Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Дурденко, Екатерина Владимировна

• Дурденко, Екатерина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дурденко, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ С БЕЛКАМИ.

1.1 УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКОВ С

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМ И.

1.1.1 Конфигурация электростатического поля на поверхности белков и формирование надмолекулярных комплексов.

1.1.2 Зависимость константы связывания полиэлектролитов с белками от ионной силы.

1.1.3 Влияние ионов 1 Ъфмеистера па стабильность белков в комплексах с полиэлектролитами.

1.1.4 Аниои-связываюиц/е центры на белках и влияние некоторых анионов на стабильность белков.

1.1.5 Роль гидрофобных взаимодействш7 в образовании полиэлектролит-белковых комплексов.

Глава 2. ВЛИЯНИЕ СВОБОДНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ

КОМПЛЕКСА.

Глава 3. ЗАРЯЖЕННЫЕ КОЛЛОИДНЫЕ ЧАСТИЦЫ В

БИОМЕДИЦИНЕ.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ЗАРЯЖЕННЫХ КОЛЛОИДНЫХ ЧАСТИЦ НА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ОБЪЕКТЫ.

1.1 Белки и ферменты.

1.1.1 Лактатдегидрогеназа.

1.1.2 Уреаза.

1.1.3 Гемоглобин.

1.2 Индольные производные.

1.3 Полиэлектролиты.

1.4 Неорганические соли и компоненты.

2. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ.

2.1 Определение активности ферментов.

2.1.1 Активуюсть лактатдегидрогеназы.

2.1.2 Активность уреазы.

2.1.3 Функциональную активность гемоглобина.

2.2 Спектрофотометрические исследования.

2.3 Флуориметрические исследования.

2.4 Круговой дихроизм.

2.5 Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

2.6 Измерение скорости тепловой денатурации лактатдегидрогеназы.

2.7 Получение микросферолитов СаСО,.

2.8 Формирование полиэлектролитных микрокапсул на микросферолитах СаСО,.

2.9 Формирование фосфолипидых везикул.

2.10 Инкубация белков с микрокапсулами и полиэлектролитами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ.

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА.

5.1 Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию производных индола - аналогов триптофановых остатков в белке.

5.2 Влияние полиэлектролитов на флуоресценцию триптофановых остатков в белках.

5.2.1 . 1актатдегидрогеназа.

5.2.2 Уреаза.

5.2.3Гемоглобин.

5.3 Особая роль ионов фосфата в стабилизации белка от разрушающего действия полиэлектролита.

5.3.1 Влияние ионов фосфата на ферментативную активность

Л/Ц'в комплексе с ПСС.

5.3.2 Влияние ионов фосфата на флуорссыентные свойства комплекса /1/Ц -ПСС.

5.4 Влияние ионов фосфата на стабильность лактатдегидрогеназы при тепловой денатурации.

5.5 Влияние аниона сульфата на структурно-функциональные особенности комплекса белка с полиэлектролитом.

5.5.1 Ферментативная активность ЛДГ в комплексе с ПС'С.

5.5.2 Динамика структурных изменении Л/Ц' при образовании комплекса с ПСС.

5.6 Взаимодействие белков с заряженными коллоидными частицами.

5.6.1 Полиэлектролитные .микрокапсулы.

5.6.2 Фосфолипидные везикулы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные особенности белков в комплексах с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами»

Белки в природе, как правило, функционируют в составе тех или иных надмолекулярных ансамблей, которые являются основой молекулярной организации биологических систем. Надмолекулярные структуры играют важную роль во многих биохимических процессах (фолдинг белков, транспорт, биосинтез). Регуляция каталитической активности и стабильности ферментов in vivo часто осуществляется именно посредством образования надмолекулярных ансамблей, включающих вещества различной природы, в частности, полиэлектролиты (ПЭ).

Изучение свойств полиэлектролит-белковых комплексов (ПБК) служит для понимания функциональной роли эндогенных полиэлектролитов в разных метаболических процессах. ПБК, содержащие синтетические ПЭ, исследуются в качестве модельных систем для изучения взаимодействия белков с клеточными стенками, мембранами, с внутриклеточными ДНК и РНК, а также в системе антиген-антитело. В ряде случаев, исследование ПБК помогает понять механизм катализа, особенно сложный для отдельных ферментов. Преимущества такого моделирования заключаются в том, что оно позволяет исследовать физико-химические свойства комплекса в зависимости от длины цепи ПЭ, знака и плотности зарядов на ПЭ и состава среды. Кроме того, такие системы удобны для исследования, поскольку в определенных условиях допускают применение оптических методов.

Сродство ферментов к полизаряженным компонентам клетки независимо от их агрегатного состояния зависит от присутствия дву- и однозаряженных ионов, находящихся в составе любого компартмента живой клетки. И хотя ионы дву- и однозаряженных солей могут влиять как на сродство ферментов к полиэлектролитам и величину энергии активации катализа, так и на собственную конформацию ПЭ и соответственно на его персистентную длину, однако такие исследования практически отсутствуют (особенно это касается влияния двузаряженных анионов). Это связано с тем, что в настоящее время разработана теория только для полимерных цепей в растворе, в то время как для ПБК описание их поведения находится только на уровне полу эмпирических закономерностей. Настоящая работа посвящена изучению влияния солевого состава среды на динамику образования и функциональные особенности ферментов в комплексе с ПЭ. Изучение динамики образования таких комплексов может позволить решать задачи, направленные на управление биологическими процессами в живых организмах.

При изучении взаимодействия белков как с синтетическими, так и с эндогенными ПЭ обнаружены значительные изменения ферментативной активности, а в ряде случаев наблюдали изменения и структурных характеристик белков после связывания их с ПЭ. Разрушающее действие отдельных ПЭ на белки особенно важно учитывать при использовании коллоидных частиц в биологических жидкостях при разработке микро контейнеров для адресной доставки различных лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для этой цели разработаны технологии получения полиэлектролитных микрокапсул с последовательным наслоением ПЭ на твердое ядро с включенным в него биологически активным веществом. Применение таких микрокапсул с заряженной полиэлектролитной оболочкой, а также коллоидных частиц различных видов, в частности фосфолипидных везикул, в качестве средства транспортировки лекарств требует тщательной проверки их влияния на функциональные свойства белков, содержащихся в биологических жидкостях. И если изучение ферментов, инкапсулированных в такие микроконтейнеры широко ведется, то исследование состояния белков в суспензии с заряженными коллоидными частицами практически отсутствуют. В настоящей работе было исследовано влияние разных типов заряженных коллоидных частиц на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

Цель работы:

Изучить структурно-функциональные особенности белков в комплексе с полиэлектролитами и полиэлектролитными микрокапсулами и влияние биологически значимых ионов на состояние комплекса.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние полиэлектролитов на флуоресцентные свойства производных индола.

2. Определить кинетические характеристики изменения флуоресценции белков - лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина, при образовании комплекса с полиэлектролитом и сопоставить их с параметрами доступности остатков триптофана полиэлектролиту.

3. Исследовать влияние различных ионных форм фосфата на устойчивость лактатдегидрогеназы к тепловой денатурации и к разрушающему действию полиэлектролита.

4. Изучить влияние ионов сульфата на динамику разрушения лактатдегидрогеназы полиэлектролитом, измеренное различными методами, дающими представление о разрушении разных элементов структуры белка.

5. Исследовать влияние двух типов заряженных коллоидных частиц -полиэлектролитных микрокапсул и липосом на функциональные и структурные характеристики белков в суспензии этих частиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Дурденко, Екатерина Владимировна

выводы

1. Флуоресценция производных индола - М-ацетила-Тгр-амида и Ь-Тгр тушится полианионом полистиролсульфонатом с разной эффективностью: константы Штерна-Фолмера /\\=10-10 и /\2=3-10 на Моль" мономеров ПСС соответственно, и не меняется в присутствии поликатиона полиалилламина.

2. Динамика изменения флуоресценции белков лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина при образовании комплекса с полиэлектролитом обнаруживает несколько классов триптофановых остатков, идентифицированных по доступности их полиэлектролиту, скорость тушения которых зависит от вида иона.

3. Из двух форм фосфата в нейтральной области рН только двузаряженная форма защищает лактатдегидрогеназу от разрушающего действия полиэлектролита и при тепловой денатурации, взаимодействуя с «кислой» конформацией белка в межсубъединичном анион-связывающем центре.

4. В зависимости от концентрации ионов сульфата можно выделить, по крайне мере, три состояния лактатдегидрогеназы в комплексе с полистиролсульфонатом: 1) необратимо разрушенный (0 - 40 мМ), 2) нативный (-400 мМ), и 3) с компактной структурой, но с заторможенной «активной» петлей (> 1,5 М). Было показано, что наиболее быстро изменяется ферментативная активность, затем происходит тушение флуоресценции белка, и наиболее медленный процесс - разрушение а-спиральной структуры.

5. Полиэлектролитные микрокапсулы с заряженной оболочкой, будучи ресуспендированы в растворы белков (лактатдегидрогеназы, уреазы и гемоглобина), сорбируют их на своей поверхности, но не изменяют ни структуру, ни функцию белков, в отличие от фосфолипидных униламеллярных везикул, которые разрушают в основном третичную структуру.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в работе данные показывают, что стабильность белков при разрушении их полиэлектролитами зависит не только от полного заряда белка, изоэлектрической точки или распределения электростатического потенциала на поверхности белка, а также в большой степени зависит от особого расположения анион-связывающих центров в белке. Из результатов наших экспериментов, представленных в этой работе, следует, что предпочтительная стабилизация ионом фосфата лактатдегидрогеназы (по сравнению с сульфатом) при разрушающем действии полиэлектролита может иметь регуляторное значение для клетки. Это видно, во-первых, из того, что максимум стабильности белка при связывании аниона приходится на относительно узкую область pH, входящую в физиологический диапазон значений pH (рис. 24а). Во-вторых, концентрации фосфата, которые снимают ингибирующее действие полиэлектролита (рис. 206) и снижают скорость структурных разрушений белка (рис. 21 г, 24а), находятся в пределах среднеклеточной его концентрации ~ 50 мМ. Этот факт особенно важен для процесса сорбции ферментов на заряженных поверхностях, включая мембраны, при взаимодействии их с полифункциональными белковыми комплексами, в том числе с эндогенными полиэлектролитами.

Среди эндогенных полиэлектрлитов особенно существенную роль в клеточном метаболизме играет полифосфат. Образование полифосфорной кислоты и ее катаболизм являются внутриклеточными процессами и присущи всем организмам, независимо от их происхождения - животным [Mino Т. et а!., 1998], растительным [Bental М. et al, 1990, 1991] и бактериальным [Mino Т. et al., 1998]. Большинство стрессовых воздействий, будь то осмотический шок, изменение освещенности для растительных клеток или щелочной стресс, сопровождаются в живой клетке переходом полифосфорной кислоты в ортофосфат, и, наоборот, и в ряде случаев являются пусковым механизмом для переключения некоторых метаболических путей, например, на синтез осмолитов или выравнивание внутриклеточного рН [8игека К. ег а1., 2007; МапГгеёо Т а1., 2010; Ел Т.Н. е1 а1., 2011]. Поэтому обнаруженная в настоящей работе стабилизация белков ионом ортофосфата является еще одной степенью свободы для регуляции процессов, связанных с ответом клетки на стресс.

Вопрос о том, какой фосфат - одно- или двузаряженный ион участвует в реакции, ранее авторами обычно не рассматривался. Как правило применяли фосфатный буфер рН 7 без какой-либо детализации, хотя в нейтральной области рН, ионы фосфата существуют в биологических жидкостях в двух ионизованных формах Н2РО"4 и НРО^2, как мы обсуждали выше. Тот факт, что именно двузаряженная форма фосфата связывается в анион-связывающем центре и влияет на стабильность белка, как показано в настоящей работе, важен не только с теоретической точки зрения, но и как возможность целенаправленного изменения стабилизирующего эффекта путём вариации рН.

Что касается ионов сульфата, то для нас важно было узнать, разрушается ли структура белка в присутствии ПСС при высокой концентрации соли, т.е. около 1,5 М, поскольку ферментативная активность в этом диапазоне концентраций вновь падает до нуля. Результат оказался несколько неожиданным: с повышением концентрации соли больше 1 М белок сохраняет компактную структуру и практически полностью сохраняет а-спиральную структуру. Мы полагаем, что при высокой концентрации сульфата разрушение белка не происходит, потому что гидрофобные взаимодействия усиливаются внутри белка более, чем между белком и полиэлектролитом. При этом заряды на белке и ПСС экранированы противоионами соли. Это позволяет ферменту в комплексе с ПСС сохранить целостность структуры, хотя при этом «активная петля», участвующая в катализе, тормозится полиэлектролитом и активность фермента падает.

Сравнение двух типов заряженных коллоидных частиц -полиэлектролитных микрокапсул и фосфолипидных везикул - по их способности инактивировать белки, находящиеся в растворе, показало существенные различия между этими частицами. Если ПЭ, находящийся в растворе, полностью инактивирует фермент, то тот же ПЭ, связанный на поверхности ПМК, является нейтральным по отношению к растворенному белку. Это мы видим из приведенных в работе данных по активности трех белков - уреазы, ЛДГ и Hb (рис. 29). Что же касается ФЛВ, то добавление их в раствор белка приводит к полной потере его функциональных свойств (рис. 32а) и более того, разрушает пространственную структуру белка (рис. 33).

Изменения конформации белков при связывании с биологическими мембранами могут быть не столь «опасны» для малых белков, которые, как правило, обратимо денатурируют. К ним относятся такие белки, как миоглобин, а-химотрипсин, лизоцим и т.д. [Khechinashvili N.N. et aL, 2008]. Однако мультисубъединичные белки денатурируют чаще всего необратимо, и изменения конформации при связывании их на поверхности заряженных частиц могут привести к необратимой потере функции белка. В этом случае для сохранения функции белка необходимо либо изменение ионной силы, либо комплексообразование с лигандами, стабилизирующими его структуру.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дурденко, Екатерина Владимировна, 2012 год

1. Балобанов В.А., Ильина Н.Б., Катина Н.С., Кашпаров И.А., Долгих Д.А., Бычкова В.Е. Кинетика взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидной мембраной И Молекулярная биология. 2010. 44 (4). С. 708-717.

2. Басова J1.B., Тиктопуло Е.И., Бычкова В.Е. Влияние модельных мембран на структуру хологлобина• конформационные изменения при pH 6.2 // Молекулярная биология. 2005. 391.. С. 105-1 12.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. 1990. 704 с.

4. Вакуров A.B. Нековалентные фермент-полиэлектролитные комплексы в водно-органических смесях /7 Дисс канд. хим. наук. М.: МГУ им.М.В. Ломоносова. 1998. с. 84.

5. Григорьев П.А., Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А. Изучение взаимодействия миоглобина с липидными бислойными мембранами потенциодннамическим методом /7 Биофизика. 2012. 57 (1). С 68-74

6. Геннис Р. Киомембраны молекулярная структура и функции. М. Мир. 1997. 624 с.

7. Дыбовская Ю.Н. Применение расчетов электростатического поля белков для анализа взаимодействия полиэлектролитов с белками // Диссертация канд ф.-м наук. Пущино. ИТЭБ РАН. 2009. 106 с.

8. Кулаев И.С. Вагабов В. М. и Кулаковская Т. В. Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. M " Научный мир, 2005. 216 с.

9. Ларионова Н.И., Унксова И.П., Миронов В.А., Сахаров И.Ю., Казанская Н.Ф., Березин И.В. Исследование комплексообразования растворимых карбоксиметиловых эфиров полисахаридов с белками //ВМС А. 1981. 23 (8). с. 1823-1829.

10. Мусил Я., Новакова О , Кунц К. Современная биохимия в схемах. М.: Мир, 1984. 215 с.

11. Мустафаев М.И. Комплексы неприродных полнэлектролитов с белками /7 Диссертация докт. хим. наук, М.: МГУ им.М.В. Ломоносова. 1981. 344 с.

12. Постникова Г.Б. и Целикова C.B. Миоглобин и митохондрии• изучение кинетики отгцелпеиия кислорода от оксимиоглобипа в суспензии митохондрий И Биофизика. 2005. 502.. С. 297-306.

13. Постникова Г.Б. Целикова C.B. и Шеховцова Е.А. Миоглобин и митохондршг оксимиоглобин в процессе дезоксигеиации взаимодействует с митохоидриальной мембраной // Биохимия. 2009. 74 (11). С 1488-1497.

14. Сабурова Е.А, Бобрешова М.Е., Елфимова Л.И., Сухоруков Б И. Ингибиторный действие полиэлектролитов на олигомерный фермент /7 Биохимия. 2000. 65 (8). С. 11511161.

15. Сабурова Е.А., Ягодина Л.О. Кинетические исследования субстратного ингибирования лактатдегадрогеназы анионами и pH/7 Биохимия. 1990. 55. С 1819-1825.

16. Самсонов В.Г. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активные вещества // ВМС A. J 979. 21 (4). с. 725-733.

17. Сивожелезов B.C. Электростатические поля вокруг биологических макромолекул как факторы молекулярного узнавания // Диссертация докт. ф.-м. наук. Пущино. ИБК РАН. 2010. 186 с.

18. Тихоненко С. А., Сабурова Е.А., Дурденко Е.Н., Сухорукое Б.И. Фермент-полиэлектролитный комплекс. Влияние солеи на взаимодействие уреазы с полиаллиламином И Журнал физической химии. 2009. 83 (10). С. 1-9.

19. Abad-Zapatero С., Griffith J.P., Sussman J.L., and Rossman M.J. Refined crystal structure of dogfish M4 a po-lactate dehydrogenase /7 J. Mol. Biol. 1987. 198. p. 445-467.

20. Amstad E., Reimhult E. Nanoparticle actuated hollow drug delivery vehicles H Nanoraedicine (Lond). 2012. 7 (1). p. 145-164.

21. Anbazhagan V. Qu J., Kleinschmidt J.H. Marsh D. Incorporation of outer membrane protein OmpG in lipid membranes: protein-Iipid interactions and beta-barrel orientation // Biochemistry. 2008. 47 (23). p. 6189-61998.

22. Antonov M., Mazzawi M., Dubin P.L. Entering and exiting the protein-polyelectrolyte coacen'ate phase via nonmonotonic salt dependence of critical conditions // Bio macro molecules. 2010. 11 (1). p. 51-59.

23. Antosiewicz J.M., Shugar D. Poisson-Boltzmann continmun-sohation models: applications to pH-dependent properties ofbiomolecules Ii Mol Biosyst. 2011. 7 (11). p. 2923-2949.

24. Atanasov В., Mustafi D., Makinen M.W. Protonation of the b-lactam nitrogen is the trigger event in the catalytic action of class A b-lactamases ¡i Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97. p. 3160-3165.

25. Bágel'ová J., Antalík M., Bona M. Studies on cytochrome c-heparin interactions by differential scanning calorimetry //Biochem 1994. 297 (1). p. 99-101.

26. Baldwin R.L. How Hofmeister ion interactions affect protein stability il Biophys. O. 1996. 71. p. 2056-2063.

27. Baldwin R.L. Desolvation penalty for burying hydrogen-bonded peptide groups in protein folding 1П Phys Chem B. 2010. 114 (49). p. 16223-16227.

28. Bashford D., Karplus M. Multiple-site titration curves of proteins an analysis of exact and approximate methods for their calculation // J. Phys. Chem. 1991. 95. p. 9556-9561.

29. Bashford D., Karplus M. pKa's of ionizable groups in proteins: atomic detail from a continuum electrostatic model H Biochem. 1990. 29 (44). p. 10219-10225.

30. Beckera A.L., Henzlera K., Welscha N., Ballauffa M., Borisov O. Proteins and polyelectroiytes: A charged relationship H Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2012. 17 (2). p. 90-96.

31. Bental M., Pick U., Avron M., and Degani H. Polyphosphate metabolism in the alga Dunaliella salina studied by 31P-NMR //Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1092. p. 21-28.

32. Bental M., Pick U., Avron M., and Degani H. Metabolic studies with NMR spectroscopy of the alga Dunaliella salina trapped in agarose beads //Eur. J. Biochem. 1990. 188. p. 117-122.

33. Berth G., Voigt A. Dautzenberg H., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate !! Biomacromolecules. 2002. 3 (3). p. 579590.

34. Boeris V., Romanini D., Farruggia B., Pico G. Interaction and complex fonvation between catalase and cationicpolyelectroiytes: chitosan and Eudragit E100!! Int J Biol Macromol. 2009. 45 (2). p. 103-108.

35. Bonincontro A., Spigone E., Ruiz Pena M., Letizia C., La Mesa C. Lysozyme binding onto cat-anionic vesicles // J Colloid Interface Sci. 2006. 304 (2). p. 342-7.

36. Bronsted J.N. Molecular magnitude and phase distribution /7 I. Z. Phys. Chem. Bodenstein Festband. 1931. p. 257-266.

37. Carlsson F., Malmsten M., Linse P. Monte Carlo simulations of lysozyme self-association in aqueous solution H J. Phys. Chem. B. 2001. 105. p. 12189-12195.

38. Chen F., Madler S., Weidmann S., Zenobi R. MALDI-MS detection of noncovalent interactions of single stranded DNA with Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein IIJ Mass Spectrom. 2012. 47 (5). p. 560-566.

39. Collins K.D. Why continuum electrostatics theories cannot explain biological structure, polyelectroiytes or ionic strength effects in ion-protein interactions 11 Biophys Chem. 2012. Epub ahead of print.,

40. Cousin F., Gummel J., Clemens D., Grillo I., Boue F. Multiple scale reorganization of electrostatic complexes ofpoly(styrenesulfonaie) and lysozyme H Langmuir. 2010. 26 (10). p. 70787085.

41. Cousin F., Gummel J., Ung D., Boue F. Polyelectrolyte-protein complexes: structure and conformation of each specie revealed by SANS ll Langmuir. 2005. 21 (21). p. 9675-9688.

42. De Cock L.J., De Koker S., De Geest B.G., Grooten J., Vervaet C., Remon J.P., Sukhorukov G.B., Antipina M.N. Polymeric multilayer capsules in drug delivery // Angew Chem Int Ed Engl. 2010. 49 (39). p. 6954-6973.

43. Di Sabato G., Kaplan N.O. The denaturation of lactic dehydrogenases // J. Biol. Chem. 1965. 240(3). p. 1072-1076.

44. Felix B. Sheinerman and Honig B. On the Role of Electrostatic Interactions in the Design of Protein Protein Interfaces HI. Mol. Biol. 2002. 318. p. 161-177.

45. Fenley A.T., Gordon J.C., Onufriev A. An analytical approach to computing biomolecular electrostatic potential. 1. Derivation and analysis // J Chem Phys. 2008. 129 (7). Published online 075101.

46. Foreman T.M., Khalil M., Meier P., Brainard J.R., Vanderberg L.A., Sauer N.N. Effects of charged water-soluble polymers on the stability and activity of yeast alcohol dehydrogenase and subtilisin .// Biotechnol Bioeng. 2001. 76 (3). p. 241-246.

47. Fowler C.B., Evers D.L., O'Leary T.J., Mason J.T. Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivity // J Histochem Cytochem. 2011. 59 (4). p. 366-381.

48. Fried, M.G., Stickle D.F. Ion-exchange reactions of proteins during DNA binding /7 Eur. J. Biochem. 1993. 218. p. 469-475.

49. Gabdoulkhakov A.G., Timofeev V.I., Mikhailov A.M. Crystal structure of the uridine phosphoiylase from salmonella typhimurium in complex with thymine and phosphate ion at 2.12 A resolution /7 To be published in 2012.

50. Galisteo F., Norde W. Adsorption of lysozyme and a-lactalbumin on poly(styrenesulphonate) latices 1. Adsorption and desorption behaviour /7 Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1995. 4 (6). p. 375-387.

51. Gao J.Y. Dubin P.L. Binding of proteins to copolymers of varying hydrophobicity // Biopolymers. 1999. 49 (2). p. 185-193.

52. Gebauer M. and Skerra A. Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics /7 Current Opinion in Chemical Biology. 2009. 13 (3). p. 245-255.

53. Gong J., Yao P., Duan H., Jiang M., Gu S., Chunyu L. Structural transformation of cytochrome c and apo cytochrome c induced by sulfonated polystyrene H Biomacromolecules. 2003. 4 (5). p. 1293-1300.

54. Gummel J., Boue F., Deme B., Cousin F. Charge stoichiometry inside polyelectrolyte-protein complexes: a direct SANS measurement for the PSSNci-lysozyme system H J Phys Chem B. 2006. 110 (49). p. 24837-24846.

55. Hallberg R.K. and Dubin P.L. Effect of pH on the binding of ft-Lactoglobulin to sodium polystyrenesulfonate H J. Phys. Chem. B. 1998. 102 (43). p. 8629-8633.

56. Halskau 0., Muga A., Martinez A. Unking new paradigms in protein chemistry to reversible membrane-protein interactions /7 Curr Protein Pept Sci. 2009. 10 (4). p. 339-359.

57. Huang H., He P., Hu N. Zeng Y. Electrochemical and electrocatalytic properties of myoglobin and hemoglobin incorporated in carboxymethyl cellulose films // Bioelectrochemistry. 2003. 61(1-2). p. 29-38.

58. Ivinova O.N. Izumrudov V.A., Muronetz V.I., Galaev I.Y., Mattiasson B. Influence of complexing polyanions on the thermostability of basic proteins /7 Macromolecular Bioscience. 2003. 3 (3). p. 210-215.

59. Jarvis N.L. and Scheiman M.A. Surface potentials of aqueous electrolyte solutions //' J. Phys. Chem. 1968. 72. p. 74-78.

60. Jencks W.P. Catalysis in Chemistry and linzymology H Dover, Mineola, NY. 1987. p. 358392.

61. Jing-jing Liu, Yun-feng Yan, Ping Yao. Binding of thermo-sensitive and pH- sensitive butylated poly(allylamine)s with lysozyme // Chinese Journal of Polymer Science. 2011. 29 (4). p. 397-406.

62. Kaibara K., Okazaki T., Bohidar H.B., Dubin P.L. pH-Induced Coacen'ation in Complexes of Bovine Serum Albumin and Cationic Polyelectrolytes //' Biomacromolecules. 2000. 1. p. 100-107.

63. Khan M.K., Rahaman H., Ahmad F. Conformation and thermodynamic stability of pre-molten and molten globule states of mammalian cytochromes-c I! MetalLomics. 2011. 3 (4) p. 327338.

64. Khechinashvili N.N., Volchkov S.A., Kabanov A.V., Barone G. Thermal stability of proteins does not correlate with the energy of intramolecular interactions // Biochim Biophys Acta. 2008. 1784(11). 1830-1834.

65. Kinraide T.B., and Wang P. The surface charge density of plant cell membranes (a): an attempt to resolve conflicting values for intrinsic a H Journal of Experimental Botany. 2010. 61 (9). p. 2507-2518.

66. Lee B. The physical origin of the low solubility ofnonpolar solutes in water // Biopolymers. 1985. 24. p. 813-823.

67. Levitsky D.i., Ponomarev M.A., Geeves M.A. Shnyrov V.L., Manstein D.J. Differential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of the motor domain fragments of Dictvostelium discoideum myosin ////Eur J Biochem. 1998. 251(1-2). p. 275-280.

68. Li T., Hamdi J., Hawthorne F. M. Unilamellar liposomes with enhanced boron content H Bioconjug. Chem. 2006. 17. p. 15-20.

69. Liang B., Tamm L.K. Structure of outer membrane protein G by solution NMR spectroscopy //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. 104. p. 16140-16145.

70. Madan B. and Lee B. Role of hydrogen bonds in hydrophobicity: the free energy of cavity formation in water models with and without hydrogen bonds // Biophys. Chem. 1994. 51. p. 279289.

71. Manfredo J. Seufferheld and Matias J. Curzi Recent discoveries on the roles of polyphosphates in plants /'/Plant Mol Biol Rep. 2010. 28 (4). p. 549-559.

72. Manning G.S. Limiting taws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligativeproperties // J. Chem. Phys. 1969. 51. p. 924-933.

73. Marky N.L. Manning G.S. An interpretation of small-ion effects on the electrostatics of the lambda repressor DNA complex H J. Am. Chem. Soc. 2000. 122. p. 6057-6066.

74. Marsich E., Borgogna M., Donati I. Mozetic P., Strand B.L., Salvador S.G., Vittur F., Paoletti S. Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: a bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation /7 J Biomed Mater Res A. 2008. 84 (2). p. 364-376.

75. Mazoniene E. Joceviciute S., Kazlauske J., Niemeyer B., Liesiene J. Interaction of cellulose-based cationic polyelectrolytes with mucin // Colloids Surf B Bio interfaces. 2011. 83(1). p. 160-164.

76. McDevit W.F. and Long F.A. The activity coefficient of benzene in aqueous salt solutions // J. Am. Chem. Soc. 1952. 74. p. 1773-1777.

77. Mehler E.L. A self-consistent, free energy based approximation to calculate pH dependent electrostatic effects in proteins H J. Phys. Chem. 1996. 100. p. 16006 -16018.

78. Mehler E.L., Eichele E. Electrostatic effects in water accessible regions of proteins // Biochemistry. 1984. 23. p. 3887-3891.

79. Mehler E.L., Fuxreiter M., Simon I., Garcia-Moreno E.B. The role of hydrophobic microenvironments in modulating pKa shifts in proteins // Proteins. 2002. 48 (2). p. 283-292.

80. Mehler E.L., Guarnieri F. A self-consistent, microenvironment modulated screened coulomb potential approximation to calculate pH-dependent electrostatic effects in proteins II Biophysical Journal. 1999. 75. p. 13-22.

81. Merrill G.N., Webb S.P. The Application of the Effective Fragment Potential Method to Molecular Anion Solvation: A Study of Ten Oxyanion- Water Clusters, A-(H20ji-4 // J. Phys. Chem. A. 2004. 108. p. 833-839.

82. Mino T., Van Loosdrecht M.C.M., and Heijnen J.J. Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process // Wat. Res. 1998. 32. p. 3193-3207.

83. Moss J.M., VanDamme M.P., Murphy W.H., Preston B.N. Dependence of salt concentration on glycosaminoglycan-lysozyme interactions in cartilage II Arch. Biochem. Biophys. 1997. 348. p. 49-55.

84. Mutch N.J., Myles T., Leung L.L., Morrissey J.H. Polyphosphate hinds with high affinity to exosite II of thrombin ¡1 J Thromb Haemost. 2010. 8 (3). p. 548-555.

85. Nakamura S., Seki Y., Katoh E , Kidokoro S. Thermodynamic and structural properties of the acid molten globule state of horse cytochrome c 11 Biochemistry. 2011. 50 (15). p. 3116-3126.

86. Olano J., Arriaga D., Busto F., Soler J. Kinetics and thermostability of NADH-isocitrate dehydrogenase from Cephalosporium acremonium 11 Appl. Enviromental Microbiol. 1995. 61. p. 2326-2334.

87. Paddeu S. Fanigliulo A. Lanzin M., Dubrovsky T., Nicolini C. H Sens. Actuators 1995. 25. p. 876-882.

88. Palankar R., Skirtach A.G., Kreft O. Controlled Intracellular Release of Peptides from Microcapsules Enhances Antigen Presentation on MHC Class I H Molecules. Small. 2009. 5 (19). p. 2168-2176.

89. Park S.J., Borin B.N., Martinez-Yamout M.A., Dyson H.J. The client protein p53 adopts a molten globule-like state in the presence of Hsp9011 Nat Struct Mol Biol. 2011. 18 (5). p. 537-41.

90. Permyakov S.E., Pershikova I.V., Zhadan A.P. Conversion of Human a-lactalbumin to an Apo-like State in the Complexes with Basic Poly-Amino Acids: Toward Understanding of the

91. Molecular Mechanism of Antitumor Action of HAMLET // J. Proteom. Research. 2005. 4 (2). p. 564-569

92. Petrov A.I., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B. Protein-calcium carbonate coprecipitation: a tool for protein encapsulation //Biotechnol Prog. 2005. 21 (3). p. 918-925.

93. Pflugrath J.W., Quiocho F.A. Sulphate sequestered in the sulphate-binding protein of Salmonella typhimurium is bound solely by hydrogen bonds // Nature. 1985. 314 (6008). p. 257260.

94. Phillips C., Gover S., Adams M.J. Structure of 6-phosphogluconate dehydrogenase refined at 2 A resolution // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1995. 51 (3). p. 290-304.

95. Polozov R.V. Montrel M., Ivanov V.V., Melnikov Y., Sivozhelezov V.S. Transfer RNAs: electrostatic patterns and an early stage of recognition by synthetases and elongation factor EI'-Tu // Biochemistry. 2006. 45 (14). p. 4481-4490.

96. Pratt L.R. and Pohorille A. Theory of hydrophobic!ty: transient cavities in molecular liquids I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89. p. 2995-2999.

97. Rivera-Gil P., Nazarenus M., Ashraf S., Parak W.J. Intracellular processing of proteins mediated by biodegradable polyelectrolyte capsules H Lett. 2009. 9 (12). p. 4398-402.

98. Romanini D., Braia M., Angarten R.G., Loh W., Pico G. Interaction of lysozyme with negatively charged flexible chain polymers // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007. 857 (1). p. 25-31.

99. Saburova E.A., Dybovskaia Yu.N., Sivezhelezov V.S., Elfamova L.I. The electrostatic contribution to interactions of some engines with polyelectrolytes /7 Biofizika. 2005. 50 (3). p. 423433.

100. Sael L. Kihara D. Detecting local ligand-binding site similarity in nonhomologous proteins by surface patch comparison /7 Proteins. 2012. 80 (4). p. 1177-1195.

101. Saftig P., Schroder B.; Blanz J. Lysosomal membrane proteins: life between acid and neutral conditions /7 Biochem Soc Trans. 2010. 38 (6). p. 1420-1423.

102. Sapay N., Cabannes E., Petitou M., Imberty A. Molecular modeling of the interaction between heparan sulfate and cellular growth factors: bringing pieces together // Glycobiology. 2011. 21 (9). p. 1181-1193.

103. Schellman J.A. A simple model for solvation in mixed solvents. Applications to the stabilization and destabilization of macromolecular structures /7 Biophys Chem. 1990. 37 (1-3). p. 121-40.

104. Schellman J.A. Selective binding and solvent denaturation ii Biopolymers. 1987. 26 (4). p. 549-559.

105. Schreiber G., Keating A.E. Protein binding specificity versus promiscuity H Curr Opin Struct Biol. 2011. 21 (1). p. 50-61.

106. Seyrek E., Dubin P.L., Tribet C, and Gamble E.A. Ionic Strength Dependence of Protein-Polyelectrolyte Interactions //' Biomacromolecules. 2003. 4. p. 273-282.

107. Shalova I.N., Naletova I.N. Saso L., Muronetz V.I., Izumrudov V.A. Interaction of poiyelectroiytes with proteins, 3. Influence of complexing poiycations on the thermoaggregation of oligomeric enzymes // Macromol Biosci. 2007. 7 (7). p. 929-939.

108. Sharp K.A., Nicholls A., Fine R.F. and Honig B. Reconciling the magnitude of the microscopic and macroscopic hydrophobic effects // Science. 1991. 252. p. 106-109.

109. Shen Q.W., Swartz D.R. Influence of salt and pyrophosphate on bovine fast and slow myosin SI dissociation from actin /7 Meat Sci. 2010. 84 (3). p. 364-370.

110. Shenoy D.B., Antipov A. A., Sukhoriikov G.B., Mohwald H. Layer-by-layer engineering of biocompatible, decomposable core-shell structures ii Biomacromolecules. 2003. 4 (2). p. 265-272.

111. Singer P.T., Wu C.W. Kinetics of promoter search by Escherichia coli RNA polymerase. Effects of monovalent and divalent cations and temperature II J. Biol. Chem. 1988. 263. p. 42084214.

112. Sivozhelezov V.S, Nicolini C. Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor H J. Theor. Biol. 2005. 234 (4). p. 479-485.

113. Sivozhelezov V.S, Pechkova E. Nicolini C. Mapping electrostatic potential of a protein on its hydrophobic surface: implications for crystallization of Cytochrome P450scc !i J. Theor. Biol. 2006. 241 (1). p. 73-80.

114. Skirtach A.G., Dejugnat C.; Braun D. Susha A.S., Rogach A.L., Sukhorukov G.B. Nanoparticles distribution control by polymers: Aggregates versus nonaggregates /7 Journal of Physical Chemistry C. 2007. 111 (2). p. 555-564.

115. Skirtach, A.G., Munoz J.A., Kreft O. Lctser-induced release of encapsulated materials inside living cells // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. 45 (28). p. 4612-7.

116. Spassov V.Z., Atanasov B P. Spatial optimization of electrostatic interactions between the ionized groups in globular proteins i! Proteins.P. Struct. Function & Gen. 1994. 19 (3). p. 222-229.

117. Spassov V.Z., Karshikov A.D., Atanasov B.P. Electrostatic interactions in proteins: theoretical analysis oflysozyme ionization // Biochim. Biophys. Acta. 1989. 999. p. 1-6.

118. St-Jean ML, Sygusch J. Slereospecific proton transfer by a mobile catalyst in mammalian fructose- 1,6-bisphosphate aldolase // J Biol Chera. 2007. 282 (42). p. 31028-31037.

119. Stephen J.L., Donald J.W. Fffects of phosphate on the dissociation and enzymic stability of rabbit muscle lactate dehydrogenase /7 Biochemistry. 1974. 13 (17). p. 3527- 3531.

120. Sukhorukov G.B., Rogach A.L., Garstka M. Multifunctionalized polymer microcapsules: novel tools for biological and pharmacological applications //Small. 2007. 3 (6). p. 944-955.

121. Sundelacruz S., Levin M., Kaplan D.L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation ii Stem Cell Rev and Rep. 2009. 5. p. 231-246.

122. Sureka K., Dev S., Datta P., Singh A.K., Dasgupta A., Rodrigue S. Basil J. Kundu M. Polyphosphate kinase is involved in stress-induced mprAB-sigE-rel signalling in mycobacteria //' Mol Microbiol. 2007. 65 (2). p. 261-276.

123. Tang E., Tommaso D.D. and de Leeuw N.H. Hydrogen transfer and hydration properties of H„PO/~" (n-0-3) in water studied by first principles molecular dynamics simulations // The journal of chemical physics. 2009. 130. Published online 234502.

124. Tolstoguzov VB.P. Protein-polysaccharide interactions /7 Food Science and Technology. 1997. 80. p. 171-198.

125. Tribet C.P. Complexation between amphiphilic polyelectrolytes and proteins: from necklaces lo gels // In Physical Chemistry of Polyelectrolytes. Edited by Radeva T. New York. P. Marcel Dekker Inc. 2001.

126. Tricot i\l. Comparison of experimental and theoretical persistence length of some polyelectrolytes at various ionic strengths // Macromolecules. 1984. 17. p. 1698-1704.

127. Turro N.J., Okubo T. Intramolecular excimer formation in aqueous solutions of sodium poly(styrenesulfonate) //J. Phys. Chem. 1982. 86 (9). p. 1485-1497.

128. Wang C„ Luo X., Zhao Y„ Han L„ Zeng X.: Feng M„ Pan S„ Peng H., Wu C. Influence of the polyanion on the physico-chemical properties and biological activities of polyanion/DNA/polycation ternary polypiexes // Acta Biomater. 2012. Epub ahead of print.,

129. Warshel A. Calculations of enzymatic reactions: calculations of pKa, proton transfer reactions, and general acid catalysis reactions in enzymes //' Biochemistry. 1981. 20 (11). p. 31673177.

130. Wojtzak L., Nalecz M.J. Surface charge of biological mem- branes as a possible regulator of membrane-bound enzymes H Eur. J.Biochem. 1979. 94. p. 99-107.

131. Yu Y., Song C., Zhang Q., DiMaggio P.A., Garcia B.A., York A., Carey M.F., Grunstein M. Historie H3 lysine 56 methylation regulates DNA replication through its interaction with PCNA // Mol Cell. 2012. 46(1). p. 7-17.

132. Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю д.б.н. Сабуровой Екатерине Андреевне за предоставленную возможность работать вместе, а также за постоянную и разностороннюю помощь в ходе подготовки диссертации.

133. Слова благодарности за постоянное внимание к работе и ценные консультации автор выражает руководителю сектора физической химии биополимеров к.б.н. Шабарчиной Людмиле Ивановне.

134. Хочу сказать слова благодарности сотруднику к.ф.-м.н. Емельяненко Виктора Ивановича за обсуждение результатов работы.

135. Выражаю глубокую благодарность своим родным, друзьям и близким за моральную поддержку, терпение и всестороннюю помощь.