Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Логинов, Дмитрий Сергеевич

• Логинов, Дмитрий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Логинов, Дмитрий Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. История исследования лакказ.

2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ.

2.3. Общая характеристика лакказ.

2.4. Структура и строение активных центров лакказ.

2.5. Субстратная специфичность лакказ.

2.6. Механизмы катализа.

2.7. Биосинтез лакказ.

2.8. Использование лакказ в биотехнологии.

2.9. Геномная организация лакказ.

2.10. Экспрессия грибных лакказ.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты.

3.1.2. Носители.

3.1.3. Реагенты.

3.2 Методы.

3.2.1 Культивирование штаммов продуцентов лакказы.

3.2.2 Получение антигена - дегликозилированной лакказы (Ьас1).

3.2.3 Иммунизация.

3.2.4 Тестирование антисывороток методом непрямого ИФА.

3.2.5 Измерение пероксидазной активности в твердофазных системах.

3.2.6 Очистка поликлональных антител.

3.2.7 Определение специфичности полученных препаратов антител.

3.2.8 Синтез конъюгатов, меченых пероксидазой хрена (ПХ).

3.2.9 Вестерн блоттинг.

3.2.10 Выделение рекомбинантной лакказы.

3.2.11 Определение активности лакказы.

3.2.12 Определение концентрации белка.

3.2.13 Оценка гомогенности препаратов и определение молекулярной массы.

3.2.14 Определение изоэлектрической точки.

3.2.15 Спектральная характеристика.

3.2.16 Регистрация ЭПР-спектров лакказы.

3.2.17 Определение количества углеводов.

3.2.18 Определение температурного и рН-оптимумов активности лакказ и изучение их термостабильности.

3.2.19 Дифференциальная сканирующая калориметрия.

3.2.20 Определение кинетических параметров.

3.2.21 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы.

3.2.22 Сбор кристаллографических данных и их обработка.62,

3.2.23 Визуализация белковых структур.

3.2.24 Динамическое светорассеяние.

3.2.25 Расчет модели взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Разработка метода иммунодетекции лакказ.

4.2. Выделение нативной и рекомбинантной лакказ.

4.3. Изучение спектральных характеристик лакказ.

4.4. Сравнительная характеристика физико-химических свойств нативного и рекомбинантного ферментов.

4.4.1 рН-оптимум.

4.4.2 Термооптимум.

4.4.3 Термостабильность.

4.4.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

4.5 Каталитические свойства рекомбинантной лакказы.

4.6 Сравнительное изучение трехмерных структур рекомбинантной лакказы из Р. canescens и нативной лакказы из Т. hirsuta.

4.6.1 Решение и уточнение структуры рекомбинантной лакказы.

4.6.2 Сравнение последовательностей нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.5 Образование димерной формы.

4.6.6 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС.

5. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы»

В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Особый интерес для промышленного использования представляет лакказа (и-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2), содержащая уникальный ансамбль из четырех ионов меди, которые формируют ее активный центр. Лакказа катализирует окисление субстрата — донора электронов, сопровождающееся восстановлением молекулярного кислорода до воды.

Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения [1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть практически значимых лакказ выделены из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом: в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина; в насекомых она участвует в процессах склеротизации и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [2]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [3].

Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратная специфичность фермента может быть значительно расширена при использовании редокс-медиаторов. В присутствии редокс-медиаторов лакказы могут окислять нефенольные соединения различной природы. Как правило, значения редокс-потенциала Т1-центра лакказ (первичного акцептора электронов) лежат в диапазоне от +430 до +790 мВ, однако использование системы 6 фермент-медиатор позволяет окислять соединения со значениями Е° выше +1100 мВ [4]. Кроме того, медиатор действует как подвижный электронный переносчик, позволяющий окислять высокомолекулярные биополимеры, такие как лигнин и целлюлозу.

По каталитическим свойствам, субстратной специфичности и биотехнологическому потенциалу лакказа - практически идеальный катализатор для «зеленой» химии. Тем не менее, промышленное использование лакказ ограничено, прежде всего, отсутствием их крупномасштабного производства и, как следствие, высокой стоимостью ферментных препаратов. Кроме того, большинство исследованных ферментов проявляют максимальную активность в кислой области рН, довольно низкую стабильность при нейтральных и щелочных рН, а также в присутствии органических растворителей, что значительно ограничивает возможности их использования в биосенсорных технологиях, биотопливных элементах и органическом синтезе. Традиционным подходом для решения такого рода проблем является создание высокоэффективных продуцентов гетерологичного белка. Гетерологичная экспрессия секреторных форм лакказ описана для большинства традиционно используемых эукариотических систем: Saccharomyces cerevisiae [5], Yarrowia lipolytica [6, 7], Pichia pastoris [8, 9], Trichoderma reesei [10], Aspergillus oryzae [11], Aspergillus niger [12] и др. Однако высокоэффективного штамма-продуцента рекомбинантной лакказы в этих эукариотических системах так и не создано, а полученные мутантные формы фермента не обладают желаемыми каталитическими характеристиками и стабильностью.

Для реализации стратегии получения эффективных рекомбинантных продуцентов лакказ необходимо разработать теоретические представления о механизмах биосинтеза и фолдинга сложных белков, в том числе металлоферментов, а также принципах их структурно-функциональной организации. В настоящее время для получения ферментов с измененными субстратными специфичностями, каталитическими свойствами и 7 олигомерными структурами используют различные подходы белковой инженерии (рациональный дизайн, направленная эволюция). Для лакказ вышеперечисленные подходы оказались малоэффективными, поскольку ключевым этапом их реализации является получение высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов, которые синтезируют фермент, не уступающий природному аналогу по стабильности и каталитическим характеристикам.

Таким образом, изучение процессов гетерологичной продукции лакказ является крайне актуальным для выяснения закономерностей фолдинга металлоферментов при секреции в эукариотических микроорганизмах. Наиболее перспективно для экспрессии гетерологичных белков использование мицелиальных грибов рода Pénicillium, способных секретировать в культуральную жидкость достаточно большие количества белка. Кроме того, использование системы Pénicillium позволяет исследовать гетерологичную экспрессию лакказы в новом эукариотическом организме.

Целью настоящей работы было сравнительное структурно-функциональное исследование нативной лакказы Trametes hirsuta и фермента, гетерологически экспрессированного в Pénicillium canescens (рекомбинантный фермент).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• разработка эффективного протокола иммунохимического скрининга трансформантов;

• разработка эффективной системы очистки рекомбинантного фермента;

• определение физико-химических и каталитических свойств рекомбинантной лакказы;

• характеристика рекомбинантного фермента на структурном уровне.

2. Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Логинов, Дмитрий Сергеевич

5. Выводы

Получены поликлональные антитела к нефолдированной лакказе Т. hirsuta, обладающие более высокой специфичностью по сравнению с антителами к нативному ферменту, что позволило разработать высокочувствительный метод скрининга лакказ в культуралыюй жидкости иммуноблоттингом.

Разработан эффективный протокол очистки рекомбинантной лакказы, позволяющий получить гомогенный фермент. Сравнительный анализ физико-химических свойств гомогенных препаратов нативной и рекомбинантной лакказ показал увеличение молекулярной массы с 67 до 72 кДа, pl с 4,0 до 4,3, температурного оптимума на 10°С, термостабильности на 70 минут и количества углеводов на молекулу с 12 до 16%. Значение энтальпии плавления для рекомбинантной лакказы, рассчитанное по данным ДСК анализа, превышало аналогичный параметр для нативной более чем в 1.5 раза. Полученные данные свидетельствуют о разных механизмах гликозилирования лакказы для нативного и рекомбинантного штаммов-продуцентов. Показано, что кинетические параметры окисления фенольных субстратов нативной и рекомбинантной лакказами практически одинаковы, в то же время установлено возрастание значений каталитических констант в 1.3 раза при окислении нефенольных субстратов рекомбинантным ферментом по сравнению с нативным. Впервые решена структура базидиальной лакказы Т. hirsuta, экспрессированной в аскомицете Р. canescens, с разрешением 2.3 А. Структуры нативного и рекомбинантного фермента могут быть совмещены по координатам всех Са атомов с r.s.m.d. 0.3 А, что указывает на отсутствие значительных отличий в ходе их полипептидных цепей.

Установлены различия в строении углеводной части нативной и рекомбинантной лакказ по сайтам гликозилирования Asn54, Asn217 и

Азп436 и наличие дополнительного сайта гликозилирования Авп377 у рекомбинантного фермента, что обуславливает его более высокие температурный оптимум и термостабильность.

6. Анализ карт электронной плотности активного центра нативной и рекомбинантной лакказ показал, что их Т1 медные центры имеют идентичную структуру. Заселенность иона меди Т2 составляет 0.8 и 0.5 для нативного и рекомбинантного фермента соответственно. Таким образом, в препарате рекомбинантной лакказы могут присутствовать молекулы белка с удаленным ионом меди второго типа.

7. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия нативного и рекомбинантного фермента с нефенольным субстратом АБТС. Показано уменьшение расстояния от Т2/ТЗ медного кластера до катион-радикала АБТС в случае рекомбинантной лакказы, обусловленное изменением строения углеводной цепи по сайту гликозилирования Азп436.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Логинов, Дмитрий Сергеевич, 2010 год

1. Nitta, К., К. Kataoka, and Т. Sakurai, Primary structure of a Japanese lacquer tree laccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases. J Inorg Biochem, 2002. 91(1): p. 125-31.

2. Valderrama, В., et al., Evolutionary and structural diversity of fungal laccases. Antonie Van Leeuwenhoek, 2003. 84(4): p. 289-99.

3. Claus, H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol, 2003.179(3): p. 145-50.

4. Fernandez-Sanchez, C., et al., Voltammetric monitoring of laccase-catalysed mediated reactions. Bioelectrochemistry, 2002. 58(2): p. 14956.

5. Necochea, R., et al., Phylogenetic and biochemical characterisation of a recombinant laccase from Trametes versicolor. FEMS Microbiol Lett, 2005. 244(2): p. 235-41.

6. Madzak, C., et al., Heterologous production of a laccase from the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res, 2005. 5(6-7): p. 635-46.

7. Jolivalt, C., et al., Expression of laccase Illb from the white-rot fungus Trametes versicolor in the yeast Yarrowia lipolytica for environmental applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2005. 66(4): p. 450-6.

8. Hong, Y., et al., Expression of a laccase cDNA from Trametes sp. AH28-2 in Pichia pastoris and mutagenesis of transformants by nitrogen ion implantation. FEMS Microbiol Lett, 2006. 258(1): p. 96-101.

9. Colao, M.C., et al., Heterologous expression of led gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microb Cell Fact, 2006. 5(31): p. 1-11.

10. Kiiskinen, L.L., et al., Expression of Melanocarpus albomyces laccase in Trichoderma reesei and characterization of the purified enzyme. Microbiology, 2004.150(Pt 9): p. 3065-74.

11. Sigoillot, C., et al., Natural and recombinant fungal laccases for paper pulp bleaching. Appl Microbiol Biotechnol, 2004. 64(3): p. 346-52.

12. Bohlin, C., et al., Heterologous expression of Trametes versicolor laccase in Pichia pastoris and Aspergillus niger. Appl Biochem Biotechnol, 2006.129-132: p. 195-214.

13. Nakamura, K. and N. Go, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins. Cell Mol Life Sei, 2005. 62(18): p. 2050-66.

14. Kiefer-Meyer, M.C., et al., Cloning and sequence analysis of laccase-encoding cDNA clones from tobacco. Gene, 1996. 178(1-2): p. 205-7.

15. Solomon, E.I., U.M. Sundaram, and T.E. Machonkin, Multicopper Oxidases and Oxygenases. Chem Rev, 1996. 96(7): p. 2563-2606.

16. Givaudan, A., et al., Polyphenol oxidase from Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere: Evidence for laccase activity in non-motile strains of A. lipoferum. FEMS Microbiology Letters, 1993. 108(2): p. 205-210.

17. Alexandre, G. and I.B. Zhulin, Laccases are widespread in bacteria. Trends Biotechnol, 2000. 18(2): p. 41-2.

18. Jimenez, M., et al., Screening of yeasts isolated from decayed wood for lignocellulose-degrading enzyme activities. Mycological Research, 1991. 95(11): p. 1299-1302.

19. Singh Arora, D. and R. Kumar Sharma, Ligninolytic Fungal Laccases and Their Bio technological Applications. Appl Biochem Biotechnol, 2009.

20. Baldrian, P., Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 2006. 30(2): p. 215-42.

21. Morozova, O.V., et al., "Blue" laccases. Biochemistry (Mose), 2007. 72(10): p. 1136-50.

22. Ander, P. and E. K.-E., The importance of phenoloxidase activity in lignin degradation by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. Archives of Microbiology, 1976. 109: p. 1-8.

23. Eggert, C., U. Temp, and K.E. Eriksson, Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett, 1997. 407(1): p. 89-92.

24. Hermann, T.E., M.B. Kurtz, and S.P. Champe, Laccase localized in hulle cells and cleistothecial primordia of Aspergillus nidulans. J Bacteriol, 1983. 154(2): p. 955-64.

25. Panepinto, J.C. and P.R. Williamson, Intersection of fungal fitness and virulence in Ctyptococcus neoformans. FEMS Yeast Res, 2006. 6(4): p. 489-98.

26. Wood, D., Production, purification and properties of extracellular laccase of Agaricus bisporus. Journal of General Microbiology,, 1980. 117: p. 327-338.

27. Dittmer, J.K., N.J. Patel, and S.W. Dhawale, Production of multiplelaccase isoforms by Phanerochaete chysosporium grown under nutrientsufficiency. FEMS Microbiology Letters, 1997. 149(1): p. 65-70.

28. Nagai, M., et al., Important role of fungal intracellular laccase formelanin synthesis: purification and characterization of an intracellular109laccase from Lentinula edodes fruit bodies. Microbiology, 2003. 149(Pt 9): p. 2455-62.

29. Wang, H.X. and T.B. Ng, Purification of a novel low-molecular-mass laccase with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma giganteum. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 315(2): p. 450-4.

30. Fernandez-Larrea, J. and U. Stahl, Isolation and characterization of a laccase gene from Podospora anserina. Mol Gen Genet, 1996. 252(5): p. 539-51.

31. Bollag, J.M. and A. Leonowicz, Comparative Studies of Extracellular Fungal Laccases. Appl Environ Microbiol, 1984. 48(4): p.'849-854.

32. Munoz, C., et al., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn2+ oxidation. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(6): p. 2166-74.

33. Shleev, S.V., et al., Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different hasidiomycetes. Biochimie, 2004. 86(9-10): p. 693-703.

34. Slomczynski, D., J.P. Nakas, and S.W. Tanenbaum, Production and Characterization of Laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(3): p. 907-912.

35. Kawasaki, N., et al., The significance of glycosylation analysis in development of biopharmaceuticals. Biol Pharm Bull, 2009. 32(5): p. 796-800.

36. Cambria, M., et al., Production, purification, and properties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus. Protein Expr Purif, 2000. 18(2): p. 141-7.

37. Ducros, V., et al., Crystal structure of the type-2 Cu depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 A resolution. Nat Struct Biol, 1998. 5(4): p. 310-6.

38. Mansur, M., et al., Identification of a laccase gene family in the new lignin-degrading basidiomycete CECT 20197. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(7): p. 2637-46.

39. Quintanar, L., et al., Spectroscopic and electronic structure studies of the trinuclear Cu cluster active site of the multicopper oxidase laccase: nature of its coordination unsaturation. J Am Chem Soc, 2005. 127(40): p. 13832-45.

40. Hakulinen, N., et al., Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Biol, 2002. 9(8): p. 601-5.

41. Zhukova, Y.N., Voelter, W., Zaitsev, V.N., Bento, I., Stepanova,

42. E.V., Kachalova, G.S., Koroleva, O.V., Betzel, C., Lindley, P.F.,111

43. Mikhailov, A.M., Tishkov, V.I., Morgunova, E.Y., Crystal structure of laccase from Coriolus zonatas at 2.6 A resolution. Crystallography Reports, To be published.

44. Garavaglia, S., et al., The structure of Rigidoporus lignosus Laccase containing a full complement of copper ions, reveals an asymmetrical arrangement for the T3 copper pair. J Mol Biol, 2004. 342(5): p. 151931.

45. Piontek, K., M. Antorini, and T. Choinowski, Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37663-9.

46. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Cu-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001. 57(Pt 2): p. 333-6.

47. Lyashenko, A.V., et al., Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2006. 62(Pt 10): p. 954-7.

48. Polyakov, K.M., et al., Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 6): p. 611-7.

49. Enguita, F.J., et al., Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19416-25.

50. Kataoka, K., et al., Structure and function of the engineered multicopper oxidase CueO from Escherichia coli--deletion of the methionine-rich helical 7-egion covering the substrate-binding site. J Mol Biol, 2007. 373(1): p. 141-52.

51. Skalova, T., et al., The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases. J Mol Biol, 2009. 385(4): p. 1165-78.

52. Pegasova, T.V., et al., Crystallization and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003. 59(Pt 8): p. 1459-61.

53. Eggert, C., et al., Molecular analysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabar inns. Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1766-72.

54. Garzillo, A.M., et al., Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii. J Protein Chem, 2001. 20(3): p. 191-201.

55. Xu, F., et al., Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 12372-5.

56. Reinhammar, B.R., Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin. Biochim Biophys Acta, 1972. 275(2): p. 245-59.

57. Koroljova, O.V., et al., Laccase of Coriolus zonatus: isolation, purification, and some physicochemical properties. Appl Biochem Biotechnol, 1999. 76(2): p. 115-27.

58. Schneider, P., et al., Characterization of a Coprinus cinereus laccase. Enz Microb Technol, 1999. 25: p. 502-508.

59. Chefetz, B., Y. Chen, and Y. Hadar, Purification and characterization of laccase from Chaetomium thermophilium and its role in humification. Appl Environ Microbiol, 1998. 64(9): p. 3175-9.

60. Heinzkill, M., et al., Characterization of laccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1601-6.

61. Bulter, T., et al., Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Appl Environ Microbiol, 2003. 69(2): p. 987-95.

62. Palmieri, G., et al., A Novel White Laccase from Pleurotus ostreatus. Thejournal of biological chemistry, 1997. 272 ( 50): p. 31301-31307.113

63. Soden, D.M., J. O'Callaghan, and A.D. Dobson, Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host. Microbiology, 2002. 148(Pt 12): p. 4003-14.

64. Record, E., et al., Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme. Eur J Biochem, 2002. 269(2): p. 602-9.

65. Xu, F., et al., A study of a series of recombinant fungal laccases and bilirubin oxidase that exhibit significant differences in redox potential, substrate specificity, and stability. Biochim Biophys Acta, 1996. 1292(2): p. 303-11.

66. Galhaup, C., et al., Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, 2002. 148(Pt 7): p. 2159-69.

67. Garzillo, A.M., et al., Laccase from the white-rot fungus Trametes trogii. Appl Microbiol Biotechnol, 1998. 49(5): p. 545-51.

68. Jung, H., F. Xu, and K. Li, Purification and characterization of laccase from wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY-7. Enzyme and Microbial Technology, 2002. 30(2): p. 161-168

69. Edens, W.A., et al., Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. tritici. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(7): p. 3071-4.

70. Quintanar, L., et al., Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner. Acc Chem Res, 2007. 40(6): p. 445-52.

71. Bento, I., et al., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans, 2005(21): p. 3507-13.

72. Gayazov, R. and J. Rodakiewicz-Nowak, Semi-continuous production oflaccase by Phlebia radiata in different culture media Folia

73. Microbiologica, 1996. 41(6): p. 480-484.114

74. Rigling, D. and N.K. Van Alfen, Regulation of laccase biosynthesis in the plant-pathogenic fungus Cryphonectria parasitica by double-stranded RNA. J Bacteriol, 1991. 173(24): p. 8000-3.

75. Couto, S.R. and J.L. Toca-Herrera, Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnol Adv, 2007. 25(6): p. 558-69.

76. Kunamneni, A., et al., Laccases and their applications: A patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008. 2(1): p. 10-24.

77. Barreca, A.M., et al., Laccase/mediated oxidation of a lignin model for improved delignification procedures. Journal of molecular catalysis. B, Enzymatic, 2003. 26(1-2): p. 105-110.

78. Pazarloglu, N.K., M. Sariisik, and A. Telefoncu, Laccase: production by Trametes versicolor and application to denim washing. Process biochemistry, 2005. 40(5): p. 1673-1678.

79. Minussi, R.C., G.M. Pastore, and N. Duran, Potential applications of laccase in the food industry. Trends in Food Science and Technology, 2002. 13(6): p. 205-216.

80. D'Annibale, A., et al., Oxirane-immobilized Lentinula edodes laccases: stability and phenolics removal efficiency in olive mill wastewater. Journal of Biotechnology, 2000. 77(2-3): p. 265-273

81. Mayer, A.M. and R.C. Staples, Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 2002. 60(6): p. 551-65.

82. Mita, N., et al., Laccase-catalyzed oxidative polymerization of phenols. Macromolecular Bioscience, 2003. 3(5): p. 253 257.

83. Gurcir, M., N. Akta, and A. Tanyolai?, Influence of reaction conditions on the rate of enzymic polymerization of pyrogallol using laccase. Process biochemistry, 2005. 40. (3-4): p. 1175-1182.

84. Nicotra, S., et al., Biotransformation of resveratrol: synthesis of trans-dehydrodimers catalyzed by laccases from Myceliophtora thermophyla andfrom Trametespubescens. Tetrahedron, 2004. 60(3): p. 595-600.

85. Bauer, C.G., et al., New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase. Fresenius1 Journal of Analytical Chemistry, 1999. 364(1-2): p. 179-183.

86. Ghindilis, A., Direct electron transfer catalysed by enzymes: application for biosensor development. Biochem Soc Trans, 2000. 28(2): p. 84-9.

87. Jiang, X., et al., Immunosensors for detection of pesticide residues. Biosens Bioelectron, 2008. 23(11): p. 1577-87.

88. Park, D.H., C. Vieille, and J.G. Zeikus, Bioelectrocatalysts: engineered oxidoreductase system for utilization of fumarate reductase in chemical synthesis, detection, and fuel cells. Appl Biochem Biotechnol, 2003. 111(1): p. 41-53.

89. Barriere, F., et al., Targetting redox polymers as mediators for laccase oxygen reduction in a membrane-less biofuel cell. Electrochemistry Communications, 2004. 6(3): p. 237-241.

90. Ong, E., W.B. Pollock, and M. Smith, Cloning and sequence analysis of two laccase complementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor. Gene, 1997. 196(1-2): p. 113-9.

91. Yaver, D.S., et al., Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(3): p. 834-41.

92. Wahleithner, J.A., et al., The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani. Curr Genet, 1996. 29(4): p. 395-403.

93. Collins, P.J. and A. Dobson, Regulation of Laccase Gene Transcription in Trametes versicolor. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(9): p. 34443450.

94. Castilho, F.J., et al., On the diversity of the laccase gene: a phylogenetic perspective from Botryosphaeria rhodina (Ascomycota: Fungi) and other related taxa. Biochem Genet, 2009. 47(1-2): p. 80-91.

95. Lobos, S., et al., Enzymology and molecular genetics of the ligninolytic system of the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora Current science, 2001. 81(8): p. 992-997.

96. Kojima, Y., et al., Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. J Biol Chem, 1990. 265(25): p. 15224-30.

97. Saloheimo, M. and M.L. Niku-Paavola, Heterologous production of a ligninolytic enzyme: expression of the Phlebia radiata laccase gene in Trichoderma reesei. Biotechnol, 1991. 9: p. 987-990.

98. Berka, R.M., et al., Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(8): p. 3151-7.

99. Cassland, P. and L.J. Jonsson, Characterization of a gene encoding Trametes versicolor laccase A and improved heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae by decreased cultivation temperature. Appl Microbiol Biotechnol, 1999. 52(3): p. 393-400.

100. Gelo-Pujic, M., et al., Electrochemical studies of a truncated laccase produced in Pichia pastoris. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(12): p. 5515-21.

101. Brown, M.A., Z. Zhao, and A.G. Mauk, Expression and characterization of a recombinant multi-copper oxidase: laccase IV fi-om Trametes versicolor. Inorganica chimica acta, 2002. 331: p. 232-238.

102. Guo, M., et al., Optimization of the expression of a laccase gene from Trametes versicolor in Pichia methanolica. Appl Microbiol Biotechnol, 2006. 71(6): p. 848-52.

103. Yaver, D.S., et al., Molecular characterization of laccase genes from the basidiomycete Coprinus cinereus and heterologous expression of the laccase led. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(11): p. 4943-8.

104. Kilaru, S., et al., Expression of laccase gene led in Coprinopsis cinerea under control of various basidiomycetous promoters. Appl Microbiol Biotechnol, 2006. 71(2): p. 200-10.

105. Otterbein, L., et al., Molecular cloning of the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinus 1-937 and expression in Pichia pastoris. Eur J Biochem, 2000. 267(6): p. 1619-25.

106. Alves, A.M., et al., Highly efficient production of laccase by the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(11): p. 6379-84.

107. Piscitelli, A., et al., Recombinant expression of Pleurotus ostreatus laccases in Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 2005. 69(4): p. 428-39.

108. Faraco, V., et al., Heterologous expression of heterodimeric laccase from Pleurotus ostreatus in Kluyveromyces lactis. Appl Microbiol Biotechnol, 2008. 77(6): p. 1329-35.

109. Camattari, A., et al., Induction by hypoxia of heterologous-protein production with the KIPDC1 promoter in yeasts. Appl Environ Microbiol, 2007. 73(3): p. 922-9.

110. Li, F., et al., High production of laccase B from Trametes sp. in Pichia pastoris. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007. 23(5): p. 741-745.

111. Hong, Y.Z., et al., Cloning of a laccase gene from a novel basidiomycete Trametes sp. 420 and its heterologous expression in Pichia pastoris. Curr Microbiol, 2007. 54(4): p. 260-5.

112. Rodriguez, E., et al., Isolation of two laccase genes from the white-rot fungus Pleurotus eiyngii and heterologous expression of the pel3 encoded protein. J Biotechnol, 2008.134(1-2): p. 9-19.

113. Hakulinen, N., et al., A near atomic resolution stmcture of a Melanocarpus albomyces laccase. J Struct Biol, 2008. 162(1): p. 29-39.

114. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

115. Huang, H.-W., et al., EPR and magnetic susceptibility studies of the trinuclear copper center in native and azide-reacted zucchini ascorbate oxidase. Journal of Inorganic Biochemistry, 1999. 75(1): p. 19-25.

116. Koroleva, O.V., et al., Isolation and study of some properties of laccase from the basidiomycetes Cerrena maxima. Biochemistry (Mosc), 2001. 66(6): p. 618-22.

117. R.Tinoco, M.A. Pickard, and R. Vazquez-Duhalt, Kinetic differences of purified laccases from six Pleurotus ostreatus strains. Letters in Applied Microbiology 2001. 32: p. 331-335.

118. Enguita, F.J., et al., Substrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23472-6.

119. Parodi, A.J., Protein glucosylation and its role in protein folding. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 69-93.

120. Hublik, G. and F. Schinner, Characterization and immobilization, of the laccase from Pleurotus ostreatus and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants. Enzyme and Microbial Technology, 2000. 27: p. 330-336.

121. Hilden, K., T.K. Hakala, and T. Lundell, Thermotolerant and thermostable laccases. Biotechnol Lett, 2009. 31(8): p. 1117-28.

122. Koroleva, O.V., et al., Temperature-induced changes in copper centers and protein conformation of two fungal laccases from Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus. Biochim Biophys Acta, 2001. 1547(2): p. 397407.

123. Bertrand, T., et al., Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine: insights into substrate recognition and correlation with kinetics. Biochemistry, 2002. 41(23): p. 7325-33.

124. Giardina, P., et al., Laccases: a never-ending story. Cell Mol Life Sci, 2009.

125. Институт Биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН); о инженеру-исследователю Храмеевой Е.Е. Учреждения Российской академии наук Института проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН.

126. РАБОТА БЫЛА ВЫПОЛНЕНА ПРИ ФИНАНСОВОЙ ПОДДЕРЖКЕ:о Федерального агенства по науке и инновациям РФ (номергосударственного контракта 02.512.11.2258); о Министерства науки и образования (номер государственного контракта П1297).