Структурно-функциональные особенности в ряду природных и синтетических дерморфинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Уранова, Мария Геннадьевна

• Уранова, Мария Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Уранова, Мария Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследование спонтанного поведения животных в различных экспериментальных условиях

1.1 Актометр "ОрЬ-Уаготех".

1.2 Тест "Норковая камера".

1.3 Тест "Открытое поле".

2. Выработка условных рефлексов с различным типом подкрепления

1.4 Условный рефлекс пассивного избегания.

1.5 Условный рефлекс активного избегания.í

1.6 Условная пищедобывательная реакция на место.

3. Определение болевой чувствительности животных

Тест "Отдергивания хвоста".?

4. Определение длительности кардиоинтервалов.

5. Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1.Влияние дерморфина и аналогов на свободное поведение животных.

1.1. Влияние дерморфина на свободное поведение животных в тесте "норковая камера".í

1.2. Влияние дерморфина на фоне действия налоксона на свободное поведение животных в тесте "норковая камера".

1.3. Влияние аналогов дерморфина на свободное поведение животных в тесте "норковая камера".

ПЛ. Влияние дерморфина на свободное поведение животных в актометре "Ор1о-Уаптех".

II.2. Влияние аналогов дерморфина на свободное поведение животных в актометре "Ор1о-Уаптех".

III. 1. Влияние дерморфина на свободное поведение животных, адаптированных к камере актометра "Ор1:о-Уаитех".

Ш.2. Влияние аналогов дерморфина на свободное поведение животных, предварительно адаптированных к камере актометра "ОрШ-Уаптех".

ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 2. Влияние дерморфина и его аналогов на поведение животных в тесте "открытое поле" в различных экспериментальных условиях

I. Влияние дерморфина и его аналогов на поведение животных в тесте "открытое поле" со сменой освещенности (модификация I).

II. Влияние дерморфина и его аналогов на тревожно-фобический уровень животных.

III. Влияние дерморфина и его аналогов на поведение животных в тесте "открытое поле" со сменой освещенности (модификация II).

IV. Влияние дерморфина и его аналогов на поведение животных в тесте "открытое поле" под воздействием стрессирующих факторов (яркий свет, звонок).

ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Влияние дерморфина и его аналогов на процессы обучения животных в тестах с отрицательным и положительным подкреплением.

I. Влияние дерморфина и его аналогов на выработку условного рефлекса активного избегания.

II. Влияние дерморфина и его аналогов на выработку условного рефлекса пассивного избегания при введении сразу после сеанса обучения.

III. Влияние дерморфина и [БРго6]ДМ на выработку условного рефлекса пассивного избегания при введении за 20 мин до сеанса обучения.

IV. Влияние дерморфина и [(ИРго6]ДМ на выработку условного пшцедобывательного навыка на место в сложном лабиринте.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Влияние дерморфина и его аналогов на болевую чувствительность животных

I. Влияние дерморфина и его аналогов на болевую чувствительность животных при внутрибрюшинном введении.

II. Влияние дерморфина и его аналогов на болевую чувствительность животных при интраназальном введении.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Влияние дерморфина и его аналогов на длительность кардиоинтервалов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные особенности в ряду природных и синтетических дерморфинов»

Дерморфины относятся к классу эндогенных опиоидных пептидов и являются наиболее сильными анальгетиками среди всех известных регуляторных пептидов. Высокая анальгетическая активность веществ данного класса обусловлена уникальностью их первичной структуры: дерморфины являются единственными среди всех регуляторных пептидов эукариот, содержащими D-аминокислотный остаток. Эта особенность привлекает к дерморфинам пристальное внимание исследователей различных специальностей, пытающихся, с одной стороны, выяснить механизмы разнообразных эффектов пептидов данного класса, а, с другой, создать на их основе оригинальные анальгетические, анксиолитические или седативные лекарственные средства.

Однако несмотря на значительное количество публикаций, посвященных исследованию физиологической активности дерморфинов, до сих пор нет единого мнения о характере зависимости эффектов пептидов этого класса от их структуры, дозы, способа введения и прочих факторов. Известно, что в реализации физиологической активности дерморфинов преимущественно участвуют различные подтипы ц-опиатных рецепторов, а высокая избирательность к ним определяется первичной последовательностью пептида (Stevens et al., 1996). Ранее высказывалось предположение о том, что специфическая избирательность природных дерморфинов к ц-рецепторам, в существенной мере, зависит от наличия аминокислотного остатка [Pro] в шестом положении молекулы пептида, что повышает вероятность наличия |3-поворота, необходимого для проявления специфической биологической активности пептида (Tancredi Т. et al., 1991). Показано также, что наличие [Pro6] или его модификаций существенно уменьшает вероятность деградации пептида под действием эндопептидаз, что приводит к пролонгации эффектов пептида (Malfroy et al., 1982).

В диссертационной работе проведено систематическое исследование физиологических эффектов ряда доз дерморфина (ДМ) при внутрибрюшинном и интраназальном введении. При этом исследовано действие ДМ на болевую 2 чувствительность, спонтанное поведение, процессы обучения при различных знаках подкрепления, фунционирование сердечно-сосудистой системы. Кроме того исследована физиологическая активность ряда структурных аналогов дерморфина, содержащих стерео-химические модификации аминокислотного остатка [Pro6]. Показано, что такого рода замены приводят в одних случаях к пролонгации и усилению эффектов, в других - к их инверсии, что также представляет большой теоретический и практический интерес. Удалось продемонстрировать, что дерморфин и его природный аналог [Нур6]ДМ обладают выраженным воздействием на поведение животных, тогда как синтетические аналоги [БРгоб]ДМ и [аНРго6]ДМ в большей степени обладают анальгетическим и кардиотропным эффектом. Показано, что дерморфины являются весьма эффективными анальгетиками при интраназальном способе введения.

Таким образом, работа представляет собой систематическое исследование структурно-функциональных зависимостей в ряду природных и синтетических дерморфинов. Полученные в диссертации данные могут быть использованы для обоснования работ по разработке новых лекарственных средств на основе аналогов дерморфинов. 3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время известно о существовании нескольких семейств опиоидов (Ашмарин, Каменская, 1988; Хухо, 1990), в каждое из которых входят пептиды, объединенные общностью происхождения. Так, из высокомолекулярного белка проопиомеланокортина в результате специфического процессинга образуются a-, ß-, у- и 8-эндорфины. Следующая группа эндоопиоидов, пентапегггиды энкефалины, имеют свою молекулу-предшественник - проэнкефалин. Наконец, из продинорфина образуются а- и ß-неоэндорфины, динорфины (1-8), А- и В-, a также лейморфин (Meunier, 1986).

Большая часть эндогенных опиоидов образуется из предшественников в результате ферментативной деятельности, во-первых, трипсин-подобного фермента, который гидролизует связи основных аминокислот Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Lys и Arg-Arg, и во-вторых, карбоксипептидазы В, которая отщепляет остатки основных аминокислот с С-конца пептидной молекулы. Пары Lys-Lys и, особенно, Lys-Arg являются наиболее вероятными мишенями для действия ферментов, тогда как последовательности Arg-Lys и Arg-Arg довольно часто присутствуют в составе длинных опиоидных пептидов, в частности нео-эндорфинов и динорфинов. Существуют и другие ферменты, участвующие в процессинге молекул-предшественников опиатов. Интересно, что процессинг предшественников подвержен также локальным вариациям. Например, преобразование проэнкефалина в мозге проходит гораздо более полно, чем в мозговом слое надпочечников (Liston et al., 1983), а превращение динорфина А в динорфин (1-8) в полосатом теле более полно, нежели в спинном мозге (Weber et al., 1982).

Энкефалины, эндо- и динорфины имеют на N-конце молекулы один и тот же тетрапептид Tyr-Gly-Gly-Phe, за которым следуют либо Leu либо Met. Эта пятичленная структура, по всей видимости, и является характерным признаком эндогенных опиоидов.

Однако, не так давно было заявлено о существовании и другого семейства опиоидов. Из кожи южноамериканских лягушек из рода Phyllomedusa в 1981 г. был выделен пептид, названный впоследствие дерморфином (ДМ) (Broccardo et 4 al, 1981; Montecucchi et al., 1981a). Позднее многие исследователи также выделили ДМ и его природные аналоги из кожи земноводных (Montecucchi et al., 1981а; Mignogna et al., 1992; Mignogna et al., 1997; Erspamer V, 1985). Это открытие положило начало большому количеству исследований как самого дерморфина, так и его природных и синтезированных аналогов, что привело к описанию обширной семьи дерморфиноподобных пептидов. Название, аминокислотная последовательность и происхождение важнейших представителей семьи дерморфинов приведены в таблице 1 (Melchiorri and Negri, 1996; Herz, 1993).

Таблица 1. Основные представители семейства дерморфинов. название аминокислотная последовательность происхождение

ДМ(1-7) H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 вьщелен из кожи южноамериканских лягушек рода РЬуПотеёша.

Нур*]-ДМ(1-7) H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2 см. вьппе

ДМ(1-7)-ОН H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-OH см. выше

Hyp6]-ДМ(1-7)-ОН H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-OH см. выше

Lys7]-ДМ(1-7)-ОН H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Lys-OH предсказан по нуклеотидной последовательности сДНК предшественника ДМ. Позже выделен из кожи Р11у11оте(1ша.

Trp4, Asn7]-ДМ (1-7)-ОН H-Tyr-D-Ala-Phe-Trp-Tyr-Pro-Asn-OH см. выше

Trp4, Asn5]-ДМ(1-5)-ОН H-Tyr-D-Ala-Phe-Trp-Asn-OH см. выше 5

Позднее дерморфины были найдены в мозге и желудке млекопитающих. Так, в мозге крыс ДМ был обнаружен в концентрации 1-5 нг/г, в мозге свиньи -в концентрации 0,8-2 нг/г (Melchiorri et al, 1984). Более детальное исследование содержания ДМ в тканях млекопитающих выявило высокую концентрацию этого пептида в отростках паравентрикулярных ядер и аркуатного ядра гипоталамуса, в супраоптическом ядре, в ядре одиночного тракта и в ядре подъязычного нерва, а также в ядрах передней оливы головного мозга крысы (Buffa, 1982; Melchiorri and Negri, 1996). Была обнаружена также иммунореактивность к антителам ДМ в нервной ткани головоногих моллюсков (Negri et al., 1981). Для исследования распределения мест связывания ДМ в тканях мозга в настоящее время используется метод ауторадиографии с л применением меченного [Н ]-ДМ (Araiche et al., 1990).

Предшественником ДМ является продерморфин, состоящий из 197 аминокислотных остатков и обладающий молекулярный весом, равным 23165 Дальтон. Продерморфин имеет следующую аминокислотную последовательность:

MSFLKKSLLLILFLGLVSLSVCK£EH^TEEENENEENHEEGSEMKR12^mM DGEAKKRDSEENEIEENHEEGSEMKRYAFGYPSGEAKKIKRVSEEENENEENE EGSEMKRYAFGYPSGEAKKIKRESEEEKEIEENHEEGSEMKRYAFGYPSGEA KKIKRESEEENENEENHEEGSEMKRYAFGYPSGEAKKM

Аминокислотная последовательность продерморфина характеризуется 4 повторами (выделены жирным), присутствующими также в аминокислотной последовательности ДМ (Tyr-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser). Продерморфин содержит также последовательность, характерную для другого пептида - дельторфина, или дерменкефалина, Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp (выделено курсивом) (Amiche et al., 1990).

Необходимо отметить, что дерморфиноподобные пептиды, выделенные из кожи лягушки, содержат в соответствующем положении остаток аминокислоты D-Ala, тогда как их предшественник продерморфин содержит в том же положении L-изомер Ala. Из этого следует, что существуют посттрансляционные преобразования, в результате которых L-Ala превращается 6 в D-Ala. Эта реакция является уникальной особенностью синтеза дерморфиноподобных пептидов, впервые обнаруженной в коже южноамериканских лягушек. Поскольку Ь-А1а-содержащие пептиды не были найдены в экстрактах кожи лягушки, то механизмом эпимеризации, возможно, является направленная инверсия ассиметричного a-углеродного атома, а не рацемизация. Не исключено также, что остаток D-Ala избирательно включается в синтезирующуюся цепь посредством не известного еще механизма, отличного от механизма включения в цепь остатка L-Ala (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Фармакокинетика дерморфинов

При изучении эффектов различных препаратов возникает целый ряд вопросов, касающихся дальнейшей судьбы введенного извне вещества. В первую очередь, ученых интересуют следующие характеристики:

- время полужизни;

- проходит ли исследуемый препарат через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ);

- какие фрагменты введенного вещества ответственны за реализацию его эффектов.

Данные о времени полужизни ДМ весьма разнонаправленны. Группой итальянских исследователей было показано, что при внутривенном введении пептида крысам его концентрация в крови быстро снижается и период полужизни составляет т 1/2= 1,3 мин. До 80% введенного ДМ накапливается и разрушается в печени и почках. Хотя скелет и кожа содержат более низкий уровень дерморфина, но с расчетом на их массу они содержат наибольшую фракцию пептида. Через 5 мин после введения ДМ в крови крысы еще содержится около 7% введенного пептида, 34% которого представлено в виде собственно ДМ, а 60% в виде продуктов его распада (ди-, три- и тетра-N-терминальных фрагментов). Основным продуктом ферментативного расщепления дерморфина в мозгу у крыс является ДМ-[1-4]. В экспериментах in vivo и in vitro было показано, что пептид в основном разрушается в печени и почках и частично экскретируются через желчь (Negri and Improta, 1984). 7

Однако существуют работы, в которых отмечается более продолжительное время полужизни дерморфина. Так, исследования, проведенные in vitro, выявили устойчивость пептида к действию протеолитических ферментов плазмы крови как минимум в течение 30 мин (Fontani et al., 1993), причем наличие остатка аминокислоты D-Ala2 в последовательности ДМ играет решающую роль в стабильности пептида к действию указанных выше ферментов (Broccardo et al., 1981). Группой других исследователей показано, что т1/2 ДМ в плазме крови крысы составляло несколько часов (Livari et al., 1983). Показано также, что ДМ гораздо более устойчив, чем лей-энкефалин, к действию протеолитических ферментов плазмы крови человека и крысы (дерморфин т1/2=180 мин; лей-энкефалин тш=2,1-4,5 мин), в мозгу ДМ обладает т]/2=29 мин, тогда как лей-энкефалин - т1/2=1 мин (Scalia et al., 1986).

При внутримозговом введении ДМ через 90 мин обнаруживается 3-4 % от введенного вещества в крови, 30-40 % - в желчи, 0,7 % - в желудке, 1 % - в почках, 8-13 % - в моче, 20-30 % - в костях, мускулатуре, в жировой ткани, 1724 % - в коже. Все остальные ткани содержат менее 0,5 % (Mueller, 1983).

В экспериментах по исследованию ферментативного расщепления дерморфинов было обнаружено, что пептиды, содержащие основные аминокислоты на С-конце, такие как [Lys7]-flM и [Arg7]-/1M, медленнее всего расщепляются ферментами мозга и имеют наибольшую продолжительность анальгетического эффекта после внутрижелудочкого введения. Замещение второй аминокислоты другим D-изомером не изменяло процесса расщепления пептида ферментами мозга, но могло увеличить устойчивость к действию пептидаз. Найдено, что в мозге процесс расщепления ДМ и [D-Arg2]-,Z1M происходит сходным образом, приводя при этом к образованию N-концевого тетрапептида. Однако, связь Tyr-D-Arg оказалась более стабильной, чем связь Tyr-D-Ala при расщеплении аминопептидазой. Это подтверждается тем фактом, что D-Arg-замещенные аналоги вызывают относительно более длительный анальгетический эффект по сравнению с D-Ala-содержащими пептидами (Р. Melchiorri and L. Negri, 1996). 8

Как и многие другие пептиды, ДМ не может легко проходить через ГЭБ (Melchiorri and Negri, 1996), однако сам факт проникновения в мозг при системном введении не оставляет сомнения. В пользу такого заключения говорят следующие данные. Так, наблюдающееся угнетающее воздействие ДМ на спонтанное поведение животных, вероятнее всего, опосредовано его воздейсвием на гиппокампальные структуры мозга (Fontani et al., 1993). Реализация анальгетических и каталептических эффектов ДМ через центральные механизмы также была неоднократно доказана в работах Broccardo et al. (1981, 1985а), Amiche et al. (1990). Показано также, что ДМ способен вызывать анальгезию как при внутрижелудочковых (в/ж) введениях (Broccardo et al., 1981), так и при системных инъекциях (в/в или п/к) (Cervini et al, 1985). Более того, в работе Negri и Improta (1984) было показано, что после в/в введения 125-I-дерморфина в хвостовую или яремную вену анестезированных крыс уже через 5 мин в мозге крыс была зафиксирована радиоактивность введенного пептида. И наконец, выброс пролактина наблюдается только in vivo при периферическом введении ДМ людям и крысам, тогда как in vitro стимулирующий эффект ДМ при нанесении его на изолированные клетки гипофиза крысы не обнаружен (Uberti et al., 1983). Таким образом, все выше перечисленные факты указывают в пользу способности ДМ проходить через ГЭБ и оказывать влияния через воздействие на ц-опиоидные рецепторы, расположенные в ЦНС.

При в/в введении дерморфина через ГЭБ проникает менее, чем 0,01 % от введенного вещества (P. Melchiorri and L. Negri, 1996). Исследования in vitro показали, что основным метаболитом ДМ, обнаруживаемым в мозге крыс, является N-концевой тетрапептид Tyr-D-Ala-Phe-Gly, который сохраняет высокую способность связывания с ¡^-рецепторами, расположенными в мембранах мозга (Negri and Improta, 1984). Следует также отметить, что ДМ разрушается в тканях мозга гораздо медленнее, чем, например, в печени или почках (Negri and Improta, 1984). Следовательно, даже если небольшой процент периферически введенного ДМ проникает через ГЭБ и связьюается с ц-опиоидными рецепторами мозга, относительно низкий уровень распада и высокая биологическая активность метаболита ДМ - тетрапептида Tyr-D-Ala9

Phe-Gly могут быть ответственны за проявление центральных эффектов дерморфина.

Показано, что аналоги ДМ, содержащие основные аминокислоты, проникают в мозг легче, чем сам дерморфин, при периферическом введении (Chaki et al., 1988). Среди природных дерморфинов [Ьуз7]-дерморфин характеризуется относительно высокой степенью проникновения через ГЭБ, что может быть объяснено существованием специальной гематоэнцефалической транспортной системы, переносящей многие пептиды (Banks and Kastin, 1990).

Особенно важны для проникновения через ГЭБ такие характеристики пептида, как липофильность, размер молекулы и способность образовывать водородные связи. Причем способность к образованию водородных связей является более важным условием, чем липофильность, для прохождения через ГЭБ (Chikhale et al., 1995).

Существуют разные способы переноса веществ через ГЭБ. Так, есть данные о том, что транспортер глюкозы переносит и 2-0-гликозидный аналог [Ser , Ме^]-энкефалин. Но дерморфины не являются гликозилированными пептидами, и более вероятно, что они транспортируются из крови в мозг системой, подобной насыщающейся системе оттока PTS-1 (Negri et al., 1995). PTS-1 транспортирует из мозга такие пептиды, как Tyr-MIF-1 (Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2) и мет-энкефалин, но не транспортирует аминокислоты, фрагменты этих пептидов и сильно отличающиеся от них пептиды и белки (Banks et al., 1993).

Существует также транспортная система PTS-5, переносящая аналог соматостатина RC-160 (Banks et al, 1994). Есть данные о существовании подобной системы для дельторфинов (Fiori et al., 1997). Возможно, имеется регулирование входа и выхода дерморфинов двумя противоположными насыщающимися транспортными системами (Negri et al., 1995).

10

Опиоидные рецепторы

Разнообразные физиологические эффекты дерморфинов опосредуются через опиодные рецепторы и, поэтому, нам представляется интересным рассмотреть их строение и возможное участие в реализации тех или иных биологических ответов организма.

Впервые предположение о существовании в организме млекопитающих различных типов рецепторов для связывания опиоидов было высказано в работах Martin с соавторами (1976), чтобы объяснить различные физиологические эффекты морфина, кетоциклазоцина и N-аллилнорциклазоцина (SKF-10 047), которые наблюдались на спинальных собаках. На начальном этапе было выделено 3 типа опиоидных рецепторов в зависимости от веществ, к которым они имели большую избирательность. Так, было показано, что морфин (mu, ц-рецепторы) вызывал анальгезию, миоз, брадикардию, уменьшение размера зрачка, урежение частоты дыхания и гипотермию; кетоциклазоцин (kappa, к-рецепторы) - анальгезию, миоз, общий седативный эффект и ослабление разгибательного рефлекса; SKF-10 047 (sigma, сг-рецепторы) -мидриаз, учащенное дыхание, тахикардию и галлюциногенное действие.

Авторы (Martin et al., 1976) предположили существование двух подтипов al - и <з2 - рецепторов. Однако ввиду нечувствительности к налоксону и стереоспецифичности рецепторов данного типа, а также низкого сродства к ним классических опиоидов большинство авторов предпочитают не относить их к опиоидным рецепторам, а классифицировать как неопиоидные. В малых дозах циклазоцин, налорфин и SKF-10 047 вызывают галлюциногенные эффекты, которые могут быть сняты налоксоном и опосредуются предположительно через высокоаффинные ai -рецепторы. В больших дозах эти вещества вызывают мидриаз и бредовые состояния у собак; эти эффекты, напротив, практически не устраняются при введении налоксона и опосредуются, вероятно, через низкоаффинные а2-рецепторы. Дальнейшее изучение рецепторов этого типа продемонстрировало их стереоспецифичность: в отличие от классических опиатных рецепторов, о-рецепторы присоединяют (+)-изомеры.

11

Вслед за открытием первых эндогенных опиоидов энкефалинов, Lord с сотрудниками (1977) предложили существование еще одного типа опиоидных рецепторов. Ими было обнаружено, что морфин был более эффективен, подавляя электрически вызванную сократительную активность на препаратах подвздошной кишки морской свинки (GPI), а энкефалины - на препаратах семявыводящего протока мыши (MVD). Более того, налоксон в равной степени подавлял действие морфина и энкефалинов на подвздошную кишку, но для семявыводящего протока требовалось в 10 раз больше налоксона, чтобы подавить эффект энкефалинов, чем морфина. Рецепторы, опосредующие эффекты энкефалинов во втором случае, получили название ô-рецепторов.

Наконец, в 1979-80 гг. было заявлено об открытии еще одного типа рецепторов. Немецкие ученые показали, что ткани семявыводящего протока крысы (но не мыши) богаты рецепторами, исключительно чувствительными к ß-эндорфину по сравнению с морфином и энкефалинами (Schulz et al, 1979; Wuster et al., 1980). Данные рецепторы были названы впоследствии е-рецепгорами. Их выделение и изучение крайне затруднено, так как ß-эндорфин активно взаимодействует также с ц- и 5-рецепторами.

Согласно имеющимся в настоящее время представлениям, в организме существуют, по крайней мере, три типа опиоидных рецепторов: ц,-, 8- и к-, через которые опосредуется многие воздействия эндо- и экзогенных опиоидов. Однако в осуществлении большинства эффектов дерморфинов главенствующую роль играют ¡л- и ô-рецепторы. Рассмотрим их более подробно.

Детальные исследования ц-рецепторов в ЦНС заставили предположить существование нескольких популяций рецепторов данного типа. Рецепторы ц!-подтипа одинаково хорошо взаимодействуют как с морфином, так и с энкефалинами, в отличие от ц2-подтипа, чувствительного только к морфину (Pasternak and Wood, 1986). Фармакологические эффекты, опосредуемые и ц 2 - рецепторами, весьма различны. Например, щ-рецепторы участвуют в регуляции супраспинальной анальгезии, в возникновении каталеписии, в модуляции пищевого поведения (как свободного, так и вызванного

12 предварительной депривацией), а также в процессе высвобождения пролактина и в функционировании ацетилхолинергической медиаторной системы. Тогда как jj-2-рецепторы, по-видимому, ответственны за подавление электрически вызванной сократительной активности подвздошной кишки морской свинки (GPI), за процесс угнетения дыхания, за регуляцию пищевого поведения (вызванного введением дезоксиглюкозой), а также за высвобождение гормона роста и модуляцию дофаминергической медиаторной системы (Adler et al., 1990).

Хотя взаимодействие опиоидов с соответствующими рецепторами приводит к целому ряду фармакологических эффектов, достаточно подробно описанных в литературе, механизмы их действия на клеточном и молекулярном уровнях остаются не до конца ясными. Для опиоидных рецепторов известно два механизма действия: 1) они могут связываться с G-протеинами и 2) их пептидные агонисты могут модулировать ионную проводимость мембран нервных клеток. В сущности, опиоидные пептиды способны работать по тем же принципам, что и классические непептидные нейромедиаторы (ацетилхолин, норадреналин, серотонин). У последних в большинстве случаев информация, закодированная в пространственной структуре агонист-рецепторного комплекса, передается ионным каналам через G-белки.

Существует предположение, что каждый тип рецепторов характеризуется своим механизмом действия, запускающим тот или иной внутриклеточный каскад биохимических реакций.

Так, ц-рецепторы сопряжены с аденилатциклазой, и для ингибирования опиатами этого фермента необходимы Na+ и гуаниновые нуклеотиды (Kosenboum, 1983).

В работах Chiu с сотр. (1990) на препаратах locus coeruleus было продемонстрировано, что ц-агонисты, в частности, ДМ, вызывают гиперполяризацию мембранного потенциала, возникающую вследстие открытия Ca"4" каналов. Причем этот процесс включает в себя опосредованное G-белком ингибирование аденилат циклазы, ведущее к выключению сАМР-зависимого входящего тока.

13

В то же время предполагается, что 5-рецепторы не сопряжены с аденилатциклазой (Zi % 1981). Пока не существует ясности в преобразовательных мехакк в случае взаимодействия с к-рецепторами, поскольку их селективный агонист U50, 488Н не оказывает влияния на активность аденилатциклазы в полосатом теле морских свинок (De Montis et al., 1986), что, по-видимому, исключает возможность считать цАМФ в данном случае вторичным мессенджером. Несмотря на это, к-рецептор способен взаимодействовать с G-протеином (хотя и не так, как ¡i-рецептор) даже в отсутствии агониста (Frances et al, 1986). Такое различие может означать, что ц-и к-рецепторы взаимодействуют с различными типами G-протеинов, либо, что взаимодействие с одним G-белком подвержено различной аллостерической регуляции.

Кроме прямого сопряжения опиатных рецепторов с аденилатциклазой, опиаты могут влиять на активность этого фермента посредством токов Са4^ (Chapman and Way, 1980). Многочисленные данные о возможной роли опиатов в регуляции Са++ обмена позволяют сформулировать гипотезу о том, что, по крайней мере, анальгетические эффекты опиатов обусловлены снижением входа Са^ в клетку или его связывания с синаптическими мембранами.

Возможно, изменение липидного состава плазматических мембран приводит к изменению проницаемости для Са4^, уровень которого в клетках после действия опиатов также изменяется. В некоторых случаях отмечено, что активация ц- и 8-опиоидных рецепторов сопровождается увеличением К+-проводимости, что, в свою очередь, приводит к падению входа ионов Са^ в клетку (Werz and MacDonald, 1983; Williams and North, 1984; Mihara and North, 1985). С другой стороны, для к-агонистов отмечено непосредственное блокирование потенциал-зависимых Са^-каналов (Cherubini and North, 1985; Wertz and MacDonald, 1985). Изменяя уровень Ca++, опиаты могут влиять на активность ряда ферментов, таких, как тирозингидроксилаза, протеинкиназа, АТФаза, а также регулировать процессы высвобождения нейромедиаторов.

Shikimi с соавторами (1969) сообщили, что морфин в высоких концентрациях (1 мМ) ингибирует К+-стимулируемое высвобождение

14 ацетилхолина из срезов коры головного мозга мышей в обычной, но не в свободной от Са^ среде. Согласно результатам Dhaliwae и Bradford (1982) морфин (15 мкМ) предотвращает вызываемый К+ вход Са4^ в синаптосомы коры головного мозга крыс и полностью блокирует выход из синаптосом глутамата, аспартата и ГАМК. Эти эффекты морфина устраняются налоксоном, что дает возможность утверждать, что опиатные рецепторы опосредуют первичный эффект морфина, выражающийся в предотвращении входа Са^ в синаптосомы.

При описании распределения ц- и ô-рецепторов чаще всего говорят о существовании в головном мозге крыс трех различных областей, характеризующихся локализацией тех или иных рецепторов опиатов (Martin, 1983):

1) отделы, в которых присутствуют почти исключительно ц-рецепторы (гипоталамус и таламус);

2) отделы, в которых ц-рецепторы доминируют над 5-рецепторами (ствол мозга, гиппокамп и лимбическая система).

3) отделы, в которых имеется примерно одинаковое число ц- и Ô-рецепторов (кора больших полушарий и полосатое тело).

Количество к-опиоидных рецепторов в мозгу обычно не превышает 1/3-1/2 общего количества ^.-рецепторов. У морских свинок к-рецепторы сконцентрированы в глубоких (V и VI) слоях коры и в грушевидной коре, хвостатом ядре и nucleus accumbens (Goodman and Snyder, 1982a,b; Foote and Mairer, 1983). У крыс к-рецепторы располагаются приблизительно так же, как ц-, но, в отличие от морских свинок, в глубоких слоях коры к-рецепторы отсутствуют (Lewis et al., 1984).

Различия в локализации разных типов опиоидных рецепторов, вероятно, можно объяснить их функциональной объединенностью. Учитывая, что ц-агонисты являются более эффективными анальгетиками по сравнению с 5- (Herz et al., 1978), можно предположить, что, по-видимому, именно ц-рецепторы в большей степени опосредуют антиноцицептивные эффекты опиоидов. Отмечено, что высокие концентрации ц-рецепторов обнаружены в зонах, связанных с восприятием боли и формированием анальгезии (желатинозной

15 субстанции, околоводопроводном сером веществе, ядрах шва, дорсомедиальном таламусе и IV слое нейронов фронтальной коры). Высокие концентрации 5-рецепторов обнаружены в зонах, принадлежащих лимбической системе (обонятельном бугорке, nucleus accumbens, миндалине) и принимающих участие в регуляции эмоционального состояния и поведенческих реакций. Предполагают, что эйфорическое действие опиатов и их влияние на психоэмоциональный статус организма опосредуются, по-видимому, преимущественно 5-рецепторами (Martin, 1983).

Периферические ткани также содержат различные типы опиоидных рецепторов. Показано, что желудочно-кишечный тракт крысы богат как ц-, так и 6-рецепторами, иммунореактивность к ним была обнаружена в пищеводе, в подвздошной и толстой кишках крысы, а также в слизистой оболочке. В половых путях мышей (семявыводящие протоки) также встречаются как ji-, так и б-рецепторы (Chang and Cuatrecasas, 1981). Есть также данные, свидетельствующие о существовании интракардиальных опиодных рецепторов. Так, из мембранной фракции предсердных кардиомиоцитов выделены опиатные рецепторы (Dashwood and Spyer, 1986). Богаты ими и сосудистые стенки крысы (Feuerstein and Zukowska, 1987). В литературе также есть немногочисленные сведения о наличии k-рецепторов в периферических тканях, однако их расположение ограничивается лишь семявыводящими протоками мыши (Traynor, 1989)

Таким образом, обобщая, можно подчеркнуть, что опиатные рецепторы локализованы как в ЦНС, так и на периферии, как на пре-, так и на постсинаптических мембранах и, следовательно, представляют собой множественную гетерогенную популяцию.

Все вышеперечисленные работы по определению локализации различных типов опиатных рецепторов в организме млекопитающих проводили на взрослых особях. Естественно, не меньший интерес представляет процесс индивидуального развития опиоидной системы в пре- и ранний постнатальный периоды жизни животных.

16

Раньше всего в организме происходит формирование системы ц- и к-опиоидных рецепторов - они появляются в организме практически сразу после рождения, на 1,5-2 недели позже начинают функционировать 6-рецепторы (Spain et al., 1985). Дальнейшее развитие также идет неравномерно. Рецепторы ц-типа достигают в мозгу детенышей уровня, характерного для взрослых особей, через 2-3 недели, 5- и к-типов - приблизительно на 1-2 недели позже (McDowell and Kitchen, 1986). Несмотря на различия в применяемых методиках и расхождения в результатах, причиной увеличения связывания опиоидов с возрастом большинство исследователей считают повышение концентрации участков связывания, а не изменение сродства рецепторов к лигандам.

Существуют многочисленные исследования с использованием разнообразных методов, которые подтверждают высокое сродство и избирательность дерморфина к ц-опиоидным рецепторам (Giagnoni et al., 1984; Stevens, 1996; Marastoni et al, 1987; Negri et al., 1992; Sakurada et al., 1992; Amiche et al., 1990).

Избирательное сродство опиоидных пептидов к рецепторам изучают, используя две стандартные методики тестирования опиоидной активности пептидов. С этой целью используются изолированные препараты гладкой мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (GPI) и семенных канальцев мыши (MVD), которые богаты ji- и 6-опиоидными рецепторами, соответственно, и которые подвергают электрическому раздражению, вызывающему их сокращение.

Было установлено, что ДМ обладает высоким сродством к ц-опиоидным рецепторам - в 20 раз превосходящим таковое морфина и в 2 раза DAMGO -высокоизбирательного ц-лиганда. Активность ДМ в стандартных тестах на препаратах подвздошной кишки морской свинки и семявыводящих протоках мыши в 116 и 74 раза превосходит активность морфина и в 5,5 и 7 раз активность DAMGO, соответственно. Сродство к ц-рецепторам некоторых других дерморфинов еще более высокое. Так, [Lys^-ДМ обладает в 6 раз большим сродством к ]и-опиоидным рецепторам, чем сам ДМ (P. Melchiorri and

17

L. Negri, 1996; Negri et al., 1992). Немного отличающиеся данные приводятся в других работах. Так, Ki дерморфина были 0.7 нМ, 62 нМ и более, чем 5000 нМ для ц.-, 5- и k-опиоидных рецепторов, соответственно, и Ki(delta)/Ki(mu) = 88 (Amiche et al., 1990). Ki дерморфина были 1,24 нМ, 78 нМ для \х-, 8-опиоидных рецепторов, соответственно (Krumins, 1987). На препарате подвздошной кишки морской свинки активность ДМ оказалась, соответственно, в 57, 294, 18 и 39 больше, чем мет-энкефалина, лей-энкефалина, Р-эндорфина и морфина (Broccardo et al., 1981).

Показано, что дерморфины практически не имеют или имеют очень слабое сродство к k-опиоидным рецепторам. Данных о сродстве ДМ к ст-рецепторам очень мало (Giagnoni et al., 1984; Stevens, 1996; Krumins, 1987; Marastoni et al., 1987; Salvadori et al., 1989; Sakurada et al., 1992).

Таким образом, имеет место избирательное сродство ДМ к ц-опиоидным рецепторам. Причем это сродство намного превышает сродство к этому типу рецепторов всех известных к настоящему времени опиоидов. Наблюдающееся явление, вероятно, объясняется специфическими пространственными взимодействиями лиганд-рецептор, в которых важную роль играют строение, конформация и физико-химические свойства молекул как лиганда, так и рецептора.

Показано, что опиоидные рецепторы - это встроенные в мембрану гликопротеиды. До сих пор не ясно, являются ли три типа опиатных рецепторов продуктами различных генов или трансформациями одного и того же предшественника, но все они похожи по молекулярным свойствам и демонстрируют структурное сходство приблизительно на 60-70 %. В рецепторах ц-, 5- и к-типов выделено по 7 трансмембранных доменов, разделенных экстра- и интраклеточными петлями. Последовательности аминокислотных остатков внутри доменов высоко гомологичны, но N- и С-концы, а также 2-я и 3-я экстраклеточные петли у разных типов рецепторов, напротив, существенно различаются. Высказывается предположение, что именно эти негомологичные

18 участки рецепторных молекул и являются решающими для связывания с соответствующими лигандами (Lazarus et al., 1996).

Показано, что заряд молекулы пептида играет важную роль в связывании с рецепторами. Расшифровка последовательности гена грызунов и человека, кодирующего ц-опиоидный рецептор показала, что он содержит отрицательно заряженные остатки аминокислот (Asp114, Asp147) внутри предполагаемых трансмембранных доменов II и III, которые формируют сайты связывания лиганда. Именно поэтому те природные дерморфины, которые имеют свободные карбоксильные группы характеризуются в 30-100 раз меньшим сродством к ц-рецепторам и гораздо меньшей активностью на препаратах изолированных органов, чем амидированные аналоги дерморфина (Amiche et al., 1988). Удлиненные дерморфиновые пептиды, несущие значительный положительный заряд, такие как flM-Gly-Glu-Ala-Lys-Lys-Ile-Lys-Arg-NH2, а также [Lys7]-ДМ, обладают гораздо более высоким сродством к ^-рецепторам.

Замещение Asp на Ala в трансмембранных доменах рецептора снижает связывание (^-избирательных агонистов не менее, чем на 5 % (P. Melchiorri, 1996). Эти данные подтверждают и другие исследования. Так, увеличение положительного заряда с +1 до +3 в серии дерморфинов (1-4) вызывало повышение сродства и селективности к ц-рецепторам (Schiller et al., 1989). Показано также, что ô-избирательный пептид, дельторфин, и дерморфин имеют сходное конформационное состояние, а различия в селективности к опиоидным рецепторам объясняются различием в заряде N-концевого участка пептидов (Temussi et al., 1989). Таким образом, увеличение положительного заряда в молекуле аналога дерморфина ведет к увеличению его сродства к ц-опиоидному рецептору.

Рядом ученых показано, что N-конец аминокислотной последовательности дерморфинов ответственней за активацию как ц,-, так и Ô-рецепторов (Erspamer et al., 1989; Improta and Broccardo, 1992). Установлено, также что N-концевой домен, одинаковый у дерморфинов и дельторфинов, имеет сходный ß-поворот цепи, образованный взаимодействием остатков Туг1 и Phe3, причем присутствие

19

Б-Ак2 на И-конце и Ь-Рго6 остатка на С-конце повышает вероятность присутствия в пептиде {3-поворота (ТапсгесН е! а1., 1991).

Известно, что эндогенные опиоидные пептиды млекопитающих обладают довольно ограниченной избирательностью: энкефалины, например, связываясь преимущественно с 5-рецепторам, тем не менее, вступают и во взаимодействие с ц-рецепторами. Гипотеза для объяснения возможных структурных различий между ц- и 8-рецепторами была предложена после сравнения характеристик связывания лей-энкефалина и морфисептина. Разница, видимо, заключается в расстоянии между участками связывания, соответствующем двум ароматическим кольцам в остатках тирозина и фенилаланина. Морфисептин, у которого между ароматическим Туг и РИе стоит только одна аминокислота, имеет слабое сродство к 8-, но при этом характеризуется высоким сродством к ц-рецепторам, т.к. в молекулах ц-рецепторов это расстояние короче, чем в 5-рецепторах. Напротив, энкефалины, имеющие две аминокислоты между предполагаемыми участками связывания, легче связываются с б-рецепторами. Таким образом, можно предположить, что одной из отличительных характеристик связывания с ц- и 8-рецепторами является расстояние между ароматическими кольцами остатков Туг и РЬе в молекуле лиганда.

С другой стороны, мет- и лей-энкефалины так же, как и множество их линейных аналогов, являются гибкими молекулами и могут существовать в различных конформациях с относительно низкой энергией. В связи с этим слабую избирательность энкефалинов к рецепторам часто объясняют их способностью приспосабливаться к различным типам рецепторов с помощью конформационньгх перестроек.

Для выяснения роли конформационной жесткости структуры лигандов для взамодействия с тем или иным типом рецепторов был синтезирован целый ряд аналогов с заданной молекулярной гибкостью, среди них - циклические аналоги энкефалинов. Одно из первых циклических производных было получено при замене аминокислотного остатка во 2-м положении на с1-а,ш-диаминомасляную кислоту (ёА2Ьи) с последующим замыканием цикла между у-аминогруппой ¿АгЬи и С-концом молекулы опиоида. В результате Н-Туг-сус1о[(1А.2Ьи-01у-Р11е

20

Leu], структура которого более жесткая, а расстояние между ароматическими кольцами уменьшено по сравнению с таковым у лей-энкефалинов, в 17 раз эффективнее в тестах на препаратах подвздошной кишки морской свинки, стабилен к биодеградации, имеет пониженное сродство к 8- и довольно высокое к ц-рецепторам (Chang and Cuatrecasas, 1981). То, что молекулярная гибкость является причиной избирательного связывания пептидов именно с тем или иным типом рецепторов, подтвердили опыты с двумя циклическими аналогами: НТуг-cyclo[dA2bu-Gly-Phe-dLeu] и H-Tyr-cyclo[dA2bu-Gly-Phe-Leu]. Выяснилось, что dLeu-содержащий аналог более гибкий, а аминокислотные остатки Туг1 и Phe3 имеют в нем больше степеней свободы, чем в Ьеи-аналоге. В результате первый аналог обладает весьма незначительной ^-избирательностью, а второй - высокой ¡л,- и низкой 5-избирательностью.

Таким образом, конформационная жесткость является причиной избирательного связывания пептидов именно с ц-рецепторами, тогда как гибкость в структуре молекулы вызывает снижение связывания с ^.-рецепторами и повышение связывания с ô-рецепторами.

Уникальной особенностью ДМ является D-изомер аминокислоты Ala, находящийся во 2-ом положении и расположенный между двумя ароматическими кольцами Туг1 и Phe3. Показано, что D-Ala2 изомер важен для реализации биологической активности ДМ, т. к. обеспечивает оптимальное расстояние и пространственное расположение указанных выше аминокислотных

1 о остатков Туг и Phe и его замещение на L-изомер ведет к практически полной инактивации пептида. L-Ala2 изомер характеризуется в 100 раз более низким сродством к рецепторам и пониженной активностью на препаратах подвздошной кишки морской свинки (Amiche et al., 1988).

О 9

Таким образом, любые замещения D-Ala на L-Ala или на другую аминокислоту приводили к уменьшению сродства к ц-опиоидным рецепторам и, как следствие, вызывали снижение биологической активности пептидов (Р. Melchiorri, L. Negri, 1996; Schiller е.а., 1989), что подтверждает важную роль аминокислотного остатка D-Ala2 в обеспечении связывания природных

21 дерморфинов с ц-опиоидными рецепторами и в реализации биологического ответа.

Установлено, что С-концевые участки пептидов различаются по конформации и полярности. После произведенных расчетов внутримолекулярных взаимодействий были предложены 1 линейная и 6 нелинейных, относительно стабильных конформаций. 3 из 6-ти нелинейных конформаций были минимальны по энергетическим показателям и характеризовались взаимодействием Туг'-Туг5 остатков и наличием 3 водородных связей, что создавало возможность для возникновения полужесткой (3-складки (P-sheet) (Pattabiraman et al., 1986).

В отличие от N-конца, который, как указывалось выше, ответственней за активацию как ц-, так и б-рецепторов, различия в С-концевой части пептидов обуславливают избирательное сродство к \х- или к 5-рецепторам (Erspamer et al., 1989; Improta and Broccardo, 1992). Так, было установлено, что конформация С-конца дельторфина His-Leu-Met-Asp-NH2 ответственна за избирательное взаимодействие с 5-рецептором (Nairn et al., 1996).

Таким образом, основываясь на вышеперечисленных данных, можно сделать вывод о том, что ^-селективные пептиды характеризуются N-концевым участком, состоящим из 4-5 аминокислотных остатков и имеющим изогнутую конформацию (возможно, {3-поворот). Именно этот участок ответственен за связывание как с ц-, так и с 5-опиоидными рецепторами, тогда как С-концевая часть этих пептидов определяет их высокое сродство и селективность к этим подтипам опиоидных рецепторов.

Исходя из вышеописанных данных, длина цепи также играет важную роль в проявлении биологической активности дерморфиноподобных пептидов. Так, некоторые более короткие аналоги ДМ представляют особый интерес, так как они являются продуктами метаболизма ДМ при периферическом или центральном его введении. При исследовании активности укороченных с С-конца фрагментов ДМ было показано, что на препаратах подвздовшной кишки морской свинки ДМ (1-5) сохраняет 50 % активности ДМ (1-7), ДМ (1-4) - лишь

22

5 %, а ДМ (1-3) - неактивен. Та же тенденция наблюдается и по отношению к сродству к ц-опиоидным рецепторам (P. Melchiorri, L. Negri, 1996; Amiche et al., 1988). Таким образом, минимальным аналогом ДМ, сохраняющим сродство к рецепторам и активность на стандартных изолированных препаратах, является ДМ(1-4).

Все вышесказанное свидетельствует о том, что высокое сродство и избирательность ДМ к ц-рецепторам определяется спецификой его аминокислотной последовательности. Предполагают, что одной из важной особенностей структуры ДМ, определяющей его высокую избирательность к \х-рецепторам, является наличие аминокислоты Pro в 6-м положении. Следует отметить, что длительность и мощность многих эффектов ДМ объясняется не только наличием ароматических колец двух аминокислотных остатков - Туг1 и Phe3; присутствием уникальной аминокислоты D-Ala2, защищающей пептид от действия экзопептидаз; наличием амидной группировки на С-конце и якровыраженной гидрофильностью двух аминокислотных остатков - Туг5 и Ser7, но и наличием таких циклических аминокислот, как Pro6 и Hyp6 (гидроксипролин), которые предотвращают или, по меньшей мере, существенно уменьшают, вероятность деградации пептида под действием эндопептидаз, например, энкефалиназы A. (Malfroy et al., 1982). Учитывая вышеперечисленные факторы, можно предположить, что наличие Pro6 во многом опеределяет специфику биологической активности ДМ.

Физиологические эффекты дерморфинов

Дерморфины, как и все опиоидные пептиды, обладают множеством физиологических эффектов и оказывают воздействие на деятельность разнообразных систем организма. Так, ДМ и его аналоги обладают не только мощным анальгетическим эффектом, но и участвуют в регуляции функций таких важнейших систем организма, как терморегуляторной, нервной, дыхательной и сердечно-сосудистой (P. Melchiorri and L. Negri, 1996). Показано также, что дерморфины оказывают существенное воздействие на функцию почек и желудочно-кишечного тракта (Broccardo et al., 1981).

23

Влияние дерморфинов на болевую чувствительность.

Дерморфины принадлежат к группе опиоидных пептидов, главным свойством и отличительной чертой которых является способность вызывать ярковыраженную анальгезию. Дерморфины являются самыми мощными анальгетиками среди известных опиоидных пептидов и способны вызывать антиноцицептивные эффекты как на спинномозговом, так и на супраспинальном уровнях.

Для определения возможных механизмов действия ДМ в регуляции болевых ответов на спинномозговом уровне существует целый ряд тестов, среди них: тест "отдергивания хвоста" ("tail-flick"), применяемый в двух модификациях, в одной из которых болевой ответ у животного провоцируется погружением хвоста в горячую воду (52° С) (Janssen et al., 1963), в другой -предъявлением луча света (D'Amour and Smith, 1941).

Исследования, направленные на изучение механизмов возникновения анальгезии, показали, что ДМ оказывает ярковыраженное воздействие на процессы формирования болевого ответа в задних корешках спинного мозга. Так, при электрическом раздражении лапы ламинэктомированных крыс ДМ, нанесенный непосредственно на спинной мозг животного, вызывает дозозависимое избирательное блокирование ответа в задних корешках спинного мозга, опосредованного активностью С-волокон. Пептид блокирует деятельность как поверхностных, так и глубоко лежащих клеток задних корешков спинного мозга, практически не влияя при этом на активность ß-волокон (Sullivan and Dickenson, 1988).

Для изучения антиноцицептивных эффектов ДМ и его аналогов на супраспинальном уровне также используется целый ряд методик, среди которых наиболее распространенной является тест "hot plate", или "горячая пластина", когда болевой ответ у животного вызывают, помещая его в плексигласовую камеру с металлическим полом, температура которого равна 52,5° С, и регистрируют время, когда крыса начинает лизать одну из задних лап (Broccardo et al., 1981; Marchioni et al., 1992; Rossi et al., 1983; Tartara et al., 1988). В работах

24 также нередко применяется тест с механическим сдавливанием здоровой и искусственно подверженной воспалению лапы ("tail-pinch") (Randall and Selitto, 1957).

Показано, что внутрибрюшинное введение ДМ (1,9 мкмоль/кг) приводит к угнетению ноцицептивных ответов, возникающих в п. lateralis anterior и в вентробазальном комплексе таламуса крыс в ответ на предъявление таких болевых стимулов, как высокое давление и жесткое излучение, не влияя при этом на фоновую активность нейронов указанных выше зон в покое (Braga et al., 1984).

Поскольку характерной чертой регуляторных пептидов, в том числе дерморфинов, является зависимость их эффектов от различных факторов окружающей среды, а также вида экспериментальных животных и способа введения, нам представляется необходимым описать анальгетические эффекты исследуемых пептидов в зависимости от вышеуказанных условий.

Так, для исследования антиноцицептивных воздействий дерморфинов используются как периферические (внутривенные, в/в; внутрибрюшинные, в/б; подкожные, п/к), так и центральные (в различные зоны мозга, например, интратекальные, и/т; внутрижелудочковые, в/ж) способы введения препаратов.

На протяжении многих лет проводится тщательное исследование зависимости эффекта ДМ от дозы и способа их введения. В целом можно сказать, что при периферическом введении (п/к и в/в) ДМ крысам в диапазоне доз 0,8 - 8 мкмоль/кг, (0,6-6,4 мг/кг) наблюдается анальгетический эффект продолжительностью 140-180 мин (Negri et al., 1995). Внутривенное введение ДМ людям в течение 30 мин (5,5 мкг/кг/мин) также вызывает длительное ярковыраженное увеличение порога болевой чувствительности (Basso et al., 1985; Sandrini et al., 1986). При центральном введении ( в/ж) ДМ в диапазоне доз 0,01-0,1 нмоль/крыса (8 - 80 нг/крыса) продолжительность эффекта составляет 120-140 мин (Negri et al., 1995).

В целом, можно сказать, что достаточно длительные анальгетические реакции, вызванные введением ДМ, наблюдаются практически у всех видов экспериментальных животных. При этом, следует отметить, что при

25 периферическом введении ДМ эффективными оказываются дозы порядка нескольких миллиграммов на килограмм веса животного, тогда как при центральном введении анальгетический эффект наблюдается при использовании доз, на 6 порядков более низких, чем в случае периферических способов введения.

Особый интерес представляет сравнение эффектов ДМ с эффектами его природных аналогов и морфина. Так, было показано, что при и/т введении людям ДМ способен проявлять анальгетическую активность, превосходящую таковую морфина в 100 раз (Basso et al., 1985). В исследованиях L.Negri et al. (1995) проводилось подробное сравнение анальгетических эффектов ДМ, морфина и [Lys7]-ДМ - природного аналога, обнаруженного сравнительно недавно в коже южноамериканской лягушки Phyllomedusa bicolor (Richter et al., 1990). Опыты проводились с использованием двух модификаций теста "отдергивания хвоста" ("tail-flick"), а также теста с механическим сдавливанием здоровой и искусственно подверженной воспалению лапы ("tail-pinch"). В тесте "отдергивания хвоста" значения А50 для дерморфина, морфина и [Lys7]-ДМ были следующими: при в/ж введении 0,030; 8,66; 0,030 (соответственно); при п/к введении 1,46; 5,8; 0,22; при в/в введении 0,46; 1,6; 0,06. Максимальный анальгетический эффект при в/ж введении наблюдался на 45; 30; 60 мин (соответственно); при в/в и п/к введении на 45; 30; 90 мин. Продолжительность анальгетического эффекта при в/ж введении составила 120; 90; 180 мин; при в/в и п/к введении -120; 20; 180 мин соответственно.

Таким образом, анальгетическая активность ДМ и его природного аналога [Lys7]-ДМ в тесте "tail-flick" превышала силу морфина в 290 раз (для обоих пептидов) при в/ж введении и в 4 и 25 раз, соответсвенно, при периферическом введении. Время достижения максимального анальгетического эффекта и продолжительность анальгезии ДМ были больше, чем морфина, но в 1,5 раза меньше, чем [Lys^-ДМ. Таким образом, при сравнении с эффектами морфина ДМ и [Lys7]-ДМ проявляют себя как более мощные анальгетики длительного действия, оказывающие влияния как на спинномозговом, так и на супраспинальном уровнях.

26

Предварительное введение налоксона (0,1 мг/кг, п/к) или налоксоназина (10 мг/кг, в/в, за 24 часа до введения пептида) снижало анальгетическую активность морфина, ДМ и [Lys7]-ДМ, что свидетельствует об опиоидной природе наблюдавшихся антиноцицептивных эффектов.

Дальнейшие исследования перспективного аналога дерморфина [Lys ]-ДМ в тесте механического сдавливания при п/к введении в дозах 1,8 и 3,6 мкмоль/кг также выявило наличие мощного анальгетического действия, превосходящего таковое ДМ. Эффект достигал максимума через 100 мин и через 40 мин, соответственно, после введения пептида и наблюдался в течение 4-х часов.

Другой природный аналог [Нур6]-ДМ также обладал анальгетическими свойствами, причем если в тесте "отдергивания хвоста" анальгезия составила лишь 75% от таковой ДМ, то в тесте "горячая пластина" она была полностью сопоставима с эффектом ДМ (Montecucchi et al., 1981b; Marchioni et al., 1992; Rossi, 1986).

Таким образом, различные природные аналоги ДМ обладают несколько отличными анальгетическими характеристиками, что, вероятно, объясняется разницей в аминокислотной последовательности, а, следовательно, и в структурной конформации, что приводит к различиям в связывании с рецепторами и к изменениям силы билогического ответа.

С целью исследования роли различных аминокислот в реализации анальгетических эффектов дерморфиноподобных пептидов был синтезирован и изучен целый ряд аналогов и фрагментов ДМ.

Так, было продемонстрировано, что введение укороченных с С-конца пептидов - ДМ(1-6), ДМ(1-5), ДМ(1-4), но не ДМ(1-3), вызывало ярковыраженную анальгезию в тестах "отдергивания хвоста" и "горячая пластина" (Broccardo et al., 1981; Marchioni et al., 1992; Rossi et al., 1983; Tartara et al., 1988). При этом было показано, что сила и длительность наблюдавшихся анальгетических реакций уменьшалась по мере укорочения аминокислотной цепи, а минимально редуцированным фрагментом ДМ, сохраняющим анальгетические эффекты, оказался ДМ(1-4).

27 у

Инъекция другого синтетического аналога - [D-Arg ]-ДМ оказалась в 4 раза менее эффективна, чем инъекция ДМ в том же тесте "отдергивания хвоста" (Kisara et al., 1986). При этом авторами выдвигается предположение о необходимости присутствия аминокислотного остатка D-Ala в соответствующем положении для реализации анциноцицептинвых свойств пептида.

Интраназально введенный [0-А1а4]-ДМ ("опилонг") вызывал более длительный анальгетический эффект, чем ДМ, что, по мнению авторов, объясняется более выраженной устойчивостью к действию эндопептидаз благодаря присутствию дополнительной D-аминокислоты в структуре пептида (Amiche et al., 1990).

Необходимо заметить, что положительно заряженные аналоги ДМ обладают более мощным анальгетическим эффектом. Ярким тому примером могут служить как природный аналог [Ьуз7]-ДМ, эффекты которого описаны выше, так и синтетический пептид TAPS ([D-Arg2 ,Sar4]-flM(l-4)), который при в/ж введении мышам проявил в тесте "отдергивания хвоста" активность в 255 раз превосходящую таковую ДМ(1-4) (Sato et al., 1987). Показано, что положительно заряженные пептиды - Tyr-D-Arg-Phe-NHCH3 и Tyr-D-Arg-Phe-N(CH3)2 - аналоги трипептида [D-Arg2]-ДМ обладают более мощным и более длительным анальгетическим эффектом по сравнению с морфином (Sakurada et al., 1992).

Существует гипотеза о том, что положительно заряженные пептиды проявляют большую активность при действии на центральные, чем на периферические ц-опиоидные рецепторы, и что "анальгетический рецептор" представляет собой особый подтип ц-рецептора (P. Melchiorri and L. Negri, 1996). Этот вывод подтверждается тем, что эффекты Arg- или Lys-содержащих пептидов блокируются налоксоназином - ji i -избирательным блокатором (Paakari et al., 1993b).

Интересно отметить, что дерморфины не вызывают анальгетических реакций у птиц (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

28

Влияние дерморфинов на электрическую активность мозга.

Имеющиеся в литературе данные о способности дерморфина вызывать судорожную активность в гиппокампе, на первый взгляд, весьма противоречивы. Однако, на самом деле, они лишь еще раз демонстрируют отличительную черту регуляторных пептидов - зависимость их эффектов от способа введения, от вида экспериментальных животных, от условий экспериментальной обстановки и пр. факторов (Dhawan, 1996; Левицкая Н.Г., Уранова М.Г. и др., 1995; Уранова М.Г.идр., 1997).

Известно, что в гиппокампе, особенно в областях САЗ, СА2 и CAI, находятся популяции ц-рецепторов (P. Melchiorri and L. Negri, 1996). В экспериментах на морских свинках было продемонстрировано, что агонисты \х-рецепторов способны существенным образом изменять электрическую активность нейронов гиппокампа (Fontani et al., 1993). Дальнейшие исследования показали, что микроинъекции ДМ в различные области мозга крыс вызывали эпилептические явления только при введении пептида в вентральный гиппокамп (CAI и САЗ области), миндалину и энторинальную кору. Эпилептический порог наиболее низок в CAI области вентрального гиппокампа, что позволяет предположить, что дерморфиноподобные пептиды при в/ж введении вызывают эпилептическую активность именно в этой зоне (Greco et al., 1994). Относительно низкие дозы ДМ (50-100 пмоль/животное) при в/ж инъекциях приводили к возникновению достаточно продолжительного "grand mal" ("большой припадок") у крыс, проявлявшегося в судорогах и легком треморе, после чего животные становились гиперактивными. Тогда как введение высоких доз ДМ (200 пмоль/животное) вызывало тонические сокращения мускулатуры туловища крыс, после чего у животных, напротив, появлялась ярковыраженная ригидность и кататония (Aloisi et al., 1982; P. Melchiorri and L. Negri, 1996; Батурина, 1989).

В гиппокампальных срезах мозга крыс низкие концентрации ДМ при нанесении препарата непосредственно на срез (50-100 нМ) приводили к заметному повышению активности нейронов в областях CAI и САЗ при предъявлении порогового уровня стимуляции с обеих коллатералей Шаффера,

29 тогда как при предъявлении стимулов более высокой интенсивности те же дозы ДМ не приводили к изменениям в активности указанных выше областей. Введение пептида в более высокой концентрации (500 нМ) приводило к ярковыраженным эпилептическим ответам в гиппокампальных срезах крыс (Jones et al., 1994). Авторы предполагают, что избыточная активация ц-опиоидных рецепторов, наблюдаемая при введении больших доз ДМ, может стать причиной судорожной активности в гиппокампе, однако в пределах нормального уровня активации рецепторы могут функционировать как модуляторы нейрональной активности в некоторых областях мозга (P. Melchiorri and L.Negri, 1996).

Следует отметить, что электрофизиологические данные, полученные в экспериментах на кроликах, несколько отличаются от результатов, наблюдавшихся на крысах. Так, существует ряд работ, свидетельствующих о том, что ДМ у кроликов вызывает седативные эффекты, не сопровождающиеся при этом эпилептическими явлениями. Так, при в/ж введении ДМ в относительно высокой дозе (1,2 нмоль/животное) электроэнцефалограмма кролика представляла собой кривую, подобную той, которая появляется во время физиологического сна. После в/в инъекции ДМ (500 нмоль/кг) на протяжении 20 мин наблюдалось ярковыраженное снижение спонтанной активности животных и увеличение времени, в течение которого животное находилось в состоянии неподвижности. Однако при этом не наблюдалось каких-либо существенных изменений ни в характере, ни в частоте электрической активности в области гиппокампа (Fontani et al., 1993; P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Аналогичные эффекты оказывало введение ДМ в третий желудочек мозга цыплят. При этом наблюдались дозозависимые поведенческие эффекты, сопровождавшиеся характерными изменениями на электрофизологическом уровне. Так, в/ж инъекция ДМ вызывала у цыплят седативные эффекты или даже сон. Причем в экспериментах по индукции сна у птиц ДМ оказался в 24 раза более эффективен, чем ß-эндорфины (Nistico et al., 1981).

30

Влияние дерморфинов на сердечно-сосудистую систему.

При изучении деятельности сердечно-сосудистой системы и влиянии различных препаратов на ее функционирование наиболее часто используемыми показателями являются величина артериального давления и частота сердечных сокращений (ЧСС). Данные о влиянии дерморфинов на сердечно-сосудистую систему весьма разнообразны, часто противоречивы, и во многом зависят от вида экспериментальных животных, дозы, способа введения и ряда других факторов.

Так, в экспериментах на крысах показано, что анальгетически активные дозы ДМ при центральном введении не оказывают существенного воздействия ни на кровяное давление, ни на ЧСС животных (Feuerstein and Faden, 1983b).

Другой группой авторов отмечается, что влияния ДМ на величину кровяного давления носили дозозависимый характер, однако если для систолического давления отмечалось повышение, то в случае диастолического давления наблюдалась несколько иная картина. Эффекты ДМ также во многом определяются местом и способом введения препарата. Так, при центральном введении крысам относительно низких (они же сверхмаксимальные анальгетические) доз ДМ (0,01-1 нм, в/ж) наблюдалось непродолжительное повышение диастолического давления, сопровождавшееся увеличением уровня циркуляции адреналина и норадреналина в крови. Тогда как инъекции высоких доз пептида (50 нм, в/ж) вызывали длительное снижение диастолического давления, сопровождавшееся ярковыраженной брадикардией (P. Melchiorri and L. Negri, 1996; Feuerstein and Zukowska, 1987).

Изменения в частоте сердечных сокращений также характеризовались прямой дозозависимостью. Так, если ДМ в дозе 0,1 нм (в/ж) не вызывала изменений в ЧСС, то более высокие дозы - 1 нм и 50 нм приводили не только к продолжительному снижению ЧСС в течение 60-90 мин, но и к возникновению каталепсии (Feurestein and Faden, 1983b).

Показано, что инъекции ДМ в преоптическую область, а также в передние гипоталамические ядра в дозе 40 пм не приводили к изменению давления, а ЧСС повышалась до 10-27%. При этом и у адреналэктомированных животных

31 введение ДМ вызывало значительное повышение ЧСС без изменений кровяного давления. Направленность эффектов сохранялась и при совместном введении атропина и ДМ в передний гипоталамус интактным животным, а блокатор ß-адренорецепторов пропраналол снимал стимулирующие эффекты ДМ на ЧСС. С другой стороны, феномен снижения ЧСС при введении ДМ в III желудочек сохранялся под действием атропина, но блокировался введением налоксона (Tartara, 1986). Увеличение дозы при гипоталамических инъкциях ДМ до 100 пм приводило к длительной тахикардии и увеличению кровяного давления (Feurestein and Faden, 1983b). Таким образом, из всех приведенных выше данных следует, что преоптическая область и передние гипоталамические ядра являются точкой приложения эффектов ДМ при активации симпатической системы. Отмечается в этих случаях и увеличение в плазме концентрации норадреналина (Feurestein and Faden, 1983b).

В литературе имеются также данные о влиянии ДМ на ЧСС и кровяное давление при периферических введениях.

При в/в введении крысам ДМ в анальгетически неактивных дозах вызывало кратковременное 40-50% падение кровяного давления, сопровождавшееся умеренной брадикардией как у нормотензивных животных, так и у спонтанно гипертензивных крыс. Падение артериального давления, наблюдающееся при в/в введении ДМ, частично блокирутся введением антител к атриальному натрий-уретическому фактору. Это открытие позволяет предположить, что влияние дерморфина на сердечно-сосудистую систему, в какой-то степени, возможно, опосредовано высвобождением атриального натрий-уретического фактора (Portolano et al., 1991).

Следует отметить, что инъекция ДМ в дозах, вызывающих анальгезию, не оказывала существенного влияния ни на кровяное давление, ни на частоту сердечных сокращений крыс (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

В другой серии экспериментов, проведенной на ненаркотизированных собаках, было показано, что введение ДМ (1-10 мкг/кг, в/в) вызывало кратковременное повышение кровяного давления (на 30 % в течение 5 мин) и учащение сердечных сокращений (на 50%) (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

32

Изменение уровня ренина тесным образом связано с ростом кровяного давления и частоты сердечных сокращений. При этом не исключено, что эффекты ДМ на функционирование сердчено-сосудистой системы опосредуются, возможно, через выброс ренина (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Влияние дерморфинов на функцию дыхательной системы.

В опытах на крысах продемонстрировано, что в низких дозах, как при центральном (до 100 пмоль/крыса), так и при периферическом (до 1,2 мкмоль/кг) способах введения ДМ вызывает стимуляцию дыхания, что проявляется в увеличении дыхательного минутного объема.

При этом отмечается, что более высокие дозы ДМ (1-30 нмоль, в/ж), введенные ненаркотизированным крысам, приводили к дозозавивимому снижению не только частоты, но и минутного объема дыхания (Paakkari et al., 1993b). Другой группой авторов проводилось исследование эффектов ДМ при введении в очень больших дозах, вызывающих каталепсию (360 нмоль/животное, в/ж; 8,3-14,2 мкмоль/кг, п/к); при этом наблюдалось значительное снижение частоты дыхания и объема вдыхаемого воздуха, а также блокировалось возникновение гиперкапнии у крыс при вдыхании воздуха, содержащего от 4% до 10% С02 (Negri, Lattanzi et al., 1998).

В работах на кроликах было также продемонстрировано дозозависимое угнетение дыхания при введении высоких доз ДМ (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

При сравнении эффектов ДМ и его аналогов на дыхательные процессы были получены похожие результаты. Так, показано, что в низких дозах, как при центральном, так и при периферическом введении ряд аналогов ДМ, подобно их природному прототипу, увеличивают дыхательный минутный объем. Было показано, что центральное введение предполагаемого щ-агониста пептида TAPS в дозах вплоть до 100 пкмоль/животное, т.е. концентрациях, достаточных для индукции у крыс налоксоназин-чувствительной каталепсии и полной анальгезии, стимулирует вентиляцию (Paakkari et al., 1993b).

33

Как и в случае введения ДМ, только очень высокие дозы его аналогов и фрагментов приводят к угнетению дыхания. Так, синтенический аналог TAPS (110 нмоль, в/ж), введенный ненаркотизированным крысам, приводил к дозозавивимому снижению частоты и минутного объема дыхания (Paakkari et al., 1993b). Введение фрагментов дерморфина - ДМ-[1-5] и ДМ-[1-4] (150-360 нмоль/кг, в/ж) подавляло дыхание в норме и дыхание, стимулированное С02 (Negri, Lattanzi et al., 1998).

Подкожное введение природного аналога [Ьуз7]-ДМ также вызывало снижение частоты дыхания и увеличение объема воздуха, обмениваемого за один дыхательный акт, при этом использовались дозы пептида, в 40 раз превосходящие дозы, необходимые для возникновения анальгезии. Следует отметить, что анальгетически активные дозы всех дерморфинов могут снижать гиперкапническую реакцию на вдыхаемый С02 (Eager et al., 1994).

О механизмах регуляции ДМ процессов дыхания известно не много. С этой целью ученые используют блокаторы различных типов рецепторов. Так, описанные выше стимулирующие эффекты низких доз ДМ и его основных метаболитов - ДМ-[1-5] и ДМ-[1-4] блокировались введением налоксона (0,1 мг/кг, п/к) и селективного Цг антагониста налоксоназина (10 мг/кг, п/к за 24 часа) (Paakkari et al., 1993b). Интересно отметить, что инъекция периферически активного опиоидного антагониста - метилбромида налоксона (3 мг/кг, п/к) не снимала стимуляции дыхания, вызываемой ДМ (P. Melchiorri and L. Negri, 1996), что, вероятно, говорит об участии центальных механизмов регуляции дыхания.

Угнетающие эффекты более высоких доз ДМ при введении ненаркотизированным крысам блокировались не только предварительной инъекцией неспецифического антагониста ^-рецепторов - налоксона, но и введением антагониста бензодиазепиновых рецепторов - флумазенилом. Аналогично угнетающие эффекты, сопровождающие введение фрагментов дерморфина-ДМ-[ 1-5] и ДМ-[1-4] (150-360 нмоль/кг, в/ж) также блокировались введением налоксона (Negri, Lattanzi et al., 1998).

34

Не исключено, что в сложном процессе регуляции дыхания дерморфином могут участвовать не только опиоидные рецепторы. Более детальное исследование возможной роли различных рецепторов неопиодного характера в регуляции дыхания показало, что введение альпразолама - препарата бензодиазепинового ряда - приводило к потенциации угнетающего эффекта, вызванного введением ДМ (1 нмоль/животное), но блокировало эффекты более высокой дозы ДМ (3 нмоль/животное). Это наводит на мысль, что бензодиазепин/ГАМК рецепторный комплекс способен модулировать процессы подавления дыхания, опосредованные стимуляцией ^-рецепторов у крыс (Paakkari et al., 1993а).

Возможно, в процессе регуляции дыхания немаловажную роль может играть и серотонергическая медиаторная система. Однако данные об участии различных типов 5-НТ рецепторов весьма разнонаправленны. Так, одной группой авторов показано, что стимулирующий эффект [Lys ]-ДМ блокируется п/к введением ритансерина (2 мг/кг) - антагониста серотониновых рецепторов типа 5-HT1D/5-HT2/5-HT7. При этом введение блокаторов рецепторов типа 5-НТ1А и 5-НТ1В/ш не оказывает существенного влияния на регуляцию дыхательных процессов (Negri et al., 1998).

Однако существуют работы, в которых показано, что активация рецепторов типа 5-НТь находящихся в спинном мозге крысы, приводит к ярковыраженной стимуляции дыхания (Sporton et al., 1991), а активация 5-НТ2 рецепторов, расположенных в IV желудочке мозга и на вентральной поверхности продолговатого мозга* приводит к угнетению дыхания (King and Holtman, 1990).

Несмотря на то, что ряд вопросов в серотонинергической регуляции дыхания остается не выясненым, сам факт участия серотониновых рецепторов в опиоидной модуляции дыхательных процессов является бесспорным.

35

Влияние дерморфинов на систему терморегуляции.

Следует отметить, что терморегуляторные эффекты дерморфинов, как и многих других регуляторных пептидов, зависят от дозы, способа введения и условий проведения эксперимента.

Двумя разными группами исследователей (Broccardo et al., 1987; Emel'yanova et al., 1996) было изучено изменение температуры тела при различных способах введения частично иммобилизованным крысам ДМ в различных дозах и при разных температурных режимах. При этом выяснилось, что независимо от способа введения, дерморфины обладали ярковыраженными дозо- и температурозависимыми эффектами.

Внутрижелудочковое введение ДМ (100 нг/животное) в условиях холода (4-7°С) приводило к снижению температуры тела. Этот эффект был не только ярковыраженным - снижение температуры составляло 3,2° С, но и характеризовался большой продолжительностью - более 4-х часов (Broccardo et al., 1987). При комнатной и при высокой температуре окружающей среды (+31-34°С) ДМ вызывал, напротив, повышение температуры тела. Этот эффект был также ярковыражен - изменение температуры достигало 3,4°С и характеризовался большой продолжительностью - более 4-х часов.

При в/ж введении ДМ в дозе 50 нг/животное в условиях холода (+4°С) наблюдался двухфазный эффект - гипертермия сменяла незначительную гипотермию (Broccardo et al., 1987).

Внутрибрюшинное введение ДМ (500 мкг/кг) в условиях холода (4-7°С), как и в случае в/ж введения, приводило к снижению температуры тела. Этот эффект был ярковыраженным - снижение температуры составляло в среднем 1,8°С и характеризовался большой продолжительностью - более 2-х часов.

При высокой температуре окружающей среды (+31-34°С) ДМ вызывал, напротив, повышение температуры тела. Этот эффект был также ярковыражен -изменение температуры достигало 0,7°С (при в/б введении 500 мкг/кг) и также характеризовался большой продолжительностью - более 2-х часов.

При в/б введении ДМ в условиях температурного комфорта (+27°-28°С) в дозе 5 мг/кг также наблюдался двухфазный эффект (гипотермия-гипертермия).

36

Введение налоксона приводило к угнетению всех температурных эффектов ДМ. Следует отметить большую продолжительность действия пептида (часто более 2-х часов) как при центральном, так и при периферическом способе введения.

Группой российских исследователей (ЕтеГуапоуа ег а1., 1996) было изучено влияние ДМ на ректальную температуру и на температуру кожи тех участков тела, которые ответственны за теплоотдачу (у крысы - хвост), что позволило приблизиться к пониманию механизмов действия этого пептида на систему терморегуляции. Высокие дозы ДМ (5 мг/кг) вызывали двухфазный эффект, в котором короткое расширение сосудов кожи хвоста сменялось длительным сужением. Более того, в условиях температурного комфорта подобный эффект был более выражен и наблюдался даже при введении ДМ в дозах 50 и 500 мкг/кг. С другой стороны, ДМ в низких дозах изменял температуру тела, не вызывая сосудистых реакций. В то же время, сосудистые реакции, вызываемые пептидом, частично облегчали изменения температуры тела и поддерживали температуру на новом уровне. Предполагается, что ДМ вызывает депрессию терморегуляторной системы и угнетает соответствующие компенсаторные сосудистые эффекты. Причем не исключено, что влияние пептида на изменение температуры тела и на компенсаторные сосудистые реакции осуществляются, вероятно, через два независимых механизма. Это подтверждается данными, полученными в экспериментах с налоксоном. Так, показано, что налоксон снижает вызванную ДМ гипертермию и гипотермию, но в некоторых случаях приводит к увеличению вызываемых пептидом сосудистых эффектов. Авторы делают предположение, что если регуляция температуры тела осуществляется через ц-опиоидные рецепторы, то сосудистые эффекты ДМ мо1ут реализовываться через другие типы опиоидных рецепторов.

Показано, что и ряд других дерморфиноподобных пептидов обладает терморегуляторными эффектами, подобными эффектам ДМ. Синтетические фрагменты дерморфина, такие как ДМ(1-6), ДМ(1-5), ДМ(1-4) вызывают зависимые от температуры окружающей среды терморегуляторные эффекты, причем минимальным фрагментом, обладающим терморягуляторными

37 свойствами, является фрагмент ДМ(1-4) (Broccardo et al., 1981; Marchioni et al., 1992; Rossi et al., 1983; Tartara et al., 1988).

Было продемонстрировано, что [Б-А1а4]-ДМ ("опилонг") также оказывает влияние на терморягуляторные процессы у крыс, однако оно менее выражено, чем у его природного прототипа - дерморфина (Amiche et al., 1990).

Кататония, вызываемая дерморфинами.

Как правило, введение больших доз дерморфинов (0,06-0,21 нмол/крыса, в/ж) вызывает у животных кататонию. При этом надо отметить, что для достижения того же эффекта требуется введение морфина в дозах, в 200 раз превосходящих дозы ДМ (10,5-38,4 нмоль/крыса). Дерморфиновая кататония характеризуется каталепсией (неспособностью животного совершить движение из неудобного положения), акинезией (потерей спонтанной двигательной активности) и ярковыраженной ригидностью скелетных мышц туловища и хвоста (Broccardo et al., 1981). Было показано, что дерморфиновая каталепсия оказывается наиболее выраженной после инъекции пептида в п. accumbens (Improta and Guglietta, 1985).

Аналогичные эффекты отмечаются и при введении аналогов ДМ, однако, как правило требуются большие по сравнению с ДМ дозы для достижения того же эффекта. Так, у животных отмечается ярковыраженная каталепсия при инъекции [Lys7]-ДМ в дозах 0,28-0,68 нмоль/крыса, в/ж, что в среднем в 4-5 раз превышает дозы ДМ, но в 60 раз меньше доз морфина, необходимых для достижения аналогичного эффекта у животных. Интересно отметить, что при введении [Lys7]^M преобладающими состояниями являются гипокинезия и акинезия, тогда как ригидность появляется только при дозах, близких к летальным.

Сравнение анальгетической (AD50) и кататонической (CD50) активности показало, что некоторые аналоги ДМ вызывают кататонию при весьма высоких дозах. Отношение AD50/CD50 для разных дерморфиноподобных пептдов

7 2 колеблется достаточно в широких пределах. Так, для ряда [Lys ]-ДМ, [D-Arg , 8аг4]-ДМ(1-4), Tyr-D-Arg-Phe-NHCH3 и Tyr-D-Arg-Phe-N(CH3)2, это отношение

38 имеет самые низкие значения (от 0,07 до 0,12), ДМ характеризуется средним показателем (0,32), a [Trp4, Asn7-NH2]-flM обладает самым высоким значением AD5o/CD5o, что в 500 раз выше, чем у [Ьуз7]-ДМ (Negri et al., 1992).

При в/ж введении [Trp4, Asn7-NH2]-,Z3M в дозах, не достаточных для проявления анальгетической активности в тесте "отдергивания хвоста", этот пептид, тем не менее, способен вызывать длительную и ярковыраженную каталепсию, которая сопровождается слабостью скелетной мускулатуры туловища и тоническим сокращением мышц-разгибателей пальцев.

Следует отметить, что каталептические эффекты описанных выше пептидов, в отличие от анальгетических, не предотвращаются введением налоксоназина - специфического блокатора щ-рецепторов. Однако блокируются предварительным введением налоксона - неспецифического блокатора р.-рецепторов. Таким образом, авторами делается предположение о том, что механизмы, опосредующие анальгетические и каталептические воздействия опиоидных пептидов, различны, причем эти различия имеют место, вероятнее всего, на уровне активации разных подтипов ^-рецепторов (Negri et al., 1995).

Влияние дерморфинов на поведение животных Поведенческие эффекты дерморфина по весьма немногочисленным литературным данным свидетельствуют о разнонаправленности их характера и во многом зависят от способа введения, от вида экспериментальных животных и от их физиологического состояния.

Ярким тому примером может служить тот факт, что в экспериментах на крысах низкие дозы ДМ при введении в желудочки мозга приводят к увеличению локомоторной активности животных, тогда как высокие дозы вызывают кататонию (Paakari et al., 1990). В экспериментах на мышах было продемонстрировано, что если внутримозговые инъекции ДМ (в дозе 12,5-125 пмоль/жив) приводили к повышению локомоторной активности животных, то в/в введение ДМ (1-5 мг/кг) приводило к снижению двигательной активности животных (Melchiorri, 1984).

39

Как и морфин, некоторые аналоги ДМ характеризуются двухфазным воздействием на двигательную активность животных. Например, введение тетрапептида Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA) (0,1-1,0 мкг/крыса, в/ж) вначале вызывает угнетение локомоторной активности, которое затем сменяется активацией горизонтальной двигательной активности и увеличением числа стоек (Meyer and Mclaurin, 1995; P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Имеет значение также и генетическая линия экспериментальных животных. Так, внутримозговые введения ДМ приводили к увеличению спонтанной двигательной активности у мышей линии С57В1/6 и к ее существенному снижению у мышей линии DBA/2 (Allegra et al., 1982). Показано, что мыши линии DBA/2 обладают меньшим количеством опиоидных рецепторов в области стриатума, чем мыши линии С57В1/6. Отмечается также, что мыши линии DBA/2 характеризуются большей чувствительностью к стрессогенности экспериментальной обстановки, что может быть связано с разницей в чувствительности к р,- и 6-рецепторам. Авторы не исключают также возможной разницы в функционировании медиаторных систем мозга у генетически различных линий мышей (Castellano and Pavone, 1985).

Дерморфины способны также оказывать влияние на процессы обучения и формирования памятного следа. Было показано, что описанные ранее линии мышей отличаются тем, что процессы формирования памяти у них зависят от того, агонисты каких рецепторов участвуют в их регуляции, т.е. они чувствительны к введению различных агонистов |> и 8-рецепторов. Так, внутримозговые введения сразу после сеанса обучения малых доз (5 нг) ДМ -агониста ц рецепторов и DADLE - агониста 8-рецепторов приводили к ухудшению выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) у мышей линии DBA/2 и С57В1/6, тогда как инъекции больших доз пептидов (50 нг) вызывали ухудшение формирования навыка у линии DBA/2, но улучшение у линии С57В1/6 (Pavone, 1990). В данном случае влияние пептидов на процессы обучения, а именно, на процессы формирования памятного следа у животных, зависили не только от дозы вводимого препарата, но и от линии экспериментальных животных, а, следовательно, и от существующей разницы

40 между уровнем и метаболизмом различных медиаторов и их путей пересечения с воздействиями, оказываемыми опиоидными пептидами на модуляцию памяти (Castellano and Pavone, 1985).

Показано, что аналог ДМ ТАРА (Tyr-D-Arg-beta-Ala-NH2) при в/ж введении в дозе 0,3-3 нг приводил к замедлению обучения мышей в тесте выработки УРПИ, приводя к нарушению процессов консолидации памятного следа, не влияя при этом на другие поведенческие реакции животных, такие как, например, двигательная активность (Ukai et al., 1993; P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Таким образом, данные о влиянии ДМ и его аналогов на поведение и на процессы обучения животных весьма немногочисленны и разнонаправленны, и касаются в основном механизмов регуляции двигательной активности животных и процессов обучения в тестах с отрицательным подкреплением.

Толерантность и зависимость

Отличительной чертой опиоидных пептидов, в том числе дерморфина, является их способность вызывать толерантность и зависимость.

В экспериментах по исследованию анальгетической активности ДМ на крысах и мышах было обнаружено, что, как в случае центрального, так и в случае периферического способа введения, для ДМ было характерно значительно более медленное развитие толерантности, чем для морфина. Так, в/ж введение ДМ в дозе 62 пмоль/час приводило к тому, что при тестировании животных при помощи методики "tail-flick" анальгетическая реакция наблюдалась у 95% крыс через 4 часа после начала введения ДМ, у 82% - через 24 часа и у 65% животных - после 4 дней инфузии пептида (Broccardo et al., 1981).

Необходимо отметить, что толерантность в отношении каталепсии и мышечной ригидности при введении ДМ возникала раньше, чем в отношении анальгезии (Broccardo et al., 1985b; Negri et al., 1995).

Для изучения возможного механизма возникновения толерантности при введении опиоидных пептидов нередко используются аналоги ДМ, среди них особое место занимает природный гептапептид [Lys ]-ДМ. Были выявлены некоторые интересные особенности этого пептида, ставящие его в один ряд с весьма перспективными в плане возможного клинического применения препаратами.

Так, было обнаружено, что если толерантность в отношении морфиновой анальгезии достигала максимума на 4-ый день хронического п/к введения мышам алкалоида, то толерантность в отношении анальгезии, вызванной природным аналогом [Lys7]-,Z]M, возрастала лишь на 7-ой день введения пептида. Оценка анальгетических эффектов морфина на 7-ой день у толерантных к морфину мышей свидетельствует о снижение максимально возможного анальгетического ответа, тогда как [Lys7]-ДМ даже при большей степени толерантности способен вызывать максимальный анальгетический эффект.

Таким образом, природный аналог ДМ, превосходящий по эффективности морфин, проявляет себя как полный агонист у животных с выработанной толерантностью, тогда как морфин в тех же условиях ведет себя как частичный агонист (P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

Особого внимания заслуживает рассмотрение феномена перекрестной толерантности у животных, что может пролить свет на процессы, лежащие в основе механизма действия дерморфина.

Показано, что острое введение морфина крысам с выработанной к ДМ толерантностью приводило к значительному снижению как анальгетического, так и каталептического ответа на алкалоид, что свидетельствует о возникновении перекрестной толерантности у животных. Введение ДМ крысам, толерантным к морфину, вызывало тот же каталептический эффект, что и у интактных животных, однако способность ДМ вызывать анальгетическую реакцию у крыс, толерантных к морфину, оказалась существенно сниженной (Broccardo and Improta, 1985а; Stevens and Yaksh, 1986). Описанные данные свидетельствуют в пользу того, что механизмы, опосредующие анальгетическую и каталептическую реакцию животного в ответ на введение ДМ, различны, а следовательно, могут быть реализованы через различные подтипы опиодных рецепторов.

42

Существует целый ряд работ, посвященный описанию перекрестной толерантности у животных при введении различных аналогов ДМ. Так, показано, что при п/к введении мышам [Lys7]-ДМ в отличие от эффектов его природного прототипа - ДМ, наблюдалась полная перекрестная толерантность с морфином, так анальгетический и каталептический ответы были существенно снижены при введении [Lys7]-/1M животным, толерантным к морфину, что говорит о некотором отличии в механизме действия ДМ и его природного аналога, опосредующего возникновение анальгетической и каталептической реакций животных (Negri et al., 1995).

У крыс с выработанной толерантностью к морфину была отмечена также существенная толерантность к [D-Arg2, 8аг4]-ДМ(1-4). Однако анальгетическая активность, вызываемая введением морфина крысам, толерантным к [D-Arg , Sar4]-flM(l-4), не снижалась, что свидетельствует о том, что у [D-Arg2, Sar4]-ДМ(1-4) более ограниченное число мест связывания в ноцицептивной системе, чем у морфина (Sakurada et al., 1993).

При исследовании опиоидной активности нередко уделяют особое внимание описанию синдрома отмены, характер его протекания является неотъемлемой характеристикой любого препарата, используемого в клинике.

В экспериментах на крысах было показано, что синдром отмены протекал значительно мягче у животных, подверженных хроническому действию ДМ, чем у животных, получавших в течение длительного времени морфин (Broccardo et al., 1985а).

Аналогичная ситуация была описана и для ряда природных и синтетических аналогов ДМ, что, по-видимому, является отличительной особенностью этого семейства опиоидных пептидов. Так, резкая отмена [Lys7]-ДМ у толерантных к нему мышей протекала достаточно мягко и не сопровождалась потерей веса, как в случае морфиновой отмены (Negri et al., 1995).

Работы по исследованию ряда других аналогов ДМ подтвердили, что симптомы отмены, наблюдающиеся на фоне введения налоксона, менее выражены у животных с выработанной зависимостью к дерморфиноподобным

43 пептидам, чем у морфин-зависимых крыс (Nakata et al., 1986; Chaki et al., 1988; Melchiorri and Negri, 1996).

Таким образом, дерморфины характеризуются значительно более медленным развитием толерантности и зависимости по сравнению с морфином, а синдром отмены у животных, подверженных хроническому действию ДМ, протекает в более мягкой форме, чем в случае длительного введения морфина.

Влияние дерморфинов на функции медиаторных и эндокринных систем организма.

Перед исследователями всегда стоит вопрос о механизме действия того или иного вещества. Особый интерес представляет выяснение того, каким образом исследуемое вещество воздействует на различные функции организма -напрямую или же, запуская каскад реакций с участием ряда посредников. Для решения этой проблемы необходимо знать, каким образом ДМ воздействует на деятельность различных эндогенных регуляторных систем организма, в частности, медиаторной и эндокринной.

Доказано, что катехоламины играют важную роль в регуляции сложных форм поведения. Однако об участии ДМ в функционировании медиаторных систем на сегодняшний день известно немного, а имеющиеся сведения весьма противоречивы.

Показано, что введение ДМ в желудочки мозга в относительно высоких дозах (1-5 ммоль/кг) вызывало ярковыраженную стимуляцию симпато-адреналовой системы. Уровни катехоламинов в крови при введении пептида в дозах 0,1-100 нмоль/кг были значительно увеличены. В дозе 100 нмоль/кг ДМ вызывал 2-15-кратное повышение уровня адреналина, норадреналина и метаболита дофамина - дигидроксифенилацетиловой кислоты и предшественника катехоламинов - 3,4-дигидроксифенилаланина в плазме крови (Siren et al., 1989; Feuerstein et al., 1983a; Feuerstein et al., 1983b; Feuerstein et al., 1987).

Голландские исследователи (Versteeg et al., 1991), изучая воздействие различных соединений на высвобождение моноаминов из нейронов

44 центрального серого вещества, показали, что синтетические аналоги ДМ -DAMGO и [D-Arg2,Lys4]-/lM(l-4) подавляют высвобождение норадреналина. Причем, этот эффект блокировался налоксоном. По мнению авторов, высвобождение норадреналина в центральном сером веществе вызывается как через а2-адренорецепторы, так и через ц-опиоидные рецепторы.

Более детальные исследования показали, что ДМ влияет на обмен дофамина, приводя к 35-40 % увеличению дигидроксифенилацетиловой кислоты (ДОФА) в полосатом теле, причем концентрация самого дофамина при этом остается неизменной (Muller, 1983). В некоторых работах продемонстрировано л также, что дерморфины, в частности его синтетический аналог DALDA ([D-Arg , Ьуз4]-ДМ( 1,4)-амид), подавляет избыточное высвобождение дофамина при электрической стимуляции неостриатума, при этом доказано, что торможение выделения дофамина осуществляется на пресинаптическом уровне (Schlosser et al., 1995).

Работ, посвященных воздействию ДМ на серотонинергическую систему, существует немного. И лишь косвенные данные указывают на то, что некоторые эффекты дерморфинов могут быть опосредованы именно участием серотонинергической системы.

При исследовании возможного антиалкогольного действия ДМ было обнаружено, что пептид ( 200 мг/кг) при ежедневном в/б введении в течение 10 дней снижал волевое потребление алкоголя на 3-4 недели. Причем, этот эффект сопровождался значительным снижением уровней серотонина и его метаболита, 5-HIAA, в гипоталамусе (Gromova et al., 1989).

Как было более детально описано выше, дерморфины участвуют в сложном процессе регуляции дыхания, немаловажную роль в котором играют серотониновые рецепторы. Показано, что введение различных блокаторов серотониновых рецепторов препятствует развитию стимулирующих эффектов ДМ и его аналогов, а активация различных подтипов 5-НТ - рецепторов оказывает модулирующее, не всегда однонаправленное влияние на дыхательные процессы у животных (Negri et al., 1998).

45

Также было показано, что существуют пути пересечения ГАМК-ергической и опиоидной систем. В ряде работ было продемонстрировано, что воздействие ДМ на дыхательные процессы у крыс блокировалось не только введением антагониста ц-опиоидных рецепторов, но и инъекцией антагониста бензодиазепиновых рецепторов - флумазенилом. Полученные данные, по мнению авторов, свидетельствуют в пользу того, что в сложном процессе регуляции дыхания могут совместно участвовать как ГАМК-ергическая, так и ц-опиоидная системы (Paakkari et al., 1993а).

Недавно было заявлено о возможном сосуществовании ГАМК и ряда эндогенных опиодных пептидов в нервных окончаниях в области ventral pallidum (Hoffinan et al., 1991).

Итак, данные о воздействие ДМ на различные медиаторные системы весьма немногочисленны и порой разноречивы. В целом, можно заключить, что ДМ оказывает влияние на синтез различных медиаторов и на их обмен, а также на выброс в пресинаптическое пространство и на выход медиаторов в кровяное русло. Таким образом, пептид участвует в регуляции многих физиологических функций организма не только через собственные рецепторы, но и опосредованно через влияние на функциональное состояние основных медиаторных систем.

Поскольку эндокринная система осуществляет гуморальную регуляцию практически всех важнейших физиологических функций организма, то особого внимания заслуживает вопрос об участии ДМ в регуляции работы этой системы, в особенности главного его компонента - гипофиза.

Существуют сведения, что как п/к введение (0,4-6,2 мкмоль/кг), так и в/ж (1,2 нмоль/кг) введение крысам ДМ и его природного аналога [Нур6]-ДМ приводило к дозозависимому 2-15-кратному увеличению выброса пролактина (Montecucchi et al., 1981b). Поскольку в экспериментах на изолированных клетках гипофиза крысы ДМ не вызывал выброса пролактина, авторы предполагают, что пептид действует не напрямую на клетки гипофиза, а опосредованно через воздействия на клетки гипоталамуса (Rossi et al., 1983; P. Melchiorri and L. Negri, 1996).

46

В другой серии экспериментов было показано, что введение людям ДМ (5,5 мкг/кг/мин в течение 30 мин) приводило к существенному увеличению концентрации пролактина и гормона роста в плазме крови. Показано также, что на фоне введения соматостатина происходило блокирование дерморфин-стимулированной секреции гормона роста и пролактина (иЬегй е1 а1., 1983). Исследовалось влияние ДМ у больных с микро- или макросекрецией пролактина, а также у пациентов с микропролактиномой или с макропролактиномой. У больных с микропролактиномой инъекция ДМ приводила к увеличению концентраци гормона роста в крови, при этом уровень секреции пролактина не изменялся. Пациенты с макропролактиномой оказались нечувствительны к инъекции ДМ (иЬегй ег а1., 1983). Вероятно, в описанном случае в основе опиатергической модуляции синтеза гормона роста и пролактина лежат разные механизмы.

Однократное введение ДМ крысам приводит к увеличению базального и стресс-индуцированного уровня кортикостерона и Р-эндорфина в плазме. Причем эти эффекты блокируются предварительным введением налоксона. При этом длительное введение ДМ не приводило к существенному изменению основного уровня кортикостерона и Р-эндорфина, но вызывало значительное уменьшение стресс-индуцированного возрастания концентрации этих гормонов в плазме крови крыс (ЦЬегй е1 а1., 1995). Таким образом, не исключено, что некоторые эффекты ДМ, наблюдаемые в стрессогенных ситуациях, могут быть опосредованы именно его влияниями на эндокринную систему организма, в частности, на выброс кортикостерона и Р-эндорфина.

Исследования изменений уровня кортикоидов в плазме после введения ДМ людям показали, что снижается концентрация кортизола, незначительно снижается концентрация АКТГ и незначительно повышается концентрация альдостерона. Снижение концентрации АКТГ и кортизола может объясняться, по мнению авторов, способностью ДМ снижать стимуляцию активного выхода этих гормонов, хотя, возможно и непосредственное ингибирование ДМ синтеза кортизола (иЬегй е! а!., 1983)

47

Внутривенное введение ДМ людям приводило к повышению концентрации тиреотропина в плазме, причем совместное введение ДМ и соматостатина подавляет эффект ДМ (Uberti, 1986). Кроме того, показано, что холод-индуцированный выброс в плазму тиреолиберина и тиреотропина блокируется предварительным введением ДМ (Mitsuma et al., 1985).

Введение ДМ людям п/к или в/в ингибировало секрецию лютеинизирующего гормона (Uberti, 1983). Более детальные исселедования выявили, что у женщин репродуктивного периода и у женщин в период постменопаузы, получающих препараты эстрогена и прогестины, в/в введение пептида приводило к снижению концентрации не только лютеинизирующего гормона, но также и фолликулостимулирующего гормона в плазме крови (Melchiorri and Negri, 1996).

Существуют также работы, в которых обсуждается вопрос об участии ДМ в регуляции углеводного обмена. Так, после в/в введения пептида крысам в дозе 0,1-10 мкг/животное отмечается увеличение концентрации глюкагона и снижение концентрации глюкозы в крови (Gullner, 1983).

Таким образом, направленность эффектов ДМ в изменении гормонального баланса оказывается во многом зависимой от используемых в эксперименте испытуемых, доз и способов введения. ДМ может оказывать как прямое, так и опосредованное воздействие либо на синтез, либо на выброс различных гормонов в кровь.

Итак, ДМ обладает широким спектром физиологической активности, в реализации которой участвуют преимущественно различные подтипы ц-опиоидных рецепторов. Показано, что высокое сродство и избирательность пептида именно к этому типу рецепторов определяется спецификой его аминокислотной последовательности. Предполагают, что одной из важнейших особенностей структуры природных дерморфинов, определяющей их высокую избирательность к ju-рецепторам, является наличие циклической аминокислоты Pro в 6-м положении (в случае ДМ) и гидроксипролина (в случае [Нур6]ДМ), которые предотвращают или, по меньшей мере, существенно уменьшают, вероятность деградации пептида под действием эндопептидаз, например,

48 энкефалиназы А, что приводит к повышенной устойчивости пептида и, следовательно, к пролонгации его биологической активности (Malfroy et al., 1982). Установлено также, что присутствие [Pro6] остатка на С-конце повышает вероятность присутствия в пептиде (З-поворота, необходимого для проявления специфической биологической активности (Tancredi et al., 1991).

Целью настоящего исследования было комплексное изучение воздействия ДМ на различные формы поведения животных, болевую чувствительность и функцию сердечно-сосудистой системы, а также выявление зависимости характера физиологической активности пептида от стерео-химических модификаций аминокислотного остатка [Pro6].

49

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на половозрелых самцах нелинейных белых крыс массой 200-230г. В экспериментах по исследованию кардиотропных эффектов дерморфинов использованы крысы массой 300-350 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, все эксперименты проводили в период с Ю00 до 1700 часов. Всего использовано 1478 животных.

В работе исследовали следующие пептиды: дерморфин Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 (ДМ); природный аналог Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr- Hyp-Ser-NH2 ([Нур6]ДМ); синтетический аналог Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-DPro-Ser-NH2 ([ОРго6]ДМ); синтетическии аналог Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-dHPro-Ser-NH2([dHPro6]flM).

Пептиды синтезированы в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН. В работе использовали также препарат налоксона ("SERVA", ФРГ).

При применении внутрибрюшинного (в/б) способа инъекции препараты вводили в виде водного раствора из расчета 1 мл/кг веса животного. Контрольные животные получали инъекцию эквивалентного объема дистиллированной воды. Пептиды вводили за 20 мин до тестирования в дозе 500 мкг/кг (0,5 мг/кг); налоксон вводили в дозах 1 мг/кг и 5 мг/кг за 15 мин до инъекции пептида.

В опытах по исследованию действия ДМ на фоне налоксона животные получали две в/б инъекции, вторая инъекция следовала через 15 мин после первой, тестирование осуществляли через 20 мин после второй инъекции. Животных разделили на 4 группы:

1-я группа (две инъекции воды);

2-я группа (первая инъекция налоксона, вторая инъекция воды);

3-я группа (первая инъекция воды, вторая инъекция дерморфина);

4-я группа (первая инъекция налоксона, вторая инъекция дерморфина).

50

В отдельной серии экспериментов проводили также исследование зависимости эффекта ДМ от дозы, с этой целью животным вводили в/б пептид в дозах 5 мкг/кг и 50 мкг/кг.

При изучении влияния интраназального (и/н) введения дерморфинов на болевую чувствительность животных использовали следующие дозы пептидов: 5 мкг/кг и 20 мкг/кг.При этом пептиды вводили в объеме 20 мкл/животное при помощи микрощприца /фирмы Hamilton/. Контрольные животные получали и/н инъекцию эквивалентного объема дистиллированной воды. Каплю объемом 5 мкл подносили к внешнему крылу ноздри на вдохе животного. Исследование эффектов пептидов на болевую чувствительность животных начинали через 10 мин после инъекции.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Уранова, Мария Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1.Анализ эффектов дерморфина, вводимого внутрибрюшинно в дозе 500 мкг/кг, показал, что пептид оказывает воздействие на ориентировочно-исследовательское поведение животных, причем характер нейротропных эффектов зависит от условий окружающей обстановки. Эффекты пептида носят дозозависимый характер. Налоксон препятствует проявлению воздействия дерморфина.

2. Дерморфин (500 мкг/кг, в/б) не оказывает влияния на формирование и сохранение условных рефлексов с положительным и с отрицательным подкреплением.

3. Дерморфин (500 мкг/кг, в/б) вызывает увеличение длительности кардиоинтервалов у животных, находящихся в свободном поведении.

4. Дерморфин, вводимый внутрибрюшинно в дозе 500 мкг/кг, а также интраназально в дозах 5 и 20 мкг/кг, обладает анальгетической активностью, причем наиболее длительный эффект наблюдается при использовании дозы 20 мкг/кг.

5. Замена аминокислотного остатка [Pro6] на [Hyp6] вызывает ослабление угнетающего воздействия пептида на спонтанное поведение животных, приводя при этом к пролонгации кардиотропного эффекта пептида и к усилению анальгетической активности пептида (при интраназальном введении).

6. Замена аминокислотного остатка [Pro6] на [DPro6] вызывает ослабление угнетающего воздействия пептида на спонтанное поведение животных, приводя при этом к усилению анальгетического эффекта и пролонгации кардиотропного воздействия пептида. t% (\

7. Замена аминокислотного остатка [Pro ] на [dHPro ] приводит к практически полному исчезновению угнетающего влияния пептида на спонтанное поведение животных, вызывая при этом усиление ориентировочно-исследовательской реакции животных в стрессогенных условиях. Данная замена приводит к усилению анальгетического эффекта и к пролонгации кардиотропного воздействия пептида.

194

8. Продемонстрирована важная роль аминокислотного остатка [Pro6] в реализации физиологической активности дерморфина. Показано, что природные пептиды - дерморфин и [Нур6]-дерморфин оказывают преимущественное воздействие на поведение животных, тогда как синтетические аналоги - [DPro6]-дерморфин и [dHPro6]-дерморфин в той же дозе обладают более выраженным анальгетическим и кардиотропным действием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог проделанной работе, можно сделать некоторые заключения о роли и механизме действия дерморфинов в организме, а также о перспективах дальнейшего изучения данных пептидов и их структурных аналогов.

Дерморфины принадлежат к группе опиоидных пептидов, главным свойством и отличительной чертой которых является способность вызывать ярковыраженную анальгезию. Показано, что представители данного семейства являются самыми мощными анальгетиками среди известных опиоидных пептидов (Broccardo et al., 1981; Rossi et al., 1983; Батурина, 1989; Marchioni et al., 1992). Дерморфины, обнаруженные впервые в коже южноамериканской лягушки (Broccardo et al., 1981), позднее были найдены и в мозге млекопитающих (Buffa, 1982; Melchiorri et al, 1984), что послужило причиной интенсивных исследований физиологической активности данной группы опиоидных пептидов.

В наших экспериментах для проведения комплексного исследования физиологической активности дерморфина (ДМ) была выбрана доза - 500 мкг/кг, которая является "пороговой" в тестах по исследованию болевой чувствительности у крыс. Показано, что при внутрибрюшинном (в/б) введении ДМ в этой дозе снижение болевой чувствительности у животных было слабовыражено и весьма не стабильно. При этом оказалось, что ДМ в той же дозе способен существенным образом изменять как ориентировочно-исследовательское поведение, так и спонтанную двигательную активность крыс. Однако характер и выраженность влияний пептида на спонтанное поведение животных, во многом, зависят от условий окружающей среды.

Так, было показано, что в бесстрессорных условиях ДМ оказывает ярковыраженное угнетающее воздействие как на ориентировочно-исследовательскую реакцию, так и на спонтанную двигательную активность крыс. Более детальное изучение эффектов ДМ позволяет предполагать, что пептид влияет преимущественно на ориентировочно-исследовательскую реакцию животных. Следует отметить, что угнетающее действие ДМ на горизонтальную компоненту ориентировочно-исследовательской реакции и

185 спонтанной двигательной активности крыс существенно более выражено, чем на вертикальную, что, вероятно, объясняется различиями в механизмах регуляции горизонтальной и вертикальной составляющих двигательной активности животных (Michael-Titus et al., 1989; Herz, 1993).

Не исключено, что наблюдаемые эффекты ДМ связаны с его влиянием на мотивационно-эмоциональную сферу поведения. Судя по полученным результатам, пептид влияет на баланс мотиваций: оборонительной и исследовательской. В бесстрессорных условиях, когда баланс мотиваций смещен в сторону ориентировочно-исследовательской реакции, ДМ оказывает угнетающее действие на эту форму поведения, которое сопровождается снижением эмоциональной напряженности животных. Как известно, эмоциональнй статус животного и побуждение к действию (то есть мотивации и эмоции), а также во многом процессы научения и памяти контролируются лимбической системой (Симонов, 1981; Дудел и др., 1985). Показано, что данная область мозга характеризуется высокой плотностью опиатных рецепторов и большой концентрацией эндогенных опиоидов (Хухо, 1990). Таким образом, не исключено, что эффекты ДМ можно объяснить непосредственным воздействием пептида на структуры лимбической системы.

При изучении эффектов ДМ на фоне действия стрессирующих факторов, мы сталкиваемся с закономерностью, характерной для многих регуляторных пептидов. Имеются в виду факты, свидетельствующие о том, что вводимый извне пептид, оказывая определенное влияние или не воздействуя на конкретный физиологический показатель, находящийся в пределах нормы, начинает оказывать обратное действие на величину этого показателя, как только последний значительно меняется под влиянием того или иного фактора (Антонова и др., 1984; Каменский и др., 1986). В нашей работе было продемонстрировано, что ДМ, смещая баланс мотиваций в сторону угнетения ориентировочно-исследовательской реакции в бесстрессорных условиях, под влиянием стрессирующих факторов (смена освещенности) приводит, напротив, к смещению баланса мотиваций в сторону преобладания ориентировочно-исследовательской реакции. Данное свойство пептида, вероятно, может играть

186 важную роль при адаптации животных к изменениям окружающей среды. Подобные влияния уже обнаружены у некоторых эндогенных опиоидов (бета-эндорфинов) и ряда их производных (Greckch et al., 1990; Kohler and Rauca, 1992; Becker and Grecksch, 1992, Dinzburg et al., 1995).

При этом на фоне постоянно действующих стрессирующих стимулов -электрической звонок и яркий свет - ДМ оказывает общее угнетающее воздействие на спонтанное поведение животных, приводя к смещению баланса мотиваций в сторону угнетения ОИР.

В результате исследования зависимости эффектов ДМ от дозы было показано, что влияния пептида на спонтанное поведение животных носили ярковыраженный дозозависимый характер, при этом минимальная доза ДМ, оказываяющая воздействие на спонтанное поведение крыс - 50 мкг/кг. Дальнейшее снижение дозы до 5 мкг/кг приводило к полному исчезновению эффектов ДМ.

Важно отметить, что ДМ, оказывая ярковыраженное влияние на ориентировочно-исследовательскую реакцию и на спонтанную двигательную активность крыс, тем не менее, практически не влияет на процессы обучения в тестах как с положительным, так и с отрицательным подкреплением. Известно, что при введении пептида до начала обучения исследуется его возможное влияние на процессы восприятия и оценки экспериментальной обстановки, а также на процессы консолидации памятного следа, тогда как инъекция сразу после сеанса обучения оказывает влияние на процессы консолидации памятного следа (Campo, 1992). При использовании введения как до, так и после сеанса обучения было продемонстрировано, что в тестах выработки условных рефлексов ДМ не влияет на перечисленные выше этапы обучения.

Нами было показано, что изменения в поведении животных, наблюдаемые после введения ДМ, сопровождаются также определенными изменениями в функциональном состоянии различных физиологических систем, в частности, сердечно-сосудистой. Большинство исследователей в данной области используют в экспериментах либо наркотизированных, либо иммобилизированных животных, что на наш взгляд, несколько осложняет

187 интерпретацию эффектов вводимых пептидов. В проводимых нами экспериментах мы изучали кардиотропные влияния ДМ на свободно передвигающихся животных. Подобного рода исследования, насколько нам известно из литературных источников, проводились впервые. Было показано, что ДМ в дозе 500 мкг/кг при в/б введении обладает отрицательным хронотропным эффектом, что необходимо учитывать при анализе и интерпретации результатов, полученных в других тестах, для более комплексной оценки эффектов пептида.

Таким образом, литературные данные и проведенные нами исследования позволяют заключить, что ДМ участвует в регуляции функций различных систем организма. Можно предположить несколько механизмов действия пептида. Так, из литературных источников известно, что влияние опиоидов связано с их модулирующим (как правило, пресинаптическим ингибирующим) действием на экзоцитоз медиаторов в нейросекреторных образованиях и взаимодействием при этом как с классическими нейромедиаторами, так и с нейропептидами (Ашмарин и Каменская, 1988).

Другим механизмом действия ДМ является, безусловно, его взаимодействие со специфическими опиатными рецепторами. В наших исследованиях было показано, что предварительное введение неспецифического блокатора опиоидных рецепторов - налоксона (1 и 5 мг/кг, в/б) дозозависимо препятствует развитию угнетающего воздействия ДМ на спонтанное поведение животных, что подтверждает опиоидную природу наблюдаемых эффектов пептида Как известно из литературных источников, в реализации физиологической активности ДМ, участвуют преимущественно различные подтипы ц-опиоидных рецепторов (Broccardo et al., 1981; Amiche et al., 1990). Показано, что высокое сродство и избирательность ДМ именно к этому типу рецепторов определяется спецификой его аминокислотной последовательности. Предполагают, что одной из важнейших особенностей структуры природных дерморфинов, определяющей их высокую избирательность к ц-рецепторам, является наличие остатка аминокислоты [Pro6] (в случае ДМ) и гидроксипролина [Hyp6] (в случае [Hyp6]ДМ), который повышает вероятность присутствия в

188 пептиде ^-поворота, необходимого для проявления специфической биологической активности (Tancredi et al., 1991). Установлено также, что наличие остатка циклической аминокислоты [Pro6] или его модификации предотвращает или, по меньшей мере, существенно уменьшает, вероятность деградации пептида под действием карбоксилдипептидаз, что приводит к повышенной устойчивости пептида и, следовательно, к пролонгации биологической активности (Malfroy et al., 1982).

В связи с вышесказанным нам представилось интересным исследовать влияние стерео-химических модификаций аминокислотного остатка [Pro6] на характер физиологической активности ДМ. С этой целью было проведено комплексное исследование влияния ряда структурных аналогов ДМ на различные формы поведения, болевую чувствительность и функцию сердечнососудистой системы животных.

Было показано, что замена [Pro6] на [Hyp6] приводит к снижению анальгетической активности, а также не только к ослаблению угнетающих воздействий пептида на спонтанное поведение и эмоциональное состояние крыс, но и к существенным изменениям в характере этих воздействий. В частности, было показано, что [Нур6]ДМ, в отличие от ДМ, вызывает стимуляцию угашения ориентировочно-исследовательской реакции, приводя к преобладанию преимущественно пассивно-оборонительного поведения на фоне действия стрессирующих стимулов. [Нур6]ДМ, подобно ДМ, не влияет на процессы консолидации памятного следа в тестах, как с положительным, так и с отрицательным знаком подкрепления. В то же время замена [Pro6] на [Hyp6] приводит к некоторому усилению и пролонгации кардиотропного эффекта пептида.

Замена [LPro6] на [DPro6] в одном из синтетических аналогов ДМ приводит к ярковыраженному усилению анальгетической активности и к пролонгации кардиотропного действия пептида. При этом обнаружено, что данная замена приводит также к усилению и пролонгации эффектов ДМ на поведение животных, предварительно адаптированных к экспериментальным условиям. Данная модификация ведет к некоторому ослаблению, а порой и к полному

189 исчезновению воздействий пептида на поведение и на эмоциональное состояние животных, находящихся в незнакомой экспериментальной обстановке или при смене освещенности. При этом замена [LPro6] на [DPro6] приводит и к некоторым изменениям в характере эффектов пептида. Так, под влиянием постоянно действующих стрессирующих факторов [БРго6]ДМ, в отличие от ДМ, приводит к смещению баланса мотиваций в сторону преобладания ориентировочно-исследовательской реакции. Данная замена приводит и к изменениям в процессе обучения животных. Так, на фоне угнетающего влияния [ОРго6]ДМ на исследовательское поведение животных в первый день обучения, возникают некоторые нарушения в восприятии и оценке животными экспериментальной обстановки, следствием чего является ухудшение обучения в тесте условного рефлекса пассивного избегания. Подобно ДМ, синтетический пептид не оказывает влияния на тревожно-фобический статус животных и на процессы консолидации ни в тестах с отрицательным, ни в тестах с положительным подкреплением.

Отдельного внимания, на наш взгляд, заслуживают эффекты синтетического гептапептида [с!НРго6]ДМ. Показано, что данная модификация приводит к ярковыраженному усилению анальгетических эффектов и к пролонгации кардиотропного действия пептида. При этом наблюдается существенное ослабление вплоть до полного исчезновения угнетающих воздействий синтетического аналога на спонтанное поведение животных как в бесстрессорных условиях, так и при смене освещенности. Кроме того, замена [Pro6] на [dHPro6] приводит к изменению в характере влияний [<ЗНРго6]ДМ на поведение животных, предварительно адаптированных к экспериментальным условиям. Так, синтетический аналог [ёНРго6]ДМ воздействуют преимущественно на уровень спонтанной двигательной активности, в отличие ДМ, который влияет в основном на ориентировочно-исследовательское поведение. Показано также, что [dHProб]ДМ, в отличие от ДМ, способен стимулировать угашение исследовательского поведения животных. Другим отличием от ДМ, является способность [dHPro6]ДМ приводить к замедлению угашения ориентировочно-исследовательской реакции под влиянием постоянно

190 действующих стрессирующих факторов. Подобно природному прототипу, [с!НРго6]ДМ не оказывал существенного влияния на тревожно-фобический статус и на процессы обучения животных в тестах, как с положительным, так и с отрицательным знаком подкрепления.

Результаты наших исследований позволяют вывести закономерность: Г анальгетически активные синтетические аналоги [DPro ]ДМ и [dHPro ]ДМ являются малоэффективными в большинстве поведенческих тестов, также верно и то, что природные дерморфины [Нурб]ДМ и ДМ, обладающие высокой эффективностью в поведенческих тестах, проявляют весьма слабые анальгетические свойства в использованной дозе. Полученные данные могут указьюать на возможность существования различных нейрохимических механизмов, ответственных за проявление физиологических эффектов исследуемых пептидов, и позволяют предположить наличие разных подтипов опиоидных рецепторов, участвующих в реализации данных биологических ответов. Так, показано, что в реализации анальгетической активности опиоидов принимают участие ц1 -рецепторы, в регуляции эмоциональной сферы поведения - преимущественно 6-рецепторы, в контроле частоты сердечных сокращений -как jil-, так и ц2-рецепторы (Herz, 1993; Melchiorri and Negri, 1996). Пока до конца не ясно, посредством каких именно типов опиоидных рецепторов дерморфины осуществляют свои влияния на различные формы поведения и на ряд других функций у животных. Для более детального изучения механизма действия дерморфинов необходимо применения специфических блокаторов ji- и 5-опиоидных рецепторов.

Существует множество способов введения физиологически активных веществ в организм. Однако особый интерес представляет поиск таких путей введения, которые могли бы использоваться в клинической практике. Одним из наиболее удобных и оптимальных методов является интраназальный (и/н).

Полученные нами результаты позволяют предполагать, что ДМ может быть весьма эффективным анальгетиком при использовании и/н способа введения. Важно отметить, что дозы ДМ и его аналогов, используемые при и/н инъекциях (5 и 20 мкг/кг) в десятки раз более низкие, чем при в/б способе введения (500

191 мкг/кг), тогда как анальгетические эффекты при и/н введении или вполне сопоставимы с эффектами, наблюдаемыми при в/б инъекциях (как в случае 5 мкг/кг) или даже существенно превосходят их (как в случае 20 мкг/кг). Наблюдаемый феномен, вероятно, может быть объяснен целым рядом особенностей структуры молекулы ДМ. Как известно, пептиды в разной степени способны проникать через слизистую оболочку носоглотки (Su et al., 1986). Не исключено, что благодаря наличию [DAla2], ДМ более устойчив к действию эндогенных пептидаз, что, может приводить к усилению и пролонгации его эффектов, поскольку пептид может задерживаться в слизистой носоглотки, образуя депо. Логично предположить, что введение в молекулу пептида еще одного остатка D-аминокислоты может приводить к еще большей потенциации анальгетических эффектов. Действительно, в наших экспериментах было показано, что наиболее выраженной анальгетической активностью обладал [DPro6] ДМ - пептид, содержащий два D-аминокислотных остатка.

Видимо наличие дополнительной D-аминокислоты играет ключевую роль и при в/б способе введения, т.к. пептиды, независимо способа введения, располагаются в следующем порядке по мере ослабления вызываемого ими анальгетического эффекта: рРго6]ДМ - [ёНРгоб]ДМ - [Нур6]ДМ- ДМ (или -ДМ - [Нур6]ДМ).

Кроме того, можно преположить, что модификации аминокислотного остатка [Pro6] в синтетических аналогах ДМ могут приводить к ряду конформационных изменений в молекуле пептида, повышая тем самым вероятность присутствия (3-поворота, что может повлечь за собой изменения в константе связывания с ц-рецепторами, ответственными за проявление анальгетических свойств пептидов. Вследствие чего мы и наблюдаем повышение анальгетической активности синтетических дерморфинов по сравнению с их природными прототипами.

Вводимые интраназально вещества могут проникать в структуры ЦНС разными путями: переноситься с помощью обратного аксонального тока и кровью, а также минуя системный кровоток - по лимфатическим сосудам, анатомически связанным с соответствующей системой гипоталамуса

192

Сагалович, 1967). Не исключено, что при и/н введении вещество может попадать непосредственно в гипоталамус, проникая через гемато-энцефалический барьер в зоне, где он ослаблен.

Итак, интраназальный способ введения, на наш взгляд, весьма перспективен, поскольку менее травматичен и позволяет быстро достигать желаемого эффекта при использовании существенно более низких доз, чем, например, в случае внутрибрюшинного введения.

Широкий спектр физиологических эффектов, показанный в наших экспериментах для системно вводимых дерморфина и ряда его структурных аналогов, наглядно показывает, что опиоидные пептиды данного класса могут быть мощными регуляторами различных функций организма. Проведенное нами исследование зависимости характера физиологической активности дерморфина от стерео-химических модификаций аминокислотного остатка [Pro6] может позволить приблизиться к пониманию механизма действия опиоидных пептидов данного класса, помочь более детально выяснить роль дерморфинов в регуляции различных физиологических процессов, протекающих в организме. В заключении можно предложить несколько направлений дальнейших исследований, которые, на наш взгляд, являются весьма перспективными. С целью детального изучения механизма действия дерморфинов имеет смысл провести эксперименты с использованием специфических блокаторов ц- и 8-опиоидных рецепторов. Кроме того, интересно исследовать более широкий диапазон доз, поскольку известно, что для многих пептидов малые и большие дозы оказывают противоположные эффекты (Клуша, 1984). Также было бы полезно применить различные способы введения пептидов и продолжить анализ физиологической активности новых аналогов дерморфина. Такого рода исследования будут интересны не только для понимания принципов функционирования опиоидов, но могут также предоставить новые ценные сведения для создания группы перспективных лекарственных препаратов с заданным спектром физиологической активности.

193

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Уранова, Мария Геннадьевна, 2000 год

1. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Физиология человека и животных. // ИНТ. -1988.- т.34.

2. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейрохимия. Москва. - 1996. - с.296.

3. Баевский P.M., Кириллов О.И., Клецкин С.З. Математический анализ изменения сердечного ритма при стрессе. // Издательство "Наука", М., 1984.

4. Бастрикова H.A., Крушинская Я.В., Каменский A.A., Соколова H.A., Ашмарин И.П. Пептидергическая коррекция геморрагического шока.// Упехи физиологических наук.-1996.-т.27:1 .-с.32-46.

5. Батурина Е. Ю. Физиологические эффекты дерморфина // Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. Москва. - 1989.

6. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. //М. "Высшая школа" 1991.- 400 с.

7. Дудел Дж., Рюэгг И., Шмидт Р. и Яниг В. Физиология человека.- М.: Мир.- 1985.

8. Каменский A.A. и др. Парадоксальные соотношения эффективности интраназального и внутрибрюшинного введения дерморфина крысам// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1988. - №2. - с.177-179.

9. Клуша В.Е. Пептиды регуляторы функций мозга // Рига, "Зинатне", 1984.

10. Крыжановский Т.Н., Слепушкин В.Д., Золоев Г.К. Опиоидные пептиды и шок.// Пат.физиология и экспериментальная терапия.-1987.-№6.- с.47-50.

11. Маклакова A.C., Назаренко И.В., Дубинин В.А., Незавибатько В.Н., Алфеева Л.А., Каменский A.A. Влияние 3-казоморфина-7 на уровень пищевой и оборонительной мотиваций при различных видах обучения.// Журнал ВНД.-1995,- т. 45, вып.6. с.1143-1150.

12. Мак-Фарленд Д. Поведение животных. П/р П.В. Симонова.//- М. Мир.- 1988.-519с.

13. Родина В.И., Крупина H.A., Крыжановский Г.Н., Окнина Н.Б. Многопараметровый метод комплексной оценки тревожно-фобических состояний у крыс. // Журн. Высш. Нерв. Деят. им. Павлова. 1993.- т.43(5).- с.1006-1011.

14. Сагалович Б.М. Физиология и патофизиология верхних дыхательных путей.-1967.-М.

15. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ.// Москва. Медицина.- 1987.-е. 258-283.

16. Симонов П.В. Эмоциональный мозг//М., "Наука", 1981.

17. Соколова H.A., Дейгин В.И., Ашмарин И.П. Опиод дерморфин подавляет холинергические хронотропные эффекты на сердце лягушки.// ДАН. -1988.- т. 298.- NL- с. 254-256.

18. Соколова H.A., Красильникова В.Г., Ашмарин И.П. Атропиноподобное не снимаемое налоксоном действие опиоида дерморфина на инотропные эффекты ацетилхолина. // Биологические науки. -1990.- N10.- с. 80-85.

19. Уранова М.Г., Латышева Н.В., Ярова Е.П., Дейгин В.И., Каменский A.A. "Нейротропная активность седатина нового структурного аналога дерморфина"// Вестн. Моск. Университета. Сер. 16. Биология. - 1997. - N 3. - с.З-8.

20. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы //1990.- М., "Мир".

21. Червова Л.С. и др. Болевая чувствительность форели и анальгезия, вызываемая интраназапьно вводимым дерморфином// Доклады АН. 1994. - т.338. - №6. -с.836-837.

22. Шмидт Р., Тевс Г.(под редакцией).Физиология человека. // Пер. с англ. в 3-х томах.-1996.- т.2.-с.641.

23. Adler В., Goodman R. and Pasternak G. Opioid peptide receptors. // In: Handbook of Chemical Neuroanatomy (Bjorklund A. and Hokfelt Т., eds.).-1990.- v.9: Neuropeptides in the CNS. Part II, Elsevier Science Publishers B.V.

24. Ainsah O., Nabishah В., Osman C., Khalid B. Effects of naloxone, glycyrrhizic acid, dezamethazone and deoxycorticosterone in repetitive stress.// Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.- 1999.- v.26:5-6.- p. 433-437.

25. Allegra S.P., Castelano C., Filibeck U. et al. Behavioural data on dermorphins in mice.// European J. of Pharmacology.-1982.- v.82.- p. 223-227.

26. Alosi F., Passarelli F., Scotti A., De Carolis A. and Longo V.G. Central effects of dermorphin. //Ann. Istituto Sup. Sanita.-1982.- v. 18.- p. 1-6.

27. Amiche M., Delfour A., Nicolas P. Structural requirements for dermorphin opioid receptor binding.// Int J Pept Protein Res.- 1988.- v. 32:1.- p. 28-34.

28. Appel M.L., Berder R.D., Saul J.M., Smith J.M., Cohen R.J Beat to baet variability in cardiovascular variables: noise or music // J. Am. Coll. Cardiol 14: 1139 1148, 1989.

29. Austin M.C. and Kalivas P.W. Blockade of enkephalinergic and GABAergic mediated locomotion in the n.accumbens by muscimol in the ventral pallidum.// Jpn. J. Pharmacol.-1989.- v. 50.- p. 487-490.

30. Banks W. and Kastin A. Peptide Transport System for Opiates Across the Blood-brain Barrier // Amer. J. Physiol.- 1990.- v.259.- p.El-ElO.

31. Banks W.A., Kastin A.J., Ehrensing C.A. Endogenous peptide Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2 (Tyr-W-MIF-1) is transported from the brain to the blood by peptide transport system-1. // J. Neurosci. Res. -1993.- v. 35:6.- p. 690-695.

32. Banks W.A., Kastin A.J., Sam H.M., Cao V.T., King B., Maness L.M., Schally A.V. Saturable efflux of the peptides RC-160 and Tyr-MIF-1 by different parts of the blood-brain barrier. //Brain Res. Bull.- 1994. v. 35:2.- p. 179-182.

33. Basso N., Marcelli M., Ginaldi A. and DeMarco M. Intrathecal dermorphin in postoperative analgesia. // Peptides/- 1985.- v. 6.- p. 177-179.

34. Becker A. and Grecksch G. dTyr-D-Phe3 (Pro-D-Phe-Pro-Gly) interacts specifically with amygdaloidkindled seizures and is capable of preventing the learning deficit occurring after kindling // Peptides.- 1992.- v.13.- p.73-6.

35. Braga P.G., Tienco M., Biella G., Dall'Oglio G. and Franceschini F. Dermorphin, a new peptide from amphibian skin, inhibits the nociceptive thalamic neurons firing rate evoked by noxious stimuli. //Neurosci. Lett. -1984.- v. 52.- p. 165-169.

36. Braid D., Gori E. and Sala M. Relationship between morphine and etonitazene-induced working memory impairment and analgesia // Eur. J. Pharmacol.- 1994.- v.271.- p.497-504.

37. Broccardo M., Improta G. Cross-tolerance between dermorphin and morphine to analgesia and catalepsy in rats. // Peptides.- 1985a.- v. 6.- p. 165-169.

38. Broccardo M., Effect of dermorphin on body temperature in rats.// Pharm. Res. Comm.-1987.- v.l9:10.- p. 713-721.

39. Broccardo M., Erspamer V., Falconieri Erspamer G., Improta G., Linari G., Melchiorri P., Montecucchi P.C. Pharmacological data on dermorphins, a new class of potent opioid peptides from amphibian skin.// Br J Pharmacol.-1981.- v. 73:3.- p. 625-631.

40. Broccardo M., Improta G., Negri L. and Melchiorri P. Tolerance and physical dependence induced by dermorphin in rats. //Eur. J. Pharmac. -1985b.- v. 110.- p. 5561.

41. BufFa R., Solcia E., Magnoni E. et al. Immunohistochemical demonstration of dermorphin-like peptide in the rat brain. //Histochemistry.- 1982.- v. 76.- p. 273-276.

42. Castellano C., Pavone F. Dose- and strain-dependent effects of dermorphin and D-Ala2-D-Leu5.enkephalin on passive avoidance behaviour in mice. // Beh. Neuroscience.- 1985.- v.99:6.-p. 1120-1127.

43. Castellano C., Introini-Collison I. and McGaugh J. Interaction of beta-endorphin and GABAergic drugs in the regulation of memory storage // Behav. Neural. Biol.- 1993.-v.60.- p.123-128.

44. Cervini M.A., Rossi A.C., Perseo G. and De Castiglione R. Antinociceptive and other opioid effects of a new series of dermorphin analogues after subcutabeous administration in the rat. // Peptides.- 1985.- v.6.- p. 433-437.

45. Chaki K., Kawamura S., Kisara K., Sakurada S., Sasaki Y., Sato T. and Suzuki K. Antinociception and physical dependence produced by (D-Arg2)dermorphin tetrapeptide analogs and morphin in rats.// Br. J. Pharmac.-1988.- v. 95.- p. 15-22.

46. Chang K.-J. and Cuatrecasas P. Heterogeneity and properties of opiate receptors // Fed. Proc.-1981.- v.40.- p.2729-2734.

47. Chapman O. and Way E. Metal ion interaction with opiates // Ann. Rev. Pham. Toxic.-1980.- v.20.- p.553-579.

48. Cherubini E. and North R. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1985.- v.82.- p. 1860-1863.

49. Chiu T., Chen T., Ho C. and Chiang S. Electrophysiological effects of dermorphin on locus coeruleus neurons of rat.//Neuropharmacology.-1990.- v.29:8.- p. 747-755.

50. D'Amour F.E., Smith D.L. Method of determing loss of pain sensation.// J. Pharmacol. Exp. Ther.-1941.-v. 72.-p. 74-79.

51. Dana R. And Martinez J. Long-term effects of leucine-enkephalin on active avoidance responding in mice. //Beh. Neuroscience/- 1986.- v.100:2.- p. 185-189.

52. Dashwood M., Spyer K. Autoradiographic localization of adrenoreceptors, muscarinic cholinoreceptors and opiate receptors in the heart. //Europ. J. Pharm. 1986.- v. 127:3.-p. 279-292.

53. De Castiglione, Rossi A.C. Structure-activity relationships of dermorphin synthetic analogues. //Peptides.- 1985.- v.6, suppl. 3.-p. 117-125.

54. De Castiglione R. Structure-activity relationships in dermorphin-like peptides. //Elsevier Science Publishers B.V. Highlights in receptor Chemistry. C.Melchiorre and M.Gianella editors. -1984.- p.149-168.

55. De Montis M., Devoto P., Gambarana C. and Tagliamonte A. // IRCS. 1986.- v.14.-p.157.

56. Delius J.D. Displacement activities and arousal.// Nature.- 1967. v.214. - p.1259-1260.

57. Dinzburg A., Chirkov A. and Chirkova S. Stress-protective effect of neuropeptides in monkeys // Patol. Fiziol. Eksp. Ter.- 1995.- v.l.- p. 19-21.

58. Dhaliwae D., Bradfofd H. Inhibition of depolarization-coupled calcium fluxes and transmitter release in vitro by morphine // FEBS Lett.- 1982.- v.144.- p.89-92.

59. Dhawan B.N., Cesselin F., Raghubir R., et al. International Union of Pharmacology. XII. Classification of Opioid Receptors.//Pharmacological Reviews.- 1996.- v. 48:4.- p. 567-592.

60. Eager K.R., Robinson B.J., Galletly D.C., Miller J.H. Endogenous opioid modulation of hypercapnic-stimulated respiration in the rat.//Resp. Physiol. -1994.- v. 96.-p. 13-24.

61. Emefanova T.G., Usenco A.B., Deigin V.l., Yarova E.P., Kamensky A.A. Effect of dermorphin on termoregulation in rats at selected ambient temperatures.// Peptides.-1996.- v.l7:2.-p. 241-245.

62. Erspamer V., Melchiorri P., Falconieri Erspamer G., Montecucchi PC., de Castiglione R. Phyllomedusa skin: a huge factory and store-house of a variety of active peptides. //Peptides.- 1985.- v. 6:3,- p. 7-12.

63. Feuerstein G. and Faden A. Central autonomic effect of dermorphin in conscious rats.// J. Pharmacol. Exp. Ther.-1983a.- v. 226.- p. 13-18.

64. Feuerstein G., Faden A.I. Dermorphin: cardiovascular and sympathetic modulation in the anteroventral hypothalamus of conscious rats.// Life Sci.- 19B3b.-v. 33, suppl. 1.- p. 731-734.

65. Feuerstein G., Zukowska Grojec Z. Effect of dermorphin and morphine on the sympathetic and cardiovascular system of the pithed rat. //Neuropeptides.- 1987.- v. 9:2.- p. 139-150.

66. Fiori A., Cardelli P., Negri L., Savi M.R., Strom R., Erspamer V. Deltorphin transport across the blood-brain barrier. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- v. 94:17.- p. 94699474.

67. Flood J., Garland J. and Morley J. Evidence that cholecystokinin-enhanced retention is mediated by changes in opioid activity in the amygdala // Brain. Res.- 1992.- v.585.-p.94-104.

68. Fontani G., Vergani L., Salvadori S., Voglino N., Aloisi A.M., Portaluppi F. and Degli Uberti E.C. Effect of dermorphin on behavior and hippocampal electrical activity in rabbits.// Life Sci.- 1993.- v. 52.- p. 323-328.

69. Foote R. and Mairer R. Kappa opiate binding sites in the substantia nigra and bulbus olfactorius of the guinea pig as shown by in vitro autoradiography // Life Sci.- 1983.-v.33.- p.243-246.

70. Frances B., Jauzac Ph., Jomary C., Moisand Ch. and Meunier J. // Colloque National des Neurosciences, Bordeaux, France, 1986.

71. Fukunaga H., Takahashi M., Kaneto H., Yoshikawa M. Effects of Tyr-MIF-1 on stress-induced analgesia and the blockade of development of morphine tolerance by stress in mice.// Jpn. J. Pharmacol.-1999.- v.79:2.- p. 231-235.

72. Giagnoni G., Parolaro D., Casiraghi L., Crema G., Sala M., Andreis C., Gori E. Dermorphin interaction with peripheral opioid receptors.// Neuropeptides.- 1984.- v.5:l-3.- p. 157-160.

73. Goodman R. and Snyder S. Autoradiographic localization of kappa opiate receptors to deep layers of the cerebral cortex may explain unique sedative and analgesic effects // Life Sci.- 1982a. -v.31.- p.1291-1294.

74. Goodman R. and Snyder S. Kappa opiate receptors localized by autoradiography to deep layers of cerebral cortex: relation to sedative effects // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982b.- v.79.- p.5703-5707.

75. Greco B., Prevost J. and Gioanni Y. Intracerebroventricular injection of dermorphin: search for the epileptic induction thresholds.//Neuroreport.- 1994.- v. 5.-p. 2169-2172.

76. Grecksch G., Becker A. and Matthies H. // Naynyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol.-1990,- v.342,Suppl.- p.Rll.

77. Gromova E.A., Bobkova N.V., Plakkhinas L.A., Deigin V.I., Iarova E.P. The role of the brain monoaminergic systems in the anti-alcohol action of dermorphin and the delta-sleep peptide. //Fiziol. Zh. SSSR.- 1989.- v. 75:5.- p. 633-637.

78. Gue M., Alvinerie M., Junien J., Bueno L. Stimulation of k-opiate receptors in intestinal wall affects stress-induced increase of plasma Cortisol in dogs.// Brain Res.-1989.- v. 502.- p.143-148.

79. Gullner H. and Kelly G. Dermorphin: effects on anteria pituitary function in the rat.// Arch. Int. Pharmacodyn.- 1983.- v. 262.- p. 208-214.

80. Hendrie C., Shepherd J. and Rodgers R. Differential effects of CCK antagonist, MK-329, on analgesia induced by morphine, social conflict (opioid) and defeat experience (non-opioid) in male mice // Neuropharmacology.- 1989.- v.28.- p.1025-1032.

81. Herz A. (ed.). Opioids II.// Handbook of experimental pharmacolology.-1993. Berlin Springer, -v. 2, p. 205-229.

82. Herz A., Blasig J., Emrich H., Cording C., Piree S., Kolling A. and Zerssen D. Is there some indication from behavioral effects of endorphins for their involvement in psychiatric disorders?//Adv. Biochem. Psychopharmacol.- 1978.- v. 18.- p.333-339.

83. Hiramatsu M., Sasaki M. and Kameyama T. Effects of dynorphin A (1-13) on carbon monoxide-induced delayed amnesia in mice studied in a step-down type passive avoidance task // Eur. J. Pharmacol.- 1995.- v.282.- p.185-191.

84. Hinde R.A. Animal Behaviour: A Synthesis of Ethology and Comparative Psychology.// N.Y. McGraw-Hill.-1970.- p. 143-145.

85. Hoffman D., West T. and Wise R. Ventral pallidal microinjections of receptor-selective opioid agonosts produce different effects on circling and locomotor activity in rats.// Brain Res.-1991.- v. 550.- p. 205-212.

86. Holaday J. Cardiovascular effects of endogenous opiate system.// Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.- 1983.- v. 23:4.- p. 541-594.

87. Improta G., Broccardo M. Spinal antinociceptive effects of D-Ala2.deltorphin II, a novel and highly selective delta-opioid receptor agonist. // Peptides.- 1992.- v. 13:6.- p. 1123-1126.

88. Improta G., Guglietta A. The role of caudate nucleus in dermorphin-induced catalepsy in rats.// Peptides.-1985.- v. 6.- p. 161-164.

89. Introini-Collison I., Ford L. and McGaugh J. Memory impairment induced by intraamygdala beta-endorphin is mediated by noradrenergic influences // Neurobiol. Learn. Mem.- 1995.-v.63.-p.200-205.

90. Jacquet Y. Stereospecific, dose-dependent antagonism by naloxone of non-opiate behaviour in mice.// Pharm. Biochem. Behav.-1980.- v. 13.- p. 585-587.

91. Jacquet Y., Klee W., Rice R., Iijima I., Minamikawa J. Stereospecific and non-stereospecific effects of (+) and (-)-morphine: evidence for a new class of receptors?// Science.- 1977.- v. 198.-p. 842-845.

92. Jaffe J. and Martin W. Opioid analgesics and antagonists // In: The Pharmacological Basis of Therapeutics (Gilman A., Goodman L., Rail T. and Murad F., eds.). New York. - 1985.

93. Janak P., Manly J. and Martinez J. Leu.enkephalin enhances active avoidance conditioning in rats and mice //Neuropsychopharmacology.- 1994.- v. 10.- p.53-60.

94. Jang W., Schadt J., Gaddis R. Peripheral opioidergic mechanisms do not mediate naloxone's pressor effect in the concious rabbit.// Circ.Shock.-1993.-v.39.- p.121-127.

95. Janssen P.A.J., Niemgeers C.J.E. and Dorg J.G.H. The inhibitory effects of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced reflex in rats.// Arzneim Forsch. -1963.- v. 13,- p. 502-507.

96. Jones L.S., Grooms S.Y., Salvadori S. and Lazarus L.H. Dermorphin-induced hyperexcitability in hippocampal CA3 and CA1 "in vitro". //Eur. J. Pharmac.-1994.- v. 264.-p. 39-48.

97. Jones D.N., Holtzman S.G. Effects of naloxone infusion upon spontaneous and amphetamine-induced activity // Europ. J. Pharmacol. 1992.- v.221.- n.l.- p.161-165.

98. Kalivas P. Sensitization to repeated enkephalin administration into the ventral tegmental area of the rat. II. Involvement of the mesolimbic dopamin system.// J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1985.- v. 235.- p. 544-550.

99. Kameyama Т., Ukai M. and Miura M. Dynorphin A (1-13) potently improves galanin-induced impairment of memory processes in mice //Neuropharmacology.- 1994,- v.33.-p.l 167-1169.

100. Kisara K. et al.// British Journal of Pharmacology.- 1986.- v. 87.- p. 183-190.

101. Коек W., Slangen J. Acute effects of naloxone and naltrexone, but lack of delayed effects, on exploratory behavior in the rat. //Psychopharmacology- 1984.- v. 84.- p. 383387.

102. Kohler U. and Rauca C. Effects of BCH 325 (Pro-D-Phe-Pro-Gly) on open field behavior after chronic stress procedure // Peptides.- 1992.- v. 13.- p. 141-144.

103. Kosenboum J., 1983 цитировано по Сергеев П.В. и Шимановский Н.Л. Рецепторы //М., "Медицина", 1987.

104. Krumins S.A. Characterization of dermorphin binding to membranes of rat brain and heart. //Neuropeptides.- 1987.- v. 9:2.-p. 93-102.

105. Lazarus L.H., Wilson W.E., Guglietta A. and De Castiglione R. Dermorphin interaction with rat brain opioid receptors: involvement of hydrophobic sites in the binding domain.// Molecular Pharmacology 1990.- v. 37.- p. 886-892.

106. Lazarus L., Bryant S., Salvadori S., Attila M. and Jones L. Opioid infidelity: novel opioid peptides with dual high affinity for 8- and |x-receptors // TINS.- 1996,- v. 19.-p.31-35.

107. Lewis M., Young E. Houghten R., Akil H. and Watson S. Binding of 3H.-dynorphin A to apparent kappa opioid receptors in deep layers of guinea pig cerebral cortex // Eur. J. Pharmacol.- 1984.- v.98.- p.149-150.

108. Liston D., Vanderhaeghen J. and Rossier J. //Nature (London).- 1983.- v.302.- p.62-65.

109. Livari M., Castellacci R., Linari G. The effect of dermorphin on exocrine pancreatic secretion of the rat. // Ital. J. Gastroenterol. 1983.- v.15.- p. 174-180.

110. Lord J., Waterfield A., Hughes J. and Kosterlitz H. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors //Nature (London).- 1977.- v.267.- p.495-499.

111. Malfroy B. and Schwartz // J.C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982.- v. 106.- p. 276-285.

112. Marastoni M., Salvadori S., Balboni G., Borea P.A., Marzola G., Tomatis R. Synthesis and activity profiles of new dermorphin-(l-4) peptide analogues.// J. Med. Chem. -1987.- v.30:9.-p. 1538-1542.

113. Marchioni et at.// Neuropsychobiology.- 1992.- v. 26.- p. 81-88.

114. Martin W. Pharmacology of opioids. // Pharmacol. Reviews/- 1983,- v.35:4- p. 283323.

115. Martin W., Eades C., Thompson J., Huppler R. and Gilbert P. The effects of morphine-and nalorphine-like drugs in non-dependent and morphine-dependent chronic spinal dogs // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1976.- v. 197.- p.517-532.

116. Martinez J., Jensen R., Messing R, Rigter H. and McGaugh J. Endogenous peptides and learning and memory processes. //N.Y: Academic Press.-1981.

117. Martinez J. D-Phe2-D-Phe5.-enkephalin impairs acquisition and enhances retention of a ne-way active avoidance response in rats // Peptides.- 1992.- v. 13.- p.885-889.

118. Matsuzawa S., Suzuki T., Misaza M., Nagase H. Roles of 5-HT3 and opioid receptors in the ethanol-induced prefernce in rats exposed to conditioned fear stress.// Life Sci.-1999.-v. 64:21.- p.241-249

119. McDowell J. and Kitchen I. Ontogenesis of 5 opioid receptors in rat brain using 3H.[D-Pen2,D-Pen5]enkephalin as a binding ligand // Eur. J. Pharmacol.- 1986.- v. 128.- p.287-289.

120. Melchiorri P. and Negri L. The dermorphin peptide family.// Gen Pharmac. 1996.- v. 27:7.-p. 1099-1107.

121. Melchiorri P., Guglietta A. Dermorphin:central sites of analgesia, catalepsy and inhibition of gastric secretion and gastric emptying. // Reg. Peptides.-1983.- v.2.- p. 110

122. Melchiorri P., Improta G., Negri L. et al. Pept. Hormone., Biomembranes, and Cell Growth. Proc. // Int. Meet. Rome.- 1984.- oct.12-14, 1983.- New York, London.- 1984.-p. 127-142.

123. Meunier J.-C. The opioid peptides and their receptors // Biochemie.- 1986.- v.68.-p.1153-1158.

124. Meyer M.E. and Mciaurin B.I. DALDA (H-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2), a potent p-opioid peptide agonist, affects various patterns of locomotor activities.// Pharmac. Biochem. Behav.- 1995.- v. 61.- p. 149-151.

125. Michael-Titus A., Dourmap N. and Costentin J. Mu and delta opioid receptors control differently the horisontal and vertical components of locomotor activity in mice // Neuropeptides.- 1989.- v. 13.- p.235-242.

126. Mignogna G., Severini C., Erspamer G.F., Siciliano R., Kreil G., Barra D. Tachykinins and other biologically active peptides from the skin of the Costa Rican phyllomedusid frog Agalychnis callidryas. // Peptides.- 1997(b).- v. 18:3.- p. 367-372.

127. Mignogna G., Severini C., Simmaco M., Negri L., Falconieri Erspamer G., Kreil G., Barra D. Identification and characterization of two dermorphins from skin extracts of the Amazonian frog Phyllomedusa bicolor.// FEBS.- 1992(a).- v. 302. p. 151-154.

128. Mihara S. and North R. // Alcohol. Drug. Res.- 1985.- v.6.- p. 162-162.

129. Millan M. Kappa-Opioid Receptor-Mediated Antinociception in the Rat. I. Comparative Actions of Mu- and Kappa-opioids Against Nosious Thermal, Pressure and Electrical Stimuli // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1989.- v.251.- p.334-431.

130. Miller L., Kastin A., Sudman C. et al. Polypeptide influence on attention, memory and anxiety in man. Pharmac. //Biochem.Behav. -1974/- v.2- p. 663-668.

131. Mitsuma T., Noginori T. and Chaya A. Dermorphin inhibits basal and cold-induced thyrotropin secretion in rats. // Endocrin. Exper. -1985.- v. 19,- p. 83-90.

132. Montecuchi P. C., de Castiglione R., Erspamer V. Identification of dermorphin and Hyp-dermorphin in skin extract of the Brazilian frog Phyllomedusa rhodei.// Int. J. Peptide Prot. Res.- 1981(a).- v. 17.- p. 316-321.

133. MullerE. Dermorphins.//Neuroendocrinol. Perspectives.- 1983.-v.2.-p. 82-106.

134. Nairn M., Nicolas P., Baron D. Folded conformations of the delta-selective opioid dermenkephalin with head-to-tail interactions. A simulated annealing study through NMR restraints.// Int J Pept Protein Res.- 1996.- v. 47:5,- p. 353-360.

135. Nakata N., Sakurada S., Sakurada T., Kisara K., Sasaski Y. and Suzuki K. Physical dependence of a dermorphin tetrapeptide analogue, (D-Arg2, Sar4)dermorphin (1-4) in the rat.// Pharmac. Biochem. Behav. -1986,- v. 24.- p. 27-31.

136. Negri L. and Improta G. Distribution and metabolism of dermorphin in rats.// Pharmac. Res. Commun. 16.-1984,-p. 1183 -1194.

137. Negri L., Lattanzi R. and Melchiorri P. Production of antinociception by peripheral administration of (Lys7)dermorphin, a naturally occurring peptide with high affinity for yi-opioid receptors. // Br. J. Pharmac. 1995.- v. 114,- p. 57-66.

138. Negri L., Lattanzi R., Tabacco F., Melchiorri P. Respiratory and cardiovascular effects of the mu-opioid receptor agonist Lys7.dermorphin in awake rats. //Br. J. Pharmacol.-1998.-v. 124:2.- p. 345-355.

139. Negri L., Melchiorri P., Erspamer GF., Erspamer V. Radioimmunoassay of dermorphin-like peptides in mammalian and non-mammalian tissues. //Peptides.- 1981.- v.2, suppl 2.-p. 45-49.

140. Olson G., Olson R., Kastin A. Endogenous Opiates. Review. // Peptides.-1990.- v.l 1:6.-p.1277-1304.

141. Olson G., Olson R., Kastin A. // Peptides.-1997,- v. 18:10.- p. 1651-1680.

142. Paakari P., Paakari I., Vonhof S., Feuerstein G., Siren A.L. Dermorphin analog Tyr-D-Arg2-Phe-Sarcosine induced opioid analgesia and respiratory stimulation . The role of mui-receptors.// J. pharmac. Exp. Ther. -1993b.- v. 266.- p. 544-550.

143. Paakkari P., Paakkari I., Feuerstien G., Siren A.L. Evidence for differential opioid mul-receptor and mu2-receptor-mediated regulation of heart-rate in the concious rat.// Neuropharmacology.- 1992.- v. 31.- p. 777-782.

144. Paakkari P., Paakkari I., Landes P., Siren A.L., Feuerstein G. Respiratory mu-opioid and benzodiazepine interactions in the unrestrained rat.// Neuropharmacology.- 1993a.- v. 32:4.- p. 323-329.

145. Paakkari P., Paakkari I., Siren A.L. and Feuerstein G. Respiratory and locomotor stimulation by low doses of dermorphin, a mui receptor mediated effect.// J. Pharmac. Exp. Ther. -1990.- v. 252,- p. 235-252.

146. Parratt J. Opioid receptors in the cardiovascular system.// Progr. Pharmacol.- 1986.- v. 6:2.- p. 97-110.

147. Pasternak G. and Wood P. Multiple mu opiate receptor // Life Sci.- 1986.- v.38.-p.1889-1898.

148. Pattabiraman N., Sorensen K.R., Langridge R., Bhatnagar R.S., Renugopalakrishnan V., Rapaka R.S. Molecular mechanics studies of dermorphin.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1986.-v. 140:1.-p. 342-349.

149. Pavone F., Populin R., Castellano C. et al. Deltorphin, a naturally occuring peptide with high selectivity for 8 opioid receptors, improves memory consolidation in two inbred strains of mice.//Peptides.- 1990.- v.ll.-p. 591-594.

150. Privette T. and Terrian D. Kappa opioid agonists produce anxiolytic-like behavior on the elevated plus-maze // Psychopharmacology (Berlin).- 1995.- v.l 18.- p.444-450.

151. Ragozzino M., Parker M. and Gold P. Spontaneous alternation and inhibitory avoidance impairments with morphin injections into the medial septum. Attenuation by glucose administration // Brain Res.- 1992.- v.597.- p.241-249.

152. Ragozzino M. and Gold P. Task-dependent effects of intra-amygdala morphine injections: attenuation by intra-amygdala glucose injections // J. Neurisci.- 1994.- v.14.-p.7478-7485.

153. Randall L.O. and Selitto J.J. A method for measurement of analgesic activity of inflamed tissue.// Arch. Int. Pharmacodyn.- 1957.- v. 111.- v. 409-419.

154. Reisine T. and Pasternak G. Opioid analgesics and antagonists.// in book Goodman and Gilman's "The pharmacological basis of theurapeutics". McGraw-Hill. Ninth edition. -1995.- Ch.23.- p. 521-555.

155. Rossi A. et al.// Peptides.- 1983.- v. 4.- p. 577-580.

156. Rossi A. et al.// Peptides.- 1986.- v. 7.- p. 755-759.

157. Ruthrich H., Grecksch G. and Matthies H. Adrenalectomy attenuates the improvement of memory in rats by peripheral application of Des-Tyr-D-Pro4-casomorphin // Behav. Neural. Biol.- 1993b.- v.59.- p.25-28.

158. Sakurada S., Chaki K., Watanabe H., Nakata N., Sakurada T., Kisara K., Suzuki K. Antinociceptive mechanisms of D-Arg2.-dermorphin tripeptide analogs.// J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1992.- v. 263:2.- p. 793-799.

159. Sakurada S., Nakata N., Sakurada T., Chaki K., Kawamura S., Kisara K. and Suzuki K. Tolerance and cross-tolerance to the antinociceptive effects of (D-Arg2)-dermorphin tripeptide analogs and morphine.// Neuropharmacology.- 1993.- v. 32.- p. 689-693.

160. Salvadori S., Marastoni M., Balboni G., Borea P., Tomatis R. Opioid peptides. Synthesis and binding properties of dermorphin related heptapeptides. // Int. J. Pept. Protein Res.- 1989.- v. 33:2.- p. 94-102.

161. Sandrini G., Degli Uberti E., Salvadori S., Margutti A., Trasforini G., Tomatis R., Nappi G. and Pansini R. Dermorphin inhibits spinal nociceptive flexion reflex in humans. Brain Res.-1986.- v. 371.-p. 364-367.

162. Sato T., Sakurada S., Sakurada T., Furuta S., Chaki K., Kisara K., Sasaki Y. and Suzuki K. Opioid activities of D-Arg substituted tetrapeptides. // J. Pharmac. Exp. Ther. -1987.- v. 242.-p. 651-659.

163. Saunders W., Thornhill I. No inotropic action of enkephalin or enkephalin derivatives on electically stimulated atria isolated from lean and obese rats. // Brit. Journ. Pharmacol. -1986.- v.85:2.- p. 513-522.

164. Scalia S., Salvadori S., Marastoni M., Bortolotti F. and Tomatis R. Reversed phase HPLC study on the in vitro enzymatic degradation of dermorphin. // Peptides.-1986.- v. 7.-p. 247-251.

165. Schiller P.W., Nguyen T.M., Chung N.N., Lemieux C. Dermorphin analogues carrying an increased positive net charge in their "message" domain display extremely high mu opioid receptor selectivity.//J. Med. Chem.- 1989.- v. 32:3.- p. 698-703.

166. Schlosser B., Kudernatsch M.B., Sutor B., ten Bruggencate G. Delta, mu and kappa opioid receptor agonists inhibit dopamine overflow in rat neostriatal slices.// Neurosci. Lett.- 1995.- v.l91:l-2.-p. 126-130.

167. Schmidt C. and Kraft KM Eur. Journal of Medical Research.- 1996.- v.l:l 1,- p. 528.211

168. SchuLz R., Faase E., Wuster M. and Herz A. Selective receptors for р-endorphin on the rat vas deferens // Life Sci.- 1979.- v.24.- p.843-849.

169. Schulteis G. and Martinez J. Roles of delta and mu opioid receptors in mediating the effects of enkephalins on avoidance conditioning // Psychopharmacology (Berlin).-1992.-v. 109.-p.l 57-62.

170. Shikimi T. et al., 1969 цитировано по Сергеев П.В. и Шимановский H.JI. Рецепторы//M., "Медицина", 1987.

171. Siren A.L., Paakkari P., Goldstein D.S., Feuerstein G. Mechanisms of central hemodynamic and sympathetic regulation by mu opioid receptors: effects of dermorphin in the conscious rat.// J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1989.- v. 248:2.- p. 596-604.

172. Spain J., Roth B. and Coscia C. Differential ontogeny of multiple opioid receptors (p., 5 and к) // J. Neurosci.- 1985.- v. 5.- p.584-588.

173. Sporton S.C.E., Shephard S.L., Jordan D. And Ramage A.G. Microinjections of 5-HTu agonists into the dorsal motor vagal nucleus produce a bradycardia in the atenolol-pretreated anaesthesized rat.// Br. J. Pharmacol.-1991.- v. 104,- p. 467-470.

174. Stevens C.V. and Yaksh T. Spinal action of dermorphin, an extremely potent opioid peptide from frog skin.// Brain Res. -1986.- v. 385.- p. 303-304.

175. Stevens C.V. Relative analgesic potency of mu, delta and kappa opioids after spinal administration in amphibians.// J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1996.- v. 276:2.- p. 440-448.

176. Stohr Т., Almeida O., Landgraf., Shippenberg T. Stress- and corticosteroid-induced modulation of the locomotor response to morphine in rats.//Behav. Brain. Res.-1999.-v.l03:l.- p.85-93.

177. SuK.S.//Pharm. Int.- 1986.-v.7.,n.l.-p.8-11.

178. Sullivan A.F. and Dickenson A.H. Electrophysiological studies on the spinal effects of dermorphin, an endogenous mu-opioid agonist.// Brain Res. 1988.- v. 481.- p. 182185.

179. Tancredi Т., Temussi P., Picone D., Amodeo P., Tomatis R., Salvadori S., Marastoni M., Santagada V., Balboni G.// Biopolymers. 1991. - v.31 (6).- p. 751 -760.

180. Tartara A. et al. // New Trends Clin. Neuropharmacol. 1988.- v. 2.- p. 168.

181. Tartara A., Maurelli M., Marchioni E. Autonomic effects of centrally administered dermorphin in conscious rabbits.//Farm.Ed. Sci. 1986.- v.41:3.- p. 215-224.

182. Temussi P.A., Picone D., Tancredi T., Tomatis R., Salvadori S., Marastoni M., Balboni G. Conformational properties of deltorphin: new features of the delta-opioid receptor.// FEBS Lett.- 1989.- v. 247:2.- p. 283-288.

183. Traynor J. Subtypes of the k-opiod receptor: fact or fiction? // TiPS, February.- 1989.-v.lO.-p. 52-53.

184. Uberti E., Roti E., Transforini G. et al. Somatostatin inhibits the dermorphin-stimulated thyrotropin release in man. // Hormone Res. -1986.- v. 23: 4.- p. 207-212.

185. Ukai M., Mori K., Hashimoto S., Kobayashi T., Saski Y. and Kameyama T. Tyr-D-Arg-Phe-beta-Ala-NH2, a novel dermorphin analog, impairs memory consolidation in mice. // Eur. J. Pharmac. 1993,- v. 239.- p. 237-240.

186. Ukai M., Kobayashi T., Shinkai N., Shan Wu.-X. and Kameyama T. Dynorphin A (113) potently improves scopolamineinduced impairment of passive avoidance response in mice // Eur. J. Pharmacol.- 1995.- v.274.- p.89-93.

187. Van den Berg C., Lamberts R., Wolterink G., Weigant V., Van Ree J. Emotional and footshock stimuli induce different long-lasting behavioural effects in rats; involvement in opioids.// Brain Res.-1998.-v. 799:1.- p. 6-15.

188. Ventura C., et al. Effects of naloxone on the mechanical activity of isolated rat heart perfusdwith morphine or opiod peptides.//Peptides-1987 v.8:4.p. 695.

189. Versteeg D., Csikys T., Spierenburg H. Stimulus-evoked release of tritiated monoamines from rat periaqueductal gray slices in vitro and its receptor-mediated modulation.//Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.- 1991.- v. 343:6.- p. 595-602.

190. Vezina P., Giovino A., Wise R., Stewart J. Environment-specific cross-sensitization between the locomotor activating effects of morphin and amphetamine.// Pharm. Biochem. and Behav. -1989.- v. 32.- p. 581-584.

191. Walsh R., Cummiss R. The open-field test: a critical review// Physiol. Bull.-1976.-v.83.-p.482-504.

192. Wan R., Givens B. and Olton D. Opioid modulation of working memory: intraseptal, but not intraamygdaloid, infusions of beta-endorphin impair performance in spatial alternation //Neurobiol. Learn. Mem.- 1995.- v.63.- p.74-86.

193. Weber E., Evans C. and Barchas J. //Nature (London).- 1982.- v.299.- p.77-79.

194. Weinberger S., Gehrig C. and Martinez J. DPen2-DPen5.enkephalin, a delta opioid receptor selsctive analo of [Leu]enkephalin, impairs avoidance learning in an automated shelf-jump task in rats // Regul. Pept.- 1989.- v.26.- p.323-329.

195. Wertz M. and MacDonald R. // Neurosci. Lett.- 1983.- v.42.- p. 173-178.

196. Wertz M. and MacDonald R. Dynorphin and neoendorphin peptides decrease dorsal root ganglion neuron calcuim-dependent action potential duration // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1985.- v.234.- p.49-56.

197. Williams J. and North R. Opioid receptor interactions on single locus coeruleus neurones // Mol. Pharmacol.- 1984.- v.26.- p.489-497.

198. WusterM., SchulzR. andHerzA. The direction of opioid agonists towards p-,8-and s-receptors in the vas deferens of the mouse and the rat // Life Sci.- 1980.- v.27.- p. 163.

199. Yeomans D., Vierck C. and Cooper B. Effects of morphine on reflexes and avoidance responses in monkeys // Soc. Neurosci. Abstr.- 1989.- v. 15.- p. 154.

200. Zukin R. and Zukin S. Multiple opiate receptors: emerging concepty // Life Sci.- 1981.-v.29.- p.2681-2690.