Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Морозов, Игорь Владимирович

• Морозов, Игорь Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Морозов, Игорь Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регуляция экспрессии генов стероидными гормонами.

1.1.1. Структура и функции стероидных гормонов.

1.1.2. Строение рецептора глюкокортикоидов

1.1.3. Изменение структуры хроматина под действием глюкокортикоидов

1.1.4. Участки ДНК, ответственные за связывание с рецептором 21 глюкокортикоидов

1.1.5. Синергичное взаимодействие глюкокортикоидного рецептора с другими 23 транскрипционными факторами

1.2. Ген тирозинаминотрансферазы - модель для изучения молекулярных 25 механизмов регуляции экспрессии генов.

1.2.1. Строение и свойства тирозинаминотрансферазы

1.2.2. Структура генов TAT

1.2.3. Регуляция экспрессии генов TAT глюкокортикоидами

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и реактивы, использованные в работе

2.2. Выделение препаратов ДНК из образцов клеток и тканей

2.2.1. Выделение геномной ДНК

2.2.1.1. Выделение геномной ДНК из тканей млекопитающих

2.2.1.2. Выделение геномной ДНК из крови

2.2.1.3. Выделение геномной ДНК из гепатоцитов

2.2.2. Выделение ДНК из клеток Е.соИ

2.2.2.1. Выделение плазмидной дцДНК с использованием термического лизиса

2.2.2.2. Выделение плазмидной дцДНК с использованием щелочного лизиса

2.2.2.3. Выделение плазмидной дцДНК с использованием ионообменной 47 хроматографии

2.2.2.4. Выделение оцДНК бактериофага М13 из бактериальных клеток

2.3. Получение препаратов ДНК с использованием полимеразной цепной 50 реакции

2.3.1. Использование техники "горячего старта" для повышения специфичности 51 полимеразной цепной реакции

2.3.2. Использование изменяющейся температуры гибридизации для повышения 52 выхода и специфичности реакции

2.3.3. Использование глицерина для понижения температуры плавления дцДНК 56 и стабилизации ДНК-полимеразы

2.3.4. Использование термостабильной ДНК-полимеразы с 3-5' экзонуклеазной 60 активностью для амплификации длинных фрагментов ДНК

2.4. Ферментативная обработка препаратов ДНК

2.4.1. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.4.2. Гидролиз ДНК МипдВеап нуклеазой

2.4.3. Введение радиоактивной метки в ДНК

2.4.3.1. С использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.соИ

2.4.3.2. С использованием полинуклеотидкиназы бактериофага Т

2.4.4. Лигирование фрагментов дцДНК с использованием ДНК-лигазы 64 бактериофага Т

2.5. Анализ и очистка препаратов ДНК методами гель-электрофореза

2.5.1. Электрофорез в гелях агарозы

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.5.3. Разделение цепей дцДНК электрофорезом в полиакриламидном геле

2.5.4. Выделение ДНК из гелей электроэлюцией в ячейках фирмы "ISCO"

2.5.5. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на стекловолокне

2.5.6. Выделение ДНК из агарозных гелей сорбцией на DEAE-81 целлюлозу в 73 процессе электрофореза

2.5.7. Очистка олигонуклеотидов в денатурирующем полиакриламидном геле с 73 непрерывной элюцией и спектрофотометрической детекцией

2.6. Клонирование фрагментов ДНК в составе бактериальных векторных ДНК

2.7. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) 78 фрагментов ДНК

2.7.1. Методом химической модификации по Максаму-Гилберту

2.7.1.1. В жидкой фазе

2.7.1.2. С использованием сорбции на DEAE-81 целлюлозе

2.7.1.3. Комбинированным методом

2.7.2. Методом специфической терминации полимеризации по Сэнгеру

2.7.2.1. Секвенирование оцДНК бактериофага М

2.7.2.2. Секвенирование суперскрученной дцДНК плазмид с использованием 86 щелочной денатурации

2.7.2.3. Секвенирование суперскрученной дцДНК плазмид с использованием 86 денатурации в присутствии гликолей

2.7.2.4. Секвенирование с использованием флюоресцентно меченных праймеров и 87 детекции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 370А

2.7.2.5. Секвенирование микроколичеств дцДНК с использованием фермента 87 ThermoSequenase

2.7.3. Разделение специфически терминированных фрагментов ДНК электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение нуклеотидных последовательностей:

3.1.1. Определение последовательности района -1990 - -580 п.н. 5'- 91 фланкирующей области гена TAT человека.

3.1.2. Определение последовательности гена TAT крысы:

3.1.2.1. Определение последовательности района 10350 - 12289 п.н.

3.1.2.2. Определение последовательности района 9298 - 10355 п.н.

3.1.2.3. Определение последовательности района 5622- 9293 п.н.

3.1.2.4. Определение последовательности района -19- 5627 п.н.

3.2. Структура гена TAT крысы.

3.3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов TAT 106 человека и крысы.

3.4. Поиск потенциальных участков связывания факторов регуляции 106 транскрипции в 5'-фланкирующей области гена TAT человека.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы»

В настоящее время одной из наиболее бурно развивающихся отраслей биологии является "геномика" - генетика, дошедшая в своем пути к элементарным носителям генетической информации до уровня последовательностей нуклеотидов, или наука о нуклео-тидных последовательностях. Наряду с грандиозными успехами, достигнутыми при сек-венировании и анализе геномов отдельных организмов (Caenorhabditis elegans (геном 100 ООО ООО п.н. секвенирован полностью); Homo sapiens; некоторые виды патогенных простейших) незаслуженно мало внимания уделяется сравнительному анализу гомологичных участков геномов разных видов. В свое время определение аминокислотной последовательности глобинов разных видов позволило сделать фундаментальные открытия в области эволюции белков. Имеющиеся на сегодняшний день многочисленные данные позволяют утверждать, что наибольшие частота и разнообразие эволюционных событий наблюдается не в кодирующих белок областях генома, на эволюцию которых накладываются жесткие ограничения естественного отбора на уровне белка, а в интронах генов, фланкирующих гены (регуляторных) районах и других "некодирующих" участков геномов. Сравнительный анализ последовательностей подобных районов геномов различных видов позволит выявить пути и механизмы эволюции генов и геномов.

Одной из наиболее привлекательных моделей для такого сравнительного анализа являются гены "минорных" белков, экспрессия которых является, как правило, ткане-специфической и находится под контролем различных факторов регуляции транскрипции. Тирозинаминотрансфераза (ТАТ, Ь-тирозин:2-оксоглутаратаминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.5) - пиридоксальфосфат зависимый фермент, катализирующий переаминирование тирозина, является одним из таких белков, механизмы регуляции экспресси гена которого в организме крысы детально изучены (Boshart et al, 1993; Мертвецов, 1990). Экспрессия гена этого белка является такнеспецифической и происходит в основном в печени (в гепа-тоцитах). Уровень экспрессии регулируется посредством нескольких путей передачи межклеточных сигналов, в частности глюкокортикоидами и цАМФ. В 5'-фланкирующей области (до -6000 п.н.) гена ТАТ крысы были локализованы три тканеспецифических энхан-сера транскрипции, два из которых взаимодействуют с комлексом гормон - рецептор глю-кокортикоидов и фактором тканевой специфичности печени HNF3, а один - с CREB и HNF4, т.е. является цАМФ-зависимым (Shinomiya et al, 1984; Jantzen et al, 1987; Danesh et al, 1987; Grange et al, 1991; Boshart et al, 1993; Espinas et al, 1994). В то время как механизмы регуляции экспрессии гена ТАТ крысы изучены в деталях, для гена ТАТ человека в литературе нет данных о выявлении функционирующих энхансеров, контролирующих экспрессию этого гена. Известны лишь небольшие фрагменты нуклеотидной последовательности 5'-фланкирующей области гена ТАТ человека (Rettenmeier et al, 1990). Знание механизмов регуляции экспрессии гена ТАТ человека имеет, наряду с фундаментальным, важное медицинское значение, поскольку может позволить предотвращать или корректировать нарушения регуляции экспрессии гена ТАТ в процессе онтогенеза, приводящие к тяжелому заболеванию - тирозинемии.

Целью настоящей работы являлось выявление функционально значимых участков и эволюционно изменчивых райнов гена тирозинаминотрансферазы путем сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов ТАТ человека и крысы, включающих все экзоны и интроны гена, а также значительные по длине районы 5'- и 3'-фланкирующих областей. Ранее были определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-фланкирующей области от -3500 до -1900 п.н. (Rettenmeier et al, 1990), последовательности экзонов (Rettenmeier et al, 1990) и интронов (Зеленин, Мертвецов, 1994) гена ТАТ человека; а также нуклеотидная последовательность кДНК, экзон-интронная структура и карта сайтов эндонуклеаз рестрикции гена ТАТ крысы (Shinomiya et al, 1984;

Grange et al, 1985; Hargrove et al, 1989). Задачами работы являлось определение полной нуклеотидной последовательности гена TAT крысы (более 12 ООО п.н.) и района от -1900 до -700 п.н. 5'-фланкирующей области гена TAT человека и сравнительный анализ определенных в работе и ранее известных последовательностей.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.