Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Путинцева, Ольга Васильевна

• Путинцева, Ольга Васильевна
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Путинцева, Ольга Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Эндогенные низкомолекулярные биорегуляторы: роль в биосис- 21 темах

1.1.1. Малые неионные лиганды

1.1.1.1. Оксид азота

1.1.1.2. Оксид углерода

1.1.2. Низкомолекулярные серосодержащие тиолы

1.1.2.1. В остановленный глутатион

1.1.2.2. Нитрозоглутатион

1.2. Структура, физико-химические и функциональные свойства раз- 46 личных лигандных форм гемоглобина

1.2.1. Оксигемоглобин

1.2.2. Нитрозогемоглобин

1.2.3. Карбоксигемоглобин

1.2.4. Метгемоглобин

1.3. Влияние УФ-излучения на структуру и функциональные харак- 72 теристики сложных белков

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение растворов оксигемоглобина человека

2.2. Получение растворов карбоксигемоглобина человека

2.3. Получение растворов метгемоглобина человека

2.4. Получение растворов нитрозогемоглобина человека

2.5. Модификация оксигемоглобина человека различными низкомо- 88 лекулярными биорегуляторами

2.5.1. Модифицирование оксигемоглобина человека растворами вое- 88 становленного глутатиона

2.5.2. Получение Б-нитрозоглутатиона и его инкубация с оксигемог- 88 лобином

2.5.3. Модификация оксигемоглобина нитроглицерином и 89 МОНОЧИНКВЕ®

2.6. Модификация оксигемоглобина человека препаратом природного полисахарида - реополиглюкином

2.7. Химическая модификация оксигемоглобина диальдегиддекстра- 89 ном

2.7.1. Получение диальдегиддекстрана из реополиглюкина, очистка и 90 определение степени его окисления

2.7.2. Синтез конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран

2.7.3. Определение содержания полисахарида в конъюгатах гемогло- 91 бин-диальдегиддекстран

2.7.4. Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 92 разование комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, методом протеолитического титрования

2.8. Облучение растворов гемоглобина

2.9. Термостатирование исследуемых растворов гемоглобина

2.10. Регистрация электронных спектров поглощения растворов на- 94 тивного и модифицированного гемоглобина

2.11. Гель-хроматография нативных и модифицированных растворов 94 гемоглобина

2.12. Диск-электрофорез различных лигандных форм гемоглобина в 95 полиакриламидном геле

2.13. Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина и его сме- 97 сей с различным содержанием нитрозо- и карбоксигемоглобина

2.14. Спектрофотометрическое определение количества БН-групп в 98 различных лигандных формах нативного и модифицированного гемоглобина

2.15. Определение соотношения основных лигандных форм в на- 98 тивных и модифицированных образцах гемоглобина

2.16. Определение интенсивности светорассеяния растворов гемо- 99 глобина

2.17. Расчет некоторых кинетико-термодинамических характеристик 99 нативных и УФ-облученных молекул гемоглобина

2.18. Создание компьютерных моделей гема, гемоглобина человека, 101 декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстран I и II типов

2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

3.1. Хроматографические и спектральные характеристики нативного 103 и УФ-облученного оксигемоглобина человека

3.2. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- 108 облученного оксигемоглобина человека

ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО МЕТГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

4.1. Спектральные и хроматографические характеристики нативного 117 и УФ-облученного метгемоглобина человека

4.2. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 122 ченного метгемоглобина человека

ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И

ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

5.1. Спектральные характеристики растворов нативного и УФ- 128 облученного карбоксигемоглобина человека

5.2. Хроматографические характеристики нативного и УФ- облученного карбоксигемоглобина человека

5.3. Электрофоретические характеристики нативного и УФ-об- 137 лученного карбоксигемоглобина человека

5.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного и фотомодифицированного карбоксигемоглобина человека 5.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина человека 5.4^у^роматографические характеристики электрофоретических 152 фракций нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина человека

ГЛАВА 6. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА 158 РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОКСИ- И КАРБОКСИФОРМ

6.1. Спектральные характеристики растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.2. Хроматографические свойства растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.3. Электрофоретические свойства растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ 6.3.1. Хроматографические характеристики электрофоретических 170 фракций растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.4. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и карбоксигемоглобина человека

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 186 УФ-ОБЛУЧЕННОГО НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

7.1. Спектральные свойства нативных и УФ-облученных растворов 186 нитрозогемоглобина человека

7.2. Хроматографические характеристики нативного и УФоблученного нитрозогемоглобина человека

7.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

7.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного и фотомодифицированного нитрозогемоглобина человека

7.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций 199 нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

7.4.2. Хроматографические свойства электрофоретических фракций 209 нативного и У1Ф-облученного нитрозогемоглобина человека

7.5. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и нитрозогемоглобина человека

ГЛАВА 8. НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 223 ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ИСТОЧНИКОВ ОКСИДА АЗОТА - НИТРОГЛИЦЕРИНА, МОНОЧИНКВЕ® и Б-НИТРОЗОГЛУТАТИОНА

8.1. Некоторые физико-химические свойства оксигемоглобина человека в присутствии различных концентраций нитроглицерина

8.1.1. Спектральные характеристики растворов нативного и модифи- 226 цированного нитроглицерином оксигемоглобина человека

8.1.2. Электрофоретические свойства оксигемоглобина человека, мо- 228 дифицированного нитроглицерином в различных концентрациях

8.2. Спектральные характеристики растворов оксигемоглобина в присутствии лекарственного препарата МОНОЧИНКВЕ®

8.3. Физико-химические свойства оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием Б-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.1 .Спектральные характеристики оксигемоглобина человека, мо- 233 дифицированного различными концентрациями 8-нитрозоглутатиона

8.3.2. Спектральные свойства оксигемоглобина человека, модифици- 236 рованного сочетанным действием 8-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.3. Хроматографические характеристики оксигемоглобина чело- 240 века в присутствии 8-нитрозоглутатиона различных концентраций

8.3.4. Хроматографические свойства оксигемоглобина человека, мо- 242 дифицированного совместным воздействием Б-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.5. Электрофоретические характеристики оксигемоглобина чело- 245 века в присутствии Б-нитрозоглутатиона различных концентраций

ГЛАВА 9. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В

ПРИСУТСТВИИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА

9.1. Гель-хроматографические свойства оксигемоглобина человека в 254 присутствии глутатиона в условиях различного микроокружения

9.2. Электронные спектры поглощения растворов нативного и УФ- 256 облученного оксигемоглобина человека в присутствии глутатиона

9.3. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 264 ченного оксигемоглобина человека, модифицированного восстановленным глутатионом

ГЛАВА 10. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ

ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ

ДОНОРОВ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

10.1. Хроматографические свойства гемоглобина, выделенного из 273 крови доноров с различными сроками хранения

10.2. Электрофоретические характеристики гемоглобина, выделен- 275 ного из крови доноров с различными сроками её хранения

10.3. Функциональные свойства гемоглобина, выделенного из крови 280 доноров с различными сроками её хранения

ГЛАВА 11. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА

ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕОПОЛИГЛЮКИНОМ И ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ

11.1. Физико-химические свойства и термостабильность гемоглобина 285 человека в присутствии реополиглюкина

11.1.1. Спектральные характеристики молекул гемоглобина челове- 285 ка в присутствии реополиглюкина

11.1.2. Хроматографические свойства гемоглобина человека в при- 287 сутствии реополиглюкина

11.1.3. Электрофоретические характеристики гемоглобина человека 288 в присутствии реополиглюкина

11.1.4. Определение природы ионогенных групп молекул гемогло- 291 бина человека в присутствии реополиглюкина методом про-теолитического титрования

11.1.5. Термостабильность молекул гемоглобина человека в присут- 293 ствии реополиглюкина

11.2. Физико-химические свойства и термостабильность молекул гемоглобина человека в комплексах с диальдегиддекстраном

11.2.1. Исследование процессов образования комплексов гемогло- 295 бин-диальдегидцекстран с помощью метода гель-фильтрации на сефадексах

11.2.2. Спектральные характеристики комплексов гемоглобин- 300 диал ьдегиддекстран

11.2.3. Электрофоретические характеристики комплексов гемогло- 303 бин-диальдегидцекстран

11.2.4. Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 305 разовании комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, с помощью метода протеолитического титрования

11.2.5. Термостабильность комплексов гемоглобин- 3 09 диальдегиддекстран

11.2.6. Создание и анализ компьютерных моделей комплексов гемо- 314 глобин- диальдегиддекстран

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения»

Актуальность темы. УФ-свет и температура - два важнейших экологических фактора, под воздействием которых возникала жизнь на Земле Понять сложные механизмы резистентности и адаптации живых систем по отношению к УФ-излучению и температурного фактора можно, только изучив их влияние на клеточно-молекулярном уровне отдельных индивидуумов. В качестве модельных объектов для изучения фото- и термостабильности белков очень удобно использовать компоненты крови, и в частности, гемоглобин эритроцитов. Последний относится к гетерогенным белкам (Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1978). В организме человека и животных он существует в комплексе с целым рядом малых лигандов (Ог, СО, N0, Н2О и др.) в виде молекул окси-, карбокси-, нитрозо-, метгемоглобина и др., физико-химические свойства и функциональная активность которых резко отличаются в зависимости от формы их существования: тетрамерной, димерной или мономерной (Л.И. Иржак, 1975; Г.А. Вашанов, 2004). Исследований, посвященных изучению вклада отдельных компонентов гембелков в процессы фотоповреждения различных структурных форм гемоглобина в условиях различного микроокружения (В.Г. Артюхов и др., 1997), крайне недостаточно. Основные фотохимические исследования гемопротеидов проведены в основном без учета их структурной неоднородности и лигандного состава.

В норме соотношение отдельных лигандных форм гемоглобина поддерживается на определенном уровне. Однако оно может значительно изменяться за счет поступления оксидов азота и углерода извне. Во многом этому способствует обострение экологической обстановки вследствие техногенного воздействия на окружающую среду (В.П. Подольский и др., 1999; М.Х.-Г. Ибрагимов, 2005; С.А. Куролап и др., 2006). Нередкими являются и бытовые случаи отравления оксидом углерода, летальные исходы которых составляют 17.5 % всех смертельных отравлений (Е.А. Лужников, Л.Г. Костомарова, 1989). Сродство N0 и СО к дезоксигемоглобину намного выше, чем кислорода. Присоединив эти лиганды, гемоглобин теряет способность транспортировать кислород к тканям и органам, что приводит к острым и хроническим отравлениям, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечнососудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию указанных веществ (водители автотранспорта, работники автостоянок, инспектора ГИБДД). Возникновение патологических эффектов может сопровождаться заметным увеличение содержания карбокси- (НЬСО) или нитрозогемоглобина (№>N0) в крови. В связи с этим всё большую актуальность приобретают исследования, посвященные изучению физико-химических и функциональных свойств препаратов гемоглобина с различным соотношением окси- и карбоксиформ, окси- и нитрозоформ.

Процессы с участием оксидов азота и углерода в биосистемах, подвергнутых воздействию физических факторов внешней среды, в том числе УФ-света от естественных и искусственных источников, остаются практически неизученными; недостаточно полно определены пути превращения комплексов белок-лиганд при этих воздействиях. Принимая во внимание усиливающуюся роль коротко- и средневолнового УФ-излучения в формировании антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также широкое использование в клинической практике метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и других видов фототерапии, становится понятной необходимость проведения подобного рода исследований.

Особый интерес представляет изучение структурного статуса молекул оксигемоглобина в присутствии различных концентраций лекарственных средств - источников N0.

Функционирование молекул оксида азота в клетках организма человека тесно связано с низкомолекулярными серосодержащими пептидами, и в частности, с восстановленным глутатионом (ОБН), молекулы которого входят в состав антиоксидантной системы, контролирующей разрушающее действие активных форм кислорода (АФК) при пероксидном стрессе. Соединяясь с оксидом азота, в8Н образует Б-нитрозоглутатион (08>Ю), который защищает N0 от различных воздействий при внутри- и межклеточном переносе. Важная роль глутатиона и его производных в нормальном функционировании клеток, тканей и организма человека и животных, а также недостаточная изученность влияния этих молекул на эритроцитарные белки крови стимулировали нас к проведению исследований третичной и четвертичной структуры нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в присутствии восстановленного глутатиона и S-нитрозоглутатиона.

Весьма перспективным является разработка кислородпереносящих А кровезаменителей на основе гемоглобина (Т.-Н. Jessen, R. Hilgenfeld, 1992; М.А. Ажигирова, Е.А. Селиванов, 1999), химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий. В связи с вышеизложенным нами было постулировано использование в качестве стабилизирующего агента гемоглобина окисленного производного клинического декстрана (реополиглюкина) - диальдегид-декстрана (ДАЦ), разработаны методы получения конъюгатов оксигемоглобина человека с данным полисахаридом, выяснены условия их образования, исследованы физико-химические характеристики и стабильность полученных комплексов.

Изучению действия температуры на белковые молекулы посвящено значительное количество работ (М. Жоли, 1968; В.Я. Александров, 1975, 1985; П. Хочачка, Дж. Сомеро, 1988; Е.Г. Франк и др., 1994). Вместе с тем мало внимания уделено исследованию природы конформационных превращений сложных (олигомерных) белков, приводящих к их термоинактивации. Недостаточно изучены вопросы, касающиеся выявления физико-химических основ тепловой денатурации этих биополимеров. Всё это убеждало нас в необходимости проведения подобного рода исследований. В качестве объектов исследования в данной серии экспериментов выступили оксигемоглобин человека в растворе, в присутствии реополиглюкина, в комплексах с диаль-дегиддекстраном и в составе эритроцитов, что позволило провести сравнительный анализ термоустойчивости оксиформы гемопротеида в зависимости от условий микроокружения и исходной конформации белка.

Таким образом, исследование фото- и термоиндуцированных структурных превращений гемоглобина человека и его производных, изучение функциональной активности оксигемоглобина в меняющихся условиях окружающей среды имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы.

Целью настоящей работы явилось определение степени УФ-чувствительности и термостабильности ряда структурных (лигандных) форм гемоглобина человека в условиях различного микроокружения.

Задачи работы предусматривали:

1. Оценку физико-химических характеристик гемоглобина человека с различными аксиальными лигандами (О2, СО, N0, Н20) в координационной сфере атома железа порфиринового кольца.

2. Изучение влияния различных диапазонов и доз УФ-света на спек: тральные, хроматографические и электрофоретические характеристики различных лигандных форм (окси-, карбокси-, нитрозо- и метформы) гемоглобина человека.

3. Выявление влияния сочетанного воздействия «терапевтических» доз УФ-света и различных концентраций НЬСО и №>N0 на функциональные свойства оксигемоглобина человека.

4. Сравнительный анализ фоточувствительности различных лигандных форм гемоглобина человека (НЮ2, НЬСО, №N0, МШЬ).

5. Изучение структурного состояния молекул оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием восстановленного глутатиона (10"4 10"2 моль/л) и УФ-излучения в дозах 151 ^ 4530 Дж/м .

6. Исследование изменений физико-химических свойств оксигемоглобина человека, индуцированных Б-нитрозоглутатионом в концентрациях 10"5 -И О"3 моль/л, а также сочетанным воздействием этого модификатора и УФ-света (240-390 нм) в дозе 151 Дж/м2.

7. Изучение влияния длительного хранения крови доноров при пониженной температуре на структурно-функциональные характеристики гемоглобина эритроцитов. Определение оптимальных сроков использования донорской крови для её трансфузии.

8. Подбор оптимальных условий химического синтеза комплексов окси-гемоглобин человека-диальдегиддекстран и определение некоторых физико-химических характеристик их молекул.

9. Изучение термостабильности молекул оксигемоглобина человека в растворе, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и тиолсодержа-щих соединений (восстановленного глутатиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МО-НОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора на структурно-функциональное состояние молекул гемоглобина человека. Выявлено, что от природы аксиального лиганда (Ог, СО, N0) в координационной сфере атома железа молекулы гемоглобина, прочности связи гем-проксимальный гистидин и конформации ближайшего белкового окружения гема зависят состояние высших типов пространственной организации молекул гемоглобина, его физико-химические свойства и фоточувствительность.

Получены доказательства, что одним из основных механизмов ответной реакции лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина на воздействие различных диапазонов и доз УФ-света является ослабление и разрыв междимерных и межсубъединичных контактов и, как следствие, накопление минорных димерных и мономерных форм гембелка. Кроме того, фотомодификации гемопротеидов могут приводить к декомпактизации их частично спирализованных молекул и ассоциации гембелков вплоть до размеров окта-меров.

Впервые исследовано влияние №N0 в диапазоне концентраций 0,110% на функциональные свойства нативного и УФ-облученного в дозах 151 и 453 Дж/м2 оксигемоглобина человека. Изучение динамики связывания кислорода гемопротеидом показало, что присутствие №N0 интенсифицирует начальные этапы процесса оксигенации и ослабляет кооперативные взаимодействия в тетрамерах, вследствие чего сродство гемоглобина к кислороду в области физиологически важных парциальных давлений (40-100 мм рт. ст.) снижается.

Показано, что направленность УФ-индуцированных изменений функциональных свойств (снижение или возрастание величин Г50 и константы Хилла) оксигемоглобина и его смесей с НЬСО и №>N0 определяется соотношением вкладов фотохимических превращений отдельных лигандных форм гембелка и процессами образования минорных компонентов системы гемоглобина. Выявлены предельные концентрации НЬСО (менее 10 %), при которых возможна корректировка и восстановление исходных характеристик кислородсвязывающей способности гемопротеида УФ-светом. На основе метода кусочно линейной аппроксимации созданы математические модели процессов оксигенации гемоглобина человека, модифицированного воздействием некоторых агентов физической и химической природы.

Исследована возможность использования производных декстрана (рео-полиглюкина и диальдегиддекстрана) в качестве стабилизаторов молекул гемоглобина. Впервые подобраны оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами. Определены а-1, б-Б-глюкопиранозные остатки декстрана, подвергающиеся окислению и участвующие в образовании альдегидных групп при получении ДАД, выявлены участки (аминокислотные остатки) глобина, ответственные за комплексообразование с указанным полисахаридным производным. Созданы компьютерные модели трехмерной пространственной структуры молекул декстрана, ДАД, комплексов

Hb-ДАД I и II типа с различным соотношением белок: модификатор.

Проанализированы термоиндуцированные изменения молекул гемоглобина человека в растворе (в свободном состоянии), в составе эритроцитов крови, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД. Выявлены оптимальные сроки хранения донорской крови при пониженной температуре, при которых структурные и функциональные характеристики гемоглобина остаются близкими к нативному состоянию. Показано, что термостабильность молекул гемоглобина можно значительно повышать путем присоединения к ним определенного количества молекул окисленного декстрана.

Практическая значимость. Результаты проведенных модельных экспериментов по исследованию динамики фотоиндуцированных превращений молекул НЬ02, HbCO, HbNO и MtHb и выяснению структуры стабильных фотопродуктов, образующихся при воздействии различных диапазонов длин волн УФ-света на гемопротеиды, можно использовать для подбора оптимальных доз УФ-облучения и длительности курса процедур при лечении заболеваний различной этиологии методом АУФОК. :

Данные, полученные при изучении влияния различных концентраций карбоксигемоглобина (10 - 80%) и нитрозогемоглобина (0,1 - 10 %) на функциональную активность гемоглобина до и после воздействия УФ-света могут быть использованы в клинической практике для диагностики интоксикаций организма СО или N0 и разработки методов регулирования кислородтранс-портной функции гемоглобина.

Разработанные программы для ЭВМ типа IBM «Анализ кривых диссоциации оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Расчет точки полного насыщения кислородом оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Прогноз функциональной активности нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в зависимости от концентрации оксида азота и углерода» (Свидетельства об официальной регистрации программ для ЭВМ № 2006614279, № 2006614280 и № 2006614281 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ, зарегистрированные в Реестре программ для ЭВМ 13 дкабря 2006 г.) позволяют быстро и точно, не прибегая к использованию графической модели процесса, рассчитать наиболее важные параметры процессов оксигенации гемоглобина в условиях различного микроокружения.

Результаты исследований, посвященных изучению структурно-функциональных характеристик молекул гемоглобина при длительном хранении консервированной крови доноров, необходимо принимать во внимание при разработке научно-обоснованных рекомендаций по использованию крови доноров в клинической практике.

Экспериментальные данные по исследованию физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии реополиглюкина и химически модифицированного гемоглобина (различные комплексы Hb-ДАД) могут быть использованы специалистами, работающими в области создания искусственных кровезаменителей.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Фотобиология", "Общая биофизика", "Фотофизика, фотохимия и фотоиммунология компонентов крови", при проведении спецпрактикума по фотобиологии, выполнении магистерских и кандидатских диссертационных работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Кислотно-основной и температурный гомеостаз» (Сыктывкар, 1994, 1997); Международной конференции «Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах (Суздаль, 1995); I и II Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1995, 1998); Second Int. Conf.on development directions of the radio communication systems and means (Voronezh, 1995); научно-практической конференции «Актуальные вопросы скорой медицинской помощи - реальность и перспективы» (Воронеж, 1996); 4-й региональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 1996); Int. Sci. Conf. "Mathematical models of non-linear excitation, transport, dynamics, control in condensed system and tb other médiums" (Tver, 1996); 12 Int. Congress on photobiology (Viena, 1996); 2nd Internat. Symposium "Molecular order and mobility in polimer systems" (Saints-Petersburg, 1996); I и II Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996, 1998); совещании-семинаре «Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации» (Воронеж, 1996); Международном симпозиуме «Кислород и свободные радикалы» (Гродно, 1996); V Международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 1997); 2-й Всероссийской научной конференции «Светоизлучательные системы. Эффективность и применение» (Саранск, 1997); 11-й межреспубликанской научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природных экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар, 1998); 2-й Международной научно-технической конференции «Решение экологических проблем в автотранспортном комплексе» (Москва, 1998); 3-й и 5-й Международных научных конференциях «Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1998; Москва, 2000); II и III съезде биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004); II и III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2000, 2003); 2-й Российской конференции «Физика в биологии и медицине» (Екатеринбург, 2001); IV съезде по радиационным исследованиям (радио-биология, радиоэкология и радиационная безопасность) (Москва, 2001); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); 7-й и 8-й Международной конференции по химии и физико-хи-мии олигомеров «0лигомеры-2000, 2002» (Пермь, 2000, Москва-Черноголовка, 2002); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); IV съезде по проблемам радиационной биологии (Москва,2001); 3 Int. Symposium on Separation in BioSciencies SBS'03 "100 yeares of chromatography" (Moskau, 2003); междисциплинарной конференции с международным участием «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2003); VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-графические приборы» (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); «Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2001, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); 6-й и 7-й международной научно-методической конференции «Информатика: проблемы, методология, технология» (Воронеж, 2006,2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 работ, в том числе коллективная монография, учебное пособие с грифом Министерства образования и науки РФ.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Состояние третичной и четвертичной структуры молекул гемоглобина и его УФ-чувствительность определяются природой аксиального ли-ганда и зависят от ближайшего микроокружения гемовой группы белковой макромолекулы. Фотомодификации различных лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина (Hb02, HbCO, HbNO, MtHb) затрагивают области контактов димеров и отдельных субъединиц, что приводит к накоплению минорных димерных и мономерных форм, или к декомпактизации тетрамер-ных молекул и образованию октамерных форм.

2. Схемы возможных физико-химических процессов, приводящих к УФ-модификации молекул карбокси-, нитрозо- и метгемоглобина человека.

3. Математические модели процессов оксигенации интактного и модифицированного УФ-излучением гемоглобина человека в присутствии оксидов углерода и азота.

4. Диальдегиддекстран - эффективный стабилизатор и модификатор структурно-функционального состояния молекул гемоглобина человека.

5. Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекст-ран I и II типов.

6. Схема процессов, протекающих в растворах интактных и термостатированных молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина и диальдегиддекстрана.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 385 страниц машинописного текста, 80 таблиц, 82 рисунка. Состоит из "Введения", 11 глав, "Заключения", "Выводов", "Приложения". Список цитируемой литературы содержит 362 работы, из них 211 отечественных и 151 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Путинцева, Ольга Васильевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе при помощи комплекса методов (спектрофо-тометрии в УФ- и видимой области, гель-хроматографии, электрофореза в ПААГ в присутствии и в отсутствие ДСН, светорассеяния, регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина, кислотно-основного титрования, математического и компьютерного моделирования) изучены структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в условиях воздействия эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и серосодержащих соединений (восстановленного глутатиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МОНОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора.

К наиболее заметным структурным последствиям замены аксиального лиганда 02 на N0 можно отнести ослабление и последующую диссоциацию междимерных контактов (а^, о.\а2, Р1Р2) гемоглобина, что приводит к образованию 4 электрофоретических фракций, а также локальное усиление спи-рализации образующихся димерных форм, молекулярные массы которых колеблются от 27,1 до 30,6 кДа.

Серия экспериментов по изучению влияния лекарственных препаратов нитроглицерина и МОНОЧИНКВЕ® на структуру оксигемоглобина, который служит своеобразным «депо» для молекул N0 и может участвовать в их транспортировке выявила, что оба препарата в достаточно большом диапазоне концентраций индуцируют только локальные изменения в молекулах оксигемоглобина: нитроглицерин - в глобиновой части (не затрагивающие его фракционный состав), а МОНОЧИНКВЕ®- в гемовой, при этом процессы окисления гембелка не наблюдаются. Однако следует избегать передозировки этих препаратов, особенно нитроглицерина, которые могут привести к более глубоким изменениям в структуре гемопротеида: к росту гетерогенности и метгемоглобинобразованию.

В отличие от №N0 в молекулах НЬСО формируются достаточно стабильные межсубъединичные и междимерные связи: они не разрушаются в процессе электрофореза и НЬСО мигрирует одной фракцией. Однако повторное воздействие щелочной среды (трис-глициновый буфер, рН 8,3) приводит к разрыву некоторых междимерных связей и во время гель-фильтрации 30 % тетрамеров электрофоретической фракции НЬСО распадается на ди-меры с молекулярной массой 39,4 кДа.

Связывание различных по своей природе аксиальных лигандов атомом железа может приводить к изменению электронного состояния и геометрии железопорфирина, которые индуцируют распространяющиеся по структуре глобинового компонента конформационные перестройки, позволяющие, по-видимому, данной лигандной форме гемоглобина более эффективно выполнять свои специфические функции.

Малые неионные лиганды, различные по своей природе, оказывают существенное влияние на физико-химические свойства гемопротеида, особенности протекания ответных реакций при воздействии на биомолекулы экзогенных факторов, в том числе и УФ-излучения.

При исследовании изменений структуры молекул гемоглобина человека и его производных после облучения интегральным потоком УФ-излуче-ния (151 +4530 Дж/м ) установлено, что хроматографическое поведение исследуемых гемопротеидов оказалось однонаправленным: не выявлено образования межмолекулярных сшивок гембелков, не обнаружено разрывов пептидных связей и связей между отдельными субъединицами гемопротеидов. Незначительное увеличение или уменьшение величин кажущихся молекулярных масс фотомодифицированных образцов свидетельствует не о процессах ассоциации или диссоциации гембелка, а о частичном разворачивании или сворачивании полипептидных цепей его макромолекул вследствие ослабления или усиления межсубъединичных контактов.

На основании собственных результатов и литературных данных предложена схема возможных процессов УФ-превращений молекул НЬСО и

HbNO человека (рис. 82).

УФ-облучение

Х>300нм Х<300нм

Ч. i

CO-Fe2 Hb-AH tI миграцм энергии (Fe2,)Hb + CO

906-1359 Дж/м5

Fe2+)Hb02 (FeJ+)HbCO (Fe3+)Hb частичная фотодиссоциация лиганда, ослабление субъединичных контатов, локальные конформационные перестройки апобелка

02;Н20 генерация активных форм кислорода

2265-4530

Дж/м2 продукты фотомодификации (Fe2+)HbC0,(Fe2t)Hb02 и (Fe3t)Hb

Х>300нм Я,<300нм

Ч 1

NO-Fe НЬ-АН t1 миграция энергии

Fe2+)Hb + NO

906-1359 Дж/м2

Fe2t)Hb02 (Fe2+)Hb; NO; NO; (Fe3t)Hb

1359-4530 Дж/м2

Fe3+)Hb + H2Oj (Fe3+)Hb |H202] + 2NOj

Fe3t)Hb + 2HOONO (Fe2+)Hb02 или -2(Fe2t)Hb

-2(Fe3+)Hb

1—9 ha]+2no; фотомодификация третичной и четвертичной структуры белка, изменение размеров молекул, накопление метгемоглобина в образце

Рис. 82. Схема процессов УФ-превращений молекул карбокси- и нитро-зогемоглобина человека

Модификации структуры молекул оксигемоглобина человека наблюдаются не только после смены лиганда в координационной сфере атома железа гема, но и при изменении ближайшего микроокружения железопорфи-рина, например, в присутствии восстановленного глутатиона, способного вступать во взаимодействие с Cys 93(3. Ближайшим соседом Cys 93 Р в спиральном сегменте F является проксимальный His 92р, имидазольная группа которого ковалентно связана с атомом железа гема. Эта связь обладает высокой лабильностью и ей принадлежит особенно важная роль в соединении порфирина с глобином. Кроме того, сульфгидрильные группы вносят значительный вклад в поддержание целостности и устойчивости структуры молекул гемоглобина. Серосодержащие аминокислотные остатки Сув 104(а) и Суэ 112(Р) участвуют во взаимодействии цепей типа а^ гемоглобина и регулируют равновесие реакции диссоциации тетрамеров белка в сторону ди-меров аф2. Было установлено, что присоединение молекул вБН к тетрамеру НЬ02 приводит к частичному разрыву связей между отдельными субъединицами гемопротеида, образованию димеров (48,8 кДа) и появлению в растворе новых конформационных форм белка (84,7 кДа), нехарактерных для его на-тивного состояния. Использование метода электрофореза также подтвердило рост гетерогенности гемопротеида и перераспределение белка между его отдельными фракциями после воздействия вБН. Степень изменений структуры оксигемоглобина зависит от соотношения в исследуемом образце молекул гемопротеида и тиолсодержащего трипептида. С ростом концентрации в8Н в смеси незначительные конформационные перестройки гембелка (1:10) постепенно заменяются процессами образования МШЬ (1:100 - 1:500) и разрывом связей между гемином и глобином (1:1000).

Таким образом, эксперименты с участием восстановленного глутатиона доказали, что изменения в ближайшем микроокружении гема, возникающие вследствие модификации связи порфирина с глобином, оказывают влияние не только на состояние железопорфирина, но и на апобелковый компонент, т.е. на структуру всей молекулы гемоглобина в целом, что нашло отражение и на её УФ-чувствительности. В присутствии восстановленного глутатиона возрастает фоторезистентность ароматических аминокислотных остатков белка к действию УФ-света в дозах 151-953 Дж/м . Однако их ответная реак О ция на воздействие больших доз (1359-4530 Дж/м ) аналогична таковой ок-сиформы гембелка без модификатора. Процессы, обеспечивающие фотопротекторное действие ОБН, реализуются по двум основным путям: за счет дезактивации активных форм кислорода, образующихся при УФ-облучении водных растворов гемопротеида, и за счет формирования смешанного дисульфида 0-8-8-НЬ, что снижает подвижность его полипептидных цепей и тем самым тормозит процессы фотоокисления хромофоров под действием УФ-света. Только большие дозы УФ-излучения могут разорвать прочные ди-сульфидные мостики 0-8-8-НЬ, лабилизировать молекулу белка и нивелировать защитное действие глутатиона.

Особый интерес представляют исследования по изучению структуры оксигемоглобина, модифицированного 8-нитрозоглутатионом, который, с одной стороны, является поставщиком N0, а, с другой, - способен после процесса диссоциации взаимодействовать с 8Н-группами Суэ 93(3 гембелка, т.е. непосредственно влиять на ближайшее микроокружение гема. Оказалось, что из всех исследуемых нами лекарственный средств, 08Ы0 наиболее сильно влияет на молекулы гемопротеида: он индуцирует образование его окисленных форм и рост гетерогенности. В то же время воздействие терапевтических доз УФ-света

151 Дж/см ) на смеси оксигемоглобина с вЗМ) приводит к обратному эффекту: процессам перехода атома железа гема из трехвалентного в двухвалентное состояние и фотопревращению окисленной формы гембелка в низкоспиновую. Следовательно, процедуру облучения крови малыми дозами УФ-излучения можно использовать для нивелирования отрицательных последствий воздействия низкомолекулярных тиолсодержа-щих соединений на гембелки.

Было установлено, что наиболее фотоустойчивыми оказались оксиге-нированные и нитрозилированные молекулы гемоглобина человека, фракционный состав которых после облучения УФ-светом оставался неизменным, при одновременном перераспределении белка между фракциями. УФ-облу-чение карбокси- и метформы гемоглобина приводило к появлению новых фракций с электрофоретическими показателями, значительно отличающимися от необлученных образцов, что характеризует их большую фотолабильность и неустойчивость по сравнению с окси- и нитрозоформой.

Таким образом, согласно данным гель-хроматографии и электрофореза

I ответной реакцией разнообразных форм гемоглобина на изменения внешней среды (ионного состава и рН ближайшего микроокружения, действия электродвижущих сил и квантов УФ-света) являются ослабление и разрыв или усиление и образование новых дополнительных межсубъединичных контактов, приводящих или к изменению фракционного состава, или к перераспределению белка между отдельными фракциями гемопротеида.

Следовательно, основная роль в приспособлении гемоглобина к меняющимся условиям окружающей среды принадлежит процессам ассоциации или диссоциации белковых глобул, которые можно рассматривать как тонкий и удобный механизм саморегуляции и адаптации биологических систем к воздействию физико-химических факторов, сложившийся в процессе биоэволюции.

Степень фотомодификации исследуемых гемопротеидов зависит от входящих в их состав малых лигандов, от электронного состояния атома железа гема, конформационного состояния полипептидных цепей глобинового компонента и прочности контактов гем - глобин, а также от диапазона и дозы применяемого УФ-света.

Высокую способность гемопротеидов и других сложных олигомерных ^ белков к процессам ассоциации-диссоциации составляющих их субъединиц следует учитывать при изучении проблем самоорганизации биологических макромолекул (О. В. Путинцева, В.Г. Артюхов, 1995), механизмов регуляции гомеостаза организма человека и животных, установлении взаимозависимых переходов отдельных форм гемоглобина вследствие УФ-облучения его изолированных растворов или цельной крови в условиях проведения АУФОК-терапии, а также изучении функциональных свойств нативных белковых глобул и их составных компонентов или комплексов с другими органическими и неорганическими веществам. ) Нами было проанализировано влияние на структуру гемоглобина другого физического фактора - температуры. Так, применение совокупности выше перечисленных методов исследования позволило нам определить наи более оптимальные сроки сохранения отдельных физико-химических характеристик молекул гемоглобина (размеры, гетерогенность, кислородсвязы-вающую способность) в процессе длительного термостатирования консервированной крови доноров, а, следовательно, и наиболее приемлемые сроки использования последней для переливания реципиентам. Сравнительный анализ кинетики термоинактивации синтезируемых de novo гемопротеидов (комплексы Hb-ДАД разного типа) с таковой нативного гемоглобина дал дополнительную информацию о природе и прочности связей, возникающих между модификатором и белком, выявил повышенную степень устойчивости химически измененного гембелка к действию денатурирующего фактора. Это позволяет рассматривать диальдегиддекстран как эффективный модификатор и перспективный стабилизатор структурно-функционального состояния белковых макромолекул, сохраняющий их биологически важные свойства и способность выполнять физиологическую роль в организме при изменении условий среды.

331