Сравнительное исследование функциональных свойств рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (А типа) в различных типах нейронов центральной нервной системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Колбаев, Сергей Николаевич

• Колбаев, Сергей Николаевич
• кандидат физико-математических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Колбаев, Сергей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация рецепторов ГАМК в ЦНС млекопитающих.

1.2. Структурная гетерогенность ГАМКд рецепторов в ЦНС млекопитающих. „

1.2.1. Репертуар субъединиц, входящих в состав ГАМКд рецепторов.

1.2.2. Количество субъединиц, входящих в состав одного ГАМКд рецептора.

1.2.3. Субъединичная композиция нативных рецепторов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное исследование функциональных свойств рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (А типа) в различных типах нейронов центральной нервной системы»

Актуальность проблемы.

Изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов имеет довольно длительную историю. Исследования в этой области стимулированы во многом благодаря тому, что ГАМК является основным тормозным нейромедиатором в ЦНС млекопитающих. Главной мишенью для ГАМК на постсинаптической мембране являются ГАМКд рецепторы, которые являются также местом воздействия широкого ряда нейротропных препаратов. Центральное место в передаче торможения обуславливает ведущую роль ГАМКд рецепторов в регуляции активности нейронов и определяет актуальность исследования функциональных особенностей ГАМКд рецепторов в разных типах нейронов.

Отличительной особенностью ГАМКд рецепторов является высокая степень их структурной гетерогенности. Такая гетерогенность не характерна для глициновых и ацетилхолиновых рецепторов, структурно близких к ГАМКд рецепторам и часто объединяемых в одно суперсемейство наряду ГАМКс рецепторами (Barnard et al. 1998). Различные структурные варианты ГАМКд рецепторов распределены определенным образом в ЦНС. Это обстоятельство вызывает интерес к исследованию структурно-функциональных связей, а также роли функциональной гетерогенности этого типа рецепторов (Doble et al. 1992; Mohler et al. 1995; Nutt et al. 2001; Pirker et al. 2000). Кроме этого, существует еще целый ряд причин, по которым изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является крайне актуальной задачей.

Во-первых, воздействие на ГАМКд рецепторы с помощью некоторых препаратов вызывает на уровне целого организма широкий спектр поведенческих эффектов. Согласно современным представлениям, широкий спектр действия фармакологических препаратов, воздействующих на ГАМКд рецепторы, связан, прежде всего, с функциональной гетерогенностью этих рецепторов, субстратом для которой является их структурная гетерогенн ость.

Во-вторых, развитие некоторых неврологических и психических заболеваний и расстройств, по-видимому, объясняется изменениями в количественном и качественном составе ГАМКд рецепторов на различных типах нейронов (Nutt et al. 2001).

Таким образом, изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов является основой для понимания процессов регуляции возбудимости и эмоционального статуса ЦНС в норме и патологии.

Использование современных методов работы с генетическим материалом, применение различных модельных систем позволило достичь определенных успехов в этом направлении. Так, недавние исследования подтверждают предположение о том, что процессы сборки функциональных рецепторов, по-видимому, подчиняются определенным закономерностям (Klausberger et al. 2001b; Klausberger et al. 2001a; Sarto et al. 2002). Сочетание субъединиц в функциональном ГАМКд рецепторе не является произвольным, а детерминировано структурными особенностями каждой субъединицы (Klausberger et al. 2001а; Sarto et al. 2002), при этом каждой субъединице в составе рецептора, по-видимому, отведена своя роль (взаимодействие с агонистом, субклеточная локализация и взаимодействие с «заякоривающими» белками и т.п.) (Chebib et al. 2000). Таким образом, первоначальные оценки структурной гетерогенности ГАМКд рецепторов, сделанные на основе предположения о случайном характере сочетания субъединиц, были явно завышены (Barnard et al. 1998).

Изучение принципов структурной организации ГАМКд рецепторов очень важно для понимания роли гетерогенности этих рецепторов, однако, результаты этих исследований не дают ответа на вопрос, насколько различаются функциональные свойства исследуемых рецепторов. Определенную информацию о свойствах рецепторов можно получить, используя рекомбинантные рецепторы, экспрессированные в гетеро логичных системах. Однако на сегодняшний день отсутствуют методики определения субъединичной композиции ГАМКд рецепторов, экспрессирующихся на определенном типе нейронов, что делает невозможным корректное сопоставление структур рекомбинантных и нативных рецепторов. Кроме того, свойства рекомбинантных рецепторов зависят от использованной системы экспрессии и, по-видимому, отличаются от свойств нативных ГАМКд рецепторов (Hevers et al. 1998).

С другой стороны, при исследовании свойств рекомбинантных рецепторов был выделен целый класс веществ, характер действия которых определяется структурой ГАМКд рецепторов (Barnard et al. 1998; Sieghart 1995). Предполагается (с различной степенью обоснованности), что свое воздействие эти селективные модуляторы оказывают, связываясь с неперекрывающимися местами узнавания, расположенными на ГАМКд рецепторах. Таким образом, действие того или иного селективного модулятора определяется различным набором структурных детерминант рецептора (Mehta et al. 1999).

Использование набора таких веществ при исследовании функциональных свойств рецепторов позволяет наиболее полным и независимым образом оценить их функциональную и, как следствие, структурную гетерогенность. Изучение воздействия того или иного вещества на определенный тип клеток позволяет связать результаты исследований на отдельных нейронах с результатами поведенческих экспериментов (in vivo) и исследований на срезах ткани.

Помимо обозначенной выше теоретической значимости, результаты таких исследований имеют и прикладное значение. Так как некоторые из применяемых селективных модуляторов являются лекарственными препаратами, то данные эксперименты позволяют глубже понять механизмы действия этих веществ (Nutt et al. 2001).

Таким образом, использование набора веществ, способных проявлять селективность к субъединичному составу, позволяет связать функциональные свойства (или, как говорят «фармакологический профиль» данного типа рецепторов) со структурой исследуемых рецепторов. При таком подходе охватывается сразу несколько несовпадающих структурных элементов - мест связывания рецептора, следовательно, полученное описание дает наиболее полное описание функциональных свойств рецепторов. Поэтому в данной работе в рамках проведения сравнительного исследования функциональных свойств нативных ГАМКд рецепторов был использован набор модуляторов селективных к их субъединичному составу. Цель работы.

Целью данной работы являлось сравнительное исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов, эксперессируемых на поверхности различных типов центральных нейронов - клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронов из головки хвостатого ядра мозга крысы. Задачи.

Были поставлены следующие задачи:

1) Используя метод фиксации потенциала на изолированной клетке и систему быстрой аппликации веществ, исследовать биофизические свойства токов, вызываемых ГАМК в клетках Пуркинье мозжечка и гигантских интернейронах стриатума, выделенных из срезов мозга крысы. Дать количественную оценку свойств ответов, вызываемых ГАМК в исследованных типах нейронов.

2) Провести сравнительное исследование в разных типах нейронов модуляции ГАМК-активируемых токов веществами, которые избирательно взаимодействуют с ГАМКд рецепторами, имеющими различный субъединичный состав (фуросемид, зольпидем, хлорид лантана, лореклезол). Выявить особенности модуляции ответов на ГАМК этими препаратами и дать количественную оценку их эффектов для исследуемых типов клеток.

3) Проанализировать полученные результаты о различии свойств нативных рецепторов в свете литературных данных по фармакологии рекомбинантных рецепторов. Сопоставить полученные результаты с литературными данными о распределении различных подтипов субъединиц ГАМКд рецепторов в мозге крысы с целью выявления наиболее вероятной субъединичной композиции этих рецепторов в исследованных нейронах. Научная новизна полученных результатов.

Методом локальной фиксации потенциала впервые проведено систематическое исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов - клетках Пуркинье (КП) мозжечка и гигантских ацетилхолинергических интернейронах стриатума (ГИС). Сравнительная оценка абсолютных амплитуд ответов на ГАМК в КП и ГИС позволяет утверждать, что количество рецепторов на обоих типах нейронов примерно одинаково.

Впервые проанализирован механизм действия фуросемида на ГАМКд рецепторы КП и ГИС и установлено, что он отличен от такового, описанного в литературе для фуросемид-чувствительных, аб-, оц-содержащих рецепторов. Впервые показано, что фуросемид блокирует токи, вызываемые ГАМК, взаимодействуя с порой канала этого типа рецепторов, и что угнетение токов происходит по механизму последовательного блока. Впервые изучена зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала. В рамках модели Woodhull различия, полученные для КП и ГИС, были связаны с различиями в строении канала ГАМКд рецепторов в обоих типах клеток. Предложена математическая модель, описывающая действие фуросемида на ГАМКд рецепторы КП.

Впервые исследовано модулирующее действие LaCb в КП и в ГИС. Совместная аппликация ГАМК и лантана приводила к потенциации ответа. Показано, что ГАМКд рецепторы КП более чувствительны к действию ЬаСЬ, чем рецепторы ГИС (ЕС^о для КП меньше чем для ГИС, а максимальный эффект больше).

Впервые исследовано модулирующее действие лореклезола на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС. Показано, что в обоих типах клеток лореклезол потенциирует ответы, вызываемые ГАМК ЕС20, при этом, максимальный потенциирующий эффект лореклезола для КП значительно выше, чем для ГИС. Научно-практическая значимость.

Полученные результаты позволяют сравнить роль ГАМКергических входов в регулировании активности клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических нейронов стриатума крысы. Использование набора селективных модуляторов при исследовании функциональных свойств ГАМКд рецепторов позволило провести систематическое исследование их функциональной гетерогенности. Подобный подход может быть распространен и на другие типы нейронов. Изложенные результаты важны для понимания и оценки роли гетерогенности ГАМКд рецепторов в ЦНС и будут полезны при интерпретации экспериментов, проводимых на срезах или на уровне целого организма. Кроме того, потенциально интересным направлением для изучения строения ГАМКд рецепторов является исследование действия канальных блокаторов - структурных гомологов фуросемида. Подобный подход с использованием соответствующих блокаторов позволит ответить на ряд принципиальных вопросов, касающихся механизмов работы каналов этих рецепторов. Предлагаемая модель действия фуросемида является удобным инструментом для проверки и выдвижения новых гипотез, в том числе и о механизмах работы ГАМКд рецептора как такового.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Колбаев, Сергей Николаевич

выводы.

1. Функциональные свойства ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов -клетках Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронах стриатума отличаются по ряду параметров. Число ГАМКд рецепторов на обоих типах клеток отличается незначительно, однако ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию ГАМК, чем рецепторы интернейронов стриатума. Временные характеристики ответов, вызываемых аппликацией ГАМК, свидетельствуют о равенстве скоростей процессов активации для клеток Пуркинье и ГИС и о более медленном течении процессов деактивации в ГИС.

2. ГАМКд рецепторы клеток Пуркинье более чувствительны к действию зольпидема, чем рецепторы ГИС. Порядок величин ЕС50 позволяет сделать вывод о преимущественной экспрессии (Х2, аз-содержащих ГАМКд рецепторов на поверхности ГИС и оц-содержащих рецепторов на поверхности клеток Пуркинье.

3. Зависимость потенциирующего эффекта лореклезола от концентрации имеет колоколообразный характер. Максимальный потенциирующий эффект для токов в клетках Пуркинье более чем в 6 раз выше, чем для токов в ГИС, что позволяет предположить, что на поверхности ГИС преимущественно экспрессируются pi-содержащие ГАМКд рецепторы, в то время как на поверхности клетках Пуркинье - рг/рз рецепторы.

4. В обоих типах клеток LaCl3 вызывает потенциацию ответов на ГАМК, однако, ГАМКд рецепторы клетках Пуркинье были более чувствительны к действию LaCl3, чем рецепторы ГИС. Характер модулирующего действия LaCl3 свидетельствует о том, что экспрессия рецепторов, содержащих ав, as и а4 субъединицы, на обоих типах нейронов маловероятна.

5. ГАМКд рецепторы в клетках Пуркинье и ГИС в целом имеют низкую чувствительность к фуросемиду. Доля фуросемид-чувствительных, содержащих аб, ад субъединицы, рецепторов, расположенных на поверхности клетках Пуркинье и ГИС, оцененная сверху, не превышает 10%.

6. Фуросемид вызывает угнетение ответов на ГАМК, что является результатом его взаимодействия с канальной порой ГАМКд рецепторов. Механизм угнетения токов существенно отличается от такового в клетках, экспрессирующих сц и аб субъединицы. Блокирующее действие фуросемида увеличивается при деполяризации мембраны. Различия параметров потенциалзависимости, трактуемые в рамках модели Woodhull, позволяют утверждать, что место связывания фуросемида в канальной поре ГАМКд рецепторов ГИС более удалено от мембранной поверхности и имеет большее сродство к фуросемиду, чем в ГАМКд рецепторах клеток Пуркинье.

7. Использованная математическая модель последовательного блока для анализа блокирующего действия фуросемида в клетках Пуркинье, на качественном уровне описывает все явления, наблюдаемые при совместной аппликации ГАМК и фуросемида.

8. Сопоставление эффектов аллостерических модуляторов, селективных к структуре ГАМКд рецепторов, с литературными данными по распределению различных субъединиц ГАМКд рецепторов позволило сделать вывод о наиболее вероятной субъединичной комбинации ГАМКд рецепторов в исследованных типах нейронов: aiJ32/372 для клеток Пуркинье и (Х2/3, Рь Yi-з и для ГИС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Колбаев, Сергей Николаевич, 2003 год

1. Валеев, А. Е., Врублевский, С. В., Черневская, Н. И. (1986). ТАМК АКТИВИРУЕМАЯ ПРОВОДИМОСТЬ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ." Нейрофизиология. 18(6), 836-839.

2. Колбаев С.Н., Шаронова И.Н., Воробьев B.C., Скребицкий В.Г. (1999). "Механизмы модуляции такрином ГАМК-активируемых токов в изолированных нейронах мозжечка." Бюлл. эксп. биол. и мед. 127(5), 539-542.

3. Шульговский, В. В. (1997). "Физиология центральной нервной системы"., М.: МГУ, 397с.

4. Angelotti, Т. P. and MacDonald, R. L. (1993). "Assembly of GABAA receptor subunits: alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S subunits produce unique ion channels with dissimilar single-channel properties." J.Neurosci. 13(4), 1429-1440.

5. Antonov, S. M., Gmiro, V. E., and Johnson, J. W. (1998). "Binding sites for permeant ions in the channel of NMD A receptors and their effects on channel block." Nat.Neurosci. 1(6), 451-461.

6. Anwyl, R. (1991). "Modulation of vertebrate neuronal calcium channels by transmitters." Brain Res.Brain Res.Rev. 16(3), 265-281.

7. Arbilla, S., Allen, J., Wick, A., and Langer, S. Z. (1986). "High affinity 3H.zolpidem binding in the rat brain: an imidazopyridine with agonist properties at central benzodiazepine receptors." Eur.JPharmacol. 130(3), 257-263.

8. Armstrong, С. M. and Gilly, W. F. (1992). "Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping." Methods Enzymol. 207, 100-122.

9. Bahring, R., Bowie, D., Benveniste, M., and Mayer, M. L. (1997). "Permeation and block of rat GluR6 glutamate receptor channels by internal and external polyamines." J.Physiol. 502 (Pt 3), 575-589.

10. Banks, M. I., Li, Т. В., and Pearce, R. A. (1998). "The synaptic basis of GABAA,slow." J.Neurosci. 18(4), 1305-1317.

11. Banks, M. I., White, J. A., and Pearce, R. A. (2000). "Interactions between distinct GABA(A) circuits in hippocampus." Neuron. 25(2), 449-457.15.