лечения рецидивирующей и устойчивой к терапии лимфомы в 2017 году [Singh, 2020]. На сегодняшний день в клинической практике применяется семь CART препаратов: Kymriah (Novartis), Yeskarta (Kite Pharma), Tecartus (Kite Pharma), Breyanzy (Bristol-Myers Squibb), Abecma (Bristol-Myers Squibb), Carvykti (Janssen Biotech) и Carteyva (JW Therapeutics) [Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов [сайт] URL: https://www.fda.gov]. Кроме того, проводится множество терапий пациентов в рамках клинических исследований и госпитальных исключений [Гаврилина и др., 2022; Конопля и др., 2023; Малахова и др., 2024].

Адоптивная клеточная терапия — это подход, использующий свойства иммунных клеток для противодействия опухолевым клеткам. CAR-T-клетки это генетически модифицированные T-лимфоциты для экспрессии CAR (химерный антигенный рецептор). Химерный антигенный рецептор представляет собой химерный белок, состоящий из нескольких доменов: внешний - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела, распознающий опухолевый антиген, трансмембранный домен, и несколько внутриклеточных сигнальных доменов. В

зависимости от набора эндодоменов выделяют несколько поколений CAR. В первом поколении присутствовал только CD3Z домен для активации клетки в ответ на распознавание антигена, однако такие CAR-T показали небольшую клиническую эффективность. Рецепторы второго и третьего поколения включали дополнительные ко-стимуляторные домены, например, CD28 или 4-1BB, или их комбинацию. Четвертое поколение CAR ко-экспрессирует дополнительные эффекторные молекулы, например, цитокины [Kim et al. 2021].

На сегодняшний день, основным источником лимфоцитов для CAR-T терапии являются аутологичные клетки пациента (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Обобщенная схема производства CAR-T препарата. Т-лимфоциты выделяются из лейкаферезного продукта, активируются, модифицируются для экспрессии CAR, размножаются ex vivo и затем подготавливаются для введения пациенту. В обязательном порядке проводится полный контроль качества препарата, включающий параметры чистоты, безопасности и эффективности [адаптировано из Gene and Cellular Immunotherapy for Cancer, 2022]

Фракция мононуклеаров периферической крови либо выделяется на производстве из цельной крови, либо поставляется в виде лейкаферезного продукта. Далее, в зависимости от протокола, клетки могут быть очищены

путем элютриации или подвергнуты магнитной сепарации для выделения конкретных популяций T-лимфоцитов (например, CD3+, CD4+, CD8+ и т.д.). Затем следует активация Т-клеток с помощью антител к CD3 и CD28. После этого клетки генетически модифицируют для экспрессии CAR.

Наиболее популярным и одобренным для клинического применения является метод лентивирусной трансдукции, благодаря сочетанию высокой изученности, относительно высокой эффективности и безопасности. Однако исследуется возможность использования и невирусных методов доставки, таких как транспозоны Sleeping Beauty и piggyBac. Кроме того, разрабатываются системы получения CAR-T-клеток in vivo, например, введением в организм наночастиц-носителей генетической конструкции или лентивирусных частиц. Заключительным этапом производства является экспансия полученных CAR-T до необходимого количества, после чего клетки подготавливаются к введению пациенту, проходя стадии тщательной отмывки, заключения в специализированный буфер и контроль качества [Abou-el-Enein et al., 2021].

1.1.2 Механизм действия CAR-T-клеток

После введения в организм пациента, обычно внутривенным путем, CAR-T-клеткам необходимо мигрировать в сторону опухолевого очага. В случае с онкогематологическими заболеваниями, это не представляет трудностей, в связи с чем именно в терапии гематологических опухолей CAR-T демонстрируют наибольшие успехи [Norelli et al., 2016].

CAR-T-клетки, в отличие от нативных Т-лимфоцитов, распознают опухолевый антиген без его презентации в комплексе с главным комплексом гистосовместимости (HLA II). Однако после такого распознавания CAR-T-клетки также формируют иммунологический синапс, несколько отличный от формируемого вокруг Т-клеточного рецептора (ТКР). Во-первых, синапс вокруг CAR отличается значительно меньшим диаметром, что приводит к более быстрому «отсоединению» CAR-T-клеток от опухолевых клеток. В то же время, такой синапс отличается малоупорядоченным расположением

кластеров протеинкиназы Lck. Кроме того, показано ускоренное ингибирование протеинкиназы С - 5, что приводит к более быстрой передаче сигнала от рецептора. В дополнение продемонстрировано, что у CAR-T синапс характеризуется ускоренной доставкой литических гранул и более быстрым уничтожением целевых клеток [Benmebarek et al, 2019].

Цитотоксическая функция лимфоцитов связана с двумя основными путями: экзоцитозом цитотоксических гранул, несущих перфорин и гранзимы, и экспрессией мембранных лигандов семейства факторов некроза опухоли (ФНО), индуцирующих апоптоз после контакта с соответствующим рецептором. Дегрануляция представляет собой быстродействующий кальций-зависимый механизм, в то время как экспрессия ФНО - долгосрочный [Meiraz et al., 2009]. Для обеспечения точности действия литические гранулы выбрасываются в полость иммунологического синапса при участии микротрубочек цитоскелета эффекторной клетки в составе мембранных пузырьков - везикул. Перфорин обеспечивает образование пор в мембране целевой клетки для доставки внутрь гранзимов, которые, в свою очередь, индуцируют апоптоз как каспаз-зависимым, так и независимым путем. Для CAR-T-клеток данный механизм является ведущим (Рисунок 2) [Benmebarek et al, 2019].

Кроме того, существуют работы, демонстрирующие антиген-независимые цитотоксические функции CAR-T за счет использования контактного Fas-FasL механизма, индуцирующего апоптоз через активацию каспаз. FasL появляется на поверхности CAR-T-клеток после активации при распознавании антигенов и позволяет уничтожать соседние опухолевые клетки, даже если они не несут на своей поверхности целевой антиген [Hong et al., 2018].

Важным дополнительным механизмом эффекторных свойств CAR-T-клеток является секреция цитокинов, таких как ИФНу. При этом ИФНу воздействует не только непосредственно на опухолевые клетки, но также и на клетки опухолевой стромы, способствуя их разрушению, и на иммунные клетки, например макрофаги, направляя их поляризацию в М1-противоопухолевый фенотип [Benmebarek et al, 2019].

Рисунок 2 - Основной механизм цитотоксического действия CAR-T-клетки. При распознавании опухолевого антигена CAR запускает внутриклеточный сигнальный каскад за счет эндодоменов, приводящий к активации Т-лимфоцита и выбросу в межклеточное пространство литических гранул с перфорином и гранзимом. Перфорин формирует в мембране опухолевой клетки поры, обеспечивая доставку гранзима, запускающего апоптоз. ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) - Мотив активации иммунорецептора на основе тирозина; ZAP70 (Zeta-chain-associated protein kinase 70) - Протеинкиназа, ассоциированная с зета-цепью -70); scFv (Single-chain variable fragment) - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела [адаптировано из Larson et al., 2021]

1.1.3 Побочные эффекты CAR-T терапии

Два основных побочных явления, возникающих при применении CART терапии - синдром цитокинового шторма и нейротоксичность.

СЦШ чаще всего манифестирует у пациентов в первую неделю после терапии, проявляясь жаром, гипотензией, дыхательной недостаточностью и высоким уровнем цитокинов в крови. Нейротоксичность проявляется временной потерей памяти, потерей сознания, судорогами, делирием и в тяжелых случаях -отеком мозга. В ряде случаев при развитии полиорганной недостаточности побочные эффекты оказываются жизнеугрожающим состоянием. Несмотря на то, что и СЦШ, и нейротоксичность связаны с чрезмерно быстрой активацией Т-клеток и секрецией провоспалительных цитокинов, механизмы возникновения этих эффектов различны [Larson et al., 2021].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Змиевская Екатерина Анатольевна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Валиуллина, А. Х. Оценка цитотоксичности CAR-T-клеток против модели карциномы предстательной железы / А. Х. Валиуллина, Е. А. Змиевская, А. Р. Рахматуллина [и др.] // Ученые записки казанского университета. Серия: естественные науки. - 2022. - Т. 164, N 2. - C. 212-230.

2. Гаврилина, О. А. Терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором взрослых больных В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями / О. А. Гаврилина, Г. М. Галстян, А. Е. Щекина [и др.] // Гематология и трансфузиология. - 2022. - Т. 67, N 1. - C. 8-28.

3. Киселевский, М. В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-Т-клеток) для терапии солидных опухолей / М. В. Киселевский, И. О. Чикилева, С. М. Ситдикова [и др.] // Иммунология. - 2019. - Т. 40, N 4. - C. 48-55.

4. Конопля, Н. Е. Применение локально изготовленных анти-CD19 CAR-T-клеток в лечении рефрактерных/рецидивирующих в-клеточных лимфом у взрослых [и др.] / Н. Е. Конопля, О. А. Каленик, И. Н. Северин // Онкогематология. - 2023. - Т. 18, N 3. - С. 26-34.

5. Малахова, Е. А. Сравнительная характеристика клеточного состава и функциональных свойств анти-CD19-биомедицинских клеточных продуктов, произведенных с помощью платформ Clinimacs Prodigy и G-REX / Е. А. Малахова, Д. Е. Першин, В. А. Ведмедская [и др.] // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2024. - Т. 23, N 2. - C. 128-139.

6. Abels, E. R. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake / E. R. Abels, X. O. Breakefield // Cellular and Molecular Neurobiology. - 2016. - Vol. 36, N 3. - P. 301-312.

7. Abou-el-Enein, M. Scalable Manufacturing of CAR T Cells for Cancer Immunotherapy / M. Abou-el-Enein, M. Elsallab, S. A. Feldman [et al.] // Blood Cancer Discovery. - 2021. - Vol. 2, N 5. - P. 408-422.

8. Afonina, I. S. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme B: Granzyme B in apoptosis and inflammation / I. S. Afonina, S. P. Cullen, S. J. Martin // Immunological Reviews. - 2010. - Vol. 235, N 1. - P. 105-116.

9. Alfonso, C. Nonclassical MHC class II Molecules / C. Alfonso, L. Karlsson // Annu. Rev. Immunol. - 2000. - N 18. - P.113-142

10. Ambattu, L. A. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism / L. A. Ambattu, S. Ramesan, C. Dekiwadia, E. [et al.] // Communications Biology. -2020. - Vol. 3, N 1. - P. 553.

11. Anichini, A. Immune Escape Mechanisms in Non Small Cell Lung Cancer / A. Anichini, V. E. Perotti, F. Sgambelluri [et al.] // Cancers. - 2020. -Vol. 12, N 12. - P. 3605.

12. Anikeeva, N. Efficient killing of tumor cells by CAR-T cells requires greater number of engaged CARs than TCRs / N. Anikeeva, S. Panteleev, W. Mazzanti [et al.] // J. Biol. Chem. - 2021. - Vol. 297. - N 3. - 101033.

13. Areny-Balagueró, A. Bioengineered extracellular vesicles: future of precision medicine for sepsis / A. Areny-Balagueró, A. Solé-Porta, M. Camprubí-Rimblas [et al.] // Intensive Care Medicine Experimental. - 2023. - Vol. 11, N 1. - P. 11.

14. Auber, M. An estimate of extracellular vesicle secretion rates of human blood cells / M. Auber, P. Svenningsen // J Extracell Biol. - 2022. - Vol. 1, N 6. - e46.

15. Aubertin, K. Massive release of extracellular vesicles from cancer cells after photodynamic treatment or chemotherapy / K. Aubertin, A. K. A. Silva, N. Luciani [et al.] // Scientific Reports. - 2016. - Vol. 6, N 1. - P. 35376.

16. Aubrey, B. J. Tumor-Suppressor Functions of the TP53 Pathway / B. J. Aubrey, A. Strasser, G. L. Kelly // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2016. - N 6. - a026062.

17. Bagheri, H. S. Low-level laser irradiation at a high power intensity increased human endothelial cell exosome secretion via Wnt signaling / H. S. Bagheri, M. Mousavi, A. Rezabakhsh [et al.] // Lasers in Medical Science. - 2018. - Vol. 33, N 5. - P. 1131-1145.

18. Bahmani, L. Different Sourced Extracellular Vesicles and Their Potential Applications in Clinical Treatments / L. Bahmani, M. Ullah // Cells. -2022. - Vol. 11, N 13. - P. 1989.

19. Benmebarek, M. Killing Mechanisms of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells / M. Benmebarek, C. Karches, B. Cadilha [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - Vol. 20, N 6. - P. 1283.

20. Bianco, F. Astrocyte-Derived ATP Induces Vesicle Shedding and IL-1ß Release from Microglia / F. Bianco, E. Pravettoni, A. Colombo [et al.] // The Journal of Immunology. - 2005. - T. 174, № 11. - C. 7268-7277.

21. Blanchard, N. TCR Activation of Human T Cells Induces the Production of Exosomes Bearing the TCR/CD3/Z Complex / N. Blanchard, D. Lankar, F. Faure [et al.] // The Journal of Immunology. - 2002. - T. 168, № 7. - C. 3235-3241.

22. Bochmann, I. T lymphocytes export proteasomes by way of microparticles: a possible mechanism for generation of extracellular proteasomes / I. Bochmann, F. Ebstein, A. Lehmann [et al.] // Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2014. - Vol. 18, N 1. - P. 59-68.

23. Brakhage, A.A. Host-derived extracellular vesicles for antimicrobial defense / A. A. Brakhage, A. Zimmermann, F. Rivieccio [et al.] // microLife. -2021. - Vol. 2. - P. uqab003.

24. Brezgin, S. Hydroxychloroquine Enhances Cytotoxic Properties of Extracellular Vesicles and Extracellular Vesicle-Mimetic Nanovesicles Loaded with Chemotherapeutics / S. Brezgin, A. Kostyusheva, N. Ponomareva [et al.] // Pharmaceutics. - 2023. - Vol. 15, N 2. - P. 534.

25. Brudno, J. N. Recent advances in CAR T-cell toxicity: Mechanisms, manifestations and management / J. N. Brudno, J. N. Kochenderfer // Blood Reviews. - 2019. - Vol. 34. - P. 45-55.

26. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system / E. I. Buzas // Nature Reviews Immunology. - 2023. - Vol. 23, N 4. - P. 236-250.

27. Cabeza, L. Cancer therapy based on extracellular vesicles as drug delivery vehicles / L. Cabeza, G. Perazzoli, M. Peña [et al.] // Journal of Controlled Release. - 2020. - Vol. 327. - P. 296-315.

28. Calvo, V. T Lymphocyte and CAR-T Cell-Derived Extracellular Vesicles and Their Applications in Cancer Therapy / V. Calvo, M. Izquierdo // Cells. - 2022. - Vol. 11, N 5. - P. 790.

29. Casasola-LaMacchia, A. Human leukocyte antigen class II quantification by targeted mass spectrometry in dendritic-like cell lines and monocyte-derived dendritic cells / A. Casasola-LaMacchia, M. S. Ritorto, R. J. Seward // Sci Rep. - 2021. - Vol. 13, N 11. - 1028.

30. Céspedes, P.F. T-cell trans-synaptic vesicles are distinct and carry greater effector content than constitutive extracellular vesicles / P. F. Céspedes, A. Jainarayanan, L. Fernández-Messina [et al.] // Nature Communications. - 2022. -Vol. 13, N 1. - P. 3460.

31. Chao, O. S. The HDAC6 Inhibitor Tubacin Induces Release of CD133 + Extracellular Vesicles From Cancer Cells / O. S. Chao, T. C. Chang, M. A. Di Bella [et al.] // Journal of Cellular Biochemistry. - 2017. - Vol. 118, N 12. - P. 4414-4424.

32. Chaudhary, S. C. Phosphate induces formation of matrix vesicles during odontoblast-initiated mineralization in vitro / S. C. Chaudhary, M. Kuzynski, M. Bottini [et al.] // Matrix Biology. - 2016. - Vol. 52-54. - P. 284-300.

33. Chiou, N. Selective Export into Extracellular Vesicles and Function of tRNA Fragments during T Cell Activation / N. Chiou, R. Kageyama, K. M. Ansel // Cell Reports. - 2018. - Vol. 25, N 12.

34. Chou, C. K. Insight into mechanisms associated with cytokine release syndrome and neurotoxicity after CD19 CAR-T cell immunotherapy / C. K. Chou, C. J. Turtle // Bone Marrow Transplantation. - 2019. - Vol. 54, N S2. - P. 780-784.

35. Cobb, D. A. Cytokine Release Syndrome Biology and Management / D. A. Cobb, D. W. Lee // The Cancer Journal. - 2021. - Vol. 27, N 2. - P. 119-125.

36. Cosenza, M. Cytokine Release Syndrome Associated with T-Cell-Based Therapies for Hematological Malignancies: Pathophysiology, Clinical Presentation, and Treatment / M. Cosenza, S. Sacchi, S. Pozzi // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - Vol. 22, N 14. - P. 7652.

37. Couch, Y. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles / Y. Couch, E. I. Buzas, D. Di Vizio [et al.] // Journal of Extracellular Vesicles. - 2021. - Vol. 10, № 14. - P. e12144

38. Daniele, T. A Role for Rab7 in the Movement of Secretory Granules in Cytotoxic T Lymphocytes / T. Daniele, Y. Hackmann, A. T. Ritter [et al.] // Traffic. - 2011. - Vol. 12, N 7. - P. 902-911.

39. Del Vecchio, F. Professional killers: The role of extracellular vesicles in the reciprocal interactions between natural killer, CD8+ cytotoxic T-cells and tumour cells / F. Del Vecchio, V. Martinez-Rodriguez, M. Schukking [et al.] // Journal of Extracellular Vesicles. - 2021. - Vol. 10, N 6.

40. De Jaeghere, E. A. Fibroblasts Fuel Immune Escape in the Tumor Microenvironment / E. A. De Jaeghere, H. G. Denys, O. De Wever // Trends in Cancer. - 2019. - Vol. 5, N 11. - P. 704-723.

41. Eguchi, T. Cell Stress Induced Stressome Release Including Damaged Membrane Vesicles and Extracellular HSP90 by Prostate Cancer Cells / T. Eguchi, C. Sogawa, K. Ono [et al.] // Cells. - 2020. - Vol. 9, N 3. - P. 755.

42. Erwin, N. Enhancing the Cellular Production of Extracellular Vesicles for Developing Therapeutic Applications / N. Erwin, M. F. Serafim, M. He // Pharmaceutical Research. - 2023. - Vol. 40, N 4. - P. 833-853.

43. Estebanez-Perpina, E. Crystal Structure of the Caspase Activator Human Granzyme B, a Proteinase Highly Specific for an Asp-P1 Residue / E. Estebanez-Perpina, P. Fuentes-Prior, D. Belorgey [et al.] // Biological Chemistry. -2000. - Vol. 381, N 12. - P. 1203-1214

44. Evangelisti, C. The wide and growing range of lamin B-related diseases: from laminopathies to cancer / C. Evangelisti, I. Rusciano, S. Mongiorgi [et al.] // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2022. - Vol. 79, N 2. - P. 126.

45. Fukuta, T. Low level electricity increases the secretion of extracellular vesicles from cultured cells / T. Fukuta, A. Nishikawa, K. Kogure // Biochemistry and Biophysics Reports. - 2020. - Vol. 21. - P. 100713.

46. Furmanik, M. Endoplasmic Reticulum Stress Mediates Vascular Smooth Muscle Cell Calcification via Increased Release of Grp78 (Glucose-Regulated Protein, 78 kDa)-Loaded Extracellular Vesicles / M. Furmanik, R. Van Gorp, M. Whitehead [et al.] // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. - 2021. - Vol. 41, N 2. - P. 898-914.

47. Fu, W. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity / W. Fu, C. Lei, S. Liu [et al.] // Nature Communications. - 2019. - Vol. 10, N 1. - P. 4355.

48. Gao, J. Cell membrane-formed nanovesicles for disease-targeted delivery / J. Gao, D. Chu, Z. Wang // Journal of Controlled Release. - 2016. - Vol. 224. - P. 208-216.

49. Garcia Borrega, J. In the Eye of the Storm: Immune-mediated Toxicities Associated With CAR-T Cell Therapy / J. Garcia Borrega, P. Godel, M. A. Ruger [et al.] // HemaSphere. - 2019. - Vol. 3, N 2. - P. e191.

50. Garcia-Hernande, A. Linoleic acid induces secretion of extracellular vesicles from MDA-MB-231 breast cancer cells that mediate cellular processes involved with angiogenesis in HUVECs / A. Garcia-Hernandez, E. Leal-Orta, J. Ramirez-Ricardo [et al.] // Prostaglandins & Other Lipid Mediators. - 2021. - Vol. 153. - P. 106519.

51. Giavridis, T. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade / T. Giavridis, S. J. C. Van Der Stegen, J. Eyquem [et al.] // Nature Medicine. - 2018. - Vol. 24, N 6. - P. 731-738.

52. Gilazieva, Z. Comparative Analysis of Natural and Cytochalasin B-Induced Membrane Vesicles from Tumor Cells and Mesenchymal Stem Cells / Z. Gilazieva, D. Chulpanova, A. Ponomarev [et al.] // Current Issues in Molecular Biology. - 2022. - Vol. 44, N 11. - P. 5363-5378.

53. Glemain, A. Neutrophil-derived extracellular vesicles induce endothelial inflammation and damage through the transfer of miRNAs / A. Glemain, M. Neel, A. Neel [et al.] // Journal of Autoimmunity. - 2022. - Vol. 129. - P. 102826.

54. Gomzikova, M. Evaluation of Cytochalasin B-Induced Membrane Vesicles Fusion Specificity with Target Cells / M. Gomzikova, S. Kletukhina, S. Kurbangaleeva [et al.] // BioMed Research International. - 2018. - Vol. 2018. - P. 1-6.

55. Gupta, D. Dosing extracellular vesicles / D. Gupta, A. M. Zickler, S. E. Andaloussi // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2021. - N 178. - P.113961.

56. Haque, S. CD19 Chimeric Antigen Receptor-Exosome Targets CD19 Positive B-lineage Acute Lymphocytic Leukemia and Induces Cytotoxicity / S. Haque, S. R. Vaiselbuh // Cancers. - 2021. - Vol. 13, N 6. - P. 1401.

57. Hettinger, C.K. Extracellular vesicles released from stress-induced prematurely senescent myoblasts impair endothelial function and proliferation / Z. R. Hettinger, C. K. Kargl, J. H. Shannahan [et al.] // Experimental Physiology. -2021. - Vol. 106, N 10. - P. 2083-2095.

58. Holling, T. M. Activated Human T Cells Accomplish MHC Class II Expression Through T Cell-Specific Occupation of Class II Transactivator Promoter III / T. M. Holling, N. Van Der Stoep, E. Quinten [et al.] // The Journal of Immunology. - 2002. - Vol. 168, N 2. - P. 763-770.

59. Hong, L.K. CD30-Redirected Chimeric Antigen Receptor T Cells Target CD30+ and CD30- Embryonal Carcinoma via Antigen-Dependent and Fas/FasL Interactions / L. K. Hong, Y. Chen, C. C. Smith [et al.] // Cancer Immunology Research. - 2018. - T. 6, № 10. - C. 1274-1287.

60. Hou, A. J. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment / A. J. Hou, L. C. Chen, Y. Y. Chen // Nature Reviews Drug Discovery. - 2021. - Vol. 20, N 7. - P. 531-550.

61. Jogalekar, M.P. CAR T-Cell-Based gene therapy for cancers: new perspectives, challenges, and clinical developments / M. P. Jogalekar, R. L. Rajendran, F. Khan [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2022. - Vol. 13. - P. 925985.

62. Karasu, E. Extracellular Vesicles: Packages Sent With Complement / E. Karasu, S. U. Eisenhardt, J. Harant [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2018. -Vol. 9. - P. 721.

63. Kim, J. W. Current status and perspectives on CAR-T therapy / J. W. Kim, S. Lee // Frontiers in Bioscience-Landmark. - 2021. - Vol. 26, N 12. - P. 1393-1395.

64. Kiselevsky, D. B. Granzymes and Mitochondria / D. B. Kiselevsky // Biochemistry. - 2020. - Vol. 85. - N 2. - P.131-139.

65. Kowal, J. Dendritic cell extracellular vesicles / J. Kowal, M. Tkach // International Review of Cell and Molecular Biology. Elsevier, -2019. - Vol. 349. - P. 213-249.

66. Kozlov, G. Calnexin cycle - structural features of the ER chaperone system / G. Kozlov, K. Gehring // The FEBS Journal. - 2020. - T. 287, №№ 20. - C. 4322-4340.

67. Kumar, M. A. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases / M. A. Kumar, S. K. Baba, H. Q. Sadida [et al.] // Signal Transduct Target Ther. - 2024. - N.9 - P.27.

68. Jang, S. C. Bioinspired Exosome-Mimetic Nanovesicles for Targeted Delivery of Chemotherapeutics to Malignant Tumors / S. C. Jang, O. Y. Kim, C. M. Yoon [et al.] // ACS Nano. - 2013. - Vol. 7, N 9. - P. 7698-7710.

69. Johnson, L. R. The immunostimulatory RNA RN7SL1 enables CAR-T cells to enhance autonomous and endogenous immune function / L. R. Johnson, D. Y. Lee, J. S. Eacret [et al.] // Cell. - 2021. - Vol. 184, N 19. - P. 4981-4995.e14.

70. Jo, W. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles / W. Jo, J. Kim, J. Yoon, [et al.] // Nanoscale. - 2014. - Vol. 6, N 20. - P. 12056-12064.

71. Jung, Y.-S. Examination of the expanding pathways for the regulation of p21 expression and activity / Y.-S. Jung, Y. Qian, X. Chen // Cell Signal. -2010. - Vol.22. - N 7. - P.1003-1012.

72. Labanieh, L. Programming CAR-T cells to kill cancer / L. Labanieh, R. G. Majzner, C. L. Mackall // Nature Biomedical Engineering. - 2018. - Vol. 2, N 6. - P. 377-391.

73. Lamichhane, T. N. Ethanol Induces Enhanced Vascularization Bioactivity of Endothelial Cell-Derived Extracellular Vesicles via Regulation of MicroRNAs and Long Non-Coding RNAs / T. N. Lamichhane, C. A. Leung, L. Y. Douti [et al.] // Scientific Reports. - 2017. - Vol. 7, N 1. - P. 13794.

74. Lamplugh, Z. Vascular Microenvironment, Tumor Immunity and Immunotherapy / Z. Lamplugh, Y. Fan // Frontiers in Immunology. - 2021. - Vol. 12. - P. 811485.

75. Larson, R. C. Recent advances and discoveries on the mechanisms and functions of CAR T cells / R. C. Larson, M. V. Maus // Nat Rev Cancer. -2021. Vol. 21, No. 3.

76. Lee, J. Y. Extracellular Vesicles in Regenerative Medicine: Potentials and Challenges / J. Y. Lee, H. Kim // Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2021. - Vol. 18, N 4. - P. 479-484.

77. Lettau, M. Intra- and Extracellular Effector Vesicles From Human T And NK Cells: Same-Same, but Different? / M. Lettau, O. Janssen // Frontiers in Immunology. - 2021. - Vol. 12. - P. 804895.

78. Liu, Y. Gasdermin E-mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome / Y. Liu, Y. Fang, X. Chen [et al.] // Science Immunology. - 2020. - Vol. 5, N 43. - P.eaax7969.

79. Li, B. Engineered T cell extracellular vesicles displaying PD-1 boost anti-tumor immunity / B. Li, T. Fang, Y. Li [et al.] // Nano Today. - 2022. - Vol. 46. - P. 101606.

80. Longshaw, V. M. Nuclear translocation of the Hsp70/Hsp90 organizing protein mSTI1 is regulated by cell cycle kinases / V. M. Longshaw, J. P. Chapple, M. S. Balda [et al.] // Journal of Cell Science. - 2004. - Vol. 117, N 5. - P. 701-710.

81. Maeshige, N. High-intensity ultrasound irradiation promotes the release of extracellular vesicles from C2C12 myotubes / N. Maeshige, P. K. Langston, Z. Yuan [et al.] // Ultrasonics. - 2021. - Vol. 110. - P. 106243.

82. Markova, K.L. Microvesicles Produced by Natural Killer Cells Regulate the Formation of Blood Vessels / K. L. Markova, A. R. Kozyreva, D. I.

Sokolov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2020. - Vol. 170, N 1. - P. 123-127.

83. Markov, O. Immunotherapy Based on Dendritic Cell-Targeted/Derived Extracellular Vesicles—A Novel Strategy for Enhancement of the Antitumor Immune Response / O. Markov, A. Oshchepkova, N. Mironova // Frontiers in Pharmacology. - 2019. - Vol. 10. - P. 1152.

84. Marofi, F. CAR T cells in solid tumors: challenges and opportunities / F. Marofi, R. Motavalli, V. A. Safonov [et al.] // Stem Cell Research & Therapy. -2021. - Vol. 12, N 1. - P. 81.

85. Ma, X. Bioengineered nanogels for cancer immunotherapy / X. Ma, S. Li, Y. Liu [et al.] // Chemical Society Reviews. - 2022. - Vol. 51, N 12. - P. 5136-5174.

86. Ma, Y. Introducing Membrane Charge and Membrane Potential to T Cell Signaling / Y. Ma, K. Poole, J. Goyette [et al.] // Frontiers in Immunology. -2017. - Vol. 8. - P. 1513.

87. Mehrabadi, A. Z. Therapeutic potential of CAR T cell in malignancies: A scoping review / A. Z. Mehrabadi, R. Ranjbar, M. Farzanehpour [et al.] // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2022. - Vol. 146. - P. 112512.

88. Meiraz, O. Switch from perforin-expressing to perforin-deficient CD8 + T cells accounts for two distinct types of effector cytotoxic T lymphocytes in vivo / A. Meiraz, O. G. Garber, S. Harari [et al.] // Immunology. -2009. - Vol. 128, N 1. - P. 69-82.

89. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication / J. Meldolesi // Current Biology. - 2018. - Vol. 28, N 8. - P. R435-R444.

90. Miao, Z. Obstacles and Coping Strategies of CAR-T Cell Immunotherapy in Solid Tumors / L. Miao, Z. Zhang, Z. Ren [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2021. - Vol. 12. - P. 687822.

91. Morrell, A. E. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation / A. E. Morrell, G. N. Brown, S. T. Robinson [et al.] // Bone Research. - 2018. - Vol. 6, N 1. - P. 6.

92. Morris, E.C. Cytokine release syndrome and associated neurotoxicity in cancer immunotherapy / E. C. Morris, S. S. Neelapu, T. Giavridis [et al.] // Nature Reviews Immunology. - 2022. - Vol. 22, N 2. - P. 85-96.

93. Mortezaee, K. Immune escape: A critical hallmark in solid tumors / K. Mortezaee // Life Sciences. - 2020. - Vol. 258. - P. 118110.

94. Mueller, H. Force Measurements on Myelin Basic Protein Adsorbed to Mica and Lipid Bilayer Surfaces Done with the Atomic Force Microscope / H. Mueller, H. Butt, E. Bamberg // Biophysical Journal. - 1999. - Vol. 76, N 2. - P. 10721079.

95. Nair, A. Cytochalasin B Treatment and Osmotic Pressure Enhance the Production of Extracellular Vesicles (EVs) with Improved Drug Loading Capacity / A. Nair, J. Bu, P. A. Rawding [et al.] // Nanomaterials. - 2021. - Vol. 12, N 1. - P. 3.

96. Németh, A. Antibiotic-induced release of small extracellular vesicles (exosomes) with surface-associated DNA / A. Németh, N. Orgovan, B. W. Sodar [et al.] // Scientific Reports. - 2017. - Vol. 7, N 1. - P. 8202.

97. Nikoletopoulou, V. Crosstalk between apoptosis, necrosis and autophagy / V. Nikoletopoulou, M. Markaki, K. Palikaras [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. - 2013. - N 1833. - P. 3448-3459.

98. Norelli, M. Clinical pharmacology of CAR-T cells: Linking cellular pharmacodynamics to pharmacokinetics and antitumor effects / M. Norelli, M. Casucci [et al.]// Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. -2016. - Vol. 1865, N 1. - P. 90-100.

99. Onwudiwe, K. Do Tumor Mechanical Stresses Promote Cancer Immune Escape? / K. Onwudiwe, J. Najera, S. Siri [et al.] // Cells. - 2022. - Vol. 11, N 23. - P. 3840.

100. Oshchepkova, A. Cytochalasin-B-Inducible Nanovesicle Mimics of Natural Extracellular Vesicles That Are Capable of Nucleic Acid Transfer / A. Oshchepkova, A. Neumestova, V. Matveeva [et al.] // Micromachines. - 2019. - N 10. - 750.

101. Pagotto, S. CAR-T-Derived Extracellular Vesicles: A Promising Development of CAR-T Anti-Tumor Therapy / S. Pagotto, P. Simeone, D. Brocco [et al.] // Cancers. - 2023. - Vol. 15, N 4. - P. 1052.

102. Phinney, D. G. Concise Review: MSC-Derived Exosomes for CellFree Therapy / D. G. Phinney, M. F. Pittenger // Stem Cells. - 2017. - Vol. 35, N 4. - P. 851-858.

103. Pospichalova, V. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer / V. Pospichalova, J. Svoboda, Z. Dave [et al.] // J Extracell Vesicles. - 2015. -V.31, N 4. - P.25530.

104. Puthalakath, H. Keeping killers on a tight leash: transcriptional and posttranslational control of the pro-apoptotic activity of BH3- only proteins / H. Puthalakath, A. Strasser // Cell Death and Differentiation. - 2002. - N 9. - P.505-512.

105. Record, M. Extracellular vesicles: lipids as key components of their biogenesis and functions / M. Record, S. Silvente-Poirot, M. Poirot [et al.] // Journal of Lipid Research. - 2018. - Vol. 59, N 8. - P. 1316-1324.

106. Rodriguez-Lorenzo, L. Nanoparticle Polydispersity Can Strongly Affect In Vitro Dose / L. Rodriguez-Lorenzo, B. Rothen-Rutishauser, A. Petri-Fink [et al.] // Particle and particle systems characterization. - 2014. - Vol. 32, N 3. - P. 321-333.

107. Qin, Y. Enhancing CAR T-cell therapies against solid tumors: Mechanisms and reversion of resistance / Y. Qin, G. Xu // Frontiers in Immunology. - 2022. - Vol. 13. - P. 1053120.

108. Qiu, Y. FOXP3+ regulatory T cells and the immune escape in solid tumours / Y. Qiu, S. Ke, J. Chen [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2022. - Vol. 13. - P. 982986.

109. Rousalova, I. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation (Review) / I. Rousalova, E. Krepela // International journal of oncology. - 2010. - N 37. - P.1361-1378.

110. Salnikow, K. Hyperinducibility of Hypoxia-responsive Genes without p53/p21-dependent Checkpoint in Aggressive Prostate Cancer / K. Salnikow, M. Costa, W. D. Figg [et al.] // Cancer Research. - 2000. - Vol. 60. - P. 5630-5634.

111. Samuel, P. Cisplatin induces the release of extracellular vesicles from ovarian cancer cells that can induce invasiveness and drug resistance in bystander cells / P. Samuel, L. A. Mulcahy, F. Furlong [et al.]// Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. - 2018. - Vol. 373, N 1737. - P. 20170065.

112. Schneider, E. CD73-mediated adenosine production by CD8 T cell-derived extracellular vesicles constitutes an intrinsic mechanism of immune suppression / E. Schneider, R. Winzer, A. Rissiek [et al.] // Nature Communications. - 2021. - Vol. 12, N 1. - P. 5911.

113. Seo, N. Activated CD8+ T cell extracellular vesicles prevent tumour progression by targeting of lesional mesenchymal cells / N. Seo, Y. Shirakura, Y. Tahara [et al.] // Nature Communications. - 2018. - Vol. 9, N 1. - P. 435.

114. Shao, Y. Role and Function of T Cell-Derived Exosomes and Their Therapeutic Value / Y. Shao, X. Pan, R. Fu // Mediators of Inflammation. - 2021. - Vol. 2021. - P. 1-7.

115. Singh, A. K. CAR T cells: continuation in a revolution of immunotherapy / A. K. Singh, J. P. McGuirk // Lancet Oncol. - 2020. - 21. - e168-178.

116. Skocaj, M. Characterisation of plasmalemmal shedding of vesicles induced by the cholesterol/sphingomyelin binding protein, ostreolysin A-mCherry / M. Skocaj, Y. Yu, M. Grundner [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Biomembranes. - 2016. - Vol. 1858, N 11. - P. 2882-2893.

117. Skotland, T. An emerging focus on lipids in extracellular vesicles / T. Skotland, K. Sagini, K. Sandvig [et al.] // Advanced Drug Delivery Reviews. -2020. - Vol. 159. - P. 308-321.

118. Song, J. Multiplexed strategies toward clinical translation of extracellular vesicles / J. Song, B. Song, L. Yuan [et al.] // Theranostics. - 2022. -Vol. 12, N 15. - P. 6740-6761.

119. Sterner, R C. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies / R C. Sterner, R. M. Sterner // Blood Cancer Journal. - 2021. - Vol. 11, N 4. - P. 69.

120. Sung, H. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries / H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel [et al.] // CA: A Cancer Journal for Clinicians. - 2021. - Vol. 71, N 3. - P. 209-249.

121. Syromiatnikova, V. Methods of the Large-Scale Production of Extracellular Vesicles / V. Syromiatnikova, A. Prokopeva, M. Gomzikova // International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - Vol. 23, N 18. - P. 10522.

122. Thery, C. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines [Text] / C. Thery, K. W. Witwer, E. Aikawa [et al.] // Journal of Extracellular Vesicles. - 2018. -Vol. 7, N 1. - P. 1535750.

123. Thone, M. N. Extracellular blebs: Artificially-induced extracellular vesicles for facile production and clinical translation / M. N. Thone, Y. J. Kwon // Methods. - 2020. - Vol. 177. - P. 135-145.

124. Trapani, J. A. Localization of Granzyme B in the Nucleus: a putative role in the mechanism of cytotoxic lymphocyte-mediated apoptosis / J. A. Trapani, K. A. Browne, M. J. Smyth [et al.] // Journal of biological chemistry. - 1996. -Vol. 271, N 8. - P. 4127-4133.

125. Tucher, C. Extracellular Vesicle Subtypes Released From Activated or Apoptotic T-Lymphocytes Carry a Specific and Stimulus-Dependent Protein Cargo / C. Tucher, K. Bode, P. Schiller [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2018. - Vol. 9. - P. 534.

126. Ukrainskaya, V. M. CAR-tropic extracellular vesicles carry tumor-associated antigens and modulate CAR T cell functionality / V. M. Ukrainskaya, O. E. Musatova, D. V. Volkov [et al.] // Scientific Reports. - 2023. - Vol. 13, N 1. - P. 463.

127. Van der Pol, E. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing / E. van der

Pol, F.A.W. Coumans, A.E. Grootemaat [et al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2014. - Vol. 12, N 7. - P.1182-1192.

128. Varga, Z. Size Measurement of Extracellular Vesicles and Synthetic Liposomes: The Impact of the Hydration Shell and the Protein Corona / Z. Varga, B. Feher, D. Kitka [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. -2020. - Vol. 192. - P. 111053.

129. Wagner, J. (CAR T Cell Therapy for Solid Tumors: Bright Future or Dark Reality? / J. Wagner, E. Wickman, C. DeRenzo [et al.] // Molecular Therapy.

- 2020. - Vol. 28, N 11. - P. 2320-2339.

130. Wang, B. Z. RNA and Protein Delivery by Cell-Secreted and Bioengineered Extracellular Vesicles / B. Z. Wang, L. J. Luo, G. Vunjak-Novakovic // Advanced Healthcare Materials. - 2022. - Vol. 11, N 5. - P. 2101557.

131. Wang, H. The Impact of the Tumor Microenvironment on Macrophage Polarization in Cancer Metastatic Progression / H. Wang, M. M. H. Yung, H. Y. S. Ngan [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2021.

- Vol. 22, N 12. - P. 6560.

132. Wang, L. Preparation of Engineered Extracellular Vesicles Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Ultrasonication for Skin Rejuvenation / L. Wang, K. K. Abhange, Y. Wen [et al.] // ACS Omega. -2019. - Vol. 4, N 27. - P. 22638-22645.

133. Wei, C. Igniting Hope for Tumor Immunotherapy: Promoting the "Hot and Cold" Tumor Transition / C. Wei, Y. Ma, F. Wang [et al.] // Clinical Medicine Insights: Oncology. - 2022. - T. 16. - C. 117955492211207.

134. Welsh, J. A. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches / J. A. Welsh, D. C. I. Goberdhan, L. O'Driscoll // J Extracell Vesicles. - 2024. - N 13. - e12404.

135. Wu, M. A novel pathway of cellular activation mediated by antiphospholipid antibody-induced extracellular vesicles / M. Wu, J. Barnard, S. Kundu [et al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2015. - Vol. 13, N 10. - P. 1928-1940.

136. Xiao, X. Mechanisms of cytokine release syndrome and neurotoxicity of CAR T-cell therapy and associated prevention and management strategies / X. Xiao, S. Huang, S. Chen [et al.] // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. - 2021. - Vol. 40, N 1. - P. 367.

137. Xu, J. Hypoxic glioma-derived exosomes promote M2-like macrophage polarization by enhancing autophagy induction / J. Xu, J. Zhang, Z. Zhang [et al.] // Cell Death & Disease. - 2021. - Vol. 12, N 4. - P. 373.

138. Xu, Q. Tropism-facilitated delivery of CRISPR/Cas9 system with chimeric antigen receptor-extracellular vesicles against B-cell malignancies / Q. Xu, Z. Zhang, L. Zhao [et al.] // Journal of Controlled Release. - 2020. - Vol. 326. - P. 455-467.

139. Valiullina, A. Kh. Evaluation of CAR-T Cells' Cytotoxicity against Modified Solid Tumor Cell Lines / A. Kh. Valiullina, E. A. Zmievskaya, I. A. Ganeeva [et al.] // Biomedicines. - 2023. - N 11. - 626.

140. Yang, C. Extracellular vesicles and their engineering strategies, delivery systems, and biomedical applications / C. Yang, Y. Xue, Y. Duan [et al.] // Journal of Controlled Release. - 2024. - Vol. 365. - P.1089-1123.

141. Yang, J. T-cell-derived extracellular vesicles regulate B-cell IgG production via pyruvate kinase muscle isozyme 2 / J. Yang, G. Dang, S. Lü [et al.] // The FASEB Journal. - 2019. - Vol. 33, N 11. - P. 12780-12799.

142. Yang, P. Immune Cell-Derived Extracellular Vesicles - New Strategies in Cancer Immunotherapy / P. Yang, Y. Peng, Y. Feng [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2021. - T. 12. - C. 771551.

143. Yang, P. The exosomes derived from CAR-T cell efficiently target mesothelin and reduce triple-negative breast cancer growth / P. Yang, X. Cao, H. Cai [et al.] // Cellular Immunology. - 2021. - Vol. 360. - P. 104262.

144. Yoon, J. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery / J. Yoon, W. Jo, D. Jeong [et al.] // Biomaterials. - 2015. - Vol. 59. - P. 12-20.

145. Zhao, Z. Low-intensity ultrasound radiation increases exosome yield for efficient drug delivery / Z. Zhao, L. Qu, T. Shuang [et al.] // Journal of Drug Delivery Science and Technology. - 2020. - Vol. 57. - P. 101713.

146. Zhu, T. Nanovesicles derived from bispecific CAR-T cells targeting the spike protein of SARS-CoV-2 for treating COVID-19 / T. Zhu, Y. Xiao, X. Meng [et al.] // Journal of Nanobiotechnology. - 2021. - Vol. 19, N 1. - P. 391.

147. Zmievskaya, E. A. Artificial Extracellular Vesicles Generated from T Cells Using Different Induction Techniques / E. A. Zmievskaya, S. A. Mukhametshin, I. A. Ganeeva [et al.] // Biomedicines. - 2024. - Vol. 12. - N 4. - 919.

148. Approved Cellular and Gene Therapy Products | FDA [Online] / URL: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products. (дата доступа: 24/05/2023).

149. Gene and Cellular Immunotherapy for Cancer / ed. A. Ghobadi, J. F. DiPersio. - Cham : Springer International Publishing, 2022.