Стратегия создания цельноклеточных антимеланомных вакцин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, доктор медицинских наук Михайлова, Ирина Николаевна

• Михайлова, Ирина Николаевна
• доктор медицинских наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Михайлова, Ирина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Актуальность темы.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1. Создание противоопухолевых вакцин.

1.1. Клеточные линии - основа цельноклеточных вакцин.

1.2. Опухолевые антигены.

2. Виды противоопухолевых вакцин.

2.1. Вакцины, основанные на опухолеассоциированных антигенах, индуцирующие гуморальный ответ.

2.2. Вакцины на основе пептидов, ДНК или рекомбинантных вирусов, индуцирующие Т-клеточный ответ.

2.3. Опухолевые вакцины на основе аллогенных клеток.

2.4. Опухолевые вакцины на основе аутологичных клеток.

2.5. Вакцины на основе белков теплового шока.

2.6. Дендритные вакцины.

2.7. Показатели эффективности противоопухолевых вакцин.

2.8. Стратегия вакцинотерапии и перспективы её развития.

2.9. Современное состояние противоопухолевой вакцинотерапии в России

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стратегия создания цельноклеточных антимеланомных вакцин»

Актуальность темы

Заболеваемость меланомой в последние десятилетия характеризуется неуклонным ростом. На момент обращения до 40% больных имеют диссеминированный процесс, требующий применения химиотерапии, после которой 5-летняя выживаемость не превышает 5%. При генерализованных формах меланомы основным методом лечения является лекарственный с использованием химио- и иммунотерапии. Среди различных средств и методов имммунотерапии меланомы клиническое применение нашли препараты а-2Ь-интерферона. Эффективность консервативного лечения достигает 50%, однако улучшения общей выживаемости достичь не удается. Иммунотерапия применяется при иммуногенных видах опухолей (меланоме, раке почки, немелкоклеточном раке легкого), способных в некоторых случаях к спонтанной регрессии. Предполагают, что механизм спонтанной регрессии связан с активацией эффекторов иммунной системы, в частности, Т-лимфоцитов, распознающих и убивающих опухолевые клетки благодаря экспрессии на их поверхности опухолеассоциированных антигенов [Ваип^аейпег Р., е1 а1., 2011].

Перспективы развития иммунотерапии меланомы связывают с созданием новых селективных методов, основанных на достижениях молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии.

Одним из таких методов является вакцинотерапия, включающая различные модификации клеточной технологии, среди которых лучшие терапевтические характеристики имеют генно-инженерные и дендритные вакцины. Главная цель иммунотерапии меланомы - увеличение у пациентов популяции СЭ8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки [8Ьапкег А., е1 а1., 2009]. Антигенный материал, используемый для создания таких вакцин, может быть в виде цельных опухолевых клеток (аллогенных или аутологичных) или специфических антигенов, РНК, протеинов или пептидных эпитопов, рестриктированных по первому или второму классу гистосовместимости [Heimburg-Molinaro J., et al., 2011]. В экспериментах и в клинике изучаются подходы, использующие аутологичные меланомные клетки, трансфицированные геном интерлейкина-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и др. Вакцины на основе ауто- и аллогенных опухолевых клеток, модифицированных указанными генами, проходят клинические испытания [Soiffer R., et. al., 2003; Maio M., et. al., 2002]. Помимо изучения таких вакцин в монорежиме, как правило, в последние годы их комбинируют с адъювантами, которые представлены цитокинами или нагруженными дендритными клетками, инициирующими иммунный ответ презентацией антигенных эпитопов к Т-лимфоцитам [Zhang H.L., et al., 2011]. Механизм действия вакцин связан с презентацией дендритными клетками опухолеассоциированных антигенов Т-клеткам пациента [Nencioni A., et al., 2004]. Чаще всего используется одна-две антигенные детерминанты с целью достичь монотаргетного контакта вакцины с мишенью, что важно, прежде всего, для уменьшения некоторых побочных эффектов. Однако, по аналогии с цельноклеточными антибактериальными вакцинами, более эффективное их применение определяет большее число присутствующих в них антигенов [Geier D., et. al., 2002].

Для лечения диссеминированной меланомы кожи монотаргетная стратегия создания вакцин пока себя не оправдывает в силу поликлональности опухоли, а также быстрой селекции клонов. Селекция является следствием не только скорости пролиферации, но и влияния микроокружения. Профиль экспрессии опухолеассоциированных антигенов чрезвычайно разнообразен, что требует мультитаргетных контактов с эффекторами для запуска программы клеточной гибели. Для осуществления этого актуально создание коллекции культур клеток меланомы, презентирующих различные опухолеассоциированные антигены. Созданная, в результате данной работы, Коллекция клеточных культур меланомы является источником вакцин, направленных на различные антигенные детерминанты и способных использовать максимальное число клеток-мишеней у разных пациентов на разных этапах роста и метастазирования опухоли. Таким образом, создание Коллекции клеточных линий, их последующая трансфекция, проведение доклинических и клинических исследований определяют стратегию разработки цельноклеточных вакцин, что является актуальным как решение важной проблемы иммунотерапии меланомы.

Цель исследования. Разработать стратегию создания цельноклеточных антимеланомных вакцин. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать из опухолевого материала больных клеточные линии меланомы с экспрессией различных опухолеассоциированных антигенов.

2. На основе клеточных линий меланомы, трансфицированных генами ГМ-КСФ и tag7, разработать новые цельноклеточные аутологичные и аллогенные вакцины.

3. Изучить основные доклинические характеристики новых вакцин.

4. Оценить безопасность применяемых вакцин у больных меланомой.

5. Для оценки специфической активности определить динамику иммунологических показателей в процессе вакцинотерапии.

6. На основе доклинического и клинического изучения сформулировать алгоритм стратегии создания новых цельноклеточных вакцин.

Научная новизна

Впервые в России из метастазов меланомы кожи человека от 68 пациентов, проходящих лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, получены и охарактеризованы по основным биологическим, иммунологическим, молекулярным и морфогенетическим параметрам 19 клеточных линий.

Получены и наработаны для доклинических и клинических испытаний клеточные линии меланомы человека mel Р и mel Kor, трансфицированные генами tag7 или ГМ-КСФ соответственно. Проведены доклинические исследования цельноклеточных геномодифицированные вакцин «Аллоген» (из клеточной линии mel P/tag7) и «Мелавак» (из клеточной линии mel Ког/ГМ-КСФ), показавшие их безопасность. Обнаружена взаимосвязь между динамикой клеточного ответа - снижением числа натуральных киллерных Т-клеток (НКТ-клеток) и прогрессированием процесса. Анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов, подтвердивший неоднородность изученных линий клеток и вакцин, позволил установить корреляцию между интенсивностью экспрессии генов раковотестикулярных антигенов (РТА) и степени дедифференцировки клеток в полученных из метастазов клеточных линиях меланомы. На основе результатов доклинического и клинического изучения разработан алгоритм оптимизации создания новых цельноклеточных вакцин из культур опухолевых и дендритных клеток больных меланомой. Научно-практическая значимость

Создана Коллекция культур клеток меланомы из 19 новых оригинальных клеточных линий - субстрат для создания новых цельноклеточных противомеланомных вакцин. 15 новых линий клеток меланомы защищены патентами РФ, 5 из них вошли в 100 лучших изобретений РФ за 2009 г. На основе дендритных и меланомных клеток созданы 3 новые цельноклеточные геномодифицированные и нативные вакцины, предназначенные для лечения онкологических пациентов. Разработан иммунобиохимический мониторинг вакцинотерапии с использованием модифицированных вакцин. Результаты данной работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так и прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленному пониманию биологии опухолевой клетки и механизмов её взаимодействия с иммунной системой. Данные о фенотипе опухолевой клетки (разнородная экспрессия антигенов гистосовместимости, костимулирующих молекул) и информация на уровне генов и антигенов дополняют фундаментальную базу знаний, лежащих в основе конструирования новых вакцин и их оптимизации путем соответствующих модификаций.

Прикладное значение выполненной работы заключается в создании Коллекции полноценно охарактеризованных культур клеток, готовых к созданию на их основе цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Подтверждением прикладного характера исследований является разрешение МЗиСР РФ на проведение клинических исследований вакцин на основе дендритных и опухолевых клеток, трансфицированных генами Ха.%-1 и ГМ-КСФ [№371-373 от 06.08.08; №282 от 218.06.10 и №286 от 21.06.10]. Основные положения, выносимые на защиту

• создана Коллекция опухолевых клеточных линий меланомы с различной экспрессией антигенов;

• созданы и охарактеризованы по основным доклиническим и клиническим показателям 4 новые цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («АутологичнаяДа§-7», «Дендритная») и 2 аллогенные («Аллоген», «Мелавак»);

• доклинические токсикологические исследования исследуемых вакцин показали их безвредность для человека;

• стратегия мониторинга клинического изучения цельноклеточных вакцин у больных меланомой направлена на контроль цитокиного профиля, НКТ-клеток и числа синтезирующих ИФН-у мононуклеарных клеток периферической крови.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Онкология», Михайлова, Ирина Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Субстратом для производства цельноклеточных противоопухолевых вакцин явились 19 клеточных линий меланомы, генерированных из метастатических узлов 68 пациентов; данные линии носили генетически обусловленные различия иммунного и онкофенотипа, коррелировавшими со степенью дифференцировки клеток.

2. Технология трансфицирования клеточных линий привнесенными новыми генами (tag-7 и ГМ-КСФ), совмещенная с последующей технологией обработки дендритных клеток опухолевым лизатом (антигенной загрузкой), позволили создать и охарактеризовать по доклиническим и клиническим показателям 4 цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Дендритная» и «Аутологичная/tag-?») и 2 аллогенные («Аллоген» и «Мелавак»).

3. Разработанные вакцины показали себя безопасными в доклинических исследованиях. Вакцины не проявляют острой, хронической токсичности и туморогенности. В результате 1-й фазы клинического изучения по критериям безопасности и специфической активности для 2-й фазы изучения рекомендованы вакцины в разовых дозах: «Дендритная» 2-5 млн клеток; «Аутологичная/tag?» 10 - 20 млн клеток; «Аллоген» 5-40 млн клеток и «Мелавак» 10-60 млн клеток.

4. Побочные эффекты вакцинации пациентов с меланомой проявлялись в виде ранних кратковременных и обратимых осложнений: локальной гиперемии (64%), общей гипертермии (26%) .

5. Исходный статус пациентов с меланомой независимо от распространенности процесса характеризуется достоверно повышенным маркером Т-клеточного ответа (Thl) по ИЛ-2 (р<0,001) и сниженным ИФН-у (р<0,001); повышенным онкомаркером CD44 (р<0,001) и сниженным TGF Ь2 в терапевтических группах (р<0,001) с последующим достоверным повышением ИЛ-12 (р<0,01) во время вакцинации.

6. Проведение иммунологического мониторинга эффективности вакцин предусматривает контроль экспрессии активационных антигенов, оценку гранзим содержащих и ИФН-у продуцирующих клеток, определение цитокиного профиля и онкомаркеров сыворотки крови, НКТ-клеток.

7. Стратегия создания цельноклеточных вакцин заключается в осуществлении последовательных действий: 1) получении стабильных перевиваемых клеточных линий; 2) детальной характеристики этих линий по генетическим и иммунологическим параметрам (с целью досконального определения опухолеассоциированных антигенов и антигенов гистосовместимости); 3) стабильной трансфекции клеток отобранными генами; 4) доклиническому изучению безопасности вакцин; 5) юридической валидации клинических исследований; 6) оценке клинической безопасности; 7) оценке индукции иммунного ответа при вакцинации.

3. Заключение

За прошедшие десятилетия в литературе широко освещаются проблемы вакцинотерапии. Раскрытие молекулярной идентификации антигенов и механизмов опухолевого иммунитета способствовало развитию научного направления и создания клинических препаратов противоопухолевых вакцин: пептидных, ДК, вирусных, ДНК, цельноклеточных и др. Использование вакцин- наиболее стандартный способ активации иммунной системы. Это могут быть вакцины аутологичной, аллогенной природы; инженерные вакцины, экспрессирующие иммуностимуляторные цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, Г-КСФ или стимулирующие молекулы (В7.1, В7.2) и др.). Главной целью вакцинотерапии является увеличение С08+ ЦТЛ, способных убивать опухолевые клетки через опухоле-ассоциированные антигены, рестректированные по антигену гистосовместимости I класса (НЬА-1 класса) или праймирования СЭ4+ хелперных Т-клеток, играющих ключевую роль в контроле иммунного ответа.

К настоящему времени проведены сотни клинических исследований, позволивших комплексно оценить результаты вакцинотерапии в монорежиме или в сочетании с другими методами лекарственного лечения (химиотерапией, гормононотерапией, оперативного лечения и пр.). Несмотря на некоторые достижения, нерешенной остается проблема эффективной иммунокоррекции как опухолевого процесса, так и недостатков других видов лечения с целью максимального ингибирования злокачественного роста. Подбор субстрата (вид вакцины, количество опухолевых антигенов, антигенов гистосовместимости, трансфекция генами и др.) и проведение вакцинаций (совместно с ХТ, гормонотерапией, хирургией и т.д.) остается актуальным. При этом клинические исследования, в основном, проводятся за рубежом. В России исследования доклинические и, особенно, клинические немногочисленны и проходят, как правило, в пилотном режиме из-за отсутствия четкой юридической рекламации для клеточных технологий.

Общий взгдяд на возможности современной биотерапии солидных опухолей с анализом перспективности только аутологичных вакцин раскрывает, соответственно, решение лишь части проблемы, касающейся противоопухолевой вакцинотерапии. Использование аутологичных вакцин на основе опухолевых клеткок действительно имеет некоторые преимущества, но лишь в упрощенной процедуре разрешения клинических испытаний [Балдуева И.А., 2008]. По сути, создание аутологичной вакцины существенно отодвигает начало лечения, так как для ее получения необходимо не только организационное решение, но, прежде всего, обеспеченность клиники лабораторным комплексом, позволяющим выполнить все технологические процедуры. Использование готовых к употреблению аллогенных клеток (Коллекция клеточных культур) дает возможность предоставить любому пациенту охарактеризованные по основным фармакологическим свойствам клеточные линии в виде субстрата вакцины. Рациональные подходы к проведению доклинического исследования, а также к адекватному мониторированию клинического наблюдения за результатами вакцинотерапии также стоят на повестке дня. В частности, недостаточно проработанным является существующий мониторинг на основании только иммунологического статуса, что создает предпосылки для изучения других методов контроля эффективности вакцинотерапии (Е118ро1, цитокиновый профиль).

Приходится констатировать, что существующая стратегия разработки и создания противоопухолевых вакцин, несмотря на солидную фундаментальную базу и отдельные примеры поступления на фармацевтический рынок России импортных препаратов, далека от оптимальной. Она ниже возможностей современного научного кадрового потенциала страны и не может удовлетворить потребности большого числа онкологических пациентов. Таким образом, следует выделить те факты, с которыми связаны возможности оптимизации существующей стратегии.

Анализ тематической литературы, посвященной фундаментальным и клиническим аспектам терапевтического и побочного действия противоопухолевых вакцин, дает такую возможность. Ясно, что совершенствование технологии получения из разных источников или усиления иммунореактивности вакцины за счет использования субстрата (антигена) и адъюванта (цитокина) не позволяют кардинально изменить клинический ответ.

Модификация диагностических приемов путем стратификации пациентов для подбора соответствующего гаплотипа вакцины, интенсификация терапевтической схемы за счет начала лечения в более ранние сроки после удаления основной массы опухоли, преодоление иммуносупрессии за счет изменения опухолевого микроокружения и восстановления системной иммунной дисфункции, как показывают исследователи разных стран, мало результативны.

Однако лучшие из имеющихся результатов так или иначе связаны с сочетанным и усиленным контактом иммунного препарата и опухоли, а иногда и организма. Этот путь может быть наполнен новым содержанием, благодаря созданию Коллекции культур клеток наиболее иммуногенных опухолей в качестве основы для разработки цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Для соответствия высоким требованиям оптимизации терапевтического эффекта вакцин они должны иметь набор разнообразных антигенов и проявлять значимый иммунобиологический эффект в условиях неповрежденной или депрессированной различными специфическими противоопухолевыми воздействиями иммунной системы организма. Поскольку такие культуры предназначены для клинических испытаний, все доклинические кандидады должны иметь необходимые общебиологические характеристики, необходимые для получения разрешения на клинические испытания.

Учитывая вышеизложенное, можно заключить, что разработка эффективных противоопухолевых вакцин остается актуальной, как для международной, так и Российской науки и практики. Оптимизация стратегии разработки и создания цельноклеточных вакцин является одним из рациональных путей достижения реальных результатов их применения в онкологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика клеточных линий 1.1. Культивирование опухолевых клеток

Образцы тканей были получены от 68 больных с диагнозом метастатическая меланома кожи, путем хирургического удаления подкожных очагов или метастатических лимфоузлов. Для выделения достаточного количества клеток минимальный объем материала составлял около 300 мг или 8 мм . Фрагмент опухоли освобождали от окружающей ткани и доставляли в лабораторию погруженными в транспортную среду: RPMI 1640 с 10% инактивированной сывороткой эмбрионов крупного рогатого скота (ТЭС), 1% HEPES и антибиотиком гентамицином (10 мг/мл). Помещение образца в транспортную среду производилось в течение не более пяти минут с момента выделения опухолевой ткани, (в противном случае возрастает количество нежизнеспособных клеток в полученных образцах). Опухолевую ткань разделяли механически на фрагменты объемом 2-3 мм в среде RPMI-1640 с антибиотиком, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли в камере Горяева по стандартной методике, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS.

Клетки 1x106 засевали в среде RPMI 1640, содержащей 15% ТЭС, 2 мл L-глутамина, 1% HEPES, 10 мг/мл гентамицина, комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar, США) площадью 25 см в 5 мл среды. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формировался через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формировался без смены среды на 2-3-и сутки. Клетки снимали с использованием стандартного раствора Версена. Для длительного хранения клетки подвергали криоконсервации. Через 15 пассажей получали стабильно растущие клеточные линии, фенотип которых был исследован иммуноцитохимическим и иммунофлуоресцентным методами.

1.2. Криоконсервация и создание коллекции клеточных культур

Для длительного хранения клетки консервировали путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендировали в криоконсерванте следующего состава: 70% питательной среды КРМ1 1640, 20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры 1°С/мин до -25°С, перенос на -70°С и далее в жидкий азот (~196°С). Размораживание быстрое при 37°С. После добавления 10 мл бессывороточной среды клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл той же среды, но содержащей 10% эмбриональной л сыворотки, после чего переносили в культуральный флакон площадью 25 см . По включению трипанового синего жизнеспособность клеток после размораживания составляла 90%.

Начиная с первого пассажа (первичные культуры), культуры меланомных клеток замораживали в процессе культивирования на разных пассажах и на стадиях выхода в клеточную линию. Таким образом, были сформированы посевной и рабочий банки культур клеток различных вариантов меланомы. Запас клеток, заложенных на хранение в качестве рабочего и посевного банков, приготовлен на одном пассаже из одного клеточного пула, полученного путем субкультивирования.

1.3. Цитоморфологическое исследование

Для морфологического анализа клетки выращивали в ростовой среде на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри. После образования монослоя на 3-4-е сутки стекла фиксировали и окрашивали по методу Лейшмана. Анализ проводили под световым микроскопом с увеличением X 40 и X 100.

1.4. Иммунофенотипическое исследование

Клетки по 5x105 инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл PBS при 1500 об/мин. К осадку клеток добавляли 20 мкл вторичных антител, конъюгированных с FITC, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После этого клетки дважды отмывали в 1 мл PBS в тех же условиях, осадок ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формалина и анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Beckton Dickinson).

Для реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали следующие антитела: IC090 (CD3 -Т-клетки), IC0180 (С020-В-клетки), ICO-53 (HLA-ABC-антиген гистосовместимости I класса), ICO-1 (HLA-DR-антиген гистосовместимости II класса), ICO-218 (HMW-меланомодифферен-цировочный антиген) (НПЦ МедБиоСпектр, РФ). А также CD86 (ко-стимулирующая молекула), CD80 (ко-регулятор активированных CD86 Т-клеток) и CD34 (маркер гемопоэтических стволовых клеток, экспрессированный на эмбриональной и нервной ткани) (Caltag, UK).

1.5. Иммуноцитохимическое исследование

Цитопрепараты из полученных клеточных линий фиксировали, промывали в PBS 5 мин и затем блокировали эндогенную пероксидазу 3% раствором перекиси водорода в течение 20 мин. Полученные образцы промывали в двух сменах PBS 10 мин и инкубировали с 1% раствором БСА 20 мин при комнатной температуре. После этого избыток раствора удаляли, на не промытые образцы наносили первичные антитела и проводили инкубирацию в течение ночи при низкой температуре (+4°С). Затем образцы промывали в трех сменах PBS. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System (Dako Corp) согласно инструкции. Выявление ферментативной активности (Streptovidin Peroxidase) проводили с помощью АЕС (3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and antimicrobial agent), докрашивали гематоксилином. Подсчет проводили в областях с максимальным окрашиванием на 200-300 опухолевых клеток, используя микроскоп "Axiolab" (ZEISS, Германия). Для цитологического анализа клетки меланомных линий выращивали в ростовой среде на предметных стеклах, помещенных в чашках Петри. Мазки окрашивали по методу Лейшмана.

Для иммуноцитохимического исследования использовали следующие антитела: CD63 (меланомный маркер, используется для идентификации меланоцитных опухолей), MelanA/MART-1 (маркер дифференцировки меланоцитов), НМВ45 (маркер дифференцировки меланоцитов, используется для идентификации меланоцитных опухолей), Tyrosinaza (маркер дифференцировки меланоцитов, определяет биосинтез меланина) (Novocastra Laboratories Ltd., UK). Экспрессию всех исследованных маркеров наблюдали в цитоплазме клеток с различной интенсивностью окрашивания. Отсутствие окрашивания или слабое окрашивание принимали за негативную реакцию, окрашивание со средней и сильной интенсивностью считали положительной реакцией.

1.6. Кариотипическое исследование

Цитогенетические препараты готовили по стандартной методике [Dracopoli N.C., et al., 2004] с модификациями. Колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл вводили в культуральные флаконы за 1,5 ч до начала фиксации. После окончания колхицинизации клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора Версена (1 мин), затем - 0,25% раствором трипсина. После инкубации с трипсином в течение 3-7 мин в термостате при 37°С клетки отставали от дна флакона. Для нейтрализации действия трипсина добавляли 3 мл эмбриональной сыворотки, а затем среды DMEM до 15 мл. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирали.

Для гипотонизации в пробирки добавляли 0,55% раствор КС1 и инкубировали в термостате при 37°С в течение 8-12 мин. Для остановки гипотонизации перед центрифугированием в пробирки добавляли 3-5 капель фиксатора, состоящего из метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Пробирки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Фиксацию проводили стандартным способом, трижды меняя фиксатор (метанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Клеточные суспензии раскапывали на охлажденные влажные стекла.

Высушенные препараты окрашивали с использованием GTG-метода (G-bands by trypsin using Giemsa). Препараты обрабатывали 10-20 с в растворе трипсина, а затем обрабатывали свежей порцией красителя Гимза на фосфатном буфере в течение 1-2 мин. Затем краску смывали холодной проточной водой, и сушили препарат на воздухе. Для каждой культуры анализировали не менее 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно международной номенклатуре ISCN [Shaffer L.G., et al., 2005]. Препараты анализировали под световым микроскопом с иммерсионным объективом. 1.7. Исследование экспрессии генов на уровне мРНК с помощью ОТ-ПЦР

В опухолевых клетках исследовали экспрессию 5 дифференцировочных антигенов меланомы (ДАМ) (MLANA, TYR, SILV, S100В) и 15 раково-тестикулярных генов семейств GAGE; MAGE; BAGE и NY-ESO-1, а также контрольных генов HLA-G, HLA-E и GAPDH. Суммарную РНК из культур опухолевых клеток меланомы выделяли с применением кислого фенола, гуанидина тиоционата (NH2C(=NH)NH2 HSCN) и аммония тиоционата (NH4SCN) в соответствии с Protocol #РТ3231-1 (CLONTECH, США). Использовали реактивы фирмы Sigma-Aldrich, США). Для выделения суммарной РНК использовали 1x106 опухолевых адгезивных клеток или такое же количество суспензионных клеток (mel Gi). Опухолевые клетки разрушали добавлением денатурирующего буфера непосредственно в культуральном флаконе с клетками, но без культуральной среды, или добавлением к осадку суспензионных клеток, полученному после центрифугирования. РНК из гомогената экстрагировали последовательным добавлением кислого фенола (рН=4,0) и хлороформа и изопропанолом. Описанную процедуру выполняли дважды. Последовательности нуклеотидов ген-специфических праймеров были выбраны при помощи программы ОН99 фирмы «Техноген» (РФ) и синтезированы на фирме «Синтол» (РФ) и получены из лаборатории генной инженерии НИИ ЭК ФГУ РКНПК Росмедтехнологий. Последовательность мРНК была получена из баз данных UniGene и AceView Национального Центра Биотехнологической Информации США {National Center for Biotechnological Information, NCBI).

Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов против геномной и мРНК последовательностей проводили при помощи программы BLAST на сервере http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Для гена глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназы использовали праймеры CLONTECH (Mountain View, США). Для реакции обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу М-MLV и реактивы фирмы Promega, США. Результаты анализировали методом электрофореза.

Фотографии гель-электрофореза продуктов ПЦР были оцифрованы при помощи программы ImageQuant (Molecular Dynamics, США). Полученные цифровые значения интенсивности полос продуктов ПЦР по величинам интенсивности ранжированы следующим образом: «О» - фоновое значение от О до 50, «1» - малая интенсивность от 51 до 699, «2» - средняя интенсивность от 700 до 1299, «3» - высокая интенсивность >1300.

1.8. Определение HLA-фенотипов I класса антигенов гистосовместимости

Для определения аллелей HLA-A,B,C в лунки планшета Терасаки раскапывали типирующие сыворотки к антигенам, затем суспензию клеток (2

4x106) по 1 мкл в лунку и инкубировали 30 мин при 22°С в термостате. По истечении срока инкубации в каждую лунку добавляли 5 мкл кроличьего комплемента с последующей инкубацией 1 час при 22°С в термостате. После чего добавляли 5% раствор эозина по 3 мкл на 3-5 мин. Реакцию останавливали 37% формалином по 6 мкл в лунку (рН=7,2). Типирование клеточных линий проводили набором сывороток антилейкоцитарных HLA-A,B,C (Межрегиональный центр иммунодиагностики и гистотипирующих реагентов, ЗАО Гисанс, г. Санкт-Петербург).

1.9. Микробиологическое обследование клеточных линий

Методом молекулярного исследования клеточные линии обследованы на CMV, ВИЧ, гепатит В и С, вирус папилломы человека, Mycoplasma species, Herpes В virus; микробиологическими исследованиями на бактерии и грибы.

2. Характеристика цельноклеточных вакцин 2.1. Общие сведения

Методики приготовления цельноклеточных вакцин описаны в главах, посвященных результатам собственных исследований. В исследование включены пять оригинальных вакцин, одна - дендритноклеточная, две модифицированы геном tag-7, а две - геном ГМ-КСФ:

По общей схеме, описанной ниже, получали 5 видов цельноклеточных вакцин: Вакцины аутологичные человеческие

1. «Дендритная», получена из нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток больных меланомой

2. «АутологичнаяА^7», генноинженерная, получена из метастатических, трансфицированных геном tag7 клеток больного меланомой

Вакцины аллогенные человеческие

3. «Аллоген», генноинженерная, получена из клеточной линии меланомы человека mel Р, транзиторно трансфицированных геном tag7,

4. «Мелавак», генноинженерная, получена из клеточной линии меланомы человека mel Kor, стабильно трансфицированных геном ГМ-КСФ

Сингенная мышиная

5. B16F10/TM-KCO, генноинженерная, получена из культуры клеток мышиной меланомы B16F10, трансфицированной геном ГМ-КСФ (клон BG)

Все клинические исследования вакцин выполнены в рамках Протоколов, утвержденных Ученым советом НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (пилотные исследования) и/или МЗиСР РФ. Для клинической апробации выбраны 4 вакцины «Аутологичная/tag-?», «Аллоген», «Мелавак» и «Дендритная», часть из которых изучена ранее по доклинической программе [Киселев C.JI, и соавт, 2000; Бережной А.Е, и соавт, 2006]. Для доклинического изучения геномодифицированной ГМ-КСФ вакцины «Мелавак» получена сингенная для мышей трансфицированная вакцина, путем стабильной трансфекции клеток мышиной меланомы B16F10, трансфицированной мышиным геном ГМ-КСФ. 3. Доклинические исследования вакцин

Доклиническое изучение безвредности прошли две вакцины «Аллоген» и «Мелавак», предназначенные для внутрикожного применения. Исследования на животных проведены при однократном внутрикожном, подкожном и/или внутрибрюшинном введении вакцин. Глубина внутрикожного введения составляла 1-3 мм. Объем раствора на одно место введения >0,1 мл для кроликов, 0,02-0,04 мл для крыс и 0,05 мл для мышей. Для исключения туморогенности исходные клеточные линии обеих вакцин подвергали ионизирующему облучению на гамма-установке «Стебель-ЗА» с мощностью дозы 5 Гр/мин с достижением летальной дозы для клеток 100 Гр, контролируемой стандартной дозиметрией.

Все доклинические исследования выполнены на различных видах лабораторных животных в рамках действующих требований [Приказ МЗиСР РФ от 23.08.2010 г. N 708н «Об утверждении правил лабораторной практики»] и в соответствии с разрешением Росздравнадзора МЗиСР РФ [Перечень организаций и учреждений, осуществляющих проведение доклинических исследований (ДИ) лекарственных средств (ЛС) от 27.01.2011].

Лабораторных животных получали из сертифицированных питомников РФ или из разведения РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Все животные были здоровы, животные из питомников имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья. Качество здоровья животных разведения РОНЦ гарантировано конвенциональными условиями разведения. Разведение, содержание, проведение экспериментов и умерщвление лабораторных животных проводились в виварии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в соответствии с действующими регламентами РФ.

Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложены в следующих документах: "Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (ЕЭС, Страсбург, 1985); [Ланималогия, 1993, т.1, с.29]; Требования Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000 г) и Рекомендации, содержащиеся в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР 755 от 12.08.1977 и Приказе Минсельхоза РФ 490 от 05.11.2008 "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии". 3.1. Изучение специфической иммунологической активности Иммунизация мышей

Эксперименты проведены на мышах линии С57В1/6 (гаплотип Н-2Ь) 8-12 нед. возраста массой тела 20-25 г из питомника «Столбовая» РАМН. Группы мышей составляли по 8 особей. Клетки вакцины B16F10/GM-CSF из криохранилища отмывали от криоконсерванта последовательно бессывороточной средой ДМЕМ и 0,9% раствором натрия хлорида, осаждали при 1000 об/мин и ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида.

Клетки меланомы B16F10 получили из коллекции культур клеток РОНЦ и выращивали in vitro в стандартных условиях. Иммунизацию здоровых мышей

5 6 7 вакциной B16F10/GM-CSF проводили в трех дозах 10J - 10 - 10' клеток в 100 мкл 0,9% раствора хлорида натрия однократно подкожно в область левой подмышечной впадины с помощью инсулинового шприца за 7 дней до инокуляции клеток меланомы В16F10. Оценка специфической активности

Оценку специфического иммунологического эффекта цельноклеточной вакцины B16F10/TM-KCO проводили в профилактическом режиме, определяя влияние вакцины на имплантационные, кинетические характеристики и способность к диссеминации метастазирующей в легкие меланомы B16/F10 у мышей линии С57В16. Культуру клеток мышиной меланомы линии B16F10 использовали при стандартной 100% прививочной дозе 105 клеток на мышь, которую имплантировали подкожно в область правой подмышечной впадины. Влияние на имплантационную способность опухоли

Оценку имплантационной способности клеток B16F10 под действием вакцины проводили по прививаемости опухолей и по длительности латентного периода выхода опухолей под кожей у мышей. О прививаемости B16F10 судили по числу мышей с опухолями в исследуемых группах на срок выхода 100% опухолей у мышей контрольной группы. С этой целью ежедневно животных обследовали на наличие опухолей в области введения клеток. О длительности латентного периода судили по сроку выхода всех опухолевых узлов в группе контроля и в исследуемой группе. Достоверное уменьшение прививаемости или пролонгирование латентного периода считали признаком снижения имплантационной способности клеток В16Р10 и положительным ответом на вакцинацию. Дозу клеток, вызвавшую 50%-ную задержку времени выхода опухолей под кожей считали, соответственно, средней эффективной дозой (ЕД50) этого эффекта и использовали для изучения других показателей специфической активности вакцин. Пересчет доз клеток для человека осуществляли с использованием коэффициентов поверхности тела человека и животных [Ргепе1сЬ ЕЛ., е1 а1., 1966]. Влияние на кинетические параметры опухолевого роста

Для оценки кинетических параметров роста опухолевых узлов в организме мышей вакцинировали в дозе ЕД50. Формирующиеся пальпируемые опухоли измеряли дважды в неделю и расчитывали объем опухоли по формуле У=0тахх01х(Т)тах/2), где Отах - максимальный диаметр, а Б] - диаметр, перпендикулярный Отах. По разнице средних объемов опухолей (Уср) в исследовательской группе и группе контроля без воздействия рассчитывали стандартный показатель торможения роста опухоли (ТРО) [Трещалина Е.М., и соавт., 2005].

Влияние на метастатическую активность опухоли

Для оценки метастатической активности опухоли в организме вакцинированных мышей рассчитывали стандартный показатель торможения роста метастазов (ТРМ) и выживаемость мышей с метастазами под действием ЕД50. О выживаемости судили по срокам гибели животных и по стандартному показателю увеличения продолжительности жизни (УПЖ), который рассчитывали по средней продолжительности жизни (СПЖ) в исследовательской группе и группе контроля без воздействия [Зуева Е.П., и соавт., 2005.].

Статистическую достоверность показателей специфической активности вакцин рассчитывали по методу АЫОУА. Определение шансов возникновения признака и расчет доверительных интервалов выполнены с помощью пакета программ STATISTICA. 3.2. Изучение безвредности

При доклиническом исследовании безвредности вакцин «Аллоген» и «Мелавак» выполнено изучение общей и локальной токсичности с оценкой иммунотоксичности, пирогенности и туморогенности, а также проведением патоморфологических исследований внутренних органов животных [Михайлова JI.M. и соавт., 2005; Верстакова O.JL, 2010; Гуськова Т.А., 2010; Березовская И.В., 2010; Иванова A.C., и соавт., 2010; Методические указания №РД-42-28-10-89, М., МЗ РФ, изд. Официальное, 1989; Трещалина Е.М., и соавт., 2012].

Вакцина «Мелавак» изучена с использованием всех стандартных показателей безвредности, рекомендованных для медицинских иммунобиологических препаратов. При изучении безвредности вакцины «Аллоген», которая оказалось близкой по специфической активности к вакцине «Мелавак», использована сокращенная программа с целью возможной оптимизации объема доклинических исследований вакцин подобного типа. Лабораторные животные

Исследования выполнены на 85 гибридных мышах-самцах BDF/ или Fi2 массой тела не менее 18 г из питомника «Столбовая» РАМН; 60 неинбредных крысах-самцах массой тела 170-250 г и 37 иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude из разведения РОНЦ; 42 кроликах породы «Шиншилла» массой тела 1,7-2,2 кг из ФГУП «Опытно-производственное хозяйство «Манихино» и 104 морских свинках-самках альбиносах массой тела 240-250 г из питомника ГУНЦ Биомедицинских технологий «Филиал Андреевка» РАМН.

Гистологическому исследованию подвергнуты участки головного мозга, сердца, легких, печени, почек, мочевого пузыря, желудка, тонкой и толстой кишки, селезенки, тимуса, лимфатических узлов брыжейки, паховых лимфатических узлов (регионарных и контралатеральных), семенников, надпочечников, поджелудочной и щитовидной железы, костного мозга, а также кожи с места введения вакцины или физиологического раствора. Материал фиксировали в 12% нейтральном формалине, подвергали общепринятой гистологической обработке для получения парафиновых срезов толщиной 5 микрон. Депарафинированнные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопию готовых микропрепаратов проводили на микроскопе Carl Zeiss, Jena (Германия).

Статистическую обработку результатов доклинического изучения безвредности проводили с помощью компьютерой программы «Статграф». 4. Клинические исследования вакцин

Для получения разрешения МЗиСР РФ на проведение клинических исследований новых оригинальных цельноклеточных вакцин на основании результатов доклинических исследований подготовлен стандартный комплект документов.

Разрешенные клинические испытания вакцин выполнены в соответствии с Протоколами в отделении биотерапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (зав. проф. Демидов J1.B.) с соблюдением стандартов GCP (Good clinical practice). Соответственно требованиям МЗиСР РФ для медицинских иммунобиологических препаратов проведены пилотные клинические исследования и открытые исследования I фазы и начата II фаза. Задачи отдельных клинических фаз касались изучения безопасности и эффективности вакцин, определению дозовых характеристик выявленных эффектов и оценки перспективности применения вакцин у онкологических пациентов.

Общая характеристика больных

В клиническое исследование включены 148 больных с метастатической меланомой III-IV ст., проходивших лечение в РОНЦ им. Н.Н.Блохина в 19992010 гг. Больные были разделены на две группы. Первая группа из 68 больных представляла собой доноров опухолевого материала, из которого получены новые клеточные линии - субстрат для разработки вакцин. Вторая группа включена в клинические исследования безвредности и эффективности вакцин и состояла из 80 больных, среди которых 41 женщина и 39 мужчин в возрасте от 21 до 78 лет.

Все пациенты подписали информированное согласие. Часть больных второй группы (п=39), ранее получавших комплексное лечение (хирургическое, иммунотерапевтическое и химиотерапевтическое), была включена в Протокол I фазы на фоне прогрессирования заболевания. Другой части больных этой группы (п=41), вакцину назначали на фоне стабилизации процесса.

Для выявления показаний к применению конкретного режима введения вакцины всем больным до начала лечения проводили стандартное клиническое обследование, включающее физикальное обследование, клинический и биохимический анализы крови, рентгенографию органов грудной клетки, ЭКГ, УЗИ органов брюшной полости (забрюшинных и периферических л/у, послеоперационных рубцов), КТ или МРТ органов грудной и брюшной полости (по показаниям) и оценку иммунологического статуса. Аналогичное обследование проводили больным в процессе и после окончания лечения для оценки результатов изучения вакцины. При проведении исследования действие вакцины каждой оценивали при эскалации дозы. Число больных, получавших разные дозы вакцин, представлены при описании результатов лечения. Методика введения вакцины

При проведении исследования вакцину вводили пациентам внутрикожно в область плеча, лопаточной, паховой или пупочной области в 2-10 точек, находящихся в непосредственной близости от регионарных лимфатических коллекторов. Инъекции вакцин повторяли многократно, кратность повтора описана в разделе результатов собственных исследований. Вакцины изучены в различных режимах применения больным: терапевтическим считали введение вакцины при наличии опухолевого процесса, адъювантным считали введение вакцины при отсутствии признаков опухолевого процесса.

В таблице 8 представлена характеристика больных, вид и дозы вакцин, режим применения.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Михайлова, Ирина Николаевна, 2012 год

1. Астахова, С.Е. Маркеры ангиогенеза в прогнозе увеальной меланомы / С.Е. Астахова, В.Г. Лихванцева, Ю.И. Ухов и др. // Мед. иммунология. 2003. - 5 (3-4). - С. 346.

2. Балдуева, И.А. Противоопухолевые вакцины / И.А. Балдуева // Практическая онкология. 2003. - Т. 4, № 3. - С. 157-166.

3. Балдуева, И.А. Разработка, обоснование и оценка современной биотерапии у больных солидными опухолями: Дис. докт. мед. наук: дата защиты 16.12.08. / И.А. Балдуева. Санкт-Петербург, 2008. - 275 с.

4. Барышников, А.Ю. Противоопухолевые вакцины. / А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Российский биотерапевтический журнал. 2002. - Т.1, № 2. - С. 12-14.

5. Белецкая, Л.В. Сходство эпителиальных клеток и эпителия тимуса / Л.В. Белецкая, Б.А. Беренбейн // Вестник дерматологии. 1986. - № 8. - С. 15-21.

6. Березовская, И.В. Прогноз безопасности лекарственных средств в доклинических токсикологических исследованиях / И.В. Березовская // Токсикологический вестник. 2010. - № 5. - С. 38-46.

7. Вавилов, A.M. Иммунокомпетентные структуры кожи их роль в развитии первичных кожных лимфом / A.M. Вавилов, Е.М. Лезвинская // Архив патологии. 1996. - № 6. - С. 7-12.

8. Верстакова, О.Л. Проблемы проведения доклинической экспертизы безопасности лекарственных средств / О.Л. Верстакова // Токсикологический вестник. 2010. - № 5. - С. 21-27.

9. Гантиевская, Ю.А. Дендритные клетки: роль в системе иммунитета / Ю.А. Гантиевская, В.В. Селявко // Иммунопатология, аллергология и инфектология. -2001.-№ 4.-С. 5-23.

10. Гуськова, Т.А. Доклиническое токсикологическое изучение лекарственных средств как гарантия безопасности проведения их клинических исследований / Т.А. Гуськова // Токсикологический вестник. 2010. - № 5. - С.28-37.

11. Дейчман, Г.И. Канцерогенез: Специфические трансплантационные опухолевые антигены / Г.И. Дейчман. М.: Научный мир, 2000. - 420 с.

12. Дейчман, Г.И. Канцерогенез: Опухолевые антигены и противоопухолевый иммунитет (врожденный и приобретенный) / Г.И. Дейчман. М.: Медицина, 2004.-С. 448-473.

13. Зимина, И.В. Кожа, как иммунный орган / И.В. Зимина, Ю.М. Лопухин // Иммунология. 1994. - № 6. - С. 8-12.

14. Иванова, A.C. Принципы изучения иммунотоксического действия фармакологических препаратов / Т.Б. Мастернак, А.И. Мартынов // Токсикологический вестник. 2010. -№ 5. - С. 61-76.

15. Кадагидзе, З.Г. Иммунорегуляторные CD25+ CD4+ Т-клетки / З.Г. Кадагидзе, А.И. Черткова, Е.Г. Славина // Российский биотерапевтический журнал. 2006. - Т. 5, № 2. - С. 13-20.

16. Киселев, С.Л. Ген tag7 и генотерапия рака / С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев // Генетика 2000. - Т. 36, № 11. - С. 1431-1435.

17. Кешелава, В.В. Противоопухолевые вакцины: возможности и перспективы применения / В.В. Кешелава // Вестник МЕДСИ. 2009. Сентябрь-ноябрь.5.-С. 16-23.

18. Кетлинский, С. А. Цитокины / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев // СПб.: ООО «Издательство Фолиант», 2008. С. 235-242.

19. Колокольцева, Т.Д. К вопросу о контроле безопасности культур клеток, пригодных для заместительной терапии / Т.Д. Колокольцева, Н.В. Шалунова, Е.М. Петручук // Биопрепараты. 2006. - Июнь. - С. 8-12.

20. Конюшко, О.И. Требования, предъявляемые к линиям диплоидных клеток, предназначенных для регенеративной медицины / О.И. Конюшко, В.Б.Хва-тов, C.B. Смирнов, B.C. Бочарова // Трансплантология. 2009. - С. 31-34.

21. Моисеенко, В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи / В.М Моисеенко // Практическая онкология. 2001. - Т. 8, № 4. - С. 58-64.

22. Москалева, Е.Ю. Теоретические основы и подготовительный этап использования дендритных клеток для биотерапии рака / Е.Ю. Москалева, A.B. Родина и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции -М.-2002.-№30.-С. 66.

23. Полосухина, Е.Р. Получение и характеристика моноклональных антител к меланома-ассоциированному антигену / Е.Р. Полосухина, А.Д. Михайлов, П.К.

24. Иванов, К.Н. Новиков, М.Е. Абрамов, Е.В. Степанова, М.И. Лукашина, Т.Н. Заботина, Л.Ф. Морозова, А.Ю. Барышников // Медицинская иммунология. -1999. Т. 1, № 3-4. - С. 107-108.

25. Сергеев, А.Ю. Имму но дерматология: иммунологические основы патогенеза воспалительных дерматозов человека / А.Ю. Сергеев, A.B. Караулов, Ю.В. Сергеев // Иммунопатология, аллергология и инфектология. 2003. - № 3.1. С. 10-23.

26. Сергеева, Н.С. Новые серологические опухолеассоциированные маркеры (S 100, Bone TRAP 5b, UBC, Tu M2-PK) в мониторинге онкологических больных / Н.С. Сергеева, Н.В. Маршутина // Вестник Московского Онкологического Общества. 2007 январь. - № 1.

27. Симбирцев, A.C. Цитокины: классификация и биологические функции / A.C. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 2 - С. 16-22.

28. Суровцева, М.А. Клинико-иммунологическая эффективность вакцинотерапии при диссеминированной меланоме кожи / М.А. Суровцева, A.A. Шишков, Г.В. Селедцова, В.А. Козлов // 2009. № 6 (36). - С. 12-18.

29. Трещалина Е.М., Исследование туморогенности (онкогенных потенций) клеточных культур / Н.В. Андронова, Н.Т. Райхлин, В.М. Бухман, Н.П.

30. Ермакова, И.Б. Меркулова, Н.Ю. Кульбачевская, Н.В. Шалунова, А.Ю. Барышников // В кн.: «Особенности доклинического исследования иммунобиологических лекарственных препаратов", руководство под ред. проф. Н.В. Медуницина. 2012. - гл.28. - С.1023-1034.

31. Тюряева, И.И. Опухолевые антигены / И.И. Тюряева // Цитология 2008. -Т.50, № 3. - С. 189-209.

32. Шалунова, Н.В. Аттестация перевиваемых клеточных линий субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов / Н.В. Шалунова, Г.А. Ломанова // Методические указания. Москва - 1989. - РД 4228-10-89.

33. Шишкова, Н.В. Иммунные реакции кожи и ассоциированных с ней лимфатических узлов / И.В. Шишкова, А.Р. Авакян // Актуальные вопросы дерматовенерологии. 2000. - Курск - Вып. 3. - С. 157-160.

34. Чкадуа, Г.З. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения / Г.З. Чкадуа, Т.Н. Заботина и др. // Российский биотерапевтический журнал. -2002.-Т. 1,№3.-С. 56-59.

35. Aarntzen, Е.Н. Dendritic cell vaccination and immune monitoring / E.H. Aarntzen, C.G. Figdor, G.J. Adema, C.J. Punt, I.J. De Vries // Cancer Immunol. -2008. Immunother. Vol. 57, P. 1559-1568.

36. Manches, L. Pan, R.R. Venhaus, E.W. Hoffman, A. Jungbluth, S. Gnjatic, L. Old, A.C. Pavlick, N. Bhardwaj // J. Immunol. 2008. - Jul 1. - 181(1). - P.776-84.

37. Almand, B. Increased production of immature myeloid cells in cancer patients: a mechanism of immunosuppression in cancer / B. Almand, J.I. Clark, E. Niki-tina et al. // The Journal of Immunology. 2001. - Vol. 166, № 1. - P. 678-689.

38. Arlen, P.M. Antiandrogen, vaccine, and combination therapy in patients withnonmetastatic hormone refractory prostate cancer / P.M. Arlen, J.L. Gulley, N.

39. Todd, R. Lieberman, S.M. Steinberg, S. Morin, A. Bastian, J. Marte, K.Y. Tsang, P. Beetham, D.W. Grosenbach, J. Schlom, W. Dahut// Jurol. 2005. 174:539-46.

40. Armstrong A. Cellular immunotherapy for cancer / A. Armstrong, D. Eaton, J. Ewing // BMJ. 2001. - Vol. 323. - P. 1289-1293.

41. Balazs, M. Chromosomal imbalances in primary and metastatic melanomas revealed by comparative genomic hybridization / M. Balazs, Z. Adam, A. Treszl, A. Begany, J. Hunyadi, R. Adany // Cytometry. 2001. 46(4) - P. 222-232.

42. Balkwill, F. Inflammation and cancer: back to Virchow? / F. Balkwill, A. Mantovani // Lancet. 2001. - 357. - P.539-45.

43. Banchereau, J. Dendritic cells and the control of immunity / J. Banchereau, R. Steinman // Nature 1998. - 392. - P. 245-52.

44. Barnavon,Y. Vaccinia colon oncolysate immunotherapy for murine hepatic metastases can be modulated with low-dose interleukin-2 / Y. Barnavon, H. Iwaki, J.A. Bash, M.K. Wallack // The american Surgeon. 1988. - 54(12). - P. 696-701.

45. Berd, D. Immunization with haptenized, autologous tumor cells induces inflammation of human melanoma metastases / D. Berd, G. Murphy, H.C. Maguire, M.J. Mastrangelo // Cancer Res. 1991. - 51: 2731-2734.

46. Berd, D. Immunopharmacologic analysis of an autologous, haptenmodified human melanoma vaccine / D. Berd, T. Sato, H.C. Maguire, J. Kairys, M.J. Mastrangelo //J. Clin Oncol 2004. - 22: 403-415.

47. Blom, D.J.R. HLA expression in a primary uveal melanoma, its cell line, and four of its metastases / D.J.R. Blom, LRHM Schurmans, IDe Waard-Siebinga, DDe Wolff-Rouendaal, JEE Keunen, M.J. Jager // Br J. Ophthalmol. 1997. - 81: 989993.

48. Bonfrer, J.M. Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumour marker / J.M. Bonfrer, C.M. Korse //Recent Results Cancer Res. 2001. - 158. - P. 149-157.

49. Borello, I. Cancer vaccines for hematologic malignancies / I. Borello, E. Sotomayor // Cancer Control. 2002. March/April. - Vol. 9, № 2. - P. 138-151.

50. Bowne, W.B. Coupling and uncoupling of tumor immunity and autoimmunity / W.B. Bowne, R. Srinivasan, J.D. Wolchok, W.G. Hawkins, N.E. Blachere, R. Dyall, J.J. Lewis, A.N. Houghton // J. Exp. Med. 1999. - 190: 1717-1722.

51. Bottoni, U. SI00 serum level: a tumour marker for metastatic melanoma/ U. Bottoni, P. Izzo A. Richetta, T.J. Mannooranparampil, V. Devirgiliis, M. Del Giudice et al. // Melanoma Res. 2003. - 13:427-429.

52. Bystryn, J.C. Double-blind trial of a polyvalent, shed-antigen, melanoma vaccine / J.C. Bystryn, A. Zeleniuch-Jacquotte, R. Oratz, R.L. Shapiro, M.N. Harris, D.F. Roses // Clin. Cancer Res. 2001. - 7:1882-1887.

53. Brady, M.S. Cytokine by CD4+ T-cells responding to antigen presentation by melanoma cells/ M.S. Brady, D.D. Eckels, F. Lee, S.Y. Ree // Melanoma Res. -1999.-9: 173-80.

54. Brossart, P. Dendritic cells in cancer vaccines / P. Brossart, S. Wirths, W. Brugger, L. Kanz // Exp. Hematol. 2001. - Vol. 29, № 11. - P. 1247-1255.

55. Brychtova, S. The role of vascular endothelial growth factors and their receptors in malignant melanomas / S. Brychtova, M. Bezdekova, T. Brychta, M. Tichy // Neoplasma. 2008. - 55: 273-9.

56. Burgdorf, S.K. Changes in cytokine and biomarker blood levels in patients with colorectal cancer during dendritic cell-based vaccination / S.K. Burgdorf, M.H. Claesson, H.J. Nielsen, J. Rosenberg // Acta Oncologica. 2009. - 48. - P. 11571164.

57. Butts, C. Randomized Phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer / C. Butts, N. Murray, A. Maksymiuk et al. // J. Clin. Oncol. 2005. - 23(27), 6674-6681.

58. Burgess, A.W. The nature and action of granulocyte-macrophage colony stimulating factors / A.W. Burgess, and D. Metcalf// Blood. 1980. - 56:947-958.

59. Cambell, M.J. Idiotype vaccination against murine B-cell Lymphoma / M.J. Cambell, L. Esserman, N.E. Byars, A.C. Allison, R. Levy // J. Immunol. 1990. -145: 1029.

60. Cavaillon, J.M. Cytokines and macrophages / J.M. Cavaillon // Biomedical Pharmacotherapy 1994. - 48: 445-53.

61. Cebon, J. Two phase I studies of low dose recombinant human IL-12 with Melan-A and influenza peptides in subjects with advanced malignant melanoma / J. Cebon, E. Jager, M.J. Shackleton et al. // Cancer Immun. 2003. - P. 3-7.

62. Chang, A. A. Phase I Trial of Tumor Lysate-pulsed Dendritic Cells in the Treatment of Advanced Cancer / A.A. Chang, B. Redman, J. Whitfield, B.J.

63. Nickoloff, T.M. Braun, P.P. Lee, J.D. Geiger, J.J. Mulé // Clinical Cancer Research. -2002.-8: 1021-1032.

64. Chang, D.Z. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor: an adjuvant for cancer vaccines / D.Z. Chang, W. Lomazow, C. Joy Somberg, R. Stan, M.A. Perales // Hematology. 2004. - 9: 207-215.

65. Chen, X. Novel strategies for improved cancer vaccines / X. Chen, C.H. Chang, D.M. Goldenberg // Expert Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8, № 5 - P. 567-576.

66. Colombo, M. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy / M. Colombo, G. Trinchieri // Cytokine Grouth Factor Rev. 2002. - Vol. 13. - P. 155168.

67. Coley, W.B. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas: With a report of ten original cases / W.B. Coley // Am J. Med. Sci. -1893.- 105: 487-51.

68. Djureen-Martenson, E. Use of serum S-100 as a marker for prognosis and in the follow up of malignant melanoma / E. Djureen-Martenson, L.O. Hansson, B. Nilsson et al. // XXIX ISOBM 2001 - Meeting. - P. 44.

69. Dong Fang. A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas / Dong Fang, T.K.Nguyen, K. Kim Leishear, R. Finko, A.N. Kulp, S. Hotz, P.A. Van Belle, X. Xu, D.E. Elder, M. Herlyn // Cancer Research. 2005. -Vol.65 (20)-P. 9328-9337.

70. Dracopoli, N.C. Short protocols in human genetics: a compendium of methods from current protocols in human genetics / N.C. Dracopoli et al. (eds) // Willey. -2004.

71. Dranoff, G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy / G. Dranoff // Nat. Rev. Cancer. 2004. - Vol.4. - P. 11-22.

72. Dredge, K. Adjuvants and the promotion of Thl-type cytokines in tumour immunotherapy/ K. Dredge, J.B. Marriott, S.M. Todryk, A.G. Dalgleish // Cancer Immunol Immunother. -2002. 51.-P. 521-31.

73. Dudley, M.E. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma / M.E. Dudley, et al. // J. Clin. Oncol. 2005. - 23: 2346-2357.

74. Dudley, M.E. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes / M.E. Dudley, J.R. Wunderlich, P.F. Robbins et al. // Science (New York, NY). 2002. - 298. - P. 850-4.

75. Dummer, W. Elevated serum levels of interleukin-10 in patients with metastatic malignant melanoma / W. Dummer, J.C. Becker, A. Schwaaf, M. Leverkus, T. Moll, E.B. Brocker // Melanoma Res. 1995. - 5: 67-8.

76. Egen, J.G. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy / J.G. Egen, M.S. Kuhns, J.P. Allison // Nat Immunol. 2002.3: 611-8.

77. Von Euw, E.M. A phase I clinical study of vaccination of melanoma patients with dendritic cells loaded with allogeneic apoptotic/necrotic melanoma cells.

78. Finkelstein, S.E. Bedside to bench and back again: how animal models are guiding the development of new immunotherapies for cancer / S.E. Finkelstein, D.M. Heimann, C.A. Klebanoff et al. // J. Leukoc Biol. 2004. - 76: 333-7.

79. Flanagan, K. The lymphoid chemokine CCL21 costimulates nanve T cell expansion and Thl polarization of non-regulatory CD4+ T cells / K. Flanagan, D. Moroziewicz, H. Kwak, H. Hörig, H.L.Kaufman // Cell Immunol. 2004. - 231: 7584.

80. Fournier, P. Randomized clinical studies of anti-tumor vaccination: state of the art in 2008 / P. Fournier, V. Schirrmacher // Expert Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8 (l).-P. 51-56.

81. Freeman, S.M. The treatment of ovarian cancer with a gene modified cancer vaccine: A phase I study / S.M. Freeman, C. McCune, W. Robinson et al. // Hum Gene Ther. 1995. - Vol. 6. - P. 927-939.

82. Freireich, E.J. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey, and man / E.J. Freireich, E.A. Gehan, D.P. Rail, L.H. Schmidt, H.E. Skipper // Cancer Chemother. Rep. 1966. -Vol. 50, № 4. - P. 219-244.

83. Gajewski, T.F. Immune resistance orchestrated by the tumor microenvironment / T.F. Gajewsk, Y. Meng, C. Blank, I. Brown, A. Kacha, J. Kline, H. Harlin // Immunological reviews. 2006. - 213: 131-45.

84. Geier, D. The true story of pertussis vaccination / D. Geier, M. Geller // Journal of the History of Medicine and Allied Sciences. 2002. Jul. - 57(3). - P. 249-284.

85. Geoffrey, A.P. Significance of Plasma Cytokine Levels in Melanoma Patients With Histologically Negative Sentinel Lymph Nodes / A.P. Geoffrey A. Porter, Abdalla Joseph, Lu Meisheng, Smith Shannon, Diane Montgomery, Elizabeth

86. Grimm, I. Ross Merrick, F. Paul, Mansfield, Jeffrey E. Gershenwald and E. Lee Jeffrey // Annals of Surgical Oncology. -2001.-8 (2): 116-122.

87. Georgiev, G.P. Genes involved in the control of tumor progression and their possible use for gene therapy / G.P. Georgiev, S.L. Kiselev, E.M Lukandin // Gene Ther. Mol. Biol. 1998.-Vol. l.-P. 381-389.

88. Ghiringhelli, F. CD4+CD25+ regulatory T cells suppress tumor immunity but are sensitive to cyclophosphamide which allows immunotherapy of established tumors to be curative / F. Ghiringhelli et al. // Eur. J. Immunol. -2004. 34: 336-344.

89. Goldberg, S.M. Comparison of two cancer vaccines targeting tyrosinase: plasmid DNA and recombinant alphavirus replicón particles/ S.M. Goldberg, S.M. Bartido, J.P. Gardner et al. // Clin Cancer Res. 2005. - 11: 8114-8121.

90. Greenberg, P. Adoptive T cell therapy of tumors: mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells/ P. Greenberg // Adv. Immunol. — 1991. — Vol.49.-P. 281-355.

91. Greten, T.F. Cancer vaccines / T.F. Greten, E.M. Jaffee // J. Clin Oncol. -1999. Vol. 17, № 3 - P. 1047-1060.

92. Guide lines for the clinical translation of the stem cells / International Societyfor Stem Cell Research // -2008. http://www.isscr.org

93. Gutcher, I. APC-derived cytokines and T cell polarization in autoimmune infla-mmation /1. Gutcher, B. Becher // J. Clin Invest. 2007. - 117. - P. 1119-27.

94. Hamilton, W.B. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography / W.B. Hamilton, F. Helling, K.O. Lloyd, P.O. Livingston // Int J. Cancer. 1993.-53: 566-573.

95. He, A.R. Clinical experiences with G17 DT in gastrointestinal malignancies / A.R. He, J.L. Marshall // Expert Rev. Anticancer Ther. 2006. - 6(4). - P. 487-492.

96. Heimburg-Molinaro, J. Cancer vaccines and carbohydrate epitopes / J. Heimburg-Molinaro, M. Lum, G. Vijay, M. Jain, A. Almogren, K. Rittenhouse-Olson // Vaccine. 2011. - Nov. - 8; 29(48). - P. 8802-26.

97. Helling, F. GM2-KLH conjugate vaccine: increased immunogenicity in melanoma patients after administration with immunological adjuvant QS-21 / F. Helling, S. Zhang, A. Shang A et al. // Cancer Res. 1995. - 55: 2783-2788.

98. Herlyn, D. Animal models of human-derived cancer vaccines / D. Herlyn, R. Somasundaram,W. Li, L. Jacob // Cell Biophys. 1995 - Aug. - 27(1). -P. -15-30.

99. Hersey, P. Adjuvant immunotherapy of patients with high-risk melanoma using vaccinia viral lysates of melanoma: results of a randomized trial / P. Hersey,

100. A.S. Coates, Mc. W.H. Carthy, F. Thompson, R.W. Sillar, R. McLeod, P.G. Gill,

101. B.J. Coventry, A. McMullen H. Dillon, R. J. Simes // J. Clin Oncol. 2002. - 20: 4181-4190.

102. Hicklin, D.J. beta2 -Microglobulin Mutations, HLA-Class I Antigen Loss, And Tunor Progression in melanoma / D.J. Hicklin., Z. Wang., F. Arienti, L. Rivoltini, G. Parmiane, S. Ferrone // J.Clin.Invest. 1998. June. - Vol.101. N.12. - P. 2720-2729.

103. Hirschowitz, E.A. Adenovirus-mediated expression of melanoma antigen gp75 as immunotherapy for metastatic melanoma / E.A. Hirschowitz, S. Leonard, W.

104. Song, B. Ferris, P.L. Leopold, J.J. Lewis, W.B. Bowne, S. Wang, A.N. Houghton, R.G. Crystal // Gene Ther. 1998. - 5. - P. 975-983.

105. Hirschowitz, E.A. Immunization of NSCLC patients with antigen-pulsed immature autologous dendritic cells/ E.A. Hirschowitz, T. Foody, G.E. Hidalgo, J.R.Yannelli // Lung Cancer. 2007. - Sep. - 57(3). - P. 365-72.

106. Hodge, J.W. Multiple costimulatory modalities enhance CTL avidity/ J.W. Hodge, M. Chakraborty, C. Kudo-Saito, C.T. Garnett, J. Schlom // J. Immunol. -2005. 174: 5994-6004.

107. Holmberg, L.A. Vaccination with Theratope (Stn-KLH) as treatment for breast cancer/ L.A. Holmberg, B.M. Sandmaier // Expert Rev. Vaccines. 2004. - 3(6). - P. 655-663.

108. Hoos, A. A clinical development paradigm for cancer vaccines and related bio-logics /A. Hoos, G. Parmiani, K. Hege et al. // J. Immunother. 2007. -30:1-15.

109. Hoos, A. Improved Endpoints for Cancer Immunotherapy Trials/ A. Hoos, A. Eggermont, S Janetzki, F.S. Hodi, R. Ibrahim, A. Anderson, R. Humphrey, B. Blumenstein, L. Old, J. Wolchok // J. Natl Cancer Inst. 2010. - Sep 22. - 102(18). -P. 1388-1397.

110. Howard, M. Identification of a T-cell-derived B-cell growth factor distinct from interleukin-2 / M. Howard, J. Farrar, M. Hilfiker, B. Johnson, K. Takatsu, T. Hamaoka, W.E. Paul // J. Exp. Med. 1982. - Vol. 155. - P. 914-923.

111. Hsuch E.C. Tumor cell-based vaccines for treatment of melanoma / E.C. Hsuch //Bio Drugs.-2001.-Vol. 15(11).-P. 713-720.

112. Hsueh, E.C. Enhancement of complement-dependent cytoxicity by polyvalent melanoma cell vaccine (CancerVax): correlation with survival / E.C. Hsueh, E. Famatiga, R.K. Gupta, D.L. Morton // Ann. Surg. Oncol. 1998. - Vol. 5. - P.595-602.

113. Hsueh, E.C. Correlation of specific immune responses with survival in melanoma patients with distant metastases receiving polyvalent melanoma cell vaccine/ E.C. Hsueh, R.K. Gupta, K. Qi, D.L. Morton // J. Clin Oncol. 1998. - 16: 2913-2920.

114. Hu, H.M. Development of antitumor immune responses in reconstituted lymphopenic hosts/ H.M. Hu, C.H. Poehlein, W.J. Urba and B.A. Fox // Cancer Res. -2002.-62:3914-3919.

115. Huang, S.K. Antibody responses to melanoma/melanocyte autoantigens in melanoma patients/ S.K. Huang, T. Okamoto, D.L. Morton, D.S. Hoon // J. Invest Dermatol. 1998. -Ill: 662-667.

116. Huben, RP. Immunotherapy of a murine renal cancer / J Urology. 1983. -129.-P. 1075.

117. Hunder, N.N. Treatment of metastatic melanoma with autologous CD4 + T cells against NY-ESO-1 / N.N. Hunder., H. Wallen, J. Cao et al. // The New England journal of medicine. 2008. -358. - P. 2698-703.

118. Ibrahim, N.K. Humoralimmune response to naturally occuring Stn in metastatic breast cancer patiens (MBC pts) treated with Stn-KLH vaccine / N.K. Ibrahim, J. Murray, J. Parker, L. Finkes, D. Miles D. // ASCO. 2004. - Proc. - 22, 2547.

119. Inaba, K. Dendritic cells pulsed with protein antigens in vitro can prime antigen-specific, MHC-restricted T cells in situ / K. Inaba, J.P. Metlay, M.T. Crowley, R.M. Steinman // J. Exp. Med. 1990. - 172: 631-640.

120. Jaffee, E.M. Considerations for the clinical development of cytokine gene-transduced tumor cell vaccines / E.M. Jaffee, D.M. Pardoll // Methods. 1997. - 12: 143-53.

121. Jury, C.S. Rising levels of serum SI00 protein precede other evidence of disease progression in patients with malignant melanoma / C.S. Jury, Mc. E.J. Allister, R.M. MacKie // Br J. Dermatol 2000. - 143: 269-274.

122. Kalinski, P. Interleukin-12 family (IL-12, -23, 12RA, and -27 / P. Kalinski, W. J. Storkus, A. W. Thomson, M.T. Lotze // In The Cytokine Handbook, 4 edition. -2003. Vol. 1-P. 383-408.

123. Kaufman, H.L. Targeting the local tumor microenvironment with vaccinia virus expressing B7.1 for the treatment of melanoma / H.L. Kaufman, G. Deraffele, J. Mitcham et al. // J. Clin Invest. 2005. - 115: 1903-1912.

124. Kawakami, Y. Interleukin-4 promotes the growth of tumor infiltrating lymphocytes cytotoxic for human autologous melanoma / Y. Kawakami, S.A. Rosenberg, M.T. Ltze // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 168. - P. 2183-2191.

125. Kawakami, Y. Shared human melanoma antigens. Recognition by tumor infiltrating lymphocytes in HLA-A2.I transfected melanomas / Y. Kawakami, R. Zakut, S.L. Topalian, H. Stotter, S.A. Rosenberg // J. Immunol. 1992. - Vol. 148. -P.638-643.

126. Keilholz, U. Immunologic monitoring of cancer vaccine therapy: results of a workshop sponsored by the Society for Biological Therapy / U. Keilholz, J. Weber, J.H. Finke et al. // J. Immunother. 2002. - 25: 97-138.

127. Kershaw, M.H. A phase I study on adoptive immunotherapy using gene-modified T cells for ovarian cancer / M.H. Kershaw, J.A. Westwood, L.L. Parker et al. // Clin Cancer Res. 2006. - 12. - P. 6106-15.

128. Kilikuchi, T. Results of a phase I clinical trial of vaccination of glioma patients with fusions of dendtitic and glioma cells / T. Kilikuchi, Y. Akasaki, M. Irie, S. Homma, T. Abe, T. Ohno // Cancer Immunol. Immunother 2001. - Vol. 50. - P. 337-344.

129. Kirkwood, J.M. High-dose interferon alfa-2b does not diminish antibody response to GM2 vaccination in patients with resected melanoma: results of the

130. Multicenter Eastern Cooperative Oncology Group Phase II Trial E2696 / J.M. Kirkwood, J. Ibrahim, D.H. Lawson, M.B. Atkins, S.S. Agarwala, K. Collins, R. Mascari, D.M. Morrissey, P.B. Chapman // J. Clin. Oncol. 2001. - 19: 1430-1436.

131. Kruijff, S. The current status of S-100B as a biomarker in melanoma / S. Kruijff, H. J. Hoekstra // Eur J Surg Oncol. 2012. - P. 1-5.

132. Lee, P. Effects of interleukin-12 on the immune response to a multipeptide vaccine for resected metastatic melanoma / P. Lee, F. Wang, J. Kuniyoshi et al. // J. Clin. Oncol.-2001.- 19: 3836-3847.

133. Levitt, M.L. Phase I study of gemcitabine given weekly as a short infusion for non-small cell lung cancer: results and possible immune systemrelated mechanisms / M.L. Levitt et al. // Lung. Cancer. 2004. - 43: 335-344.

134. Lienard, D. Ex vivo detectable activation of Melan-A-specific T cells correlating with inflammatory skin reactions in melanoma patients vaccinated with peptides in IFA / D. Lienard, D. Rimoldi, M. Marchand et al. // Cancer Immun. -2004.-4:4.

135. Lindenmann, J. Immunological Aspects of Viral Oncolysis. Recent Results / J. Lindenmann, P.A. Klein // Cancer Res. 1967. - 9. -1.

136. Livingston, P.O. Improved survival in stage III melanoma patients with GM2 antibodies: a randomized trial of adjuvant vaccination with GM2 ganglioside / P.O. Livingston, G.Y.C. Wong, S. Adluri et al. // J. Clin. Oncol. 1994. - Vol. 12. - P. 2012-2069.

137. Lopez M. Advances in cellular immunotherapy for malignant melanoma / M. Lopez, A. Escobar, J. Alfaro, M. Fodor, M. Larrondo, C. Ferrada, F. Salazar-Onfray // Rev Med Chil. 2004. - Sep. - 132(9). - P. 1115-1126.

138. Lou, Y. Dendritic cells strongly boost the antitumor activity of adoptively transferred T cells in vivo / Y. Lou, G. Wang, G. Lizee, G.L. Kim, S.E. Finkelstein, C. Feng, N.P. Restifo, P. Hwu // Cancer Res. 2004. - 64. - P. 6783-6790.

139. Luiten, R.M. Immunogenicity, including vitiligo, and feasibility of vaccination with autologous GM-CSF-transduced tumor cells in metastatic melanoma patients / R.M. Luiten, E.W. Kueter, W. Mooi et al. // J. Clin Oncol. 2005. - 23: 8978-8991.

140. Lutsiak, M.E. Inhibition of CD4(+)25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide / M.E. Lutsiak, R.T. Semnani, R. De Pascalis, S.V. Kashmiri, J. Schlom, H.I. Sabzevari // Blood. 2005.- 105:2862-8.

141. Maecker, H.T. The role of immune monitoring in evaluating cancer immunotherapy / H.T. Maecker // In: Disis ML, eds. Cancer Drug Discovery and Development: Immunotherapy of Cancer.Totowa, NJ: Humana Press. 2005. - P. 5972.

142. Maio, M. Vaccination of stage IV patients with allogeneic IL-4- or IL-2-gene-transduced melanoma cells generates functional antibodies against vaccinating and autologous melanoma cells / M. Maio, E. Fonsatti, E. Lamaj, M. Altomonte, I.

143. Cattarossi, C. Santantonio, C. Melani, F. Belli, F. Arienti, M.P. Colombo, G. Parmiani // Cancer Immunol Immunother. 2002. - Mar. - 51(1): 9-14.

144. Marks, M.S. The melanosome: membrane dynamics in black and white. / M.S. Marks, M.C. Seabra // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. - 2(10). - P. 738-748.

145. Marchand, M. Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-A1 / M. Marchand, N. van Baren, P. Weynants et al. // Int J. Cancer. 1999. -80:219-230.

146. Martenson, E.D. Serum S-lOOb protein as a prognostic marker in malignant cutaneous melanoma / E.D. Martenson, L.O. Hansson, B. Nilsson, E. von Schoultz,

147. E. Mansson Brahme, U. Ringborg, J. Hansson // J. Clin. Oncol. 2001. Feb. - 19(3). -P. 824-31.

148. Mercader, M. Tcell infiltration of the prostate induced by androgen withdrawal in patients with prostate cancer / M. Mercader, B.K. Bodner, M.T. Moser et al. // Proc Natl Acad Sci US A. 2001. - 98: 14565-70.

149. Meyer, R.G. A phase I vaccination study with tyrosinase in patients with stage II melanoma using recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA-hTyr) / R.G. Meyer, C.M. Britten, U. Siepmann et al. // Cancer Immunol Immunother. 2005. -54: 453-467.

150. Mitchell, M.S. Perspective on allogeneic melanoma lysates in active specific immunotherapy / M.S. Mitchell // Semin. Oncol. 1998. - Vol. 25. - P. 623-635.

151. Mitchell, M.S. Phase I trial of large multivalent immunogen derived from melanoma lysates in patients with disseminated melanoma / M.S. Mitchell, J. Kan-Mitchell, P.R. Morrow et al. // Clin Cancer Res. 2004. -10: 76-83.

152. Mocellin, S. The dual role of IL-10 / S. Mocellin, M.C. Panelli, E. Wang, D. Nagorsen, F.M. Marincola // Trends Immunol. 2003. - Vol. 24. - P. 36-43.

153. Moingeon, P. Strategies for designing vaccines eliciting Thl responses in humans/ P. Moingeon // J. Biotechnol. 2002. - 98. - P. 189-98.

154. Morton, D.L. Presented at: 58 Annual Meeting of the Society of Surgical Oncology / D.L. Morton // Atlanta, GA, USA. -2006. 3-6 March.

155. Melief, C.J. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines / C.J. Melief, S.H. van der Burg // Nat. Rev. Cancer. 2008. -May.-8(5)-P. 351-60.

156. Moore, K.W. Interleukin-10 and the Interleukin-10 receptor / K.W. Moore, R.W. Malefyt, R.L. Coffman, A. O'Garra // Annu Rev. Immunol 2001. - Vol. 19. -P. 683-765.

157. Nawrocki, S. Genetically modified tumor vaccines where we are today / S. Nawrocki, A. Mackiewicz // Cancer Treat. Rev. - 1999. - Vol. 25, № 1. - P. 29-46.

158. Nembrini, C. Strong TCR signaling, TLR ligands, and cytokine redundancies ensure robust development of type 1 effector T cells / C. Nembrini, B. Abel, M. Kopf, B.J. Marsland // J. Immunol. 2006. - 176. - P. 7180-88.

159. Nemunaitis, J. Comparison of serum interleukin-10 (IL-10) levels between normal volunteers and patients with advanced melanoma / J. Nemunaitis, T. Fong, P. Shabe, D. Martineau, D. Ando // Cancer Invest 2001. - Vol. 19(3). - P. 239-47.

160. Nencioni, A. Anticancer vaccination strategies / A. Nencioni, F.Grunebach, F.Patrone, P.Brossart // Annals of Oncology. 2004. -15. - P. 153-160.

161. Nevala, W.K. Evidence of systemic Th2 driven chronic inflammation in with metastatic melanoma / W.K. Nevala, C.M. Vachon, A.A. Leontovich, C. G Scott, M.A. Thompson, S.N. Markovic // Clin. Cancer Res. 2009. - 15(6). - P. 19311939.

162. Nestle, F.O. Vaccination of melanoma patients with peptide or tumor lysate-pulsed dendritic cells / F.O. Nestle, S. Alijagic, M. Gilliet, Y.Sun, S. Grabbe, R. Dummer, G. Burg, D. Schadendorf// Nat. Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 328-332.

163. Nishimura, T. The critical role of Thl-dominant immunity in tumor immunology / T. Nishimura, M. Nakui, M. Sato, K. Iwakabe, H. Kitamura, M. Sekimoto // Cancer Chemother Pharmacol. 2000. - 46 (Suppl.). - P. S52-S61.

164. Ohm, J. VEGF as a mediator of tumor-associated immunodeficiency / J. Ohm, D. Carbone // Immunol. Res. 2001. - Vol. 23. - P. 263-272.

165. Old, L.J. Cancer immunology: the search for specificity / L.J. Old, G. H. A. Clowes // Menorial lecture. Cancer Res. 1981. - 41: 361-375.

166. Old, LJ. Cancer/testis (CT) antigens a new link between gametogenesis and cancer / L.J. Old // Cancer Immun. - 2001. - 1. - P. 1-7.

167. Osanto, S. Vaccination of melanoma patients with an allogeneic, genetically modified interleukin 2-producing melanoma cell line / S. Osanto, P.P. Schiphorst, N.I. Weijl et al. // Hum Gene Ther. 2000. - 11: 739-750.

168. Ostrand-Rosrnberg S. Cell-based vaccines for the stimulation of immunity to metastatic cancer / S. Ostrand-Rosrnberg, B.A. Pulaski, V. K. Clements, L. Qi, M.R. Pipeling, L.A. Hanyok // Immunological reviews. 1999. - Vol. 170. - P. 101-14.

169. Palucka, A.K. Single injection of CD34+ progenitor-derived dendritic cell vaccine can lead to induction of T-cell immunity in patients with stage IV melanoma / A.K. Palucka, M.V. Dhodapkar, S. Paczesny et al. // J. Immunother 2003. -26. -P. 432-39.

170. Pardoll, D.M. Cancer vaccines / D.M. Pardoll // Nat. Med. 1998. - Vol. 4. -P.525-531.

171. Petricciani, J. An overview of animal cell substrates for biologicalproducts / J. Petricciani, R. Sheets // Biologicals. 2008. - 36: 359-62.

172. Perales, M.A. Strategies to overcome immune ignorance and tolerance / M.A. Perales, N.E. Blachere, M.E. Engelhorn, C.R. Ferrone, J.S. Gold, P.D. Gregor, G. Noffz, J.D.Wolchok, A.N. Houghton // Semin Cancer Biol. 2002. - 12. - P. 63-71.

173. Petricciani, J. An overview of animal cell substrates for biological products / J. Petricciani, R. Sheets // Biologicals. 2008. - Vol. 36. - Issue 6. - P. 359-362.

174. Phan, G.Q. Cancer regression and autoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade in patients with metastatic melanoma / G.Q. Phan, J.C. Yang, R.M. Sherry et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. -100:8372-77.

175. Plate, J.M. Effect of gemcitabine on immune cells in subjects with adenocarcinoma of the pancreas / J.M. Plate, A.E. Plate, S. Shott, S. Bograd, J.E. Harris // Cancer Immunol. Immunother. 2005. - 54:915-925.

176. Porgador, A. Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocytes / A. Porgador, E. Gilboa// J. Exp. Med. 1995. - 182: 255-260.

177. Porgador, A. Predominant role for directly transfected dendritic cells in antigen presentation to CD8+ T cells after gene gun immunization / A. Porgador, K.R. Irvine, A. Iwasaki et al. // J. Exp. Med. 1998. - 188: 1075-1082.

178. Ragupathi, G. Induction of antibodies against GD3 ganglioside in melanoma patients by vaccination with GD3-lactone-KLH conjugate plus immunological adjuvant QS-21/ G. Ragupathi, M. Meyers, S. Adluri, et al. // Int J. Cancer. 2000. -85: 659-666.

179. Rasku,M.A. Transient T cell depletion causes regression of melanoma metastases/ Rasku MA, Clem AL, Telang S, et al. // Journal of translational medicine. -2008.-6.-P.12.

180. Redondo, P. Immunologic escape and angiogenesis in human malignant melanoma / P. Redondo, I. Sánchez-Carpintero, A. Bauzá, M. Idoate, T. Solano, M.C. Mihm // Am J. Dermatol, acad. 2003. - Vol. 49 (2). - P. 255-63.

181. Restifo, N. Cancer vaccines / N. Restifo, M. Sznol // Cancer: Principles @xL

182. Practice of Oncology, 5 ed. Eds. V. DeVita, S. Helmann, S. Rosenberg. -Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. 1997. - Chapter 61. - P. 3023-3043.

183. Reynolds, S.R. Vaccine-induced CD8+ T-cell responses to MAGE-3 correlate with clinical outcome in patients with melanoma / S.R. Reynolds, A. Zeleniuch-Jacquotte, R.L. Shapiro et al. // Clin. Cancer Res. 2003. - 9: 657-662.

184. Ribas, A. Antitumor activity in melanoma and anti-self responses in a phase I trial with the anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 monoclonal antibody

185. CP-675,206 / A. Ribas, L.H. Camacho, G. Lopez-Berestein et al. // J. Clin. Oncol. -2005.-23.-P. 8968-77.

186. Ridolfi, R.Improved overall survival in dendritic cellvaccination-induced immunoreactive subgroup of advanced melanoma patients/ R. Ridolfi, L. Fiammenghi // J. Transl. Med. 2006. - 4. - P. 36.

187. Ridway, D. The first 1000 dendritic cell vaccines / D. Ridway // Cancer Invest. -2003.-21(6).-P. 873-886.

188. Riker, A.I. Immunotherapy as part of a multidisciplinary approach to melanoma treatment / A.I. Riker, R. Jove, A.I. Daud // Front Biosci. 2006. - 11:114.

189. Ritter, G. Antibody response to immunization with ganglioside GD3 and GD3 congeners (lactones, amide and gangliosidol) in patients with malignant melanoma / G. Ritter, E. Boosfeld, R. Adluri, et al. // Int J. Cancer. 1991. - 48: 379-385.

190. Roberts, J.D. Phase 2 study of the g209-2M melanoma peptide vaccine and low-dose interleukin-2 in advanced melanoma: Cancer and Leukemia Group B 509901/ J.D. Roberts, D. Niedzwiecki, W.E. Carson, et al. // J. Immunother. 2006. -29:95-101.

191. Rosenberg, S.A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy / Rosenberg SA. // Nature. 2001. - 411: 380-384.

192. Rosenberg, S.A. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma / S.A.Rosenberg, J.C. Yang, D.J. Schwartzentruber, et al. // Nat. Med. 1998. - 4: 321-327.

193. Rosenberg, S.A. Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gplOO melanoma antigens / S.A. Rosenberg, Y Zhai., J.C. Yang, et al. // J. Natl. Cancer Inst. 1998. - 90: 1894-1900.

194. Rosenberg, S.A. Tumor progression can occur despite the induction of very high levels of self/tumor antigen-specific CD8+ T cells in patients with melanoma / S.A. Rosenberg, R.M. Sherry, K.E. Morton et al. // J. Immunol. 2005. -175. -P.6169-76.

195. Rosenberg, S.A. Inability to immunize patients with metastatic melanomausing plasmid DNA encoding the gplOO melanoma-melanocyte antigen / S.A.Rosen-berg, J.C. Yang, R.M. Sherry et al. // Hum Gene Ther. 2003. - 14: 709-714.

196. Rosenberg, S.A. Cancer: Principles and Practice of Oncology: / Ed. V. T. Devita, Hellman, S.A. Rosenberg. // Philadelphia: Lippincott-Raven 1997. - 5th ed. -P. 349-379.

197. Sakaguchi, S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25 CD4 regulatory T-cells in immunological tolerance to self and non-self/ S. Sakaguchi // Nat. Immunology. 2005. - Vol. 6. - P. 345-352.

198. Sato, Y. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization / Y. Sato, M. Roman, H. Tighe, D. Lee, M. Corr, M.D. Nguyen, G.L. Silverman, M. Lotz, D.A. Carson, E. Raz // Science. 1996. -273. - P.352-354.

199. Saunier, E. TGF beta inhibition for cancer therapy/ E. Saunier, R. Akhurst // Curr Cancer Drug Targets. 2006 - Nov. - 6(7) - P. 565-78.

200. Shaffer, L.G. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature / L.G. Shaffer, N. Tommerup, S. Karger // Basel. 2005. -P. 130.

201. Schaider, H. Circulating adhesion molecules as prognostic factors for cutaneous melanoma/ H. Schaider, I. Rech-Weichselbraun, E. Richtig, H. Seidl, H.P. Soyer, J. Smolle, H. Kerl // J. Am Acad Derm. 1997. - Vol. 36. - P. 209-213.

202. Schlom, J. Cancer Vaccines: moving Beyond Current Paradigms / J. Schlom, M. Arlen Philip, L. Gulley James // Clin. Cancer Res. 2007. -13(13) - July 1.

203. Segal, B.M. Cutting edge: IL-10-producing CD4+ T cells mediate tumor rejection / B.M. Segal, D.D. Glass, E.M. Shevach // J. Immunol 2002. - Vol. 168. P. 1-4.

204. Shaffer, L.G. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature / L.G. Shaffer, N. Tommerup (eds) S. Karger // Basel. - 2005. - P. 130.

205. Shaprio, J. Analysis of one the rare melanoma patients with a spontaneous CTL response to a MAGE-A3 peptide presented by HLA-A1 / J. Shaprio, T. Hanagiri, N. Baren, B. Neyns // Cancer Immunol Immunother. 2006. - Vol 55(2). -P. 178-184.

206. Sheu, B. Predominant Th2/Tc2 polarity of tumor-infiltrating lymphocytes in human cervical cancer / B. Sheu, R. Lin, H. Li H.N. Ho, S. M. Hsu, S. C. Huangen // Immunol. 2001. - Vol. 167. - P. 2972-2978.

207. Schroder, K. Interferongamma: An overview of signals, mechanisms and functions / K. Schroder, P.J. Hertzog, T. Ravasi, D.A. Hume // J. Leukoc Biol. -2004.-75.-P. 163-89.

208. Slingluff, C.L. Immunotherapy for malignant melanoma with a tumor cell vaccine / C.L. Slingluff, H.F. Seigler // Ann Plast Surg. 1992. - 28: 104-107.

209. Slingluff, C.L. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells / C.L.

210. Slingluff, G.R. Petroni, G.V. Yamshchikov et al. // J. Clin. Oncol. 2003. -21: 4016-4026.

211. Steinman, R.M. Dendritic cells in the T-cell areas of lymphoid organs / R.M. Steinman, M. Pack, K. Inaba // Immunol. Rev. 1997. - Vol. 156. - P. 25-37.

212. Steinman, R.M. Dendritic cells in vivo: a key target for a new vaccine science / R.M. Steinman // Immunity. 2008. - 29 - P. 319-324.

213. Steinman, R.M. The dendritic cell and its role in immunogenicity system / R.M. Steinman // Annual Review Immunology -. 1991. 9:271-96.

214. Stevenson, F.K. DNA vaccines against cancer: From genes to therapy // Annals of oncology. -1999. -V.10. P. 1413-1418.

215. Tagawa, S.T. Phase I study of intranodal delivery of a plasmid DNA vaccine for patients with stage IV melanoma/ S.T. Tagawa, P. Lee, J. Snively, et al. // Cancer. -2003.-98: 144-154.

216. Tao, M.H. Idiotype/granulocyte-macrophage colonystimulating factor fusion protein as a vaccine for B-cell-lymphoma / M.H. Tao, R. Levy // Nature. -1993. -362.-P. 755-758.

217. Thompson, R.H. Anti-cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-) immunotherapy for the treatment of prostate cancer / R.H. Thompson, J.P. Allison, E.D. Kwon // Urol. Oncol. 2006. - 24. - P. 442-447.

218. Toi, M. Clinical significance of the determination of angiogenic factors / M. Toi, T. Taniguchi, Y. Yamamoto, T. Kurisaki, H. Suzuki, T. Tominaga // Eur. J. Cancer 1996.-Vol. 32A.-P. 2513-2519.

219. Tsuchida, K. Inhibitors of the TGF-beta superfamily and their clinical applications / K. Tsuchida, Y. Sunada, S. Noji, T. Murakami, A.Uezumi, M. Nakatani //Mini Re. Med. Chem. 2006. - Vol. 6.-P. 1255-1261.

220. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity / G. Trinchieri // Nature Rev Immunol 2003. - Vol. 3. - P. 133148.

221. Trinchieri, G. The IL-12 family of heterodimeric cytokines: new players in the regulation of T-cell response / G. Trinchieri, S. Pflans, R. Kastelein // Immunity -2003.-Vol. 19.-P. 641-644.

222. Triozzi, PL. Phase I study of a plasmid DNA vaccine encoding MART-1 in patients with resected melanoma at risk for relapse / P.L. Triozzi, W. Aldrich, K.O.

223. Allen, R.R. Carlisle, A.F. LoBuglio, R.M. Conry // J. Immunother. 2005. - 28. - P. 382-388.

224. Triozzi, P.L. Clinical and immunological effects of a synthetic B-human chronic gonadotropin vaccine / P.L. Triozzi, D. Cochnour, E.W. Martin // Int. J. Oncol. 1994. - 5. - P. 1447-1454.

225. Van den Eynde, B.J. T-cell defined tumor antigens / B.J. Van den Eynde, P. van der Brüggen // Curr Opin Immunol. 1997. - 9. - P. 684-693.

226. Vaishampayan, U. Active immunotherapy of metastatic melanoma with allogeneic melanoma lysates and interferon alpha / U. Vaishampayan, J. Abrams, D. Darrah, V. Jones, M. Mitchell // Clin. Cancer Res. 2002. - 8. - P. 3696-701.

227. Walker, E.B. Monitoring immune responses in cancer patients receiving tumor vaccines / E.B. Walker, M.L. Disis // Int Rev. Immunol. 2003. - 22(3-4): 283-319.

228. Wang, R.F. Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes / R.F. Wang, E. Appella, Y. Kawakami, X. Kang, S.A. Rosenberg // J. Exp. Med. 1996. - 184: 2207-2216.

229. Wang, R.F. Cloning genes encoding MHC class II-restricted antigens: mutated CDC27 as a tumor antigen / R.F. Wang, X. Wang, A.C. Atwood, S.L. Topalian, S.A. Rosenberg//Science. 1999.-284: 1351-1354.

230. Wang, F. Phase I trial of a MART-1 peptide vaccine with incomplete Freund's adjuvant for resected high-risk melanoma / F. Wang, E. Bade, C. Kuniyoshi, L.Spears, G. Jeffery, V. Marty, S. Groshen, J. Weber // Clin. Cancer Res. 1999. - 5: 2756-2765.

231. Wang, R.F. Identification of a novel major histocompatibility complex class II-restricted tumor antigen resulting from a chromosomal rearrangement recognized by

232. CD4(+) T cells / R.F. Wang, X. Wang, S.A. Rosenberg // J. Exp. Med. 1999. -189(10).-P. 1659-1668.

233. Weber, J. Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor added to a multipeptide vaccine for resected Stage II melanoma / J. Weber, V.K. Sondak, R. Scotland et al. // Cancer. 2003. -97. - P. 186-200.

234. Wellbrock, C.V599EB-RAF is an oncogene in melanocytes / C. Wellbrock, L. Ogilvie, D. Hedley, M. Karasarides, J. Martin, D. Niculescu-Duvaz, C.J. Springer, R. Marais // Cancer Res. 2004. - Vol. 64. - P. 2338-42.

235. Yasasever, V. Serum levels of the soluble adhesion molecules in patients with malignant melanoma / V. Yasasever, F. Tas, D. Duranyildiz, H. Camlica, S. Kurul, N. Dalay // Pathol. Oncol. Res. 2000. - Vol. 6. - P. 42-45.

236. Yurkovetsky, Z.R. Multiplex Analysis of Serum Cytokines in Melanoma Patients Treated with Interferon-a2b / Z.R. Yurkovetsky, J.M. Kirkwood, H.D.

237. Edington, A.M. Marrangoni, L. Velikokhatnaya, M.T. Winans, E. Gorelik, A.E. Lokshin // Clin. Cancer Res. 2007. - April. 15. - Vol. 13 (8). - P. 2422-2428.