Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и их сверхрезистентных гибридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Радаева, Татьяна Вячеславовна

• Радаева, Татьяна Вячеславовна
• кандидат медицинских наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Радаева, Татьяна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Генетический контроль резистентности к 9 туберкулезу и ответа на микобактериальные антигены. "

1. Введение.

2. Гены, кодирующие интерлейкины и их рецепторы.

3. Ген, кодирующий ЫО-синтетазу.

4. Гены комплекса Н-2.

5. Ген Ыгатр 1.

6. Ген и*/.

7. Ген ТЬс-1.

8. Ген хи/.

9. Ген, кодирующий рецептор к витамину О. 32 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 43 Введение. 43 [.Противотуберкулезная резистентность мышей.

1.1. Динамика гибели и потери веса.

1.2. Характер наследования тяжести течения инфекции: анализ расщепления 48 у гибридов ¥2 (В6х1/80 и ВС 1 [В6 х да х В6)П ].

1.3. Высеваемость микобактсрии из органов инфицированных животных.

1.4. Патология легочной ткани. 54 II. Параметры противотуберкулезного иммунитета. 60 II. 1. Т-клеточный ответ.

II. 1.1. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов in vitro на микобактериальные 62 антигены.

II. 1.2. Продукция цитокинов клетками лимфатических узлов

II 1.3. Характеристика поверхностных маркеров Т-клеток.

II.2. Макрофагальный ответ.

И.2.1. Антимикобактериальная активность легочных макрофагов мышей I/St, 73 В6 и F1.

II.2.2. Цитопатогенное действие микобактерий на макрофаги в культуре.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и их сверхрезистентных гибридов»

Актуальность проблемы.

Многочисленные исследования последних лет ясно показали, что восприимчивость к туберкулезной инфекции и ее течение в организме-хозяине -полигенно контролируемые признаки. В настоящее время уже картированы гены главного комплекса гистосовместимости и гены первой хромосомы Nramp и sst-1 (Kramnik I. et al., 2000), участвующие в определении уровня чувствительности к туберкулезу у мышей. Гомолог гена Nramp мыши, ген NRAMP 1, найден во второй хромосоме человека и его роль в контроле туберкулеза интенсивно изучается (Skamene Е., Schurr Е„ Gros Ph., 1998; Liu J. et al., 1995; Bellamy R.J. and Hill A.V.S., 1998; Bellamy R.J. et al.,1998). Недавно появились данные о роли локусов Tlrl, Т1г2, Т1гЗ, расположенных, соответственно, в 1, 3 и 7 хромосомах мыши (Mitsos L.M., et al. 2000) в контроле резистентности к туберкулезу, вызванного вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv.

В лаборатории иммуногенетики ЦНИИ Туберкулеза РАМН была исследована чувствительность к летальной туберкулезной инфекции мышей более 30 линий. Среди них были обнаружены сверхчувствительная к туберкулезу линия I/St, чувствительная линия С57В1/6 и ряд резистентных линий - A/Sn, СВА, AKR (Nikonenko В. V. et al. 1985; 2000). Недавно на мышах линии I/St было показано сцепление скорости гибели и потери веса у зараженных животных с локусами tbs-I и tbs-2, расположенными в 3 и 9 хромосомах, соответственно (Lavebratt С., et al. 1999; Sanchez F.О. et al., 2002). Есть основания полагать, что именно эти локусы являются одними из наиболее мощных генетических факторов, определяющими течение туберкулезной инфекции в нашей модели (Nikonenko В. V. et al., 2000).

Вместе с тем, большой интерес вызывает изучение наследования чувствительности к туберкулезу и проявления фенотипических различий в сочетании линий инбредных мышей I/St и С 57В1/6. Обе эти линии чувствительны к туберкулезу, при этом, гибриды Fl между ними оказались гораздо резистентнее не только обоих родителей, но и других исследованных мышей. Мы полагаем, что это - проявление комплементации между независимыми генетическими локусами, контролирующими течение туберкулезного процесса. Подобные межгенные взаимодействия принципиально важны для эффективного контроля инфекции, однако пока они остаются совершенно неизученными.

Влияние конкретных генов, их аллелей и взаимодействие между ними реализуется через экспрессию определенных фенотипов. При микобакгериальной инфекции физиологически значимы фенотипические характеристики Т-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов как основных эффекторов антимикобактериальной защиты (Orme I M.et al., 1992, 1993; Kaufmann S.H.E., 2001). Таким образом, для выявления и последующего картирования новых локусов, контролирующих резистентность к туберкулезу, представлялось целесообразным провести сегрегационный анализ в паре инбредных линий мышей I/St и С57В1/6. Для выявления дефектов в системе противотуберкулезной защиты у родительских линий и анализа межгенной комплементации у гибридов Fl на иммунологическом уровне было решено исследовать основные параметры Т-клеточного и макрофагального ответа на микобактерии у мышей чувствительных родительских линий I/St и С57В1/6, а также их резистентных гибридов F1.

Цель и млачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось выявление дефектов в системе иммунологических механизмов антимикобактериальной резистентности у мышей с генетически детерминированными различиями по чувствительности к туберкулезу и анализ компенсации этих дефектов за счет генетической комплементации. Для ее решения в работе поставлены следующие задачи:

1. Определить характер генетического расщепления и количество основных генов, участвующих в контроле туберкулеза в выбранной модели.

2. Определить динамику нарастания и степень кахексии у мышей линий I/St, С57В1/6 и гибридов (I/Stx С57В1/6 )F1 после инфицирования.

3. Сравнить мышей чувствительных родительских линий и их резистентных гибридов по способности контролировать размножение микобактерий в органах.

4. Сравнить особенности патоморфологических изменений в легких у изучаемых мышей.

5. Оценить функциональную активность Т-лимфоцитов мышей чувствительных родительских линий и резистентных гибридов F1.

6. Оценить антимикобактериальную активность макрофагов легких родительских линий I/St, C57BL/6 и гибридов F1 по интенсивности образования активных форм азота, ограничению роста микобактерий в культуре и цитопатическому действию микобактерий на сами макрофаги.

Научная новизна.

-71. Впервые изучена динамика развития кахексии у чувствительных и резистентных животных, инфицированных М. tuberculosis H37Rv. Показано, чт о чувствительные к туберкулезу мыши теряют 25% вес в течение 15-25 дней после заражения, тогда как резистентные животные начинают терять вес не ранее, чем через 2 месяца после заражения. Вместе с тем, несмотря на разную динамику развития кахексии, ее абсолютный уровень к моменту гибели одинаков у чувствительных мышей I/St и C57BL/6 и резистентных гибридов F1.

2. У мышей инбредной линии В6 показано наличие ранее неизвестного локуса, контролирующего течение туберкулезного процесса. Этот локус не сцеплен с локусами, определяющими чувствительность к туберкулезу у мышей I/St.

3. Впервые показано, что тяжесть патоморфологических изменений в легких после заражения туберкулезом может не зависеть от бактериальной нагрузки, а определиться генетически детерминированной реактивностью организма.

4. Установлено, что Т-лимфоциты лимфоузлов мышей I/St характеризуются сниженной продукцией цитокинов 1 типа, особенно ИФН-у.

5. На данной генетической модели впервые удалось показать, что макрофаги резистентных (F1) и чувствительных (I/St) мышей при низком соотношении микобактерия : макрофаг могут обладать одинаковой антимикобактериальной активностью, но отличаться по устойчивости к цитопатическому действию микобактерий

Практическая значимость.

Данные о генетически детерминированных различиях в реактивности к микобак i ериям у мышей чувствительных и резистентных к инфекции и сегрегационный анализ в новом сочетании инбредных линий мышей ноказал наличие ранее неизвестного(ых) гена(ов), контролирующего(их) резистентность к туберкулезу. Поскольку, генетический контроль чувствительности и резистентности к микобактериям осуществляется у человека и мыши гомологичными генами (Liu J. et al., 1995), наши исследования могут служить основой для поиска новых генов, участвующих в контроле туберкулез! у человека. Сходство между мышью и человеком на уровне генетического контроля чувствительности и резистентности к туберкулезу позволяет думать и о сходстве механизмов противотуберкулезной защиты. Исследования работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяют выделить те иммунологические реакции, которые определяют высокую индивидуальную чувствительность к туберкулезной инфекции, что потенциально важно для установления групп высокого риска заболеваемости туберкулезом, а также для контроля за лечением и вакцинацией.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Генетический контроль резистентности к туберкулезу и ответа на микобактериальные антигены.

Введение.

Со второй половины 80-х годов неуклонно увеличиваеться заболеваемость туберкулезом во всем мире. По некоторым данным (Murray et al., 1990) в мире инфицирована треть населения, а по данным ВОЗ регистрируется 8-10 миллионов новых случаев туберкулеза в год и ежегодная смертность составляет 2-3,5 миллиона человек (Dolin D.J. et al, 1994). По прогнозам с 1998 года по 2030 год появится 225 миллионов новых случаев и 79 миллионов смертей от туберкулеза (Murray et al., 1998). Несмотря на столь впечатляющие цифры, клинические проявления болезни наблюдаются только у 10% инфицированных (Kauffman, 2000). Даже при случайном заражении 249 детей в 1926 в городе Любеке большой дозой живых вирулентных М tuberculosis 173 человека выжили, продемонстрировав, что большая часть популяции резистентна к туберкулезу. Со времен Коха основной интерес исследователи фокусировали на патогене и на физиологических, биохимических, иммунологических аспектах ответа организма-хозяина, уделяя недостаточно внимания его генетическим характеристикам. Сейчас уже очевидно, что влияние генетических факторов макроорганизма на чувствительность к инфекции, патогенез и механизмы патологического процесса крайне важно и разнообразно (Апт А.С., 2001). Исследования показали зависимость степени чувствительности к туберкулезу от принадлежности к различным этническим группам (Stead WW. et al., 1990), описаны семейные случаи заболевания туберкулезом (Stead WW. et al., 1992), показана более высокая конкордантность при туберкулезе у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными (Comstock GW. et al., 1978). Определенно можно говорить об участии в контроле туберкулезной инфекции у человека таких генов, как гены II класса комплекса HLA (Goldfeld АЕ. et al., 1998; Meyer CG. et al., 1998; Brahmajothi V. et al., 1991): комплекс аллелей семейства HLA-DR2 обнаруживает высокую степень ассоциации с повышенной заболеваемостью в нескольких этнически отдаленных друг от друга популяциях »Fospelov L.E. et al., 1996), а аллели локуса HLA-DQ влияют на клиническую картину туберкулеза (Goldfeld А.Е. et al., 1998). Недавно удалось достичь первых успехов в анализе связи с ткберкулезом гена NRAMP1. Некоторые аллельные варианты этого умеренно полиморфного гена с высокой степенью достоверности сцеплены с повышенной восприимчивостью к туберкулезу среди народностей Гамбии и аборигенов Северной Канады (Bellamy R. et al., 1998; Abel L. et al., 1998,)

Изучение генетических факторов, контролирующих чувствительность к инфекции у человека затруднено рядом обстоятельств. Например, существует большое количество генов со слабым влиянием на течение инфекции и для нахождения главных генов, определяющих основные параметры чувствительности, необходимо четко выделять группы больных с одинаковыми клиническими проявлениями инфекционного процесса. На практике очень сложно собрать достаточное количество таких данных, позволяющих провести многоуровневый генетический анализ (Jing L. et al., 1993). Кроме того, без сегрегационного анализа, который у человека сводится к семейному анализу, почти невозможно определить характер наследования сложно! о признака. Все это заставило исследователей обратиться к моделированию инфекционного процесса на животных.

Для изучения туберкулеза широко используются, в частности, модели на мышах. Появление инбредных конгенных, мутантных, рекомбинантных инбредных пиний мышей обеспечило хорошую основу для генетического анализа комплексных факторов резистентности к М. tuberculosis. Высокая гомология геномов мыши и человека (85%) значительно облегчает поиск у человека генов-кандидатов, ответственных за резистентность к инфекции (Skamene Е. et al., 1998). Современные генноинженерные технологии позволяют изучать функции многих генов на мутантных, трансгенных и "нокаутных" животных (животные, у которых полностью функционально "выключен" определенный ген) (McLeod R. et al., 1995). Так, изучение мышей с разрушенными генами, кодирующими некоторые цитокины, помогло установить иммунологические механизмы резистентности организма- хозяина к М.tuberculosis и особенности патогенеза туберкулеза. Такие цитокины как ИФН-у и ИЛ-12 оказались принципиально важными для формирования протективного иммунитета (Cooper A. et al., 1993,1995; Flynn J.et al., 1993,1995). Аналогичные данные получены для человека. Мутации в генах рецепторов к ИФН-у и ИЛ-12, нарушающие их функцию, вызывают повышенную восприимчивость к микобактериальным инфекциям (Newport М. et al., 1996, A'tare F. et al , 1998). Важно, что фенотипически сходные иммунодефицитные состояния у мыши и человека возникают при повреждении ортологичных генов. Фантастически быстрый прогресс в геномном анализе скорее всего позволит сделать переход от генетики туберкулеза мыши к генетике туберкулеза человека очень быстрым (Baltimore D., 2001; Kerksiek К.М. et al., 1999). Существует реальная надежда, что детальная фенотипическая характеристика и клонирование соответствующих генов, которые значительно легче удаются в физиологически, а главное, генетически более простых условиях эксперимента, не топыео дадут методы и подходы для аналогичных исследований у человека, но и на прямую послужат генетическому определению групп риска по туберкулезу.

С самого рождения млекопитающие находятся в тесном контакте с микробами. До тех пор пока взаимоотношения носят характер симбиоза, формируется эндогенная флора макроорганизма. При проникновении патогенных микро организмов включаются механизмы защиты, отработанные в ходе эволюции и призванные не допустить развития патологического процесса. Система защиты состоит из двух тесно взаимосвязанных и взаимодействующих частей: набор быстро активирующихся антимикробных механизмов, формирующих естественную резистентность и широкого спектра более поздних адаптивных механизмов иммунитет, зависящих от клональной экспансии лимфоцитов необходимой специфичности. Механизмы естественной резистентности наличествуют в организме еще до первой встречи с патогеном и обеспечивают защиту на ранних стадиях ^часы) после проникновения микроорганизма. Эти механизмы достаточно успешно препятствуют развитию многих инфекций и дают ьремя для запуска и развития медленного антиген- специфического адаптивного иммунитета. Как правило, адаптивный иммунитет запускается только в случае, если первая линия защиты не справилась с инфекцией.

Понятно, что сложная многоуровневая система защиты организма хозяина от патогенов регулируется целым рядом генов, эффекты которых выявляются на разных ее звеньях. Конечно, наличие того или иного аллеля у определенного индивидуума может решающим образом сказаться на восприимчивости к болезни и на ее течении, но на популяционном уровне, скорее всего, многие менделирующие и не менделирующие гены (в том числе гены-модификаторов к гены с плейотропным влиянием) определяют особенности и формы течения туберкулезной инфекции. На сегодняшний день известно достаточно много генов и комплексов генов так или иначе участвующих в формировании резистентности к микобактериальной инфекции. Роль некоторых из них будет освещена в этом обзоре.

Гены, кодирующие интерлейкины и их рецепторы.

Роль отдельных генов в иммунитете к туберкулезной инфекции может быть выявлена с помощью "нокаут-мышей", полученных путем прицельного разрушения определенных генов за счет гомологической рекомбинации с искусственными аллелями, несущими вставки или делеции. Ген-мишень для создания нокаут-мутаций выбирают на основе современных представлений об иммунном ответе на микобактериальную инфекцию. Разрушение некоторых генов мыши (например, генов, кодирующих ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10) не приводит к изменению чувствительности к микобактериям (Erb KJ. et al., 1998; North R.J. 1998). В тоже время неспособность продуцировать ИФН-у, ИЛ-12, ИЛ-6 катастрофически сказывается на выживаемости животных после заражения туберкулезом (Cooper AM. et al., 1995, 1993; Flynn JL. et al., 1995; Kopf M. et al., 1994)

Хорошо известна ключевая роль ИФН-у в системе иммунной защиты макроорганизма от внутриклеточных паразитов. Поэтому неудивительно, что "мыши-нокауты" по гену ИФН-у не способны контролировать даже сублетальную в норме дозу М tuberculosis, введенную внутривенно или аэрозольно. У этих мышей наблюдается прогрессирующее распространенное некротическое разрушение тканей легкого и значительное размножение микобактерий в органе. Хотя они способны формировать гранулемы, они не синтезируют активных форм азота и не могут ограничивать размножение микобактерий. Туберкулез у таких животных протекает стремительно и имеет тенденцию к дессимеьации. Введение экзогенного рекомбинантного ИФН-у может отсрочить, но не предотвратить гибель животных (Cooper AM. et al., 1993, Flynn JL.etal., 1993

R.Kamijo с соавт. (1993) показали , что важен и полноценный нормально функционирующий рецептор к ИФН-у. "Нокаутных" мышей по гену рецептора к ИФН-у (ИФН-у R0/0) заражали М. bovis (BCG). Для контрольных мышей дикого типа инфекция, естественно, не была летальной, тогда как носители нокаут-мутации погибли через 7-9 недель. В печени этих мышей уже через 2 недели после инфицирования присутствовало микобактерий больше, чем у контрольных животных через 6 недель. Кроме того у мышей ИФН-у R0/0 была снижена способность к формированию гранулем, а в сыворотке были значительно снижены концентрации ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6 после заражения BCG по сравнению с мышами, несущими аллель дикого типа.

У человека также удалось выявить иммунодефицитные состояния, связанные с мутациями в генах, кодирующих ИФН-у и его рецептор (Jouanguy Е. et al., 1996, Levin М. et al., 1995). В 1995 году описали несколько детей с наследственным иммунодефицитом, предрасполагающим к дессиминированной нетуберк>лезной микобактериальной инфекции и сальмонелезам (Levin М. et al., 1995). У этих больных выявили дефект макрофагов, состоящий в неспособности вырабатывать ФНО-а в ответ на эндотоксин и отвечать на ИФН-у выработкой цитокинов. Дальнейшее генетическое исследование позволило установить наличие мутации (преждевременный стоп-кодон) в гене, кодирующем лиганд-связывающую цепь (ИФН-у)-рецепторного комплекса, что приводило к отсутствию этого рецептора на поверхности лейкоцитов. Вместе с тем, описаны случаи, когда мутация вызывала лишь замену аминокислот и частично функционирующий рецептор нормально экспрессировался. Клинически это проявилось как один случай дессиминированной BCG инфекции после вакцинации и один случай туберкулеза (Levin М. et al., 1995; Newport M. et al., 1996). Мутации могут затрагивать и другую часть рецепторного комплекса - сигнальную трансдукторную цепь, что приводит к неспособности клеток активироваться ИФН-у при нормальной экспрессии рецептора (Newport М. et al., 1999).

Еще одним важным фактором, участвующем в защите от микобактерий, является ИЛ-12. Эксперименты на мышах, лишенных гена субъединицы р40 ИЛ-12 показали, что такие животные не способны контролировать размножение микобактерий в органах и погибают ; у них наблюдается существенное снижение продукции ИФН-у и ФНО-а, что приводит к задержке активации макрофагов. ИЛ-12 мыши не развивают реакции Г'ЗТ в отвег на микобактериальные антигены даже через 30 дней после заражения. Эти данные хорошо согласуются с тем, что формируются гранулемы с низким содержанием лимфоцитов, а многие макрофаги вакуолизированы из-за присутствия большого количества микобактерий в ткани легкою. Возможно, неспособность образовывать полноценные гранулемы связана с дефицитом Т-хелперов-1, продуцирующих ИФН-у (Cooper А. М. et al., 1997). Отсутствие ИЛ-12 приводит к резкому снижению экспрессии (Зг-цепи рецептора к нему на Г-лимфоцитах, что мешает созреванию Т-хелперов-1, продуцирующих ИФН-у, и антигенспецифической активации Т-клеток после инфицирования животного (Cooper А. М. et al., 1997).

У человека мутации в генах субъединицы р40 ИЛ-12 и рецептора к ИЛ-12 ((3|-цепь) приводят к развитию дессиминированной формы микобактериальных инфекций (Altare F. et al., 1998, Jong R. et al 1998). Клинические проявления сходны с таковыми при дефиците ИФН-у и его рецептора, но болезнь протекает значительно мягче и наблюдается положительный эффект при лечении таких больны е экзогенным ИФН-у (Newport М. et al., 1999).

Сильное влияние на течение туберкулеза оказывает и выключение 1ена, кодирующего ИЛ-6, многофункционального цитокина, участвующего в гемопоэзе, Т- и B-клеточной дифференцировке и воспалительных реакциях. Оказалось, что мыши ИЛ-в'1' очень чувствительны к заражению вирулентным штаммом М. tuberculosis. У нокаут-мышей среднее время выживания составляет 59 дней, тогда как контрольные животные живут более 120 дней. Через 15 дней после заражения высеваемость из органов между группами различается в 10 раз, а через 60 дней из органов мышей ИЛ-6"Л высевается уже в 100-1000 раз больше микобактерий, чем у мышей дикого типа. В реакциях in vitro клетоки селезенок нокаут- мышей в ответ на микобактериальные антигены продуцировали меньше ИФН-у и ФНО-а, но больше ИЛ-4, чем мыши дикого типа. Таким образом, роль ИЛ-6 в защите организма хозяина от микобактерий может состоять в развитии воспалительного ответа и активации ответа по типу 1, приводящего к синтезу ИФН-у, который, в свою очередь, активирует макрофаги и повышает их бактериостатические возможности (Ladel СН. et al., 1997). Интересно, что при заражении М bovis (BCG), и мутантные мыши и мыши дикого типа хорошо контролируют инфекцию, а к 60 дню после заражения из легких животных обеих групп микобактерии не высеваются.

Ген, кодирующий NO-синтетазу.

Основной эффекторный механизм антимикобактериальной активности макрофагов - это выработка активных форм азота (RNI), в том числе NO и NO2". Многими авторами было показано, что ингибирование размножения микобактерий макрофагами мышей, стимулированными различными цитокинами, коррелирует с образованием RNI (Flesch I. E.et al., 1991; Denis M. et al., 1991; Nathan С. et al., 1991;

Chan J. et al., 1992, 1995; O'Brien L. et al., 1994). Источником RNI в макрофагах служит L-аргинин, и их синтез осуществляется при участии фермента индуцибильной NO-синтетазы (iNOS).

Исследования, проведенные на нокаут-мышах iNOS'/" продемонстрировали существенную роль локуса NOS в контроле первичного туберкулеза у мышей. Чувствительность этих животных к туберкулезу сходна с таковой у мышей с иммуносупрессией после введения высоких доз гидрокортизона. Отсутствие гена NOS ведет к быстрому, неограниченному росту микобактерий в легких [время удвоения количества микобактерии у таких животных составляет 27-31 час (MacMicking J. D. et al., 1997), что немногим больше чем в культуре микобактерий -20 часов (Middlebrook G. et al., 1977)]. Интересно отметить, что темпы роста микроорганизмов в нокаут-мышах iNOS '/" превышают таковые в нокаутах но генам ИФН-у, ИФН-yR, ФНО -R1. У мышей, несущих только один аллель гена NOS (NOSw) выработка NO снижается на 30-40%, но этого оказывается достаточным, чтобы продолжительность жизни после заражения была не меньше, чем у мышей дикого типа (MacMicking J D. et al., 1997).

Гены комплекса H-2.

Для изучения роли генов комплекса Н-2 в восприимчивости к туберкулезу исследователи использовали конгенные по Н-2 линии мышей. В этом случае исключается влияние других генов на показатели противотуберкулезной резистентности и иммунитета, такие как выживаемость мышей, интенсивность реакции ГЗТ, эффективность вакцинации BCG. На модели летального туберкулеза на панели линий мышей, несущих разные гаплотипы Н-2, но имеющих одинаковую генетическую основу C57BL/10 (В10), было установлено, что по среднему времени выживания зараженные животные разбились на две группы: относительно резистентные B10.D2 (H-2d), B10.BR (Н-2к), В10.М (H-2f) (срок жизни 32-41 день) и более чувствительные BIO (H-2b), B10.WB (Н-21), B10.SM (H-2V) (срок жизни 23-26 дней). Поскольку эти линии различаются только генами Н-2, несомненна роль этого комплекса генов в контроле общей восприимчивости к инфекции (Апт A.C. и др., 1988, Апт A.C., 1991).

Оценка уровня ГЗТ показала, что более резистентные линии B10.D2 (H-2d) и B10.BR (Н-2к) характеризуются более высокими показателями реакции, чем чувствительные линии. Таким образом, обнаружилась корреляция силы ответа irt vivo и выживаемости.

Чтобы выяснить, какие из генов Н-2 играют решающую роль в определении уровня резистентности животного к инфекции, аналогичные исследования проводились на рекомбинантных по Н-2 линиях (Apt et al., 1993). Было установлено, что в формировании восприимчивости к инфекции играют роль аллели генов I-A класса II. Благоприятное действие оказывает аллель I-Ak, и это подтверждается тем фактом, что 7 из 11 исследованных линий, несущих этот аллель, относятся к резистентным. Кроме того, показано протективное действие аллеля Dd по сравнению с Db. Это подтверждается высокой резистентностью носителей Dd—мышей линий 5R (В 10.А) и 9R (B10.S). Следует отметить, что совместное наследование I-Ak и Dd ^мыши BIO.А) не приводит к кумулятивному эффекту, и такие мыши не отличаются от мышей линий 2R, 4R (AkDb) и 9R (AsDd).

J. Ivanyi с соавторами было показано, что после внутриперитонеального заражения мышей высокой дозой вирулентного штамма М tuberculosis H37Rv динамика микобактериального размножения в легких, репертуар антител и размер специфических гранулем зависят от гаплотипа комплекса Н-2 (Ivanyi J. et al., 1986; Brett S. J. et al., 1990, 1992). В течение 23 недель после заражения наблюдалась прогрессирующая инфекция в легких с увеличением высева микобактерий и размера гранулем. Для изучения влияния генов комплекса Н-2 на течение туберкулезной инфекции в легких использовались конгенные линии мышей на основе BIO и В ALB. Размножение микобактерий в легких проходило значительно легче у мышей с гаплотипом Н-2к по сравнению с гаплотипом Н-2Ь, и это было справедливо как для линий мышей на основе BIO, так и на основе BALB. Результаты, полученные на рекомбинантных линиях, показали, что бактериальная нагрузка и гранулематозная инфильтрация была ниже у мышей BIO {KbAbEDb) и В10.A (4R) {KkAkEDb) по сравнению с мышами В10.A (3R) и B10.BR (KkAkEkDk) соответственно.

Таким образом, резистентность на поздней фазе туберкулезной инфекции может быть связана с отсутствием экспрессии молекулы 1-Е или с экспрессией молекулы Db.

Еще одним параметром, подверженным влиянию генов Н-2, является эффективность вакцинации BCG против заражения мышей вирулентным штаммом М. tuberculosis. Авторы (Apt et al., 1993) исследовали два показателя: протективный эффект вакцинации BCG и уровень реакции ГЗТ у вакцинированных, а затем зараженных мышей. Выяснилось, что вакцинация существенно продлевает время жизни и увеличивает силу реакции ГЗТ у вакцинированных мышей. Вакцинация стирает различия между носителями аллелей I-Ak -I-Ab и Dd -D h.

В этом эксперименте выявились и интересные исключения. У мышей с гаплотипами H-2V (В 10.SM) и H-2f (В10.М и А.С А) значительно слабее выражено усиление реакции ГЗТ после вакцинации. Более того, если доза вакцинации BCG велика,то вакцинация не только не вызывает протекции, но даже ведет к сокращению срока выживания зараженных мышей В10.М. Эти данные позволяют сделать важный с практической точки зрения вывод о зависимости между гаплотипом Н-2 и эффективностью вакцинации разными дозами BCG (Buschman Е. et al., 1988, Апт A.C., 1988).

Основная функция продуктов генов Н-2 (экспрессированных на поверхности АРС) — презентация Т-клеткам антигенных пептидов, которая проявляется, в частности, в виде генетической рестрикции по МНС (Kaufmann S. et al., 1986; Boom W.H. et al., 1987; Апт A.C., 1988). В ряде работ была показана рестрикция продуктами локуса I-A реакции Т-клеток на микобактериальные антигены. Для этого использовали два подхода: тест локального переноса ГЗТ с лимфоцита! <и от вакцинированного донора к интактным реципиентам и блокирование ответа Т-лим^ ^цитов на PPD in vitro с помощью моноклональных антител к продуктам Н-2 класса И.

При локальном адоптивном переносе ГЗТ на туберкулин клетки перитонеального экссудата мышей, вакцинированных BCG, переносили реакцию интактным реципиентам без рестрикции. Если из экссудата удалить прилипающие клетки, то перенос становится успешным только в сингенном сочетании донор-реципиент (Никоненко Б.В., 1988, Межлумова М.Б., 1990). Перенос был рестриктирован по локусу I-A (Nikonenko В. et al., 1989, Апт A.C., 1991 ). Использование иммунных лимфоцитов вместе с антителами к I-Akp отменяло перенос (Nikonenko В. et al., 1989). Введение антител к I-A in vitro частично подавляло реакцию Т-лимфоцитов на PPD, а совместное использование антител к локусам I-A и 1-Е полностью отменяет ответ (Апт А.С.с соавт., 1988 ).

Помимо перечисленного, гены Н-2 участвуют в контроле и других параметров иммунного ответа. Так Huygen et al. (1988) показали связь гаплотипа Н-2Ь (линий BIO, В6) и высокой активности IFN-y в культуре клеток селезенки в ответ на микобактериальный антиген молекулярной массы 32 кД. Позднее было показано, что гены правой части комплекса Н-2 (Н-2К и/или I-A) регулируют уровень и спектр специфических противотуберкулезных антител. (Huygen К. et а!., 1990,1993).

В недавних исследованиях (Pichugin А. V. et al., 1998) открылся еще один аспект влияния генов Н-2 на резистентность к туберкулезу. У конгенных по Н-2 мышей В10.М, В6 и 4R выделяли клетки лимфоузлов после иммунизации животных ультразвуковым дезинтегратом микобактерий (соникатом H37Rv). Далее клетки культивировали в присутствии того же антигена. В зависимости от генотипа клетки в культуре вели себя по-разному. Лимфоциты мышей 4R (устойчивые к туберкулезу) после нескольких пассажей формировали стабильную культуру с преимущественным фенотипом CD4+CD8~ ; клетки В6 (чувствительные к туберкулезу) гибли на втором пассаже in vitro.

Таким образом, иммунные Т-лимфоциты с «дефектным» в отношении защиты от микобактерий генотипом при длительном культивировании теряют способность отвечать на микобактериальные антигены и погибают. Клетки же с генотипом, определяющим высокий уровень резистентности, сохраняют эту способность и могут защищать сингенного реципиента от заражения, что показано на модели адоптивного переноса.

Причина гибели Т-клеток в культуре остается не выясненной, но существуют предположения, что она связана с запуском апопгоза, вызванного активацией под действием антигена. В позднюю фазу в культуре клеток В6 наблюдается крайне низкое содержание бластоподобных клеток. Это согласуется с более ранними наблюдениями, что в клетках, чувствительных к туберкулезу животных, сигнал, полученный Г-клеточным рецептором, ведет к апоптозу в S-фазе клеточного цикла (Hirsch С. S. et al., 1999; Das G. et al., 1999). Возможно, представление микобактериальных антигенов антигенпрезентирующими клетками в контексте продуктов 1АЬ, но не IAk, ведет к апоптозу CD4+ лимфоцитов.

Приведенные данные говорят о важной роли генов комплекса Н-2 в регуляции противотуберкулезной резистентности и иммунитета. Вероятно, определенную роль играют как продукты генов класса I, так и И. Но скорее всего, наиболее важными являются гены класса И, что хорошо согласуется с первостепенной защитной функцией CD4+ лимфоцитов при туберкулезе (Orme I., 1983,1993; Boom W., 1987).

Ген Nramp 1.

Было установлено, что одним из генов, контролирующих естественную резистентность к некоторым непатогенным штаммам микобактерий (в том числе к M bovis BCG) и ряду других внутриклеточных паразитов (Salmonella typhimurium, Leishmania donovani, M. lepraemurium), является ген, первоначально обозначенный Beg (Gros P. et al., 1981, Forget A. et al., 1981). На ранних этапах развития инфекционного процесса (первые 3 недели) после заражения авирулентным штаммом M bovis (BCG) наблюдаются существенные различия в характере размножения микроорганизмов в органах у мышей разных инбредных линий. У одних отмечался логарифмический рост микобактерий в селезенке и легких, у других же рост M bovis был подавлен. Через 3 недели после заражения высеваемость из органов мышей этих двух групп различалась на два порядка. Такие различия в способности контролировать размножение микобактерий BCG контролируются одним геном, расположенным в центромерной части 1 хромосомы мыши и названным Bcg (Schurr Е. et al., 1989).

Ген представлен двумя аллельными формами: Begr (резистентный, доминантный) и Beg1 ( чувствительный, рецессивный) (Gros P. et al., 1983). Этот локус идентичен двум другим генам Ity и Lsh, контролирующим естественную резистентность к S. typhimurium и L. donovani (Skamene Е. et al., 1982). Его структурный аналог (85% гомологии) картирован в длинном плече 2 хромосомы человека (Svhurr Е. et al., 1989,1990).

Ген Beg был клонирован и получил название Nramp-I (natural resistance associated macrophage protein-1) (Vidal S. et al., 1993, 1995; Grueheid S et al., 1995). Он экспрессируется на зрелых тканевых макрофагах, выделенных из паренхиматозных органов. Показано, что макрофаги Nramp-Í превосходят Nramp-ls по продукции активных форм кислорода и азота, высвобождению ФИО , экспрессии поверхностных маркеров активации (Skamene Е. et al., 1989; Blackwell JM. et al., 1994, 1996). На ранних стадиях активации макрофагов Nramp-Г, но не Nramp-ls, после воздействия ЛПС было зарегистрировано значительное увеличение количества м-РНК, считанной с генов КС и JE. Продукты этих генов относятся к суперсемейству белковых цитокинов и являются специфическими аттрактантами , соответственно, для нейтрофилов и моноцитов. Сходным образом регулировалась экспрессия протоонкогенов c-fos и с-тус, участвующих в регуляции транскрипции (Roach Т et al., 1994). Помимо этого, макрофаги Nramp-Í имеют существенно более выраженную способность презентировать антигены.

Иммунофлюорисцентные исследования позволили установить внутриклеточную локализацию белка Nramp. Этот белок располагается в мембране поздних эндосом/лизосом макрофагов, появляясь там сразу после фагоцитоза и сохраняясь до полного созревания фаголизосомы (Gruenheid S. et al., 1997; Vidal S et al., 1995,1996). Белок Nramp представляет из себя высоко гидрофобный полипептид массой 60 кД. Это интегральный мембранный белок, формирующий 12 трансмембранных доменов, имеющий гликозилированную внеклеточную петлю и несколько сайтов фосфорилирования протеинкиназой С (Vidal S. et al., 1993). В трансмембранных доменах аминокислотные остатки расположены таким образом, что полярная сторона петли формирует стенки трансмембранной поры, а более гидрофобная - контактирует с двойным липидным слоем мембраны.

Таким образом, этот полипептид имеет черты сходства с эукариотическими и прокариотическими белками-транспортерами. Он содержит небольшую последовательность (20 аминокислотных остатков), идентичную белку-транспортеру нитратов. Тот факт, что продукт Nramp имеет сходство с транспортером нитратов, позволил сформулировать гипотезу о его возможной биологической роли. Продукт гена Nramp имеет SH3 связывающий домен, что позволяет объяснюь механизм регуляции этим геном ранних процессов трансмембранной передачи сигналов путем связывания с тирозинкиназами. Связываясь с ТПК, Nramp может участвовать в передаче сигналов. Вместе с этим, фосфорилирование белка Nramp может регулировать его транспортную функцию.

В пользу того, что продукт Nramp-1 может выполнять транспортную функцию, говорит то, что в этом белке имеется инвариантная последовательность аминокислотных остатков, характерная для высоко консервативной области К' -канала (Wood М. et al., 1995). Имеется предположение, что Nramp может участвовать в транспорте двувалентных катионов из фагосомы. Снижение концентрации Мп2+. Mg2+ или Zn2+ приводит к тому, что ферменты, участвующие в нетрализации активных форм кислорода и азота не могут выполнять своих функций. То, что М tuberculosis, М bovis, L. donovani и другие внутриклеточные патогены могут синтезировать, в частности, некоторые изоформы супероксиддисмутазы, указывает на важную роль антиоксидантных систем в стратегии выживания этих паразитов внутри клетки организма хозяина (Supek F. et al., 1996).

Для того, чтобы выявить какие различия в последовательности гена Nramp определяют различия по чувствительности к инфекциям, провели секвенирование этого гена у инбредных мышей, отличающихся по чувствительности. Удалось установить, что у всех Nramp-Is животных имеется одна и та же мутация: в положении 169 глицин замещен аспарагиновой кислотой. По всей видимости, замена Гли на объемный заряженный Асп затрагивает транспортную функцию. Мыши, несушие мутантный аллель и "нокауты" по этому гену имеют идентичные фенотипические характеристики, что говорит о ключевой роли аминокислотного остатка в положении 169 (McLeod R. et al., 1995; Vidal S.M. et al., 1996).

Как упоминалось выше, ген Nramp-1 регулирует естественную резистентность к невирулентным штаммам микобактерий. В работах Б.В.Никоненко (Никоненко Б. В., 1992, Nikonenko В. et al., 1996) был рассмотрен вопрос о влиянии гена Nramp-1 на чувствительность к вирулентному штамму М tuberculosis H37Rv. Оказалось, что при заражении высокими дозами, выживаемость и сила реакции ГЗТ в парах конгенных по Nramp-1 линий мышей на разных генетических основах (BALB/C и В10.А) не зависят от аллеля данного гена, а зависят лишь от генетической основы. Эти данные по выживаемости согласуются с результатами по высеваемости микобактерий из органов, полученными North R. и соавт. на модели аэрозольной туберкулезной инфекции (Medina Е. et al., 1996). В тоже время установленное влияние аллелей гена Nramp-1 на презентацию антигенов микобактерий, несомненно, играет некоторую роль в протекции против вирулентных штаммов (Никоненко Б. В., 1992). Действительно, при заражении низкими дозами М. tuberculosis H37Rv мышей, конгенных по гену Nramp-1, удалось выявить, что высеваемость микобактерий из селезенки через 18 дней была в 4 раза выше у мышей Nramp-Í, по сравнению с мышами Nramp-Í (Nikonenko В. V. et al., 1996).

Влияние этого гена можно проследить и в формировании иммунитета к ВСО Подкожная вакцинация конгенных по Nramp-1 мышей BALB/C (Nramp-Г) и CD2 (Nramp-1показала, что генотип Nramp-Г способствует более раннему развитию иммунного ответа. Это подтвердилось при заражении иммунных мышей М. tuberculosis H37Rv. Через 3 недели после иммунизации мыши с генотипом Nramp-Г оказались лучше защищены, чем мыши Nramp-Г, однако, через 6 недель после иммунизации эта разница исчезала, то есть мыши Nramp-Г достигали такого же уровня протективного иммунитета, что и мыши Nramp-Г, но в более поздние сроки (Buschman Е et al., 1988).

Таким образом, ген Nramp-l, регулируя функции макрофагов, в первую очередь влияет на природную устойчивость хозяина к внутриклеточным инфекциям, особенно при низкой дозе и/или вирулентности инфекта.

Ген sst 1.

Совсем недавно в первой хромосоме мыши, на 10-19 сМ дистальнее гена Nramp-/, был картирован ген sst-I (susceptibility to tuberculosis), оказывающий мощный эффект на чувствительность к туберкулезу (Kramnik I. et al., 2000). Этот ген определяет характер патологического процесса в легких после заражения вирулентным штаммом микобактерий туберкулеза. Мыши, несущие разные аллели локуса sst-l, принципиально отличаются не только по способности контролировать размножение микобактерий в легких животных, но и по характеру легочной патологии. Очш и в легких у .^//-чувствительных мышей характеризуются обширным распространенным некрозом и быстрым внеклеточным размножением вирулентных микобактерий, в то время как у sstl-резистентных мышей формируются интерстициальные гранулемы и более эффективно контролируется рост микобактерий.

Первоначально была протестирована панель инбредных линий мышей по среднему времени выживания и высеваемости микобактерий из органов после заражения М. tuberculosis (штамм Эдман). Среднее временя выживания значительно отличалось между линиями, что позволило выделить 3 группы животных : высоко чувствительные (CBA/N, C3HeB/FeJ, DBA/2), промежуточные (BALB/c, 129/SvJ), и относительно резистентные (C57BL/6J, C57BL/10J). Интересно, что все чувствительные линии мышей имели резистентный аллель Nramp-1 в то время как резистентные линии - его чувствительный аллель. Через 3-4 недели после заражения у чувствительных мышей СЗН в легких наблюдался тяжелый пневмонит и очаги некроза. В то же время у резистентных В6 выявлялось небольшое интерстициальное воспаление и единичные живые микобактерии в очагах. Для дальнейшего генетического анализа и картирования этого гена выбрали именно эти две оппозитные по чувствительности к туберкулезу линии мышей (Kramnik I. et al., 1998).

Через 6 недель после заражения вирулентным штаммом М tuberculosis бактериальная нагрузка в легких у sstl-чувствительных и sstl-резистентных мышей различалась в 100 раз. Отмечалось лишь 5-кратное различее в количестве КОЕ, высеяных из селезенок, так что ген sstl контролирует течение туберкулезного процесса преимущественно в легких мышей (Kramnik I. et al., 2000).

Не менее ярко различалась и гистологическая картина в легких у чувствительных и резистентных мышей. У sstlrs мышей очаги локализовались строго в интерстициальной ткани и состояли из мононуклеаров преимущественно макрофагальной природы. Микобактерии располагались внутриклеточно, и инфицированные клетки были окружены гораздо более многочисленными неинфицированными макрофагами и лимфоцитами. Напротив, у sstls/s мышей в патологический процесс были вовлечены как интерстиций так и альвеолярное пространство. Кроме макрофагов и лимфоцитов очаги содержали полиморфонуклеарные лейкоциты и макрофаг-подобные клетки с разрушенным ядром.

Таким образом, становится очевидной корреляция между выживаемостью, высеваемостью М. tuberculosis из легких и патоморфологией легочных очагов, зависящих от генетического полиморфизма sstl. Пока неизвестно, может ли этот ген контролировать другие внутриклеточные легочные инфекции, но при инфицировании вирулентными штаммами микобактерий очевидна его роль в контроле чувствительности к инфекции в органоспецифической манере.

Ген ТЬс-1.

Создание в 70-е годы М. М. Авербахом и сотр. экспериментальной модели летального туберкулеза у лабораторных мышей, вызванного внутривенным заражением М tuberculosis в высокой дозе и оценкой увствительности к инфекции по среднему времени выживания, позволило исследовать более 20 инбредных линий (Мороз А. М., Торонджадзе В. Г. с соавт., 1977; Авербах М. М. с соавт., 1976; Авербах М. М. с соавт., 1980, 1985) на чувствительность к туберкулезу в этой модели. Было выявлено, что среди этих линий встречаются как высокорезистентные (A2G, A/Sn, СВА) так и высокочувствительные (I/St, В6) линии мышей. Чувствительность к инфекции оценивали по среднему времени выживания.

Гибридологические исследования показали, что гибриды Fl(I/StxA2G) являются резистентными. Из этого следует, что в данной паре признаков доминирует резистентность, а восприимчивость I/St - рецессивный признак (Nikonenko В. et al., 1985). Кроме того, гибриды F1 между разными линиями имели большее время жизни, чем даже резистентные родители A2G. Интересно отметить, что гибриды F1 практически всегда обладают большей резистентностью к туберкулезу, чем родительские линии, что говорит о проявлении феномена гетерозиса или сверхдоминирования (Nikonenko В. et al., 1985), характерного для генетики количественных признаков.

Заражение летальной дозой М tuberculosis H37Rv потомков возвратного скрещивания (Flxl/St) ВС1 выявило их генетическую неоднородность. Все потомки ВС1 разбились на две количественно равные группы: гомогенная группа короткоживущих высокочувствительных (подобно I/St) и гетерогенная группа долгоживущих относительно резистентных животных. Такое расщепление позволяет сделать предположение о моногенном наследовании высокой восприимчивости (Апт А. С. с соавт., 1982). Тот факт, что в группе долгоживущих мышей время гибели колебалось достаточно в широких пределах, указывает на количественный характер наследования параметров противотуберкулезной защиты.

Эти данные позволили сформулировать следующую гипотезу: у мышей существует некий ген противотуберкулезной резистентности, рецессивный аллель которого в гомозиготном состоянии обуславливает повышенную чувствительность мышей I/St к заражению вирулентным штаммом М tuberculosis H37Rv. В гомозиготном состоянии этот аллель оказывает эпистатическое действие на другие гены, отвечающие за противотуберкулезную защиту. Находясь в гетерозиготном состоянии, рецессивный аллель комплементирован и все другие гены функционируют нормально (Апт А. С. с соавт., 1982; Мороз А. М. с соавт., 1984). Рецессивный дефектный аллель был обозначен Tbc-Is. В работе Никоненко Б.В. и соавт. (1990) было показано, что гены Tbc-I и Nramp не идентичны и находятся в разных группах сцепления. Гибриды между двумя чувствительными к туберкулезу линиями мышей I/St(Tbc-ls) и В6(Beg5) или BALB/c (Begí) оказались высоко резистентны к инфекции.

Кроме среднего времени выживания, мыши I/St (Tbc-ls) существенно отличаются по ряду показателей от мышей, несущих резистентный аллель (г) гена ТЬс-1, например, линии A/Sn. Так, у I/St высеваемость микобактерий из органов в 10-100 раз выше, чем у A/Sn, независимо от инфицирующей дозы. Также различаются и темпы развития кахексии - показателя, характерного для терминальной стадии туберкулеза. Чувствительные мыши уже через 15-17 дней после заражения теряют до 15 % веса тела, а к моменту гибели потеря веса составляет 25% от первоначального веса животного. В свою очередь, резистентные мыши к 10 дню после инфицирования набирают 5-10% веса, а к 20 дню возвращаются к показателям, соответствующим началу эксперимента (Nikonenko В. et al., 2000). При этом никакой достоверной разницы в динамике веса у незараженных мышей обеих линий и обоих полов не было выявлено (Lavebratt С. et al., 1999).

Ранее было показано, что у мыши именно легкие являются органом, где идет прогрессивное развитие туберкулезного процесса. Поэтому степень деструктивных изменений легочной ткани (размер гранулем) использовали как количественный признак для характеристики генетического контроля чувствительности к хронической туберкулезной инфекции у зараженных мышей линий I/St и A/Sn. При заражении как высокой дозой М tuberculosis H37Rv так и аттенуированным штаммом М tuberculosis H37Ra в легких I/St микроскопически наблюдались патологические изменения в виде многочисленных гранулем, обильно инфильтрированных мононуклеарами, причем инфильтрат захватывал легочную паренхиму. В то время как у A/Sn выявлялись незначительные периваскулярные и перибронхиальные инфильтраты (Nikonenko В. et al., 2000).

Все вышеперечисленное позволило сделать вывод, что инбредные линии мышей I/St и A/Sn находятся на разных полюсах спектра чувствительности к туберкулезу, что делает их очень привлекательными для работ по картированию гена (генов), определяющего восприимчивость к туберкулезной инфекции. Для анализа сцепления генетического локуса, определяющего тяжесть течения туберкулезного процесса, было использованы методы геномного скрининга и статистической количественной генетики. Удалось выявить достоверное сцепление данного признака с дистальной частью хромосомы 3 и проксимальной частью хромосомы 9. и предположительное сцепление с хромосомами 5, 8, 10, 17 (Lavebratt С. et al., 1999 ). Хотя вокруг областей, содержащих данный локус, находятся гены, контролирующие функции клеток иммунной системы (гены кандидаты), физиологические основы различной чувствительности мышей I/St и A/Sn к туберкулезу остаются не выясненными.

Ген jad.

У мышей линии CBA/N в Х-хромосоме имеется мутантный ген xid, определяющий развитие Х-сцепленного иммунодефицита у мышей. Он выражается в незавершенности В-клеточной дифференцировки. Даже после длительного процесса созревания, В-клетки остаются незрелыми: они не имеют таких поверхностных маркеров как Lyb-3, Lyb-5, Lyb-7, имеют высокую плотность мембранного IgM, не способны реагировать на Mis- суперантигены в реакции смешанной культуры лимфоцитов (CKJ1). Вместе с тем они могут рециркулировать и мигрировать в периферические лимфоидные органы (Scher I. et al., 1975; Sprent J. et al., 1985).

Данный иммунодефицит приводит к повышению чувствительности к ряду патогенов, таких как St. pneumoniae, Ps aeruginosa, S typhimurium (Yother J. et al., 1982; Zwecrink HJ. et al., 1988; O'Brien AD. et al., 1981). При туберкулезной инфекции он проявляется отменой протектнвного эффекта вакцинации BCG мышей CBA/N при сохранении относительной их резистентности к первичной инфекции. При вакцинации и последующем заражении вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv мышей линий СВА (не несут мутантного гена xid) и CBA/N установили, что продолжительность жизни после заражения вакцинированных СВА возрастает примерно вдвое (с 40 до 74 дней) по сравнению с невакцинированными мышами, в то время как у вакцинированных CBA/N она не меняется (35 дней у невакцинированных и 38 дней у вакцинированных животных). Также у вакцинированных мышей CBA/N не наблюдается характерного для других линий усиления реакции ГЗТ на туберкулин (Никоненко Б.В. с соавт., 1990). Чтобы выяснить причины низкого уровня ответа на микобактериальные антигены в реакции ГЗТ, оценили специфический пролиферативный ответ in vitro клеток лимфатических узлов, полученных от вакцинированных мышей СВА и CBA/N. Уровень специфической и неспецифической (на митоген СопА) пролиферации лимфоцитов мышей CBA/N был достоверно ниже, чем у СВА. При совместном культивировании АПК от мышей CBA/N с Т-клетками обеих линий, уровень пролиферации был существенно ниже, чем при использовании АПК от мышей СВА. Учитывая эти данные и тот факт, что количество макрофагов у обеих линий не отличалось, был сделан вывод, что различия в способности стимулировать пролиферацию Т-клеток могут быть обусловлены более низкой антигенпрезентирующей способностью В-клеток CBA/N или менее эффективным их взаимодействием с Т-клетками (Nikonenko В. et al., 1996).

Ген, кодирующий рецептор к витамину D.

Кроме регуляции кальциевого обмена, активный метаболит витамина D 1,25-дигидроксивитаминОз (1,250з) является важным иммунорегуляторным гормоном, который активирует моноциты и стимулирует некоторые реакции клеточною иммунитета, но супрессирует пролиферацию лимфоцитов и синтез цитокинов (Tsoukas et al 1984, Rook et al 1986). Эти эффекты опосредуются через рецептор к витамину D (VDR), представленный на моноцитах, а также активированных Т и В клетках (Prowedini et al, 1983).

Эпидемиологические данные свидетельствуют о связи дефицита витамина D и чувствительности к туберкулезу (Davies P.D.O., 1985) и также показано, что лечение туберкулезных больных этим витамином дает положительный эффект, особенно при туберкулезе кожи. Исследования in vitro показали, что 1,25Эз усиливает способность моноцитов человека контролировать внутриклеточное размножение М. tuberculosis (Rook et al 1986, Denis 1991).

Индивиды с генотипом tt (высокий риск развития остеопороза) имеют максимальный уровень циркулирующего 1,25D3 (Howard et al 1995). Гомозигот по гену tt достоверно меньше среди заболевших туберкулезом, чем в контроле. Это говорит о том, что индивидуумы с таким генотипом могут быть менее чувствительны к туберкулезу, а витамин D может защищать от этой инфекции (Bellamy et al, 1998).

Таким образом, изучая сложный интегральный фенотип, такой как устойчивость к туберкулезной инфекции, мы сталкиваемся с его полигенным генетическим контролем. Вероятно, генов, регулирующих основные феномены естественной резистентности, иммунитета и прочих значимых для организма реакций в борьбе с микобактериями не слишком много, но несомненно и то, что огромное число генов модифицирует действие этих главных локусов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Линейные мыши. Исследования выполнены на мышах инбредных линий I/StSnEgYCit (I/St) и C57BL/6Ycit (В6), поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ РАМН путем инбридинга по общепринятым правилам (Бландова и др. 1983). Гибриды (I/StxC57BL/6)Fl, (I/StxC57BL/6)F2 и потомки возвратного скрещивания [C57BL/6x(I/StxC57BL/6)]BCl получены в этом же питомнике . Всего в работе было использовано 650 мышей. В экспериментах использовались мыши обоего пола, весом 21-24 грамма, в возрасте 2-4 месяцев.

Микобактерии. В работе использовали вирулентный штамм М. tuberculosis H37Rv (Pasteur), полученный из института Пастера (Paris). Микобактерии выращивали в течение 3 недель при 37°С на среде Lowenstein-Jensen (Difco, США), осаждали при 3000 g, отмывали в физиологическом растворе и доводили до концентрации 3-5x107 КОЕ/мл в физиологическом растворе, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США) и 0,05% Tween 80 (Sigma) (Apt A. S. et al., 1991). Аликвоты хранили при -80° С до использования.

М tuberculosis из размороженных аликвот пассировали при 37°С на бульоне Dubos (Difco) с 0,5% БСА - 2 цикла по 7 дней (Lyadova I. V. et al., 1998). Для определения концентрации микобактерий в культуре серийные 5-кратные разведения суспензии наносились в виде капель (объем капель - 20 мкл) на чашки Петри с агаром Dubos (Difco). Чашки Петри культивировали при 37°С, а исходную суспензию хранили при 4°С. Через 3-4 суток культивирования производили подсчет колоний. Концентрация микобактерий в суспензии выражалась числом колониеобразующих единиц микобактерий на мл (КОЕ/мл).

Перед заражением суспензию трижды отмывали центрифугированием (3000g, 15 мин, 4°С) и ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе.

Экспериментальная туберкулезная инФекпня. Для индукции летальной туберкулезной инфекции мышам в латеральную хвостовую вену вводили 5x106 КОЕ H37Rv в 0,5 мл физиологического раствора (Apt A. S. et al., 1993). Выживаемость мышей контролировали ежедневно, начиная с 15 дня после заражения. Данные приведены в виде среднего времени выживания (СВВ).

Высеваемость микобактерий из органов зараженных животных. Через две недели после инфицирования летальной дозой М. tuberculosis H37Rv животных забивали и в стерильных условиях выделяли подмышечные лимфоузлы, легкие и селезенки. Органы гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе и делали серию 10- кратных разведений каждой суспензии. На пластиковые чашки Петри с агаром Дюбо наносили по 100 мкл суспензии каждого разведения. Чашки герметично закрывали и инкубировали при 37°С 18 дней. Затем производили подсчет колоний и пересчитывали количество колоний микобактерий на целый орган.

Культуральные среды. Культивирование клеток in vitro проводили в «среде культивирования», для получения которой в среду RPMI-1640 (HyClone, Carlington, The Netherlands) добавляли HEPES (до конечной концентрации 10 мМ), L-глутамин (2 мМ), 1% заменимых аминокислот, пируват (1 мМ), антибиотики (пенициллин/стрептомицин, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, все ингредиенты - Ну Clone). В культуральную среду добавляли также эмбриональную телячью сыворотку (FCS, Ну Clone) в различных количествах в зависимости от того, для каких целей использовали питательную среду 5% для краткосрочного культивирования клеток и 2% для краткосрочного культивирования клеток в присутствии живых микобактерий. В экспериментах по оценке антимикобактериальной активности макрофагов, требующих совместного культивирования макрофагов и живых микобактерий, антибиотики в культуральную среду не вносили.

На этапе выделения органов и получения клеточных суспензий использовали среду 199 (Sigma, St. Louis, МО) с добавлением 2% сыворотки крупного рогатого скота («среда для выделения клеток»), В зависимости от целей эксперимента в среду вносили или не вносили антибиотики.

Получение суспензии клеток лимфоузлов. Суспензии клеток готовили в стерильных условиях на льду. Подмышечные лимфоузлы от инфицированных мышей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в среде 199 с 2% сыворотки крупного рогатого скота, осаждали клетки центрифугированием при 200 g в течение 10 минут. Клетки трижды отмывали центрифугированием и определяли число жизнеспособных клеток по окраске трипановым синим. Затем клетки переводи пи в среду для культивирования.

АнтигенспепиФнческий пполнФепатнвнын ответ Т-лимфопитов. Для оценки уровня специфического пролиферативного ответа Т-лимфоцитов лимфоузлов, суспензию, содержащую 3x105 клеток в 200 мл среды для культивирования, вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Контрольные и экспериментальные лунки группировали в триплеты. В экспериментальные вносили микобактериальные антигены в виде ультразвукового дезинтеграта M tuberculosis (сониката). Планшет с клетками инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 часов. На последние 12 часов вносили Н3- тимидин (0,5 mkCí) в 10 мкл среды и об уровне пролиферации лимфоцитов судили по включению метки. Подсчет активности проводили на ß- счетчике "Wallac 1409".

Определение продукция цитокинов Т-клетками. Для установления спектра цитокинов, продуцируемых клетками лимфоузла, суспензию клеток (по 3x106 клеток на лунку) культивируют in vitro в лунках 24-луночных плейтов в присутствии антигена (соникат H37R.v в дозе 10 мг/мл) и без него. Супернатанты культур собирают через 4872 часа после начала культивирования. Содержание в них цитокинов ИФН-у, ИЛ-10, ИЛ-5, ИЛ-12, ФНО-а определяют методом ELISA с использованием моноклональных антител фирм PharMingen, Sigma и Genzyme.

Проточная иитофлуорометрия. От 200 тыс. до 500 тыс. клеток дважды отмывали в фосфатном буфере, содержащем 0,01% №N3 и 0,5% БСА. Осадок клеток разводили в фосфатном буфере, содержащем антитела анти-СШ6/С032 (0,2-0,5 мкг в зависимости от количества окрашиваемых клеток) для предотвращения неспецифического связывания (рекомендуемый фирмой Pharmingen "Fc-блок"). Через 5 минут в суспензии добавляли моноклональные антитела, меченые флуоресцентной меткой (из расчета 1 мкг/106 клеток) и инкубировали клетки 30 минут при 4°С. Были использованы одинарные, двойные и тройные окраски моноклональными антителами анти-СОЗ, анти-С04, анти-С08. анти-С044, aHTH-CD45RB (все - Pharmingen), меченными FITC, РЕ и CyChrome. f лрашенные клетки дважды отмывали и фиксировали в 1% параформальдегиде Контрольные пробы отмывали и фиксировали одновременно с опытными, но не добавляли к ним меченых антител. Анализ окрашенных клеток проводили в лаборатории иммунохимии Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). Полученные данные обрабатывали с помощью программы MultiGraph (Coulter). В каждой пробе анализировали не менее 10 тыс клеток.

Получение легочных макрофагов. Суспензию ингерстициальных легочных клеток получали по методу (Holt et al., 1985) в нашей модификации (Lyadova et al., 1998). После анестезии гексеналом (5 мг/мышь) кровеносную систему перфузировали через правый желудочек сердца раствором Версена с антибиотиками (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) до молочно-белой окраски легочной ткани. Для удаления бронхоальвеолярных клеток легкие несколько раз промывали этим же раствором через канюлированный надрез в трахее. Легочные доли измельчали глазными ножницами до кусочков размером 1-2 мм3 и переваривали в RPMÍ 1640, содержащей 10 mM HEPES, 5% FCS, 150 ед/мл коллагеназы, 50 ед/мл ДНК-азы и антибиотики, из расчета 5 мл среды/мышь. После инкубации в течении 90 минут в СО2-инкубаторе полученый дезинтеграт для улучшения моноклеточности интенсивно пипетировали. Суспензию клеток трижды промывали средой 199, содержащей 2% FCS с антибиотиками, ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 5 mM HEPES, 2 тМ глутамином, 10%FCS и антибиотиками, а затем инкубировали в культуральных флаконах Costar (75 см2) в СС^-инкубаторе (60 мин) из расчета 20-30*106 легочных клеток в 8-10 мл на флакон.

Дальнейшую отмывку от неприлипших клеток и перевод макрофагов из монослоя в суспензию проводили в среде без антибиотиков. Суспензия легочных макрофагов состояла из 75-85% эсгеразо-положительных клеток.

Взаимодействие макрофагов с микобактериями осуществляли в плоскодонных 96-луночных культуральных планшетах в СОг-инкубаторе в среде RPMI-1640 с 5 mM HEPES, 2 mM глутамином, 2%FCS без антибиотиков. Суспензию легочных макрофагов переносили в лунки планшета (по 60*103 клеток/100 мкл/лунку) и инкубировали 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляли: суспензию hi. tuberculosis H37Rv (Pasteur) в разных концентрациях. Конечный объем среды доводили до 200 мкл.

Оценка антимикобактериальной активности макрофагов в культуре оценивалась на разные сроки инкубации макрофагов с микобактериями по избирательному включению последними [3Н]-урацила. Метку (1 цСл/10 мкл/лунку) вносили за 18 часов до окончания инкубационного периода. Содержимое лунок переносили с помощью клеточного харвестора Skatron на стекловолоконные фильтры (Skatron) и просчитывали включенную микобактериями радиоактивность на сцинтиляционном счетчике Wallak 1409. Для разрушения монослоя макрофагов перед переносом на фильтры планшет замораживали при -80°С и оттаивали.

Секреция (NO;) макрофагами оценивалась по концентрации нитрит-аниона в супернатантах макрофагальных культур, измеренной с помощью колориметрической реакции нитрит-аниона (NO2) с реактивом Грисса (Migliorini et al,. 1991). Для этого супернатанты 36-40-часовых культур (50 или 100 мкл) переносили в круглодонный 96-луночный планшет (Costar), где к ним добавляли эквивалентный объемом реактива Грисса, который приготавливался непосредственно перед анапизом. Реактив Грисса готовится смеи'иваниом одинаковых объемов растворов А (0,1% нафтилэтилендиамин дигидрохлорид) и В (1% сульфаниламид в 5% HjPO-»). После инкубации реакционной смеси в течении 10 мин при комнатной температуре интенсивность цветной реакции измеряли против отрицательного контроля на автоматическом ри^ере El A (Sigma) при л.=545 нм и фильтре сравнения 630 нм. В качество контроля использовали реакционную смесь, в которой супернатант был заменен эквивалентным объемом культуральной среды, прошедшей ид<. нтичные с супернатантом режимы культивирования. На такой же среде готовили двукоатные разведения KNO2 в диапозоне концентраций 1-100 цМ, который использовали в качестве стандарта при построении калибровочной кривой. Результаты выражали в uM (NO2) /t инкубации(час)/кол-ьо макрофагов/объем лунки (мкл).

Цитопатогенное действие микобактерий на макрофаги определяли через 2,5 суток их совместной ку;,ьтиваци по высвобождению ЛДГ из поврежденных макрофагов во внеклеточную среду. Уровень гибели макрофагов в культуре определяли по формуле:((А 490)0 -(А 49о)к) / ((А 49о)ш«—(А 4,о)к)х100 (%), где (А 490)0 и (А 49о)к - поглощение при Х,=490нм в супернатантах опытней и контрольной (без микобактерий) культуры макрофагов, соответственно, а (А 49о)ш«х - поглощение в супернатантах после полного разрушения макрофагов. (A 49о)тах определяли в лизатах макрофагов, полученных замораживанием (при -80°С) и оттаиванием контрольных (без микобактерий) культур.

Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили с использованием CytoTox 96 kit (Promega, Madison, WI), согласно рекомендациям производителя. В основе работы этого набора лежит следующая двухступенчатая реакция:

ЛДГ (из супернатанта) NAD+ + лактат —» пируват + NADH

Диафораза

NADH + INT* —» NAD+ + формазан (красный) * - йод нитротетразолиум

Получившийся продукт формазан имеет красную окраску, интенсивность которой определяли колориметрически на автоматическом ридере EIA (Sigma) при Х=490нм. Процент специфического лизиса определяли по формуле, приведенной выше. Современный подход к картированию генетических локусов. участвующих вконтроле микобактериальнойинфекции. Для картирования локуса(ов), контролирующего чувствительность к туберкулезу и тяжесть заболевания у мышей, гыбирают две инбредные линии животных, занимающие разные полюсы всего (или почти всего) спектра восприимчивости к этой инфекции. Чаще всего для сравнения линий используют такие показатели чувствительности к инфекции как среднее время выживания после инфицирования, высеваемость микобактеоий из органов, гистопатология легких и динамика потерии веса (развитие кахексии). Например, для картирования гена sst-1 Kramnik et al. (2000) использовали инбредные линии C3HeB/FeJ (СЗН) и C57BL/6J (В6). В работах нашей лаборатории для определения хромосомной локализации генов, контролирующих восприимчивости, использовались оппозитные по восприимчивости линии мышей I/StSnEgYCit (I/St) и A/SnYCit (A/Sn).

Для картирования локусов, влияющих на экспрессию количественного признака, используя ДНК гибридов возвратного скрещивания и гибридов F2, проводят анализ всего генома на сцепление признака, например, тяжести туберкулезного процесса, с микросателлитными и фено.ипическими маркерами. Микросателлиты - это динуклеотидные повторы (СА)П, обладающие высокой полиморфностью: в каждом таком локусе количество п варьирует в пределах популяции, но постоянно для каждой линии животных. Для скрининга генома в сочетании линий I/St и A/Sn , например, использовалось 118 микросателитных и 2 фенотипических маркера, что соответсвует средней плотности маркеров ~ 12сМ и максимальной дистанцией между маркерами ~30сМ (Lavebratt et al., 1999)

Картирование локусов по сцеплению исследуемого признака с микросателлитными маркерами позволяет локализовать на хромосоме участок размером примерно в 10-12 сантиморганид, в пределах которого находится анализируемый локус. Понятно, что идентификация сотен генов, расположенных в нем, крайне сложна и малоэффективна. Лучшим на сегодняшний день методом сужения интервала (до 1 сантиморганиды) является выведение конгенных линий животных, которые отличаются исключительно по небольшому участку хромосомы, окружающему данный QTL. Такой участок может содержать ориентировочно от 40 до 60 открытых рамок считывания (ОРС). Эти ОРС можно секвенироватьс обеих конгенных линий животных, затем, наиболее пристальное внимание уделяют тем из них, у которых наблюдается вариабельность в кодирующих участках и при этом сохраняется способность кодировать полноценную аминокислотную последовательность. Следует иметь в виду, однако, что отсутствие вариабельности в кодирующей части не всегда означает, что данная ОРС не является кандидатом для дальнейших исследований (например, ген может существенно менять экспрессию в зависимости от типа клеток, что будет биологически значимо). Среди полиморфных генов в первую очередь изучают гены-кандитаты, то есть гены так или иначе влияющие (согласно представлениям исследователя) на изучаемый признак, в нашем случае, на течение и тяжесть туберкулезного процесса.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли критерий Стьюдента. Полученные данные обсчитывали с помощью программы БИОСТАТ (Практика, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение.

В трех ранее проведенных исследованиях по скринингу генома мыши (Lavebratt С. et al., 1999; Kramnik I. et al., 2000; Mitsos L.M. et al., 2000), было обнаружено нескольких участков хромосом, участвующих в контроле туберкулезной инфекции. Многие из этих участков относятся к разным хромосомам, хотя, есть основания полагать, что некоторые QTL, участвующие в контроле туберкулеза, образуют кластеры. Так, в хромосоме 1 сцеплены ген Nramp 1 и QTL sstl (Kramnik I. et al., 2000), а в хромосоме 3 сцеплены QTL tbsl (Sanchez et al., 2002) и Tlr2 (Mitsos L.M. et al., 2000). Судя по характеру наблюдаемых расщеплений при генетическом анализе, не вызывает сомнения, что существует и другие, может быть, не менее важные полиморфные QTL, участвующие в контроле туберкулезной инфекции, которые не сегрегировались в использованных ранее сочетании линий (Lavebratt С. et al., 1999; Kramnik I. et al., 2000; 2002).

Для поиска новых локусов методами скрининга генома мы выбрали комбинацию инбредных линий с необычным типом наследования чувствительности и резистентности к туберкулезу: животные обеих родительских линий чувствительны к туберкулезу, тогда как их гибриды первого поколения сверхрезистентны к этой инфекции.

Линия мышей I/St, наиболее чувствительна к инфекции по сравнению с более чем с 30 исследованными ранее линиями мышей. (Мороз A.M. с соавт., 1977; Авербах М.М. с соавт., 1980). Вторая линия C57BL/6 (В6) резистентна к заражению низкими дозами М. tuberculosis (Medina Е, North RJ., 1996; Kramnik I. et al, 2000), но при внутривенном заражении высокими дозами в нашей модели летального туберкулеза проявляет себя как чувствительная линия (Nickonenko B.V. et al., 1985; Никоненко Б.В. с соавт., 1990). Таким образом, в нашей модели обе линии ведут себя как чувствительные к туберкулезу. В тоже время гибриды (I/St х B6)F1 между этими линиями являются сверхрезистентными. После внутривенного заражения туберкулезом эти животные выживают достоверно дольше мышей не только любой из родительских линий, но и любой другой резистентной линии, исследованной в нашей модели.

I. Противотуберкулезная резистентность мышей.

Основными показателями уровня резистентности животного к туберкулезу являются срок выживаемости после инфицирования, динамика потери веса тела (развитие кахексии), способность контролировать размножение микобактерий в органах (то есть количество микобактерий, измеряемое в КОЕ) и степень патологических изменений легочной ткани.

1.1. Выживаемость и динамика потери веса.

В первой серии экспериментов мы проверили, сохраняются ли различия по чувствительности к туберкулезу при заражении животных не M tuberculosis из коллекции ЦНИИТ РАМН, а стандартными штаммами Pasteur (Intitute Pasteur, Paris). Оказалось, что выживаемость животных, зараженных штаммом Pasteur, полностью соответствует срокам выживаемости, полученным при работе со штаммом из коллекции ЦНИИТ РАМН. Как показано в таблице 1, мыши инбредных линий I/St и В6 чувствительны к туберкулезу и выживают достоверно меньше, чем высокорезистентные гибриды (I/St х B6)F1. Кроме того, мы обнаружили, что самцы как родительских линий, так и их гибридов F1 выживают дольше, чем самки этих же линий. Вероятно, это можно объяснить влиянием зависимых от пола факторов, например, половых гормонов (Tsuyuguchi К. et al., 2001; Hernandez-Pando R. et al., 1995), поскольку сцепления скорости гибели с Х-хромосомой обнаружено не было (данные не приводятся).

Таблица 1. Выживаемость мышей после внутривенного заражения летальной дозой М. tuberculosis H37Rv.

Линия мышей Среднее время выживаемости (СВВ), дни самки самцы

I/St 21.5 ± 1.2 26.3 ± 1.7

Вб 27.5 ± 2.: 31.4 ± 2.0

1/St х B6)F1 95.6± 5.2 114.4± 11.2 различия по выживаемости у В6 и (I/St х B6)F1 , а также у I/St и (I/St х B6)F1 высоко достоверны для обоих полов (р<0.01).

Мы предположили, что наследование резистентности к туберкулезу по типу сверхдоминирования или гетерозиса может объясняться либо наличием генетической комплементации между рецессивными аллелями неизвестных пока генов, которые определяют чувствительность в каждой из родительских линий, либо сильным влиянием гетерозиготности на способность мышей контролировать туберкулезную инфекцию, что является характерной чертой количественных генетических признаков, либо сочетанием этих факторов.

Еще один важный показатель тяжести течения туберкулезной инфекции - это скорость потери веса (кахексии) у инфицированных животных. Нами исследовалась динамика потери веса по мере развития туберкулезного процесса у животных родительских линий I/St, В6 и их гибридов (I/St х B6)F1. К 10 дню после инфицирования мыши I/St и (I/St х B6)F1 продолжали набирать вес, тогда как мыши линии В6 сразу после заражения начинали его терять (рисунок 1). К 20 дню у животных родительских линий обоего пола наблюдалась значительная потеря веса. Самцы I/St и В6 к этому времени теряют вес примерно одинаково (потеря составляет около 12%). Для самок характерна большая разница в потери веса между животными родительских линий. После 10 дня самки I/St начинают быстро терять вес и к 20 дню потеря составляет 20%, тогда как у В6 - не более 10%. Важно отметить, что к моменту гибели мыши В6 обоего пола терют вес в той же степени, что и мыши I/St (около 20%). Высокорезистентные гибриды (I/St х B6)F1 теряют вес значительно медленнее (самки) или вообще продолжают набирать вес (самцы) в течение первых двух месяцев после заражения.

Таким образом, для животных родительских линий I/St и В6 характерна значительная потеря веса после инфицирования М. tuberculosis. Важно отметить разную динамику развития кахексии, хотя ее степень уравнивается: для мышей I/St характерно резкое падение веса в терминальной фазе инфекции, а у мышей В6 происходит плавное снижение веса, начинающееся сразу после инфицирования. Это может свидетельствовать о различном генетическом контроле этого количественного признака у двух линий мышей. У высокорезистентных гибридов F1 непосредственно перед гибелью (>100 дней) также развивается кахексия, по тяжести сравнимая с животными родительских линий (потеря веса у самок составляет 15%, у самцов—12%). А

О 10 20 30 40 50 60 70

Дни Б

140

60

0 10 20 30 40 50 60 70

ДНИ

Рисунок 1. Потеря веса мышами линий I/St, В6, F1 после инфицирования. А - самцы; В - самки.

Для эксперимента брали 7-9 животных одинакового исходного веса (21-23 г.), измерения веса проводили каждые 10 дней после заражения.

Различия по весу достоверны (р<0,01) на 20 день после заражения между обеими родительскими линиями и гибридами F1 у обоих полов; на 30 день различия достоверны (р<0,01) между мышами В6 и F1 обоего пола.

-481.2. Характер наследования тяжести течения инфекции: анализ расщепления у гибридов F2 (B6xl/St) и ВС1[В6 х (I/St х B6)F11.

Для выяснения характера наследования чувствительности к туберкулезу в нашей модели, нами были получены потомки возвратного скрещивания [В6 х (I/St х B6)F1]BC и гибриды (I/St х B6)F2 и исследованы динамика гибели и потери веса после заражения.

Характер расщепления животных (I/St х B6)F2 и [В6 х (I/St х B6)F1]BC1 по выживаемости после внутривенного заражения летальной дозой М. tuberculosis представлен соответственно на рисунках 2 и 3.

Из рисунков видно, что во всех группах четко выделяется компактный пик близких по срокам жизни мышам родительских линий короткоживущих животных, а более резистентные особи значительно различаются по срокам гибели, и поэтому четкого пика не образуют. Для проведения границы между чувствительными и резистентными животными, от среднего времени выживания более резистентной родительской линии В6 откладывали интервал, равный 2а, позволяющий отделить достоверно отличающуюся от резистентных группу чувствительных животных. Животные, выживающие меньше СВВ+ 2ст считались чувствительными. Для самок граница прошла по 34 дню (27,5+6,3= 34 дня), для самцов по - 37 дню (31,4+6,0=37 дней). Следует отметить, что выделенная таким образом группа чувствительных животных, четко соответствуют области пика на рисунке. Анализируя характер полученного расщепления, мы предположили, что каждая из родительских линии несет один "главный" рецессивный аллель, определяющий чувствительность этой линии, а также потомков от любого скрещивания, если этот аллель находится в гомозиготном состоянии, причем, соответствующие гены не сцеплены и расщепляются независимо. Если наше предположение верно, то у гибридов F2 можно ожидать расщепление о* э 8

3 e Z и X а 6 о S и о в о 4

03 fи 4> т 2

4 * о и 0

• ••

• • • •• •

• • • • • •

15 25 35 45 55 65 75 дни после заражения

85

95

105

12

5 ¡10 8 s ° 3 о

Я ^ fe 6 с о & 4

0) т S

§ 2

• •

• ••

•• • •• • •

15 25 35 45 55 65 75 85 95 дни после заражения

105 115

Рисунок 2. Расщепление по выживаемости у гибридов F2(B6xI/St) после заражения М.tuberculosis H37Rv. А - самки, Б - самцы. Показаны дни гибели индивидуальных животных. Отрезком обозначен интервал 2о, позволяющий разделять группы чувствительных и резистентных животных. А ав «

§ 4 л S

93 • •• le х U о Б о 2 •• • • • ••

90 Б т 1 тшштт •• • «в т •• о 0

15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 дни после заражения v С л g 5 • 3 7 4 •

1 ■-♦-• s , из • • • • с о н 2 ••• • • • •• • и

V X а

§ | • ••• •• • • • ••• • • •• • • 0

15 25 35 45 55 65 дни после заражения

Рисунок 3. Расщепление по выживаемости у [ибридов возвратною скрещивания BC[B6xFl(B6xI/St)] после заражения М tuberculosis H37Rv. А - самки, Б - самцы.

Показаны дни гибели индивидуальных животных. Отрезком обозначен интервал 2а, позволяющий разделять группы чувствительных и резистентных животных. чувствительные:резистентные животные равное 7:9, как при классическом менделевском дигибридном скрещивании. Для возвратного скрещивания на любую из родительских линий соотношение будет равно 1:1, так как у 50% потомков один из рецессивных "алле - - л чувствительности" оказывается гомозиготным. При этом, разнообразие в группе резистентных животных определяемое, по-видимому, генами-модификаторами, у потомков возвратного скрещивания должно быть снижено. Анализ расщепления у гибридов F2 и потомков возвратного скрещивания [В6 х (I/St х B6)F1]BC1 приведен в таблице 2.

Таблица 2. Характер расщепления чувствительных и резистентных животных свидетельствует о контроле чувствительности двумя независимыми аллелями.

Мыши Расщепление х2 Вероятность

Самки F2 46:66 0,29 р<0.001

Самцы F2 52:74 0,33 р<0.001

Самки ВС1 15:25 2,5 р< 0.05

Самцы ВС1 16:18 0,118 /?<0.001

Для обоих типов скрещивания гипотеза о наличии у каждой из родительских линии мышей одного главного рецессивного аллеля, участвующего в контроле туберкулезной инфекции, подтвердилась. Важно отметить, что эти локусы распределяются независимо, то есть не сцеплены. Учитывая, что в других моделях туберкулезной инфекции линия В6 выступает в качестве резистентного партнера (Кгатшк I. е1 а!., 2000; МИэоз 1-.М. е1 а1., 2000), велика вероятность того, что обнаруженный "аллель чувствительности" принадлежит ранее неизвестному локусу.

-521.3. Высеваемость микобактерии из органов инфицированных животных.

Высеваемость микобактерий из органов зараженного животного является показателем способности последнего сдерживать размножение патогена. Как правило, из органов чувствительных мышей высевается в 10-100 раз больше микобактерий, по сравнению с резистентными животными (Nikonenko B.V. et al., 1996, 2000; Kramnik I. et al., 2000). Поскольку гибриды Fl(B6xI/St) являются наиболее резистентными среди выбранных линий по срокам выживания, можно было ожидать, что из их органов будет высеваться существенно меньше микобактерий. Мышей родительских инбредных линий I/St, В6 и их гибридов Fl(B6xI/St) заражали внутривенно летальной дозой 5 х 106 КОЕ М tuberculosis H37Rv и через две недели производили забор лимфатических узлов и легких для высева. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3. Высеваемость микобактерий из органов инфицированных животных *

Линия мышей КОЕ, лимфоузлы КОЕ, легкие

I/St 1,7+0 2 х 106 3,6+0,6 х 108

В6 3,2±0 7 х 105 1,0±0,1 х 108

Fl(B6xI/St) 1,3±0 2 х 105 4,3+0,8 х 107

В таблице суммированы результаты двух экспериментов (лимфоузлы N=6; легкие N=7).

В стерильных условиях выделяли легкие и подмышечные лимфоузлы у инфицированных животных и делали гомогенаты этих органов. Серии десятикратных разведений в физиологическом растворе высевали на чашки с агаром Дюбо. Через 18 дней производили подсчет колоний на чашках и пересчитывали число КОЕ на орган.

Из результатов следует, что мыши I/St, как наиболее чувствительные, хуже всех контролируют размножение микобактерий после внутривенного заражения. Разница по высеваемости достоверна даже между мышами I/St и мышами другой родительской линии В6 (/><0.01), хотя обе чувствительны к туберкулезу. Наиболее существенные различия наблюдаются между животными, занимающими разные полюса спектра чувствительности, то есть между I/St и Fl(B6xI/St). В этой паре различия были 10-кратными, как для лимфатических узлов, так и для легких (р<0.01).

Обращает на себя внимание тот факт, что из лимфоузлов высевается в 10 раз меньше микобактерий по сравнению с инфицирующей дозой, тогда как из легких чувствительных животных - в 10 раз больше микобактерий, чем было введено. Вероятно, при внутривенном введении микобактерий первоначально они распределяются по всему организму мыши, но туберкулезный процесс протекает преимущественно в легочной ткани, где и создаются наилучшие условия для размножения паразита, особенно это касается легких чувствительных к туберкулезу мышей. Согласно данным литературы (Lyadova I.V. et al, 2000, North R.J. et al„ 1999; Dunn P L. and North R.J., 1995), количество микобактерий продолжает прогрессивно нарастать в ходе туберкулезного процесса именно в легких, тогда как в лимфоидных органах, например в селезенке, их количество стабилизируется или даже несколько снижается. Таким ооразом, результаты оценки высеваемости микобактерий подтвердили, что родительские линии мышей В6 и I/St являются чувствительными к туберкулезу и не способны контролировать размножение микобактерий в органах при заражении в высокой дозе, тогда как гибриды Fl(B6xI/St) резистентны и способны более эффективно сдерживать инфекцию.

1.4. Патология легочной ткани.

Как отмечалось выше, туберкулез является заболеванием с преимущественно легочной локализацией, в том числе при экспериментальном заражении мышей, поэтому обширность поражения и тяжесть деструктивных изменений в этом органе наилучшим образом характеризуют генетически детерминируемую чувствительность к туберкулезу. Через две недели после заражения летальной дозой М. tuberculosis H37Rv в легких мышей всех изучаемых линий наблюдаются признаки туберкулезного поражения, но их степень варьирует от чрезвычайно сильной до умеренной. У мышей линии I/St (Рис. 4) отмечается резко выраженное полнокровие крупных сосудов и капилляров межальвеолярных перегородок. Перегородки значительно утолщены за счет инфильтрации. По всей ткани легкого отмечаются макрофагальные и лимфоцитарные гранулемы, расположенные перибронхиально, периваскулярно, а также субплеврально. Мононуклеарный инфильтрат значительно выражен, сливается в крупные пневмонические фокусы. В просветах бронхов наблюдается картина гнойного туберкулезного бронхита, перибронхиальная лимфатическая ткань гипертрофирована. При цитологическом исследовании видно, что в гранулемах много зрелых макрофагов, содержащих палочковидные формы микобактерий, где они, очевидно, размножаются. (рис.5)

Рисунок 4. Гистологический препарат ткани легкого мыши линии I/St, зараженной летальной дозой М. tuberculosis H37Rv. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х60.

Рисунок 5. Отпечаток ткани легкого мыши линии I/St, зараженной летальной дозой М. tuberculosis H37Rv. Макрофаги, содержащие скопления микобактерий. Окраска по Романовскому-Гимзе, микобактерии окрашены по Цшпо-Нильсену. Увеличение хбОО. Вставка: единичный макрофаг, содержащий микобактерии. Окраска по Романовскому-Гимзе, микобактерии окрашены по Цилю-Нильсену. Увеличение х!500.

Патологические изменения меньше выражены у мышей В6, инфицированных такой же дозой (рис.6). В легких выявляется лимфоци;арно-макрофагальный инфильтрат, расположенный как периваскулярно, так и перибронхиально. Выявляются чаще единичные некрупные лимфоцитарно-макрофагальные гранулемы, локализуюющиеся вблизи бронхов и субплеврально. Межальвеолярные перегородки даже вне зон гранулем существенно утолщены за счет макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации. Нигде не удалось выявить картины туберкулезного бронхита.

Еще менее выражено поражение легочной ткани у гибридов F1 (рис.7). Инфильтрация выражена незначительно, захватывает преимущественно перибронхиальные и периваскулярные зоны. Выявляются только мелкие гранулемы. Вне зон инфильтрата легкое воздушно, в некоторых областях межальвеолярные перегородки незначительно утолщены за счет макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации. В формирующихся здесь инфильтратах и гранулемах преобладают молодые мононуклеары. Микобактерии в легочных макрофагах микроскопически не обнаруживаются.

Таким образом, через 2 недели после внутривенного заражения летальной дозой туберкулеза патологическая картина в легком существенно различается у мышей I/St и гибридов F1. Вместе с этим, мы показали, что бактериальная нагрузка у этих мышей отличается в 10 раз. Естественно было предположить, что патологическая картина в легком во многом определяется бактериальной нагрузкой. Чтобы проверить правильность этого предположения, мы заразили мышей I/St и гибридов F1 дозами микобактерий, различающимися 25 раз, что позволило уравнять бактериальную нагрузку к 2 неделям после заражения у этих животных (данные не приводятся).

Рисунок 6. Гистологический препарат ткани легкого мыши линии В6, зараженной летальной дозой М. tuberculosis H37Rv. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х60.

Рисунок 7. Гистологический препарат ткани легкого гибрида F1, зараженного летальной дозой М. tuberculosis H37Rv. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х60.

Оказалось, что гистологическая картина легкого I/St существенно не отличается оттаковой при летальной дозе инфицирования (Рис. 8), то есть значительное снижение инфицирующей дозы не отразилось на патофизиологических процессах в легком. Следовательно, тяжесть туберкулезного процесса и характер поражения легочной ткани напрямую не зависят от бактериальной нагрузки, но, скорее, определяются генетически детерминированной реактивностью организма. Например, существенный вклад в определение тяжести легочной патологии может вносить ген 1 хромосомы sstl (Kramnik I. et al., 2000). К сожалению, пока неизвестно, какой аллель этого гена присутствует у мышей I/St, и можно ли объяснить тяжесть легочной патологии у этих мышей наличием "аллеля чувствительности". Очевидно, что мыши I/St несут целый ряд локусов, определяющих чувствительность к туберкулезу, часть из которых пока не картированы.

II. Параметры противотуберкулезного иммунитета.

Описанные выше различия противотуберкулезной резистентности четко показали разницу между мышами родительских линий и их гибридами по чувствительности к инфекции. Пытаясь обнаружить возможные причины этих различий на уровне клеточных механизмов защиты, было решено исследовать основные параметры специфического иммунного ответа организма-хозяина. Микобактерия - внутриклеточный паразит, поражающий клетки макрофагальноги ряда. Помимо механизмов естественной резистентности, для успешной борьбы с паразитом макрофагу требуется активирующий сигнал Т-лимфоцитов (Cooper A.M. et al., 1995; Orme I.M. et al., 1992, 1993; Kaufmann S.H.E., 2001). Нарушение в любом из

Рисунок 8. Гистологический препарат ткани легкого мыши линии I/St, зараженной 1/25 летальной дозы М tuberculosis H37Rv. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х60. звеньев цепи этих сложных взаимодействий может приводить к значительному снижению резистентности к микобактериям. Согласно этим соображениям, нами были изучены некоторые параметры Т-клеточного и макрофагального звеньев иммунитета, обычно рассматриваемые как основные при защите от микобактерий.

II. 1. Т-клеточный ответ.

II. 1.1. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов in vitro на микобактериальные антигены.

Для выявления в лимфоузлах Т-лимфоцитов, специфичных к микобактериальным антигенам, и сравнения степени их сенсибилизированности к микобактериям у чувствительных и резистентных мышей через две недели после заражения летальной дозой М. tuberculosis H37Rv, у мышей линий I/St и В6, а также их гибридов Fl(I/StxB6), выделяли подмышечные лимфоузлы и исследовали способность Т-лимфоцитов отвечать на микобактериальные антигены в пролиферативном тесте.

Таблица 4. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов подмышечных лимфоузлов через 2 недели после заражения летальной дозой М tuberculosis H37Rv*

Линия мышей СРМ (имп./мин.)** IS*** контроль Соникат H37Rv

I/St 5633±866 27543±2775 4,9

В6 2143±314 16907^1575 7,9

Fl(I/StxB6) 4468±668 27783±5883 6,2

В таблице представлены суммированные результаты (М±т) трех независимых экспериментов, в каждом из которых использовалось от 3 до 5 животных. **СРМ оценивали по включению [Н3 - тимидина]. ♦♦■"Бсиндекс стимуляции) = СРМС0Ник.гг/ СРМкотроль

Как видно из таблицы 4, Г-клетки мышей обеих родительских линий и их гибридов активно пролиферируют, причем, как спонтанно так и в ответ на соникат H37Rv. Обращает на себя внимание тот факт, что клетки мышей I/St спонтанно пролиферируют активнее, чем Т-лимфоциты мышей В6. При этом, индекс стимуляции для клеток I/St достоверно не отличается от индексов для клеток мышей двух других групп. Этот результат согласуются с многочисленными данными нашей лаборатории, полученными ранее (Lyadova I.V. et al, 1998, 2000). Можно предположить, что столь высокие значения спонтанной пролиферации у чувствительных мышей могут быть связаны с большей бактериальной (а, следовательно, и антигенной) нагрузкой через две недели после инфицирования. Однако, в этом случае, минимальную пролиферативную активность следовало бы ожидать у мышей Fl(I/StxB6), что не соответствует полученным данным: у гибридов характер пролиферации Т-лимфоцитов практически не отличается от мышей I/St (таблица 4). У мышей линии В6 отмечена минимальная спонтанная пролиферация лимфоцитов (несмотря на высокую антигенную нагрузку), но клетки начинают активно пролиферировать при взаимодействии с антигенами микобактерий (индекс стимуляции составляет 7,9) Таким образом, можно сделать вывод, что у мышей чувствительных родительских линий нет выраженного дефекта Т-клеток в способности отвечать на антигены микобактерий, который мог бы снижать их резистентность к туберкулезу. Вместе с тем, встает вопрос о том, какой уровень пролиферативного ответ играет протективную, а какой уже патологическую роль.

Пролиферация является необходимым этапом дифференцировки лимфоцитов и образорания эффекторов и клеток памяти. Однако, избыточная пролиферация может играть и патологическую роль в туберкулезном процессе. С одной стороны, активное деление Т-клеток с последующей их миграцией в легкое может приводить к нарушениям структурно-функциональных свойств его ткани (обширные инфильтраты, наблюдающиеся у мышей после заражения летальной дозой туберкулеза, сокращают дыхательную поверхность легких, приводят к спадению альвеол), с другой стороны, одним из следствий бурной пролиферация может быть формирование незрелых Т клеток.

II.1.2. Продукция цитокинов клетками лимфатических узлов.

Среди эффекторных механизмов действия Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции ведущая роль принадлежит секреции цитокинов (Shams H., et al., 2001; Kerksiek К.M., et al., 1999; Daniel and Boom, 2000). В связи с этим представляло интерес сравнить уровень продукции различных цитокинов у чувствительных мышей I/St и В6 и резистентных мышей F| при экспериментальной туберкулезной инфекции. Клетки подмышечных лимфатических узлоч, выделенные через 2 недели после внутривенного заражения, культивировали in vitro в присутствии микобактериальных антигенов (сониката H37Rv) и определяли содержание цитокинов в супернатантах таких культур.

Спектр изучаемых цитокинов определялся тем, что активация макрофагов происходит под действием цитокинов типа 1, в первую очередь, ИФН-у, который на стадии активного адаптивного ответа преимущественно вырабатывается антигенспецифическими Т-лимфоцитами Thl и является одним из основных факторов, влияющих на бактерицидную функцию макрофагов. В частности, под действием ИФНу происходит активация iNOS (индуцируемая NO синтетаза) с последующим образованием RNI (активные формы азота) в макрофагах (Dalton et al, 1993; Biron and Gazzinelli, 1995, McMicking J.D. et al., 1997).

Можно предполагать, что резистентные животные должны синтезировать наибольшее количество цитокинов I типа, тогда как чувствительные мыши будут не способны вырабатывать необходимые количества этих факторов. Полученные нами данные представлены на рисунке 9.

Как и ожидалось, клетки высокочувствительных мышей линии I/St вырабатывают достоверно меньше цитокинов типа 1, а именно, ИФН-у (р<0.01) и ФНОа (/?<().05), чем клетки В6 и Fl(I/StxB6). С другой стороны, максимальная продукция этих цитокинов отмечалась в культурах клеток мышей линии В6, которая также чувствительна к инфекции, а резистентные гибриды занимали промежуточное положение.

ИЛ-4 и ИЛ-5 не выявлялись ни в одном опыте, что, очевидно, отражает тот факт, что микобактериальные антигены индуцируют развитие иммунного ответа преимущественно по типу 1 (Russo et al, 2000; Erb et al, 1998). Вместе с тем, антивоспалительный цитокин ИЛ-10 продуцировался клетками мышей I/St в меньшем (р<0.05) количестве. Этот результат противоречит данным, полученным на модели хронической инфекции у мышей I/Sl (Lyadova I V. et al, 1998, 2000), согласно которым мыши I/St продуцируют большее ИЛ-10, чем более резистентные животные. Противоречие может объясниться острым характером воспаления в нашей модели, при котором выработка ИЛ-10 оказывается подавленной уже на второй недели инфекции, вскоре вступающей в терминальную фазу. пкг 30000

25000

20000

15000

10000

5000 0

ИФН-гамма

I/St В6 линия мышей

Fl(I/StxB6) пкг 2000

1600

1200

800

400 О

ФНО-альфа

I/St

В6 линия мышей

Fl(I/StxB6)

II кг

9000 7500 6000 4500 3000 1500 О

ИЛ -10 l/St

JM1HI фгг. iV

SPa-'f

B6 линия мышей

Fl(I/StxB6)

Рисунок 9. Продукция цитокинов в культуре in vitro клетками подмышечных лимфоузлов через две недели после заражения.

Поскольку активный синтез протективных цитокинов I типа наблюдается у чувствительных животных линии В6, но не I/St, можно предполагать, что дефекты противотуберкулезной защиты изучаемых мышей проявляются на разных уровнях.

Слабая продукция клетками мышей I/St цитокинов первого типа (ИФН-у, ФНО-а) может быть одной из причин их высокой чувствительности к туберкулезу, поскольку эти цитокины оказывают влияние как на дифференцировку моноцитов и эффекторные функции зрелых макрофагов, так и на созревания и функционирование Т-лимфоцитов и гранулемообразование (Cooper A.M. et al., 1997).

Известно, что полное отсутствие любого из основных цитокинов типа 1 (ИФН-у, ИЛ-12, ФНО-а) или рецепторов к ним у мышей, несущих нокаут-мутации, приводит к развитию диссеминированных микобактериальных инфекций и быстрой гибели животных (Newport М. et al., 1996,1999; Jouanguy Е. et al., 1996; Cooper A M. et al.,1993). Вместе с тем, для нормального функционирования всех звеньев иммунологической защиты необходима, как правило, совместная работа нескольких цитокинов. Так, для поляризации Т-лимфоцитов в сторону Thl требуется присутствие как ИФН-у, так и ИЛ-'2 (Cooper al, 1997). Влияние на макрофаги ИФН-у во многом зависит от одновременного присутствия других факторов, в частности, ФНО-а (Denis М. et al., 1991; Flynn J., 1993, 1995; Chan J. et al„ 1992; Byrd T.F., 1998; Schaible U E. et al„ 1998). Локальная продукция ИФН-у и ФНО-а важна для дифференцировки и активации моноцитов, недавно достигших очага инфекции. При этом, наряду с протективными функциями (Kindler V. et al., 1989; Flynn J. L. et al., 1992), ФНО-а может играть важную роль в иммунопатологии (Rook, G., and R. Hernandez-Pando. 1996; Bekker L-G et al., 2000). Было показано, что Mtuberculosis синтезирует фактор, который повышает чувствительность инфицированных клеток к токсичности ФНО-а (Filley Е. A. et al., 1991, 1992).

Хотя нередко можно встретить утверждение, что при туберкулезе протективный иммунный ответ связан с развитием ответа по типу Thl, тогда как преимущественная активация Th2 ассоциирована с чувствительностью к туберкулезу (Wangoo et al, 2001; Modlin R. L. et al., 1994; Sanches F. O. et al., 1994). По-видимому, для эффективной борьбы с инфекцией важно соотношение цитокинов 1 и 2 типов. Так, ИЛ-10 ингибирует образование N0 и ФНО-а, инактивирует антибактериальную активность макрофагов, и способствует развитию Т-клеточного ответа по типу Th2, но при этом является важным модулятором микобактериального клиренса in vivo (Zhang М. et al., 1994, 1995). Применительно к нашим данным, относительно слабо сниженная продукция ИЛ-10 на фоне многократно пониженной продукции ИФН-у клетками мышей I/St может вносить существенный вклад в чувствительность этих мышей к туберкулезу.

В то же время, количественные вариации этих цитокинов между мышами I/St и В6, не влияют коренным образом на общую противотуберкулезную резистентность животных. Кроме того, низкие уровни продукции всех изученных цитокинов ) мышей I/St при высокой пролиферативной активности Т-лимфоцитов могут свидетельствовать о том, что эти клетки могут не успевать дифференцироваться в Т-хелперы I или II типа, а преимущественно продолжают пролиферировать, оставаясь на стадии Т-хелперов 0 и продуцируя целый спектр цитокинов в низких концентрациях. Об этом говорят и результаты исследования Т-клонов, полученных из лимфоцитов I/St, многие из которых имели цитокиновый профиль ThO (Lyadova I.V. et al, 1998).

II. 1.3. Характеристика поверхностных маркеров Т-клеток.

Ранее рядом авторов было показано, что течение туберкулезной инфекции сопровождается появлением активированных Т-лимфоцитов в селезенке и лимфатических узлах зараженных экспериментальных животных (Feng et al, 1999; Daniel, Boom, 2000; Lalvani et al, 2001). Известно, что "покоящиеся" лимфоциты CD4+ и CD8+ характеризуются низким уровнем экспрессии молекул CD44 и относительно высокой экспрессией молекул CD45RB. Активация лимфоцитов CD4+ сопровождается увеличением экспрессии молекул CD44 и снижением экспрессии молекул CD45RB (Griffin, Orme, 1994). При активации лимфоцитов CD8+ также происходит увеличение экспрессии ими молекул CD44, однако, экспрессия молекул CD45RB при этом не обязательно снижается (Cooper et al, 1997, Feng et al, 1999). В настоящей работе методом проточной цитофлуорометрии была изучена экспрессия молекул CD44 и CD45RB на лимфоцитах подмышечных лимфоузлов после внутривенного заражения мышей летальной дозой M tuberculosis. Результаты определения экспрессии молекул CD44 и CD45RB на популяциях лимфоцитов CD4+ и CD8+ приведены в таблице 5.

Таблица 5. Процент активированных Т-лимфоцитов у инфицированных животных*

Линия мышей Популяция клеток

CD4+: (CD44hlCD45RB"/low) CD8+ (CD44h,CD45RB+)

I/St 39,2 41,8

36 34,9 40,3

F, 37,6 44,9

-70* Суспензии клеток подмышечных лимфоузлов, полученные через 2 недели после заражения мышей, обрабатывали антителами: FITC-aHTH-CD44, PE-aHTH-CD45RB и Cy5-aHTH-CD4 или ПТС-анти-С044, PE-aHTH-CD45RB и Су5-анти-С08 и анализировали методом проточной цитофлуорометрии. Результаты приведены в процентах от всей популяции соответствующих клеток.

Как видно из таблицы, у всех изучаемых мышеи Т-лимфоциты активированы одинаково слабо. Активировано примерно по 40% CD4 и CD8 клеток. Количество активированных CD4 и CD8 клеток достоверно не различается у разных групп животных, хотя у мышей В6 и F1 отмечается несколько больше активированных лимфоцитов CD8, по сравнению с CD4. Такой низкий уровень активации лимфоцитов, вероятно, можно объяснить разными причинами для разных групп животных. У чувствительных мышей через две недели после инфицирования наступает угнетение иммунологических реакций за счет супрессорного действия самих микобактерий и зараженных макрофагов (Apt A S. et al., 1991). С другой стороны, у резистентных мышей, вероятно, только начинает развиваться ответ на возбудителя и клетки еще слабо активированы.

Еще одна важная молекула, экспрессия которой коррелирует с активацией Т-клеток - CD28. Это ко-стимулирующая молекула непримированных Т- клеток, являющаяся рецептором для молекул В7 на антигенпрезентирующих клетках. Ее взаимодействие с молекулами В7 необходимо для стимуляции выработки ИЛ-2, созревания Т- клеток, их активации в ответ на антиген и пролиферации Показано, что отсутствие этого дополнительгого сигнала может приводить к анергии Т-клеток (Schwartz R.H., 1990; Harding F.A., et al., 1992 ) и их апоптозу (Shi Y , et al., 1995; Boise

L.H., et al., 1995; Noel P.J., et al., 1996). Характер экспрессии этого поверхностного маркера представлен в таблице 6.

Таблица 6. Экспрессия молекулы CD28 на Т-лимфоцитах подмышечных лимфоузлов.*

Линия мышей Популяция клеток

CD28+

CD4 CD8

I/St 70,4 54,8

В6 51,6 39,3

F1 63,2 44,0 Экспрессию молекул CD28 на лимфоцитах лимфоузлов определяли, обрабатывая суспензию клеток моноклональными антителами: FITC-aHTH-CD4, РЕ-анти-С08 и Су5-анти-С028 Процент клеток, экспрессирующих молекулы CD28, определяли отдельно для каждой популяции Т-лимфоцитов (CD4f и CD8*).

Анализируя данные, приведенные в таблице, можно отметить достаточно высокий процент С028-положительных лимфоцитов, причем, их процент среди клеток CD4 на 10-20% больше, чем среди клеток CD8. Интересно отметить, что у наиболее чувствительных мышей I/St зарегистрирован самый высокий процент Т-клеток CD28+ (70,4 % для CD4 и 54,8% для CD8). В то же время, вторая чувствительная линия В6 характеризуется самыми низкими показателями (51,6% для CD4 и 39,3% для CD8). Мыши F1 занимают промежуточное положение. Следовательно, ни относительно высокая, ни относительно низкая экспрессия этого маркера не коррелирует с резистентностью животного к туберкулезу.

Вместе с тем, не исключено, что повышенный процент клеток, несущих молекулу CD28 у мышей I/St, может служить объяснением усиленной пролиферативной активности Т-лимфоцитов у этих мышей (см. выше).

II.2. Макрофагальный ответ.

Тканевой макрофаг - основная эффекторная клетка при туберкулезной инфекции. Поскольку туберкулез протекает преимущественно как легочное заболевание, наибольший интерес представляют эффекторные функции легочных макрофагов.

По данным нашей лаборатории (Майоров К Б., 2001) у мышей I/St имеется ярко выраженный дефект антимикобактериальной эффекторной функции легочных макрофагов. Как показано выше, вторая чувствительная родительская линия В6 несет аллель чувствительности к туберкулезу в другом локусе В этой связи мы поставили задачу сравнить эффекторную активность макрофагов чувствительно;"' родительской линии В6 и сверхрезистентных гибридов F1 с макрофагами мышей I/St. Было важно установить, является ли высокая резистентность гибридов F1 результатом генетической комплементации, приводящей к улучшению способности макрофагов этих мышей выполнять свои функции в борьбе с патогеном.

II.2.1. Антимикобактериальная активность легочных макрофагов мышей

I/St, В6 и F1.

Исследования антимикобактериальной активности макрофагов легкого проводили при совместном культивировании этих клеток, взятых от интактных мышей I/St, В6 и гибридов Fl(I/StxB6), с микобактериями в разных соотношениях. Антимикобактериальную активность (то есть способность макрофага подавлять размножение фагоцитированных микобактерий) определяли по включению микобактериями Н 3-урацила, согласно широко распространенному методу (Stach J.L. et al., 1984; Majorov K.B. et al., 2002). Результаты представлены на рисунке 10.

При высоких соотношениях микобактерия: макрофаг (20:1 и 10:1) не выявлялось различий в антимикобактериальной активности макрофагов мышей разных линий, т.к. доза микобактерий была столь велика, что с ней не справлялись даже макрофаги резистентных животных (данные не приводятся).

При более низких соотношениях выявилась достоверно более слабая антимикобактериальная способность макрофагов мышей В6 как по сравнению с макрофагами мышей I/St (р<0,01), так и мышей Fl (р<0,01) Кроме того, при соотношении микобактерия макрофаг, равном 5 1, способность макрофагов I/St подавлять размножение микобактерий была достоверно ниже (р<0,01), чем у макрофагов Fl, тогда как при более низких соотношениях антимикобактериальная способность макрофагов I/St и Fl достоверно не отличалась. Это - неожиданный результат, так по данным нашей лаборатории (Майоров К.Б., 2001) легочные мчкрофаги мышей инбрсдной линии I/St обладают сниженным микобактериостатическим действием по сравнению с макрофагами мышей другой инбредной линии A/Sn даже при низких соотношениях микобактерия макрофаг

1,25:1 2,5:1 5,0:1 соотношение микобактерия : макрофаг

Рисунок 10. Включение урацила микобактериями, фагоцитированными макрофагами легкого.

-75В нашей же тест-системе при разнице во времени выживания в S раз и при 10-кратных различиях по высеваемости микобактерий из органов, мыши I/St и гибриды (I/St х B6)F1 отличаются по способности легочных макрофагов подавлять размножение микобактерий только при высоких дозах патогена. Это еще раз доказывает сложный характер контроля взаимодействия микобактерий с организмом-хозяином и демонстрирует насколько широк спектр фенотипов, отражающих генетическую чувствительность и резистентность.

Еще одним показателем антимикобактериальной активности макрофагов служит продукция активных форм азота после фагоцитоза микобактерий. Уровень продукции активных форм азота определяли по содержанию одного из химически-стабильных продуктов метаболизма азота - нитрит-аниона - (N0)2" в супернатантах культур макрофагов. Оказалось, что макрофаги легких не продуцируют (N0)2" ни спонтанно, ни после добавления экзогенного ИФН-у. Эти данные полностью согласуются с результатами, полученными Майоровым К.Б. (Майоров К.Б , 2001).

II.2.2. Цитопатогенное действие микобактерий на макрофаги в культуре.

При взаимодействии макрофагов с микобактериями происходит не только уничтожение патогена макрофагами, но и обратный процесс, то есть цитотоксическое действие фагоцитированных микобактерий на макрофаги (Rojas et al. 1998). Гибель макрофагов в легком может, с одной стороны, приводить к распространению микобактерий, а с другой - к повреждению легочной ткани. Изучение этого феномена важно для понимания особенностей течения инфекции и формирования патологических изменений у мышей различных линий.

Д1 i оценки клеточной гибели при заражении микобактериями, мы культивировали легочные макрофаги интактных мышей с микобактериями вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv. На модели инфекции in vitro цитопатический эффект можно зарегистрировать микроскопически по увеличению количества нежизнеспособных макрофагов, а также по выходу в культуральную среду цитозольного фермента макрофагов - лактатдегидрогеназы (ЛДГ), который можно оценить биохимически. Поскольку, микобактерии не содержат ЛДГ (Хоулт, 1981), содержание этого фермента во внеклеточной среде смешанных культур макрофаги+микобактерии реально отражает именно нарушение целостности мембраны и гибель макрофагов. Для более объективной оценки цитопатогенного эффекта микобактерий мы использовали биохимический метод. Результаты измерения специфического лизиса макрофагов по выходу ЛДГ после 60 часов совместного культивирования с М. tuberculosis H37Rv представлены на рисунке 11.

При высоких дозах микобактерий (20:1 и 10:1) достоверных различий по способности макрофагов разных линий выживать в смешенной культуре выявлено не было (данные не приводятся). При более низких соотношениях микобактерия : макрофаг обнаружились различия между легочными макрофагами животных разных линий. Наибольшей устойчивостью к цитопатическому действию микобактерий характеризовались макрофаги наиболее резистентных мышей F1 (р<0,01). Вместе с тем, достоверных различий между макрофагами родительских линий не проявляется даже при соотношении патоген: макрофаг равном 1,25:1. Таким образом, легочные макрофаги чувствительных мышей родительских линий одинаково плохо контролируют размножение фагоцитированных микобактерий (рисунок 10) и сами выживают в присутствии микобактерий (рисунок 11). С другой стороны, макрофаги резистентных животных F1, контролируя размножение микобактерий не лучше, чем макрофаги чувствительных животных, достоверно более устойчивы к цитопатогенному о

I I

1,25:! 2,5:1 5,0:1 соотношение микобактерия : макрофаг

Рисунок 11. Выход ЛДГ (% специфического лизиса макрофагов) через 60 часов культивирования. действию. Если ситуация in vitro достаточно точно отражает процессы, происходящие в организме, можно предположить, что менее выраженная гибель инфицированных макрофагов может быть одним из механизмов резистентности мышей F1. Этот механизм может, в частности, в какой-то стенени объяснить различия в характере легочной патологии, описанной выше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В последние годы во всем мире резко возросла заболеваемость туберкулезом. По данным Всемирной Организации Здравоохранения за год в мире регистрируется около 10 миллионов новых случаев заболевания активным туберкулезом и около 3 миллионов человек умирает от этой инфекции (Dolm D J. et al, 1994.; Dye et al, 1999). В этой связи особое значение имеет выявление групп риска по заболеванию туберкулезом, ранняя диагностика, своевременный и дифференцированный подход к лечению.

Изучение иммунологических параметров туберкулезного процесса не всегда однозначно позволяет сделать вывод о механизмах чувствительности или резистентности к туберкулезу. Поскольку борьба с инфекционным агентом, а с внутриклеточным паразитом особенно, ~ это сложный многоэтапный процесс, в который вовлечено множество эффекторных механизмов, сбой в одном из звеньев может приводить к повышению чувствительности к возбудителю в целом. С другой стороны, даже наличие такого яркого фенотипа как повышенная чувствительность (или резистентность) не всегда позволяет найти иммунологический механизм, лежащий в его основе. Это положение нашло подтверждение в данной работе. Нам удалось показать, что у мышей I/St дефект продукции цитокинов 1 типа может быть причиной повышенной чувствительности к туберкулезу. Напротив, у другой чувствительной линии В6 ответ по типу 1 не страдает, но наблюдается снижение эффекторных функций макрофагов.

Почти наверняка некоторые из механизмов, обуславливающие чувствительность мышей к туберкулезу обнаружить не удалось. Кроме того, остаются невыясненными иммунологические механизмы резистентности гибридов F1, так как по основным параметрам противотуберкулезного иммунитета они существенно не отличаются либо от одного либо от другого чувствительного родителя. В общем, сниженная резистентность животного или человека к инфекционному агенту может быть обусловлена не только неполноценностью иммунологических механизмов защиты. Например, при туберкулезе большую роль может играть микроокружение в легком, на фоне которого клетки иммунной системы осуществляют антимикобактериальный ответ. Принимая во внимание все эти возможности, становится очевидным, что исследование только физиологичных естественного и приобретенного иммунитета организма, вовлеченного в инфекционный процесс, не позволяет получить полного представления о механизмах защиты и, следовательно, не даст возможности ей управлять.

Весьма многообещающим подходом является выявление, картирование и последующее клонирование генов, определяющих уровень чувствительности к инфекции, а также определение уровня экспрессии генов в клетках, органах и тканях (например, в макрофагах легкого при туберкулезной инфекции). Для этой цели широко используют модели на животных и клеточных <ультурах in vitro, позволяющие упростить систему и уменьшить влияние факторов окружающей среды и клеточного многообразия. В этом направлении достигнуты значительные успехи. Использование инбредных линий мышей для обнаружения генов, участвующих в контроле чувствительности к микобактериям, позволило картировать, а затем и клонировать ген мыши Nrampl, регулирующий выживание некоторых видов микобактерий в макрофагах (Vidal et al., 1995; Skamene et al., 1998). Был обнаружен также ген sst-1, определяющий тяжесть патологических изменений в легком (Kramnik et al., 2000), локусы tbs-1 и tbs-2, участвующие в контроле времени выживания и скорости потери веса после заражения (Lavebratt et al., 1999; Sanchez F., et al., 2002), локусы Tlrl, Tlr2,

Tlr3 (Mitsos L.M., et al. 2000), определяющие уровень размножения M tuberculosis в паренхиматозных органах.

Не вызывает сомнений, что чувствительность к туберкулезу у человека и животных - полигеьно контролируемый признак (îv ort M., and M. Levin. 1999; Kramnik I., et al., 1998, 2002), и на данный момент еще не все гены, вовлеченные в процессы взаимодействия патогена и организма-хозяина, известны и картированы. При этом, представляется вероятным, что одни локусы являются "главными", вносящими больший вклад в контроль инфекции, а другие служат лишь их модификаторами (например, Nrampl при инфицировании вирулентными штаммами микобактерий (Medina and North, 1996)). Вместе с тем, чаще всего чувствительность и резистентность к патогену контролируется многими взаимодействующими локусами, которые следует рассматривать как локусы, определяющие количественные признаки, или QTL (quantitative trait loci) (Leigeling A., et al., 2001; Sanchez F., et al., 2002; Mitsos L.M., et al., 2000), что значительно осложняет их анализ.

В данной работе мы рассмотрели необычное сочетание линий мышей, обе из которых чувствительны к туберкулезу, а гибриды Fl высоко резистентны. Такой тип наследования предполагает богатый спектр генотипов у гибридов F2, что позволит провести поиск новых QTL по всему геному мыши.

Высокий уровень гомологии больших участков генома и ортологичность многих локусов человека и мыши (McLeod et al., 1995; Skamene et al., 1998) позволяет применять методы «межвидовой генетики». Так, картирование гена Nrampl мыши позволило картировать его аналог у человека NRAMPl (Schurr Е. et al., 1989,1990). Кроме того, возможно типирование ДНК человека на наличие "дефектных" аллелей известных локусов на основе гибридизации с ДНК мыши (Hill. 1996).

Есть основания полагать, что рано или поздно картирование локусов, контролирующих восприимчивость к туберкулезу и последующее клонирование соответствующих генов, позволит усовершенствовать профилактику и методы раннего выявления групп риска по туберкулезу, а также поможет более дифференцированно подойти к вопросам вакцинации. выводы.

1. Показано, что каждая из линий мышей I/St и В6 несет по одному основному рецессивному аллелю, участвующему в контроле туберкулезной инфекции, которые не сцеплены между собой. "Аллель чувствительности" В6 относится к ранее неизвестному л оку су.

2. После инфицирования М. tuberculosis у всех изучаемых мышей к моменту гибели наблюдается развитие одинаковой по тяжести кахексия, но динамика ее развития у линий В6 и I/St различна, что может свидетельствовать о различном генетическом контроле этого количественного признака у двух линий мышей.

3. Обнаружено, что родительские линии мышей В6 и I/St являются чувствительными к туберкулезу и не способны эффективно контролировать размножение микобактерий в органах, тогда как гибриды Fl(B6xI/St) резистентны и значительно лучше контролируют инфекцию.

4. Установлено, что тяжесть туберкулезного процесса и характер поражения легочной ткани в исследованной модели напрямую не зависят от бактериальной нагрузки, а определяются генетически детерминированной реактивностью организма.

5. У мышей восприимчивых родительских линий не обнаружено выраженного дефекта Т-клеток в способности отвечать на антигены микобактерий, который мог бы полностью отвечать за их чувствительность к туберкулезу. Вместе с тем, сниженная продукция клетками мышей I/St цитокинов первого типа (ИФН-у, ФНО-а) может быть связана с их высокой чувствительности к туберкулезу.

6. Установлено, что наибольшей устойчивостью к цитопатическому действию микобактерий характеризуются макрофаги наиболее резистентных мышей F1. За счет большей резистентности макрофагов F1 могут замедляться деструктивные процессы в ф * легочной ткани при туберкулезе, тем самым обеспечивая повышенную резистентность животных Р1 к заражению.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Авербах М.М. (ред.) Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М. Медицина, 1976,312 с.

2. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Торонджадзе В., Ильина И.Н. Межлинейные различия чувствительности мышей к туберкулезу. Иммунология, 1980, 2, с.42-43.

3. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Никоненко Б.В. Иммуногенетика инфекционных заболеваний. М. Медицина, 1985, 256 с.

4. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах М.М. Генетический анализ факторов, детерминирующих восприимчивость мышей к туберкулезу. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1982,12, с. 83-85.

5. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах М.М. Регуляция противотуберкулезного иммунитета генами комплекса Н-2. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1988, 106, с. 73-75.

6. Апт A.C. Регуляция иммунитета к внутриклеточным инфекциям генами комплекса Н-2 (на примере туберкулеза). Дисс. доктора биологических наук. М., 1991.

7. Апт A.C. Генетические аспекты выявления групп риска по туберкулезу. Проблемы туберкулеза, 2001, 7, с.65-68.

8. Майоров К.Б. Эффекторные функции макрофагов у линий мышей с различной генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу. Проблемы наследственности при туберкулезной и другой легочной и инфекционной патологии. М., 1990, Т.54, с. 194-198.

9. Майоров К.Б. Иммуногенетические аспекты функциональной активности макрофагов при экспериментальном туберкулезе. Дисс. кандидата биологических наук. М„ 2001.

-8610. Межлумова М.Б. Иммунологический анализ гиперчувствительности замедленного типа к туберкулину у мышей методом локального адоптивного переноса. Проблемы туберкулеза, 1990,4, с.55-58.

11. Мороз A.M., Торонджадзе В.Г. Генетически обусловленная иммунологическая реактивность мышей различных линий к туберкулезной инфекции. Сб. трудов ЦНИИ туберкулеза, 1977, Т.21, с. 131-133.

12.1Лороз A.M. Иммуногенетический механизм резистентности к туберкулезу. Дисс. доктора биологических наук. М.,1984, 214с.

13. Никоненко Б.В., Межлумова М.Б., Апт А.С., Мороз A.M. Генетическая рестрикция гиперчувствительности замедленного типа к туберкулину у мышей. Генетика, 1988, 9, с. 1707-1709.

14. Никоненко Б.В., Апт А.С., Межлумова М.Б., Мороз A.M. Гены Beg и ТЬс-1, взаимосвязь. Генетика, 1990, 26, с 2254-2257.

15. Никоненко Б.В., Межлумова М.Б., Мороз A.M. Генетическая регуляция ответа хозяина на введение Mycobacterium bovis (BCG) и Mycobacterium tuberculosis H37RV. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1990, 110, с. 526-528.

16. Никоненко Б.В. Полигенный контроль противотуберкулезного иммунитета и резистентности. Дисс. доктора медицинских наук. М., 1992.

17. Никоненко Б.В., Апт А.С., Межлумова М.Б. и соавт. Генетические аспекты вакцинации BCG при экспериментальном туберкулезе. Вест. Рос. Акад. Мед. Наук., 1995, 7, с 24-28.

18. Хоулт Дж.(ред.). Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1981.

19. Abel I, Sanchez F.O., Oberti J, Thuc N.V, Hoa L.V, Lap V.D, Skamene E, Lagrange P.H, Schurr E. Susceptibility to leprosy is linked to the human NRAMP1 gene. J Infect Dis., 1998,177, p.133-145.

20. Altare F., Durandy A., Lammas D., et al. Impairement of Mycobacterial immunity on human IL-12 receptor deficiency. Science, 1998,280, p. 1432-1435.

21. Apt A., Kramnik I., Moroz A. Regulation of T-cell proliferation response by cells from solid lung tissue of M. tuberculosis - infected mice. Immunology, 1991, V.73, p. 173-179.

22. Apt A., Avdienko V., Nikonenko B. et al. Distinct H-2 complex control of mortality, and immune responses to tuberculosis infection in virgin and BCG-vaccinated mice. Clin. Exp. Immunol., 1993, 94, p. 322-329.

23. Baltimore D. Our genome unveiled. Nature, 2001, V.409, p.814-816.

24. Bekker L-G, Moreira AL, Bergtold A, Freeman S, Ryffel B, Kaplan G Immunopathologic Effects of Tumor Necrosis Factor Alpha in Murine Mycobacterial Infection Are Dose Dependent Infection and Immunity, December 2000, p. 6954-6961, Vol. 68, No. 12

25. Bellamy R.J., Ruwende C, Corrah T, McAdams K.P.W.J., Thursz M, Whittle H.C, Hill A.V S. Assessment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphisms in host susceptibility to tuberculosis. Tuberue Lung Dis., 1998, 79, p. 8389.

26. Bellamy R.J. Genetic susceptibility to tuberculosis in human populations. Thorax, 1998, 53, p. 588-593.

27. Bellamy R.J., Hill A.V S. Host genetic susceptibility to human tuberculosis. Novartis Foundation Symposium 217, 1998, p. 3-23.

28. Bellamy R, Ruwende C, Corrah T, McAdam K, Whittle H.C, Hill A.V S Variations in the NRAMP1 gene and susceptibility to tuberculosis in West Africans. N Engl J Med , 1998, 338, p. 640-644.

29. Biron C.A., and Gazzinelli R.T. Effects of IL-12 on immune responses to microbial infections: a key mediator in regulating disease outcome. Curr. Opin. Immunol., 1995, v. 7, p. 485-496.

-8830. Blackwell J.M., Barton C.H., White J.K., Roach T.I.A., Shaw M.A., Whitehead S.H., Mock B.A., Searle S., Williams H., Baker A.M. Genetic regulation of leishmanial and mycobacterial infections: the Lsh/Ity/Bcg gene story continues. Immunol. Lett., 1994, 43, p. 99-107.

31. Blackwell J.M. Structure and function of the natural-resistanse-associated macrophage protein (Nramp 1), a candidate protein for infectious and autoimmune disease susceptibility. Mol. Med. Today., 1996, 2, p. 205-211.

32. Boise L.H., Minn A.J., Noel P.J., June C.H., Accavitti M.A, Thompson C.B. CD 28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of BcI-xl-Immunity, 1995, 3, p. 87.

33. Boom W.H., Husson R.N., Young A., David J.R., Piessens W.F. In vivo and in vitro characterization of murine T-cell clones reactive to Mycobacterium fuh^rcvlot>is. Infect. Immun.l 987, V55, p.2223-2229.

34. Brahmajothi V, Pitchappan R.M, Kakkanaiah VN, Sashidhar M, Rajaram K, Ramu S, Palanimurgan K, Paramasivan C.N, Prabhakar R. Association of pulmonary tuberculosis and HLA in South India. Tubercle, 1991, 72, p. 123-132.

35. Brett S.J., Ivanyi J. Genetic influences on the immune repertoire following tuberculosis infection in mice. Immunology, 1990, 71, p. 113-119.

36. Brett S.J., Orrell J.M., Swanson-Beck J., Ivanyi J. Influence of H-2 genes on growth of Mycobacterium tuberculosis in the lungs of chronically infected mice. Immunology, 1992, 76, p. 129-132.

37. Buschman E., Apt A.S., Nikonenko B.V. et al. Genetic aspects of innate resistance and acquired immunity to mycobacteria in inbred mice. Springer Semin. Immunopathol., 1988, 10, p. 319-336.

-8938. Ryrd T.F. Multinucleated giant cell formation induced by IFN-gamma/IL-3 is associated with restriction of virulent Mycobacterium tuberculosis cell to cell invasion in human monocyte monolayers. Cell.Immunol., 1998, v. 188, p. 89-96.

39. Chan J., Xing Y., Magliozzo R.S., Bloom B. Killing of virulent Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen itnermediates produced by activated murine macrophages. J. Exp. Med., 1992, 175, p.l 111-1122.

40. Chan, J., Tanaka K., Carroll D., Flynn J., Bloom B. Effects of nitric oxide synthase inhibitors on murine infections with Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 1995, 63, p. 736-740.

41. Comstock G.W. Tuberculosis in twins: a re-analysis of the Prophit survey. Am Rev Respir Dis., 1978, 117, p. 621-624.

42. Cooper A.M., Dalton D.K., Stewart T.A. et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J. Exp. Med., 1993, 178, p. 2243-2247.

43. Cooper A.M., Roberts A.D., Rhoades E.R., Callahan J.E., Getzy D.M., Orme I.M. The role of intrleukin-12 in asquired immunity to Mycobacterium tuberculosis infection. Immunology, 1995, 84, p. 423-432.

44. Cooper A.M.,. Flynn J.L. Protective immune response on Mycobacterium tuberculosis. Curr. Opin Immunol., 1995, 7, p. 512-516.

45. Cooper A.M., D'Souza C., Frank A.A., Orme I. M. The course of M tyberculosis infection in the lungs of mice lacking expressions of either perforin- or granzyme-mediated cytolytic mechanisms. Infect. Immun., 1997, 65, p. 1317-1320.

46. Cooper A.M., Magram J., Ferrante J., Orme I. M. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Exp. Med., 1997, V.186 (1), p. 39-45.

-9047. Dalton D.K., Pitts-Meek S., Keshav S., et al. Multiple defects of immune call function in mice with disrupted interferon-y genes. Science, 1993, v. 259, p. 1739-1742.

48. Daniel T.M., and Boom W.H. Immunology of Tuberculosis. From Tuberculosis. A comprehensive international approach. Reichman L.R., Hershfield E.S., eds. 2000. Marcel Dekker, New York;

49. Das G., Vohra H., Saha B., Agrewala J.N., Mishra G.C. Apoptosis of Thl-like cells in experimental tuberculosis (TB). Clin. Exp. Immunol., 1999, 115, p. 324-328.

50. Davies P.D.O. A possible link between vitamin D deficiency and impaired host defence to Mycobacterium tuberculosis. Tubercule, 1985,66, p. 301-306.

51. Denis M. Killing of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: activation by cytokines and calcitriol. Clin. Exp. Immunol., 1991, 84, p. 200-206.

52. Denis M. TNF and GM-CSF stimulate human macrophages to restrict growth of virulent Mycobacterium avium and to kill avirulent Mycobacterium avium: killing effector mechanism depends on the generations of reactive nitrogen intermediates. J. Leukocyte Biol., 1991,49, p. 380-387.

53. Dolin D.J., Raviglione P. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull. Word Health Organ., 1994, 72, p. 213-220.

54. Dunn P L., North R.J. Virulence ranking of some Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis strains according to their ability to multiply in the lungs, induce lung patology, and cause mortality in mice. Infect. Immun., 1995, V.63, 9, p. 3428-3437.

55. Dye C., Scheele S., Dolin P., et al. Consensus statement: global burdei, of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project. J. Am. Med. Assoc., 1999, v. 282, p. 677-686.

56. Erb K.J., Kirman J., Delahunt B., Chen W., LeGros G. IL-4, IL-5 and IL-10 are not required for the control of M. bovis- BCG infection in mice. Immunol. Cell Biol., 1998; 76, p. 41-46.

57. Feng, C, A. G. D. Bean, H. Hool, H. Briscoe, and W. J. Britton. 1999. Increase in gamma interferon-secreting CD8+, as well as CD4+, T cells in lungs following aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immun. 67:3242

58. Flesch, I.E., Kaufmann S.H. Mechanisms involved in mycobacterial growth inhibition by IFN-y activated bone marrow macrophages: role of reactive nitrogen intermediates. Infect. Immun., 1991,59, p. 3213-3218.

59. Flynn J.L., Goldstein M.M., Triebold K.J., et al. Major histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. Proc Natl. Acad. Sei USA, 1992, v. 89, p. 12013-12017.

60. Flynn J.L., Chan J., Triebold K.J., Dalton D.K., Stewart T.A., Bloom B.R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J. Exp. Med., 199*, ¡78, p. 2249-2254.

61. Flynn JL., Goldstein MM., Chan J., Triebold K.J., Pfeffer K., Lowenstein CJ., Schreiber JL., Mak TW., Bloom B.R. Tumor necrosis factor-a is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity. 1995, 2, p. 561-572.

62. Forget A., Skamene E., Gros P., Miaihle A.-C., Turcotte R. Strain diffirences in the response to infection with small dispersed doses of Mycobacterium bovis BCG among inbred mice. Infect. Immun., 1981, 32, p. 42-47.

63. Filley E.A, Rook G.A.W, Bull H.A, Dowd P.M. The effect of Mycobacterium tuberculosis on the susceptibility of human cells to the stimulatory and toxic effects of TNF. Immunology. 1992, 77: 505-509.

64. Filley E.A, Rook G.A.W. Effects of mycobacteria on sensitivity to the cytotoxic effects of TNF. Infect. Immun. 1991, 59: 2567-2572.

65. Goldfeld A.E, Delgado J.C, Thim S, Bozon M.V, Uglialoro A M, Turbay D, Cohen C, Yunis E.J. Association of HLA-DQ allele with clinical tuberculosis. JAMA, 1998, 279, p. 226-228.

66. Griffin, J. P., and I. M. Orme. 1994. Evolution of CD4 T-cell subsets following infection of naive and memory immune mice with Mycobacterium tuberculosis. Inf. Immun. 62: 1683

67. Gros P., Scamene E., Forget A. Genetic control of natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG) in mice. J. Immunol., 1981, 127, p. 2417-2421.

68. Gros P., Skamene E., Forget A. Cellular mechanisms of genetically controled host resistance to Mycobacterium bovis (BCG). J. Immunol. 1983, 127: 2417-2421.

69. Gruenheid S., Cellier M., Vidal S.M., Gros P. Identification and characterization of a second mouse Nramp gene. Genomics, 1995, 25, p. 514-525.

70. Gruenheid S., Pinner E., Desjardins M. Gros P. Natural resistance to infection with intracellular parasites: the Nramp 1 protein is recruited to the membrane of the phagosome. J. Exp. Med., 1997, 185, p.717-730.

71. Harding F A., McArthur J.G., Gross J.A., Raulet D.H., Allison J.P. CD28- mediated signaling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones. Nature, 1992. 356, p. 607.

72. Hernandez-Pando, R., H. Orozco, J. Honour, P. Silva, R. Leyva, and G. A. W. Rook. Adrenal changes in murine pulmonary tuberculosis; a clue to pathogenesis? FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1995, 12:63-72.

73. Hill A.V.S. Genetics of infectious disease resistance. Curr Opin Genet Dev., 1996, 6, p. 348-353.

-9374. Hirsch C.S., Toossi Z., Vanham G., Johnson J.L., Peters P., Okwera A., Mugerwa R., Mugyenyi P., Ellner J.J. Apoptosis and T cell hyporesponsiveness in pulmonary tuberculosis. J. Infect. Dis., 1999,179, p. 945-953.

75. Howard G., Ngyen T., Morrison N., et al. Genetic influences on bone density : physiological correlates of vitamin D receptor gene alleles in premenopausal women. J. Clin. Endocrinol. Metab.,1995, 80, p. 2800-2805.

76. Huygen K., Palfliet K., Jurion F., Hilgers J. H-2 linked control of in vitro inter^ron-y production in response to 32-kilodalton antigen (P32) of Mycobacterium bovis Bacillius Calmet- Guerin. Infect. Immunol., 1988, V.56, p. 3191-3200.

77. Huygen K., Ljungovist L„ ten Berg R., van Vooren J. Repertories of antibodies to culture filtrate antigens in different mouse strains infected with Mycobacterium bovis (BCG). Infect. Immunol., 1990,V.58, p.2192-2197.

78. Huygen K„ Drowart A., Harboe M. et al. Influence of genes from the MHC on the antibody repertoire against culture filtrate antigens in mice infected with live Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun., 1993, 61, p. 2687-2693.

79. Ivanyi J., Sharp K. Control by H-2 genes of murine antibody responses to protein antigens of Mycobacterium tuberculosis. Immunology, 1986, 59, p. 329-332.

80. Jing L., Cellier M., Schurr E„ Skamene E. Comparative genome analysis -a novel strategy to study the genetics of host-parasite interaction. J.Parasitol., 1993, V. 79(4), p. 463-469.

81. Jong R., Altare F., Haagen I.A., Elferink D.G., de Boer T„ van Breda Vriesman P.G C., Kabel P.J., Draaisma J.M.T., van Dissel J.T., Kroon F.P., Casanova J.L., Ottenhoff T.H.M. Severe Mycobacterial and Salmonella infections in IL-12 receptor-deficient patiens. Science, 1998, 280, p. 1435-1438.

-9482. Jouanguy E., Altare F., Lamhamedi et al. IFN-yß deficiency in an infant with fatal bacille Calmette-Guerin infection. N. Engl. J. Med., 1996, 335, p. 1956-1961.

83. Kamijo R., Le J. Shapiro D., Havell E.A., Huang S., Aguet M., Bosland M., Vilcek J. Mice that lack the interferon-gamma receptor have profoundly altered responses to infection with Bacillus Calmette-Guerin and subsequent challenge with lipopolysaccharide. J. Exp. Med., 1993, 178, p. 1435-1440.

84. Kaufmann S.H.E., Flesh I. Function and antigen recognition pattern of L3T4+ T-cell clones from Mycobacterium tuberculosis immune mice. Infect. And Immun., 1986, V.54, p.291-296.

85. Kaufmann S.H.E. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? Nature Med., 2000, 6, p. 955-960.

86. Kaufmann S.H.E. How can immunology contribute to the control of tuberculosis. Nat. Rev.Immun., 2001, 1(1), p.20-30.

87. Kindler V., Sappino A-P., Grau G.E., et al. The inducing role of tumour necrosis factor in the development of bactericidal granulomas during BCG infection. Cell, 1989, v. 56, p. 731-740.

88. Kerksiek K.M., Pamer E.G. T cell response to bacterial infection. Curr. Opin. Immunol., 1999, 11, p. 400-404.

89. Kopf M., Baumann H., Freer G., Freudenberg M., Lamers M., Kishimoto T , Zinkernagel R., Bluethman H., Köhler G. Impaired immune and acute phase responses in interleukin -6 deficient mice. Nature, 1994, 368, p. 339-341.

90. Kramnik I., Demant P., Bloom B.B. Susceptibility to tuberculosis as a complex genetic trait: analysis using recombinant congenic strains of mice.Genetics and tuberculosis. Novartis Foundation Symposium 217, 1998, p. 120-137.

91.Kramnik I., Dietrich W.F., Demant P., Bloom B.B. Genetic control of resistance to experimental infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, V.97 (15), p. 8560-8565.

92. Kramnik I.,Boyartchuk V. Immunity to intracellular pathogens as a complex genetic trait. Cur.Opin.Microbiol., 2002, 5, p. 111-117.

93. Ladel C.H., Blum C., Dreher A., Reifenberg K., Kopf M., Kaufmann S.H.E. Lethal tuberculosis in interleukin-6-deficient mutant mice. Infection and Immunity, 1997, V.65 (11), p. 4843-4849.

94. Lalvani A, Pathan AA, McShane H, Wilkinson RJ, Latif M, Conlon CP, Pasvol G, Hill AV.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med. 2001 Mar;163(4):807-8;

95. Lavebratt C., Apt A.S., Nikonenko B.V., Schalling M., Schurr E. Severity of tuberculosis in mice linked to distal chromosome 3 and proximal chromosome 9. J. Infect. Dis., 1999, 180, p. 150-155.

96. Levin M., Newport M.J., D'Souza S„ Kalabalikis P., Brown I., Lenicker H., Vassallo Agius P., Davies E.G., Thrasher A., Blackwell J.M. Familial disseminated atypical mycobacterial infection in early childhood: a human mycobacterial susceptibility gene? Lancet, 1995, 345, p. 79-83.

97. Leigeling A., Pfeffer K., Balling R. The battle of two genomes: genetics of bacterial host/pathogen interaction in mice. Mammal. Genome., 2001, 12, p. 261-271.

98. Lyadova I.V., Eruslanov E.B., Khaidulov S.V., Yeremeev V.V., Majorov K.B., Pichugin A.V., Nikonenko B.V., Kondratieva T.K., Apt A.S. Comparative analysis of T lymphocytes recovered from the lungs of mice genetically susceptible, resistant and hyperresistant to Mycobacterium tuberculosis-triggered disease. J.Immunol., 2000, 165: 5921-5932.

99. MacMicking J.D., North R.J., LaCourse R., Mudgett J.S., Shah S.K., Nathan C.F. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997,94, p. 5243-5248.

100. Majorov K.B., Lyadova I.V., Kondratieva T.K., Eruslanov E.B, Rubakova E.I., Orlova M.O., Mischenko V.V., and A. S. Apt. Different innate ability of I/St and A/Sn mice to combat virulent M. tuberculosis-, phenotypes expressed in lung and extra-pulmonary macrophages. J.Immunol., 2002 (in press).

101. McLeod R., Buschman E., Arbucle L.D., Skamene E. Immunogenetics in the analysis of resistance to intracellular pathogens. Curr. Opin. Immunol., 1995, 7, p. 539-552.

102. Medina E., North R.J. Evidence inconsistent with a role for the Beg gene (Nrampl) in resistance of mice to infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. J. E ,p. Med., 1996, 183, p. 1045-1051.

103. Meyer C.G, May J, Stark K. Human leukocyte antigens in tuberculosis and leprosy. Trends Microbiol., 1998, 6, p. 148-154.

104. Migliorini P., Corradin G., Corradin S.B. Macrophage NC>2~ production as a sensitive and rapid assay for quantitation of murine IFN-y. J.Immunol.Meth., 1991, 139: 107-114.

105. Modlin, R.L. Thl-Th2 paradigm: insights from leprosy. J.Invest. Dermatol. 1994, 102: 828-832.

106. Murray G.D.L., Styblo K., Rouillon A. Tuberculosis in developing countries: burden, invention and cost. Bull. Int.Union Tuberc.Lung Dis., 1990, 65, p. 6-24.

107. Murray C„ Solomon J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95, p. 13881 -13886.

108. Nathan C., Hibbs J. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. Curr. Opin. Immunol., 1991, 3, p. 65-70.

-97109. Newport M.J.,Huxley C.M., Huston S., Hawrylowicz C.M., Oostra B.A., Williamson R., Levin M. A mutation in interferon-gamma receptor gene and susceptibility to mycobacterial infections. N.Engl. J.Med., 1996, 335, p.1941-1949.

110. Newport M.J, Levin M. Genetic susceptibility to tuberculosis. J Infect., 1999, 39, p. 117-121.

111. Nikonenko B.V., Apt A.S., Moroz A.M, Averbakh M.M. Genetic analysis of susceptibility of mice to H37Rv tuberculosis infection: sensitivity versus relative resistance. Prog. Leukocyte Biol., 1985,3, p. 291-299.

112. Nikonenko B.V., Mezhlumova M.B., Apt A.S., Moroz A.M. Local adoptive transfer of delayed-type hypersensitivity to tuberculin from M, bovis BCG-infected mice. Folia Biol., 1989, 35, p. 255-258.

113. Nikonenko B.V., Apt A.S., Mezhlumova M.B. et al. Influence of the mouse Beg, Tbc-1 and xid genes on resistance and immune responses to tuberculosis infection and efficacy ofbacille Calmette-Guerin (BCG) vaccination. Clin. Exp. Immunol., 1996, 104, p. 37-43.

114. Nikonenko B.V., Averbakh M.M., Lavebratt C., Schurr E., Apt A.S. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tuber. Lung. Dis., 2000, 80, p. 15-25.

115. Noel P.J., Boise L.H., Green J.M., Thompson C B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J. Immunol., 1996, 157 (2), p. 636- 642.

116. North R.J. Mice incapable of making IL-4 or IL-10 display normal resistance to infection with Mycobacterium tybercolosis. Clin. Exp. Immunol., 1998. 113, p. 55-58.

117. North R.J., Lacourse R., X.yan L. Vaccinated mice remain more susceptible to Mycobacterium tybercolosis infection initiated via the respiratory route than via the intravenous route. Infection Immunity, 1999, V.67, 4, p. 2010-2012.

118. O'Brien A.D., Scher I., Metealf E.S. Genetically conferred defect in antisalmonella antibody formation renders CBA/N mice initially susceptible to Salmonella typhimurium infection. J. Immunol., 1981, V.126, p. 1368-1372.

119. O'Brien L., Carmichael J. Lowrie D., Andrew P. Strains of Mycobacterium tuberculosis differ in susceptibility to reactive nitrogen intermediates in vitro. Infect. Immun., 1994,62, p. 5187-5190.

120. Orme I.M., Collins F.M. Protection against Mycobacterium tuberculosis infection by adoptive immunotherapy. Requirement for T cell-deficient recipients J. Exp. Med., 1983, 158, p. 74-83.

121. Orme I.M., Colins F.M. Adoptive protection of the Mycobacterium tuberculosis infected lung: dissociation between cells that passively transfer protective immunity and those that transfer delayed-type hypersensitivity to tuberculin. Clin. Immunol., 1984, V.84, p.l 13-120.

122. Orme I.M., Miller E.S., Roberts A., Furney S„ Griffin J., Dobos K„ Brennan P.J. T lymphocyte mediated protection and cellular cytolysis during the course of Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol., 1992, V.148, 1, p. 189-196.

123. Orme I.M., Andersen P., Boom W.H. T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J. infect. Dis., 1993, 167, p. 1481-1497.

124. Pichugin A.V., Khaidukov S.V., Moroz A.M., Apt A.S . Capacity of mu/irie T cells to retain long-term responsiveness to mycobacterial antigens is controlled by the H-2 complex. Clin. Exp. Immunol., 1998, 111, p. 316-324.

125. Pospelov L.E, Matrakshin A.G, Chernousova L.N, Malenko A.F, Yeremeev V.V, Khomenko A.G. Association of various genetic markers with tuberculosis and other lung diseases in Tuvinian children. Tubercle Lung Dis., 1996, 77. p. 77-83.

-99126. Prowedini D.M., Tsoukas C.D., Deftos L.J., Manolagas S.C. 1,25 dihydroxyvitamin D3 receptors in human leukocytes. Science, 1983,221, p.l 181-1183.

127. Roach T.I.A., Chatteijee D., Blackwell J.M. Inducation of early-response genes KC and JE by Mycobacterial Lipoarabinomannans. regulation of KC expression in murine macrophages by Lsh/Ity/Bcg (candidate Nramp). Infection and Immunity, 1994,V.62,#4, p.l 176-1184. % *

128. Rojas M., Barrera L.F., Garcia L.F. Induction of apoptosis in murine macrophages by Mycobacterium tuberculosis is reactive oxygen intermediates-independent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 247: 436-442

129. Rook G.A, Steele J, Fraher L, et al. Vitamin D3, gamma interferon, and control of proliferation of Mycobacterium tuberculosis by human monocytes. Immunology, 1986, 57, p. 159-163.

130. Rook, G., and R. Hernandez-Pando. 1996. Pathogenesis of tuberculosis. Ann. Rev. Microbiol. 50.259.

131. Russo D.M., Kozlova N., Lakey D.L., and Kernodle D. Naive human T cells develop into Thl effectors after stimulation with Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages or recombinant Ag85 proteins. Infect Immun , 2000, v. 68, p. 6826-6832.

132. Sanches F.O., Rodriguez J.I., Agudelo G., Garcia L. F. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls. Infect. Immun. 1994, 62: 5673-5678.

133. Schaible U.E., Sturgill-Koszycki S. Schlesinger P.H., and Russell D.G. Cytokine fctivation leads to acidification and increases maturation of Mycobacterium avium-containing phagosomes in murine macrophages. J Immunol, 1998, v. 160, p. 1290-1296.

134. Shams H„ Wizel B., Weis S.E., et al. Contribution of CD8f T cells to gamma interferon production in human tuberculosis. Infect. Immun., 2001, v. 69, p. 3497-3501.

135. Scher I., Ahmed A., Strong D.M., Steinberg A.D., Paul W.E. X-linked B lymphocytes immune defect in CBA/N mice. Studies of the function and composition of spleen cells. J.Exp. Med., 1975, V.141, p. 788-791.

136. Scher I., Steinberg A.D., Berning A.K., Paul W.E. X-linked B lymphocytes immune defect in CBA/N mice. Studies of the mechanism underlying the immune defect. J.Exp. Med., 1975, V.142, p. 637-640.

137. Schurr E., Skamene E., Forget A., Gros F. Linkage analysis of the Beg gene on mouse Chromosom I. Identification of tightly linked marker. J. Immunology, 1989, V.12, p. 4507-4513.

138. Schurr E., Buschman E., Malo D., Gros P., Skamene E. Immunogenetics of mycobacterial infections: mouse-human homologies. J. Infect. Dis., 1990, V. 161, p. 634639.

139. Schwartz R.H. A cell culture modell for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990, 248, p. 1349.

140. Shi Y., Radvanyi L.G., Sharma A., Shaw P., Green D R., Miller R.G., Mills G.B. CD28-mediated signaling in vivo prevents activation-induced apoptosis in the thymus and alters peripheral lymphocyte homeostasis. J. Immunol., 1995, 155, p. 1829.

141. Skamene E., Gros F., Forget A., Kongshavn P.A.L. Genetic regulation of resistance to intracellular pathogens. Nature, 1982, 297, p. 506-509.

142. Skamene E. Genetic control of susceptibility to mycobacterial infections. Rev. of Infec. Dis., 1989, V.l 1, p. 394-399.

143. Skamene E., Schurr E., Gros F. Infection genomics: Nrampl as a major determinant of natural resistance to inracellular infections. Annu. Rev Med., 1998, 49, p. 275-287.

144. Sprent J., Bruce J., Ron Y., Webb S.R. Physiology of B-cells in mice with X-linked immunodeficiency. Size, migratory properties and turover of the B-cell pool. J.Immunol., 1985, V. 134, p. 1442-1448.

145. Stach J.L., Gros P., Skamene E., Forget A. Phenotypic expression of genetically controlled natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG). J.Immunol., 1984, 132: 888892.

146. Stead W.W, Senner J.W, Reddick W.T, Lofgren J.P. Racial differences in susceptibility to infection by Mycobacterium tuberculosis. N Engl J Med., 1990, 322, p. 422-427.

147. Stead W.W. Genetics and resistance to tuberculosis: could resistance be enhanced by genetic engineering? Ann Intern Med., 1992, 116, p. 937-941.

148. Supek F., Supekova L., Nelson N., Nelson H. A yeast manganese transporter related to the macrophage protein involved in conferring resistance to mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, p. 5105-5110.

149. Tsoukas C.D., Prowedini D.M., Manolagas S.C. 1,25 dihydroxyvitamin Ü3' a novel immunoregulatory hormone. Science, 198^', 224, p. 1438-1440.

150. Tsuyuguchi K„ K. Suzuki, H Matsumo'o, E. Tanaka, R. Amitani, F. Kuze. Effect of oestrogen on Mycobacterium avium complex pulmonary infection in mice. Clin. Exp. Immunol., 2001, 123, p. 428-434.

151. Vidal S.M., Malo D., Vogan K., Skamene F., Gros P. Natural resistance to infection with intrcellular parasites: isolation of a candidate for Beg. Cell, 1993, 73, p. 469-485.

152. Vidal S.M., Tramblay M.L., Govoni G. et al. The Ity/Lsh/Bcg locus: natural resistance to infection with intracellular parasites is abrogated by disruption of the Nrampl gene. J Exp. Med., 1995. 182, p. 655-666.

- 102153. Vidal S.M, Gros P., Skamene E. Natural resistance to infection with intracellular parasites: molecular genetics identifies Nrampl as the Bcg/Ity/Lsh locus. J.Leukoc.Biol., 1995, 58, p. 382-390.

154. Vidal S.M., Belouchi A.M., Cellier M. Cloning and characterization of a second human NRAMP gene onchromosom 12ql3. Mamm.Genome., 1995, 6, p. 224-230.

155. Vidal S.M., Pinner E., Lepage P., et al. Natural resistance to intracellular infectious: Nrampl encodes a membrane phosphoglycoprotein absent in macrophages from susceptible (Nrampl0169) mouse strains. J.Immunol., 1996, 157, p. 3559-3568.

156. Wangoo A., Sparer T., Brown I.N., et al.Contribution of Thl and Th2 cells to protection and pathology in experimental models of granulomatous lung disease. J. Immunol., 2001, v. 166, p. 3432-3469.

157. Wood M. W., Vandongen H.M.A., Vandongen A.M.J. Structural conservation of ion conduction pathways in K+ channels and glutamate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995,92, p.4882-4886.

158. Yother J., Forman C., Gray B.M., Briles D.E. Protection of mice from infection with Streptococcus pneumonia by anti-phosphocholine antibody . Infect. Immun., 1982, V.36, p.184-188.

159. Zhang M., Gong J., Iyer D. V., Jones B. E., Modlin R. L., Barnes P F Y cells cytokine responses in persons with tuberculosis and human immunodeficiency virus infections. J. Clin. Invest. 1994, 94: 2435-2442.

160. Zhang M., Lin Y., Iyer D. V., Gong J., Abrams J. S., Barnes P.F. T-cell cytokine responses in human infections with Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 1995, 63 3231-3234.

161. Zweerink H.J., Gammon M.C., Hutchison C.F., Jackson J., Pier G.B., Puckett J.M., Sigal N.H. X-linked immunodeficient mice as a model for testing the protective efficacy rfof monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa. Infect. Immun., 1988, V.56, p.1209-1214.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Радаева, Татьяна Вячеславовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В последние годы во всем мире резко возросла заболеваемость туберкулезом. По данным Всемирной Организации Здравоохранения за год в мире регистрируется около 10 миллионов новых случаев заболевания активным туберкулезом и около 3 миллионов человек умирает от этой инфекции (Dolm D J. et al, 1994.; Dye et al, 1999). В этой связи особое значение имеет выявление групп риска по заболеванию туберкулезом, ранняя диагностика, своевременный и дифференцированный подход к лечению.

Изучение иммунологических параметров туберкулезного процесса не всегда однозначно позволяет сделать вывод о механизмах чувствительности или резистентности к туберкулезу. Поскольку борьба с инфекционным агентом, а с внутриклеточным паразитом особенно, это сложный многоэтапный процесс, в который вовлечено множество эффекторных механизмов, сбой в одном из звеньев может приводить к повышению чувствительности к возбудителю в целом. С другой стороны, даже наличие такого яркого фенотипа как повышенная чувствительность (или резистентность) не всегда позволяет найти иммунологический механизм, лежащий в его основе. Это положение нашло подтверждение в данной работе. Нам удалось показать, что у мышей I/St дефект продукции цитокинов 1 типа может быть причиной повышенной чувствительности к туберкулезу. Напротив, у другой чувствительной линии В6 ответ по типу 1 не страдает, но наблюдается снижение эффекторных функций макрофагов.

Почти наверняка некоторые из механизмов, обуславливающие чувствительность мышей к туберкулезу обнаружить не удалось. Кроме того, остаются невыясненными иммунологические механизмы резистентности гибридов F1, так как по основным

параметрам противотуберкулезного иммунитета они существенно не отличаются либо от одного либо от другого чувствительного родителя. В общем, сниженная резистентность животного или человека к инфекционному агенту может быть обусловлена не только неполноценностью иммунологических механизмов защиты. Например, при туберкулезе большую роль может играть микроокружение в легком, на фоне которого клетки иммунной системы осуществляют антимикобактериальный ответ. Принимая во внимание все эти возможности, становится очевидным, что исследование только физиологичных естественного и приобретенного иммунитета организма, вовлеченного в инфекционный процесс, не позволяет получить полного представления о механизмах защиты и, следовательно, не даст возможности ей управлять.

Весьма многообещающим подходом является выявление, картирование и последующее клонирование генов, определяющих уровень чувствительности к инфекции, а также определение уровня экспрессии генов в клетках, органах и тканях (например, в макрофагах легкого при туберкулезной инфекции). Для этой цели широко используют модели на животных и клеточных <ультурах in vitro, позволяющие упростить систему и уменьшить влияние факторов окружающей среды и клеточного многообразия. В этом направлении достигнуты значительные успехи. Использование инбредных линий мышей для обнаружения генов, участвующих в контроле чувствительности к микобактериям, позволило картировать, а затем и клонировать ген мыши Nrampl, регулирующий выживание некоторых видов микобактерий в макрофагах (Vidal et al., 1995; Skamene et al., 1998). Был обнаружен также ген sst-1, определяющий тяжесть патологических изменений в легком (Kramnik et al., 2000), локусы tbs-1 и tbs-2, участвующие в контроле времени выживания и скорости потери веса после заражения (Lavebratt et al., 1999; Sanchez F., et al., 2002), локусы Tlrl, Tlr2,

Tlr3 (Mitsos L.M., et al. 2000), определяющие уровень размножения M tuberculosis в паренхиматозных органах.

Не вызывает сомнений, что чувствительность к туберкулезу у человека и животных - полигеьно контролируемый признак (îv ort M., and M. Levin. 1999; Kramnik I., et al., 1998, 2002), и на данный момент еще не все гены, вовлеченные в процессы взаимодействия патогена и организма-хозяина, известны и картированы. При этом, представляется вероятным, что одни локусы являются "главными", вносящими больший вклад в контроль инфекции, а другие служат лишь их модификаторами (например, Nrampl при инфицировании вирулентными штаммами микобактерий (Medina and North, 1996)). Вместе с тем, чаще всего чувствительность и резистентность к патогену контролируется многими взаимодействующими локусами, которые следует рассматривать как локусы, определяющие количественные признаки, или QTL (quantitative trait loci) (Leigeling A., et al., 2001; Sanchez F., et al., 2002; Mitsos L.M., et al., 2000), что значительно осложняет их анализ.

В данной работе мы рассмотрели необычное сочетание линий мышей, обе из которых чувствительны к туберкулезу, а гибриды Fl высоко резистентны. Такой тип наследования предполагает богатый спектр генотипов у гибридов F2, что позволит провести поиск новых QTL по всему геному мыши.

Высокий уровень гомологии больших участков генома и ортологичность многих локусов человека и мыши (McLeod et al., 1995; Skamene et al., 1998) позволяет применять методы «межвидовой генетики». Так, картирование гена Nrampl мыши позволило картировать его аналог у человека NRAMPl (Schurr Е. et al., 1989,1990). Кроме того, возможно типирование ДНК человека на наличие "дефектных" аллелей известных локусов на основе гибридизации с ДНК мыши (Hill. 1996).

Есть основания полагать, что рано или поздно картирование локусов, контролирующих восприимчивость к туберкулезу и последующее клонирование соответствующих генов, позволит усовершенствовать профилактику и методы раннего выявления групп риска по туберкулезу, а также поможет более дифференцированно подойти к вопросам вакцинации.

выводы.

1. Показано, что каждая из линий мышей I/St и В6 несет по одному основному рецессивному аллелю, участвующему в контроле туберкулезной инфекции, которые не сцеплены между собой. "Аллель чувствительности" В6 относится к ранее неизвестному л оку су.

2. После инфицирования М. tuberculosis у всех изучаемых мышей к моменту гибели наблюдается развитие одинаковой по тяжести кахексия, но динамика ее развития у линий В6 и I/St различна, что может свидетельствовать о различном генетическом контроле этого количественного признака у двух линий мышей.

3. Обнаружено, что родительские линии мышей В6 и I/St являются чувствительными к туберкулезу и не способны эффективно контролировать размножение микобактерий в органах, тогда как гибриды Fl(B6xI/St) резистентны и значительно лучше контролируют инфекцию.

4. Установлено, что тяжесть туберкулезного процесса и характер поражения легочной ткани в исследованной модели напрямую не зависят от бактериальной нагрузки, а определяются генетически детерминированной реактивностью организма.

5. У мышей восприимчивых родительских линий не обнаружено выраженного дефекта Т-клеток в способности отвечать на антигены микобактерий, который мог бы полностью отвечать за их чувствительность к туберкулезу. Вместе с тем, сниженная продукция клетками мышей I/St цитокинов первого типа (ИФН-у, ФНО-а) может быть связана с их высокой чувствительности к туберкулезу.

6. Установлено, что наибольшей устойчивостью к цитопатическому действию микобактерий характеризуются макрофаги наиболее резистентных мышей F1. За счет большей резистентности макрофагов F1 могут замедляться деструктивные процессы в

легочной ткани при туберкулезе, тем самым обеспечивая повышенную резистентность животных Р1 к заражению.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Радаева, Татьяна Вячеславовна, 2002 год

1. Авербах М.М. (ред.) Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М. Медицина, 1976,312 с.

2. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Торонджадзе В., Ильина И.Н. Межлинейные различия чувствительности мышей к туберкулезу. Иммунология, 1980, 2, с.42-43.

3. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C., Никоненко Б.В. Иммуногенетика инфекционных заболеваний. М. Медицина, 1985, 256 с.

4. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах М.М. Генетический анализ факторов, детерминирующих восприимчивость мышей к туберкулезу. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1982,12, с. 83-85.

5. Апт A.C., Никоненко Б.В., Мороз A.M., Авербах М.М. Регуляция противотуберкулезного иммунитета генами комплекса Н-2. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1988, 106, с. 73-75.

6. Апт A.C. Регуляция иммунитета к внутриклеточным инфекциям генами комплекса Н-2 (на примере туберкулеза). Дисс. доктора биологических наук. М., 1991.

7. Апт A.C. Генетические аспекты выявления групп риска по туберкулезу. Проблемы туберкулеза, 2001, 7, с.65-68.

8. Майоров К.Б. Эффекторные функции макрофагов у линий мышей с различной генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу. Проблемы наследственности при туберкулезной и другой легочной и инфекционной патологии. М., 1990, Т.54, с. 194-198.

9. Никоненко Б.В., Межлумова М.Б., Апт А.С., Мороз A.M. Генетическая рестрикция гиперчувствительности замедленного типа к туберкулину у мышей. Генетика, 1988, 9, с. 1707-1709.

10. Никоненко Б.В., Апт А.С., Межлумова М.Б., Мороз A.M. Гены Beg и ТЬс-1, взаимосвязь. Генетика, 1990, 26, с 2254-2257.

11. Никоненко Б.В., Межлумова М.Б., Мороз A.M. Генетическая регуляция ответа хозяина на введение Mycobacterium bovis (BCG) и Mycobacterium tuberculosis H37RV. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1990, 110, с. 526-528.

12. Никоненко Б.В. Полигенный контроль противотуберкулезного иммунитета и резистентности. Дисс. доктора медицинских наук. М., 1992.

13. Никоненко Б.В., Апт А.С., Межлумова М.Б. и соавт. Генетические аспекты вакцинации BCG при экспериментальном туберкулезе. Вест. Рос. Акад. Мед. Наук., 1995, 7, с 24-28.

14. Хоулт Дж.(ред.). Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1981.

15. Abel I, Sanchez F.O., Oberti J, Thuc N.V, Hoa L.V, Lap V.D, Skamene E, Lagrange P.H, Schurr E. Susceptibility to leprosy is linked to the human NRAMP1 gene. J Infect Dis., 1998,177, p.133-145.

16. Altare F., Durandy A., Lammas D., et al. Impairement of Mycobacterial immunity on human IL-12 receptor deficiency. Science, 1998,280, p. 1432-1435.

17. Apt A., Kramnik I., Moroz A. Regulation of T-cell proliferation response by cells from solid lung tissue of M. tuberculosis - infected mice. Immunology, 1991, V.73, p. 173-179.

18. Apt A., Avdienko V., Nikonenko B. et al. Distinct H-2 complex control of mortality, and immune responses to tuberculosis infection in virgin and BCG-vaccinated mice. Clin. Exp. Immunol., 1993, 94, p. 322-329.

19. Baltimore D. Our genome unveiled. Nature, 2001, V.409, p.814-816.

20. Bekker L-G, Moreira AL, Bergtold A, Freeman S, Ryffel B, Kaplan G Immunopathologic Effects of Tumor Necrosis Factor Alpha in Murine Mycobacterial Infection Are Dose Dependent Infection and Immunity, December 2000, p. 6954-6961, Vol. 68, No. 12

21. Bellamy R.J., Ruwende C, Corrah T, McAdams K.P.W.J., Thursz M, Whittle H.C, Hill A.V S. Assessment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphisms in host susceptibility to tuberculosis. Tuberue Lung Dis., 1998, 79, p. 8389.

22. Bellamy R.J. Genetic susceptibility to tuberculosis in human populations. Thorax, 1998, 53, p. 588-593.

23. Bellamy R.J., Hill A.V S. Host genetic susceptibility to human tuberculosis. Novartis Foundation Symposium 217, 1998, p. 3-23.

24. Bellamy R, Ruwende C, Corrah T, McAdam K, Whittle H.C, Hill A.V S Variations in the NRAMP1 gene and susceptibility to tuberculosis in West Africans. N Engl J Med 1998, 338, p. 640-644.

25. Blackwell J.M. Structure and function of the natural-resistanse-associated macrophage protein (Nramp 1), a candidate protein for infectious and autoimmune disease susceptibility. Mol. Med. Today., 1996, 2, p. 205-211.

26. Boise L.H., Minn A.J., Noel P.J., June C.H., Accavitti M.A, Thompson C.B. CD 28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of BcI-xl-Immunity, 1995, 3, p. 87.

27. Boom W.H., Husson R.N., Young A., David J.R., Piessens W.F. In vivo and in vitro characterization of murine T-cell clones reactive to Mycobacterium fuh^rcvlot>is. Infect. Immun.l 987, V55, p.2223-2229.

28. Brahmajothi V, Pitchappan R.M, Kakkanaiah VN, Sashidhar M, Rajaram K, Ramu S, Palanimurgan K, Paramasivan C.N, Prabhakar R. Association of pulmonary tuberculosis and HLA in South India. Tubercle, 1991, 72, p. 123-132.

29. Brett S.J., Ivanyi J. Genetic influences on the immune repertoire following tuberculosis infection in mice. Immunology, 1990, 71, p. 113-119.

30. Brett S.J., Orrell J.M., Swanson-Beck J., Ivanyi J. Influence of H-2 genes on growth of Mycobacterium tuberculosis in the lungs of chronically infected mice. Immunology, 1992, 76, p. 129-132.

31. Chan J., Xing Y., Magliozzo R.S., Bloom B. Killing of virulent Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen itnermediates produced by activated murine macrophages. J. Exp. Med., 1992, 175, p.l 111-1122.

32. Chan, J., Tanaka K., Carroll D., Flynn J., Bloom B. Effects of nitric oxide synthase inhibitors on murine infections with Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 1995, 63, p. 736-740.

33. Comstock G.W. Tuberculosis in twins: a re-analysis of the Prophit survey. Am Rev Respir Dis., 1978, 117, p. 621-624.

34. Cooper A.M., Dalton D.K., Stewart T.A. et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J. Exp. Med., 1993, 178, p. 2243-2247.

35. Cooper A.M., Roberts A.D., Rhoades E.R., Callahan J.E., Getzy D.M., Orme I.M. The role of intrleukin-12 in asquired immunity to Mycobacterium tuberculosis infection. Immunology, 1995, 84, p. 423-432.

36. Cooper A.M.,. Flynn J.L. Protective immune response on Mycobacterium tuberculosis. Curr. Opin Immunol., 1995, 7, p. 512-516.

37. Cooper A.M., D'Souza C., Frank A.A., Orme I. M. The course of M tyberculosis infection in the lungs of mice lacking expressions of either perforin- or granzyme-mediated cytolytic mechanisms. Infect. Immun., 1997, 65, p. 1317-1320.

38. Daniel T.M., and Boom W.H. Immunology of Tuberculosis. From Tuberculosis. A comprehensive international approach. Reichman L.R., Hershfield E.S., eds. 2000. Marcel Dekker, New York;

39. Das G., Vohra H., Saha B., Agrewala J.N., Mishra G.C. Apoptosis of Thl-like cells in experimental tuberculosis (TB). Clin. Exp. Immunol., 1999, 115, p. 324-328.

40. Davies P.D.O. A possible link between vitamin D deficiency and impaired host defence to Mycobacterium tuberculosis. Tubercule, 1985,66, p. 301-306.

41. Denis M. Killing of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: activation by cytokines and calcitriol. Clin. Exp. Immunol., 1991, 84, p. 200-206.

42. Dolin D.J., Raviglione P. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull. Word Health Organ., 1994, 72, p. 213-220.

43. Dye C., Scheele S., Dolin P., et al. Consensus statement: global burdei, of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project. J. Am. Med. Assoc., 1999, v. 282, p. 677-686.

44. Erb K.J., Kirman J., Delahunt B., Chen W., LeGros G. IL-4, IL-5 and IL-10 are not required for the control of M. bovis- BCG infection in mice. Immunol. Cell Biol., 1998; 76, p. 41-46.

45. Feng, C, A. G. D. Bean, H. Hool, H. Briscoe, and W. J. Britton. 1999. Increase in gamma interferon-secreting CD8+, as well as CD4+, T cells in lungs following aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immun. 67:3242

46. Flesch, I.E., Kaufmann S.H. Mechanisms involved in mycobacterial growth inhibition by IFN-y activated bone marrow macrophages: role of reactive nitrogen intermediates. Infect. Immun., 1991,59, p. 3213-3218.

47. Flynn J.L., Goldstein M.M., Triebold K.J., et al. Major histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. Proc Natl. Acad. Sei USA, 1992, v. 89, p. 12013-12017.

48. Flynn J.L., Chan J., Triebold K.J., Dalton D.K., Stewart T.A., Bloom B.R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J. Exp. Med., 199*, ¡78, p. 2249-2254.

49. Forget A., Skamene E., Gros P., Miaihle A.-C., Turcotte R. Strain diffirences in the response to infection with small dispersed doses of Mycobacterium bovis BCG among inbred mice. Infect. Immun., 1981, 32, p. 42-47.

50. Filley E.A, Rook G.A.W, Bull H.A, Dowd P.M. The effect of Mycobacterium tuberculosis on the susceptibility of human cells to the stimulatory and toxic effects of TNF. Immunology. 1992, 77: 505-509.

51. Filley E.A, Rook G.A.W. Effects of mycobacteria on sensitivity to the cytotoxic effects of TNF. Infect. Immun. 1991, 59: 2567-2572.

52. Goldfeld A.E, Delgado J.C, Thim S, Bozon M.V, Uglialoro A M, Turbay D, Cohen C, Yunis E.J. Association of HLA-DQ allele with clinical tuberculosis. JAMA, 1998, 279, p. 226-228.

53. Griffin, J. P., and I. M. Orme. 1994. Evolution of CD4 T-cell subsets following infection of naive and memory immune mice with Mycobacterium tuberculosis. Inf. Immun. 62: 1683

54. Gros P., Scamene E., Forget A. Genetic control of natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG) in mice. J. Immunol., 1981, 127, p. 2417-2421.

55. Gros P., Skamene E., Forget A. Cellular mechanisms of genetically controled host resistance to Mycobacterium bovis (BCG). J. Immunol. 1983, 127: 2417-2421.

56. Gruenheid S., Cellier M., Vidal S.M., Gros P. Identification and characterization of a second mouse Nramp gene. Genomics, 1995, 25, p. 514-525.

57. Gruenheid S., Pinner E., Desjardins M. Gros P. Natural resistance to infection with intracellular parasites: the Nramp 1 protein is recruited to the membrane of the phagosome. J. Exp. Med., 1997, 185, p.717-730.

58. Harding F A., McArthur J.G., Gross J.A., Raulet D.H., Allison J.P. CD28- mediated signaling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones. Nature, 1992. 356, p. 607.

59. Hernandez-Pando, R., H. Orozco, J. Honour, P. Silva, R. Leyva, and G. A. W. Rook. Adrenal changes in murine pulmonary tuberculosis; a clue to pathogenesis? FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1995, 12:63-72.

60. Howard G., Ngyen T., Morrison N., et al. Genetic influences on bone density : physiological correlates of vitamin D receptor gene alleles in premenopausal women. J. Clin. Endocrinol. Metab.,1995, 80, p. 2800-2805.

61. Huygen K., Palfliet K., Jurion F., Hilgers J. H-2 linked control of in vitro inter^ron-y production in response to 32-kilodalton antigen (P32) of Mycobacterium bovis Bacillius Calmet- Guerin. Infect. Immunol., 1988, V.56, p. 3191-3200.

62. Huygen K., Ljungovist L„ ten Berg R., van Vooren J. Repertories of antibodies to culture filtrate antigens in different mouse strains infected with Mycobacterium bovis (BCG). Infect. Immunol., 1990,V.58, p.2192-2197.

63. Huygen K„ Drowart A., Harboe M. et al. Influence of genes from the MHC on the antibody repertoire against culture filtrate antigens in mice infected with live Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun., 1993, 61, p. 2687-2693.

64. Ivanyi J., Sharp K. Control by H-2 genes of murine antibody responses to protein antigens of Mycobacterium tuberculosis. Immunology, 1986, 59, p. 329-332.

65. Jing L., Cellier M., Schurr E„ Skamene E. Comparative genome analysis -a novel strategy to study the genetics of host-parasite interaction. J.Parasitol., 1993, V. 79(4), p. 463-469.

66. Kaufmann S.H.E., Flesh I. Function and antigen recognition pattern of L3T4+ T-cell clones from Mycobacterium tuberculosis immune mice. Infect. And Immun., 1986, V.54, p.291-296.

67. Kaufmann S.H.E. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? Nature Med., 2000, 6, p. 955-960.

68. Kaufmann S.H.E. How can immunology contribute to the control of tuberculosis. Nat. Rev.Immun., 2001, 1(1), p.20-30.

69. Kindler V., Sappino A-P., Grau G.E., et al. The inducing role of tumour necrosis factor in the development of bactericidal granulomas during BCG infection. Cell, 1989, v. 56, p. 731-740.

70. Kerksiek K.M., Pamer E.G. T cell response to bacterial infection. Curr. Opin. Immunol., 1999, 11, p. 400-404.

71. Kopf M., Baumann H., Freer G., Freudenberg M., Lamers M., Kishimoto T Zinkernagel R., Bluethman H., Köhler G. Impaired immune and acute phase responses in interleukin -6 deficient mice. Nature, 1994, 368, p. 339-341.

72. Kramnik I., Demant P., Bloom B.B. Susceptibility to tuberculosis as a complex genetic trait: analysis using recombinant congenic strains of mice.Genetics and tuberculosis. Novartis Foundation Symposium 217, 1998, p. 120-137.

73. Kramnik I., Dietrich W.F., Demant P., Bloom B.B. Genetic control of resistance to experimental infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, V.97 (15), p. 8560-8565.

74. Kramnik I.,Boyartchuk V. Immunity to intracellular pathogens as a complex genetic trait. Cur.Opin.Microbiol., 2002, 5, p. 111-117.

75. Ladel C.H., Blum C., Dreher A., Reifenberg K., Kopf M., Kaufmann S.H.E. Lethal tuberculosis in interleukin-6-deficient mutant mice. Infection and Immunity, 1997, V.65 (11), p. 4843-4849.

76. Lalvani A, Pathan AA, McShane H, Wilkinson RJ, Latif M, Conlon CP, Pasvol G, Hill AV.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med. 2001 Mar;163(4):807-8;

77. Lavebratt C., Apt A.S., Nikonenko B.V., Schalling M., Schurr E. Severity of tuberculosis in mice linked to distal chromosome 3 and proximal chromosome 9. J. Infect. Dis., 1999, 180, p. 150-155.

78. Leigeling A., Pfeffer K., Balling R. The battle of two genomes: genetics of bacterial host/pathogen interaction in mice. Mammal. Genome., 2001, 12, p. 261-271.

79. MacMicking J.D., North R.J., LaCourse R., Mudgett J.S., Shah S.K., Nathan C.F. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997,94, p. 5243-5248.

80. McLeod R., Buschman E., Arbucle L.D., Skamene E. Immunogenetics in the analysis of resistance to intracellular pathogens. Curr. Opin. Immunol., 1995, 7, p. 539-552.

81. Medina E., North R.J. Evidence inconsistent with a role for the Beg gene (Nrampl) in resistance of mice to infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. J. E p. Med., 1996, 183, p. 1045-1051.

82. Meyer C.G, May J, Stark K. Human leukocyte antigens in tuberculosis and leprosy. Trends Microbiol., 1998, 6, p. 148-154.

83. Migliorini P., Corradin G., Corradin S.B. Macrophage NC>2 production as a sensitive and rapid assay for quantitation of murine IFN-y. J.Immunol.Meth., 1991, 139: 107-114.

84. Modlin, R.L. Thl-Th2 paradigm: insights from leprosy. J.Invest. Dermatol. 1994, 102: 828-832.

85. Murray G.D.L., Styblo K., Rouillon A. Tuberculosis in developing countries: burden, invention and cost. Bull. Int.Union Tuberc.Lung Dis., 1990, 65, p. 6-24.

86. Murray C„ Solomon J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95, p. 13881 -13886.

87. Newport M.J, Levin M. Genetic susceptibility to tuberculosis. J Infect., 1999, 39, p. 117-121.

88. Nikonenko B.V., Apt A.S., Moroz A.M, Averbakh M.M. Genetic analysis of susceptibility of mice to H37Rv tuberculosis infection: sensitivity versus relative resistance. Prog. Leukocyte Biol., 1985,3, p. 291-299.

89. Nikonenko B.V., Mezhlumova M.B., Apt A.S., Moroz A.M. Local adoptive transfer of delayed-type hypersensitivity to tuberculin from M, bovis BCG-infected mice. Folia Biol., 1989, 35, p. 255-258.

90. Nikonenko B.V., Averbakh M.M., Lavebratt C., Schurr E., Apt A.S. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tuber. Lung. Dis., 2000, 80, p. 15-25.

91. Noel P.J., Boise L.H., Green J.M., Thompson C B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J. Immunol., 1996, 157 (2), p. 636- 642.

92. North R.J. Mice incapable of making IL-4 or IL-10 display normal resistance to infection with Mycobacterium tybercolosis. Clin. Exp. Immunol., 1998. 113, p. 55-58.

93. North R.J., Lacourse R., X.yan L. Vaccinated mice remain more susceptible to Mycobacterium tybercolosis infection initiated via the respiratory route than via the intravenous route. Infection Immunity, 1999, V.67, 4, p. 2010-2012.

94. O'Brien A.D., Scher I., Metealf E.S. Genetically conferred defect in antisalmonella antibody formation renders CBA/N mice initially susceptible to Salmonella typhimurium infection. J. Immunol., 1981, V.126, p. 1368-1372.

95. O'Brien L., Carmichael J. Lowrie D., Andrew P. Strains of Mycobacterium tuberculosis differ in susceptibility to reactive nitrogen intermediates in vitro. Infect. Immun., 1994,62, p. 5187-5190.

96. Orme I.M., Collins F.M. Protection against Mycobacterium tuberculosis infection by adoptive immunotherapy. Requirement for T cell-deficient recipients J. Exp. Med., 1983, 158, p. 74-83.

97. Orme I.M., Miller E.S., Roberts A., Furney S„ Griffin J., Dobos K„ Brennan P.J. T lymphocyte mediated protection and cellular cytolysis during the course of Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol., 1992, V.148, 1, p. 189-196.

98. Orme I.M., Andersen P., Boom W.H. T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J. infect. Dis., 1993, 167, p. 1481-1497.

99. Pichugin A.V., Khaidukov S.V., Moroz A.M., Apt A.S. Capacity of mu/irie T cells to retain long-term responsiveness to mycobacterial antigens is controlled by the H-2 complex. Clin. Exp. Immunol., 1998, 111, p. 316-324.

100. Rojas M., Barrera L.F., Garcia L.F. Induction of apoptosis in murine macrophages by Mycobacterium tuberculosis is reactive oxygen intermediates-independent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 247: 436-442

101. Rook G.A, Steele J, Fraher L, et al. Vitamin D3, gamma interferon, and control of proliferation of Mycobacterium tuberculosis by human monocytes. Immunology, 1986, 57, p. 159-163.

102. Rook, G., and R. Hernandez-Pando. 1996. Pathogenesis of tuberculosis. Ann. Rev. Microbiol. 50.259.

103. Russo D.M., Kozlova N., Lakey D.L., and Kernodle D. Naive human T cells develop into Thl effectors after stimulation with Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages or recombinant Ag85 proteins. Infect Immun 2000, v. 68, p. 6826-6832.

104. Sanches F.O., Rodriguez J.I., Agudelo G., Garcia L. F. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls. Infect. Immun. 1994, 62: 5673-5678.

105. Schaible U.E., Sturgill-Koszycki S. Schlesinger P.H., and Russell D.G. Cytokine fctivation leads to acidification and increases maturation of Mycobacterium avium-containing phagosomes in murine macrophages. J Immunol, 1998, v. 160, p. 1290-1296.

106. Shams H„ Wizel B., Weis S.E., et al. Contribution of CD8f T cells to gamma interferon production in human tuberculosis. Infect. Immun., 2001, v. 69, p. 3497-3501.

107. Scher I., Ahmed A., Strong D.M., Steinberg A.D., Paul W.E. X-linked B lymphocytes immune defect in CBA/N mice. Studies of the function and composition of spleen cells. J.Exp. Med., 1975, V.141, p. 788-791.

108. Scher I., Steinberg A.D., Berning A.K., Paul W.E. X-linked B lymphocytes immune defect in CBA/N mice. Studies of the mechanism underlying the immune defect. J.Exp. Med., 1975, V.142, p. 637-640.

109. Schurr E., Skamene E., Forget A., Gros F. Linkage analysis of the Beg gene on mouse Chromosom I. Identification of tightly linked marker. J. Immunology, 1989, V.12, p. 4507-4513.

110. Schurr E., Buschman E., Malo D., Gros P., Skamene E. Immunogenetics of mycobacterial infections: mouse-human homologies. J. Infect. Dis., 1990, V. 161, p. 634639.

111. Schwartz R.H. A cell culture modell for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990, 248, p. 1349.

112. Shi Y., Radvanyi L.G., Sharma A., Shaw P., Green D R., Miller R.G., Mills G.B. CD28-mediated signaling in vivo prevents activation-induced apoptosis in the thymus and alters peripheral lymphocyte homeostasis. J. Immunol., 1995, 155, p. 1829.

113. Skamene E., Gros F., Forget A., Kongshavn P.A.L. Genetic regulation of resistance to intracellular pathogens. Nature, 1982, 297, p. 506-509.

114. Skamene E. Genetic control of susceptibility to mycobacterial infections. Rev. of Infec. Dis., 1989, V.l 1, p. 394-399.

115. Skamene E., Schurr E., Gros F. Infection genomics: Nrampl as a major determinant of natural resistance to inracellular infections. Annu. Rev Med., 1998, 49, p. 275-287.

116. Sprent J., Bruce J., Ron Y., Webb S.R. Physiology of B-cells in mice with X-linked immunodeficiency. Size, migratory properties and turover of the B-cell pool. J.Immunol., 1985, V. 134, p. 1442-1448.

117. Stach J.L., Gros P., Skamene E., Forget A. Phenotypic expression of genetically controlled natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG). J.Immunol., 1984, 132: 888892.

118. Stead W.W, Senner J.W, Reddick W.T, Lofgren J.P. Racial differences in susceptibility to infection by Mycobacterium tuberculosis. N Engl J Med., 1990, 322, p. 422-427.

119. Stead W.W. Genetics and resistance to tuberculosis: could resistance be enhanced by genetic engineering? Ann Intern Med., 1992, 116, p. 937-941.

120. Supek F., Supekova L., Nelson N., Nelson H. A yeast manganese transporter related to the macrophage protein involved in conferring resistance to mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, p. 5105-5110.

121. Tsoukas C.D., Prowedini D.M., Manolagas S.C. 1,25 dihydroxyvitamin Ü3' a novel immunoregulatory hormone. Science, 198^', 224, p. 1438-1440.

122. Tsuyuguchi K„ K. Suzuki, H Matsumo'o, E. Tanaka, R. Amitani, F. Kuze. Effect of oestrogen on Mycobacterium avium complex pulmonary infection in mice. Clin. Exp. Immunol., 2001, 123, p. 428-434.

123. Vidal S.M., Malo D., Vogan K., Skamene F., Gros P. Natural resistance to infection with intrcellular parasites: isolation of a candidate for Beg. Cell, 1993, 73, p. 469-485.

124. Vidal S.M., Belouchi A.M., Cellier M. Cloning and characterization of a second human NRAMP gene onchromosom 12ql3. Mamm.Genome., 1995, 6, p. 224-230.

125. Vidal S.M., Pinner E., Lepage P., et al. Natural resistance to intracellular infectious: Nrampl encodes a membrane phosphoglycoprotein absent in macrophages from susceptible (Nrampl0169) mouse strains. J.Immunol., 1996, 157, p. 3559-3568.

126. Wangoo A., Sparer T., Brown I.N., et al.Contribution of Thl and Th2 cells to protection and pathology in experimental models of granulomatous lung disease. J. Immunol., 2001, v. 166, p. 3432-3469.

127. Wood M. W., Vandongen H.M.A., Vandongen A.M.J. Structural conservation of ion conduction pathways in K+ channels and glutamate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995,92, p.4882-4886.

128. Yother J., Forman C., Gray B.M., Briles D.E. Protection of mice from infection with Streptococcus pneumonia by anti-phosphocholine antibody. Infect. Immun., 1982, V.36, p.184-188.

129. Zhang M., Gong J., Iyer D. V., Jones B. E., Modlin R. L., Barnes P F Y cells cytokine responses in persons with tuberculosis and human immunodeficiency virus infections. J. Clin. Invest. 1994, 94: 2435-2442.

130. Zhang M., Lin Y., Iyer D. V., Gong J., Abrams J. S., Barnes P.F. T-cell cytokine responses in human infections with Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 1995, 63 3231-3234.