Структурно-функциональные взаимосвязи и белковая инженерия формиатдегидрогеназ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор наук Пометун Анастасия Александровна

  • Пометун Анастасия Александровна
  • доктор наукдоктор наук
  • 2019, ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
  • Специальность ВАК РФ03.01.04
  • Количество страниц 309
Пометун Анастасия Александровна. Структурно-функциональные взаимосвязи и белковая инженерия формиатдегидрогеназ: дис. доктор наук: 03.01.04 - Биохимия. ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». 2019. 309 с.

Оглавление диссертации доктор наук Пометун Анастасия Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность и степень разработанности темы исследования

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы

1.5. Методология и методы исследования

1.6. Положения, выносимые на защиту:

1.7. Степень достоверности и апробация работы

1.8. Публикации

1.9. Структура и объем работы

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общая характеристика формиатдегидрогеназ

2.2. Ретроспектива исследований ФДГ

2.3. Физиологическая роль формиатдегидрогеназ

2.4. Получение формиатдегидрогеназ

2.5. Основные свойства ФДГ из различных источников

2.5.1. Каталитические свойства

2.5.2. Субстратная специфичность

2.5.3. Коферментная специфичность

2.5.4. Термостабильность

2.5.5. Ингибирование

2.5.6. Катализ обратной реакции

2.5.7. Влияние рН на свойства ФДГ

2.5.8. Химическая стабильность

2.6. Анализ аминокислотных последовательностей ФДГ

2.6.1. Общий анализ первичной структуры формиатдегидрогеназ

2.6.2. Анализ последовательностей сигнальных пептидов растительных ФДГ

2.7. Пространственная структура формиатдегидрогеназ из различных источников

2.8. Механизм действия ФДГ

2.9. Изучение взаимосвязей между структурой и функцией ферментов методами белковой инженерии

2.9.1. Неупорядоченный мутагенез

2.9.2. Направленный мутагенез

2.9.3. Создание фьюжн-белков

2.10. Белковая инженерия формиатдегидрогеназ из различных источников

2.10.1. Увеличение стабильности ФДГ

2.10.2. Изменение коферментной специфичности

2.10.3. Получение фьюжн-белков на основе ФДГ

2.10.4. Мутагенез ФДГ для повышения эффективности обратной реакции

2.11. Применение ФДГ

2.11.1 Регенерация кофактора

2.11.2. Получение различных соединений на основе индустриальных штаммов за счет суперэкспрессии гена, кодирующего ФДГ

2.11.3.Фиксация CO2

2.11.4. Другие области применения

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы

3.2. Методы исследования

3.2.1. Клонирование генов формиатдегидрогеназ

3.2.2. Направленный мутагенез генов формиатдегидрогеназ из различных источников

3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.4. Рестрикция фрагментов ДНК

3.2.5. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля

3.2.6. Лигирование

3.2.7. Трансформация клеток E .coli

3.2.8. Выделение плазмидной ДНК

3.2.9. Секвенирование ДНК

3.2.10. Экспрессия SoyFDH и ее мутантных форм в клетках E. coli

3.2.11. Выделение и очистка формиатдегидрогеназ

3.2.12. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях

3.2.13. Определение активности фермента

3.2.14. Определение констант Михаэлиса

3.2.15. Титрование активных центров и расчет каталитических констант

3.2.16. Определение каталитических констант методом Бредфорда

3.2.17. Определение констант скорости термоинактивации

3.2.18. Определение активационных параметров процесса термоинактивации фермента

3.2.19. Изучение термостабильности с помощью ДСК

3.2.20. Получение кристаллов и определение трехмерной структуры формиатдегидрогеназ

3.2.21. Моделирование трехмерной структуры апо-SoyFDH

3.2.22. Определение изоэлектрической точки

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Получение новых формиатдегидрогеназ из различных источников

4.1.1. Выбор организма для клонирования генов ФДГ

4.1.2. Клонирование новых генов формиатдегидрогеназы

4.1.3. Экспрессия генов, кодирующих формиатдегидрогеназу

4.1.4. Очистка рекомбинантных ферментов

4.2. Основные свойства рекомбинантных ФДГ дикого типа

4.2.1. Кинетические параметры

4.2.2 Определение концентрации активных центров и каталитических констант рекомбинантных ФДГ

4.2.3. Термостабильность формиатдегидрогеназ дикого типа

4.2.4. Влияние различных факторов на температурную стабильность формиатдегидрогеназ

4.3. Кристаллизация

4.3.1. Получение кристаллов формиатдегидрогеназ из различных источников

4.3.2. Определение трехмерных структур формиатдегидрогеназ из различных источников

4.4. Белковая инженерия ФДГ из различных источников

4.4.1. Использование различных подходов для стабилизации белковой глобулы на примере формиатдегидрогеназы сои

4.4.2. Мутагенез канонической последовательности XP(A)QP формиатдегидрогеназ из различных источников

4.4.3. Изучение синергистического эффекта мутаций на примере ФДГ сои

4.4.4. Увеличение химической стабильности OpaFDH

4.4.5. Мутагенез каталитически важных остатков ФДГ из S.aureus

4.4.6. Изменение коферментной специфичности формиатдегидрогеназы

4.4.7. Инженерия изоэлектрической точки PseFDH методом направленного

мутагенеза

4.5. Изучение влияния ионных жидкостей на свойства формиатдегидрогеназы

V. ВЫВОДЫ

VI. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

ИПМДГ - изопропилмалатдегидрогеназа

ИПТГ - изопропил^^-тиогалактопиранозид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТАК - теория активированного комплекса

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(оксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

ФДГ - формиатдегидрогеназа

ФМДГ - формальдегиддегидрогеназа

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид, окисленный

NADH - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный

NADP+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленный

AS - сульфат аммония

AthFDH - формиатдегидрогеназа из растения Arabidopsis thaliana

dNTP - дезоксирибонуклеотид трифосфат

OpaFDH - формиатдегидрогеназа из дрожжей Ogataea parapolymorpha

PpaFDH - формиатдегидрогеназа из мха Physcomitrella patens

PseFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp

SauFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Staphylococcus aureus

SceFDH - формиатдегидрогеназа из дрожжей Saccharomyces cerevisiae

SDS - додецилсульфат натрия

SoyFDH - формиатдегидрогеназа из сои Glycine max

NaPB - натрий-фосфатный буфер

I. Введение

1.1. Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Ферменты выполняют различные функции в живых организмах, играют ключевую роль в процессах метаболизма и передачи сигналов. Изучение взаимосвязей между структурой и функцией ферментов является важной и актуальной задачей современной науки, поскольку это позволяет лучше оценить физиологическую роль исследуемого фермента, выявить общие закономерности в функционировании, понять особенности механизма действия и получить информацию для эффективного применения на практике.

Под названием формиатдегидрогеназа (ФДГ) в научной литературе понимается две больших группы ферментов, катализирующих окисление формиат-иона до углекислого газа. Первая группа представлена ферментами в основном из анаэробных организмов, имеющими сложную четвертичную структуру и содержащими в своем составе ионы металлов, железо-серные кластеры и другие металл-содержащие кофакторы. Зачастую такие ФДГ являются мембранными белками [1]. Вторую группу образуют NAD(P)+-зависимые ФДГ (КФ 1.2.1.2.). Эти ферменты являются гомодимерами, не содержат ни ионов металлов, ни каких-либо простетических групп [2]. Объектами исследования в данной работе являются формиатдегидрогеназы, относящиеся ко второй группе. Эти ферменты катализируют вышеуказанную реакцию при сопряженном восстановлении NAD(P)+ до NAD(P)H. ФДГ этой группы являются простейшими представителями суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот [3] и рассматриваются как модельные объекты для изучения реакций, катализируемых представителями этого суперсемейства. Такие ФДГ были найдены в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах и растениях [2,4]. Было показано, что в некоторых прокариотах находятся оба типа ФДГ, которые, по всей видимости, выполняют различные функции [1]. Исследования ФДГ были начаты еще в начале прошлого века на примере ферментов из растений [5,6]. В 70-х - 80-х годах XX столетия стали активно изучать ФДГ из метилотрофных бактерий и дрожжей [7]. Развитие методов генетической инженерии позволило проводить клонирование генов формиатдегидрогеназ и получать рекомбинантные ферменты [8-10]. Анализ

фрагментов геномов и целых геномов различных организмов показал, что ФДГ содержится в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах и растениях. За последние 30 лет было проведено клонирование генов, кодирующих ФДГ, из более чем 20 различных организмов [8-14]. В настоящее время исследования этого фермента продолжаются; только за последние пять лет было клонировано 6 новых генов, кодирующих ФДГ [12,14-18]. Изучение физиологической роли ФДГ показало, что этот фермент выполняет ряд важных функций в жизнедеятельности различных организмов. Эти исследования были начаты на метилотрофах, для которых было показано, что ФДГ катализирует последнюю стадию в трехстадийном окислении метанола до СО2, участвуя в снабжении клетки энергией [2]. Анализ геномов большинства патогенных организмов показал наличие генов, кодирующих ФДГ. Показано, что в Staphylococcus aureus в условиях их роста в виде биопленок количество мРНК ФДГ находится на третьем месте, т.е. данный фермент играет чрезвычайно важную физиологическую роль в существовании этого патогенного микроорганизма в такой форме [19]. При этом исследования ФДГ патогенов до сих пор не проводилось. До нашей работы не было клонировано ни одного такого гена. В растениях ФДГ является универсальным белком стресса, и ее количество резко возрастает при биотическом и абиотическом стрессе [20-22]. Известно, что ФДГ в растениях существует в виде нескольких изоформ, по которым можно определить видовую принадлежность и выявить больные растения [23]. Также было показано, что разные изоферменты ФДГ синтезируются в ответ на различные виды стрессовых воздействий [21]. Поэтому детальное изучение ФДГ растений является важным этапом в исследовании механизмов адаптации к стрессу. Таким образом, учитывая чрезвычайно важную физиологическую роль, которую играет ФДГ в различных организмах, можно сказать, что этот фермент представляет собой интересный объект исследования с точки зрения фундаментальной науки.

Формиатдегидрогеназа широко применяется на практике в процессах, где требуется регенерация кофактора NAD(P)H в системах синтеза оптически активных соединений с помощью оксидоредуктаз [24,25]. К преимуществам применения формиатдегидрогеназы для регенерации восстановленного кофермента можно отнести необратимость катализируемой реакции, простоту удаления

второго продукта реакции - углекислого газа, невысокую стоимость субстрата -формиат-иона, широкий pH-оптимум активности, высокую специфичность, а также высокую стабильность фермента в различных условиях. Именно поэтому до сих пор самым крупномасштабным процессом с применением очищенных ферментов является процесс получения трет^-лейцина, реализованный фирмой Evonic. В данном процессе ФДГ из дрожжей Candida boidinii применяется в качестве катализатора для регенерации NADH [26]. ФДГ активно применяется в биоаналитических целях. Она используется для определения формиата в продуктах питания, в биосенсорах на формиат-ион в качестве базового фермента, а также в различных биосенсорах, использующих сразу несколько ферментов. Кроме того, недавно было начато использование ФДГ для определения NAD/NADP+ в сложных системах (например, в препаратах мозга крыс). Использование ФДГ в таких системах предполагает довольно высокие требования к этим ферментам. Они должны обладать высокой стабильностью к химическим агентам, различным растворителям, высоким температурам, должны иметь высокую каталитическую активность и высокую специфичность (практически абсолютную) к субстрату и коферменту. Учитывая вышесказанное, можно сказать, что современное состояние биотехнологий требует новых вариантов формиатдегидрогеназ, обладающих необходимыми функциональными характеристиками. Поэтому поиск и получение новых ФДГ (клонирование новых генов, их экспрессия и белковая инженерия) являются в настоящее время актуальной научной задачей.

В нашей лаборатории проводятся систематические исследования ФДГ из бактерий, дрожжей и растений: имеется одна из самых больших коллекций генов этого фермента, разработана высокоэффективная система экспрессии, которая позволяет получить целевой белок с выходом до 40% от всех белков клетки. Оптимизация условий очистки позволила быстро и с высоким выходом получать препараты ФДГ с более чем 95% чистотой.

Данная работа посвящена решению важных и актуальных проблем - анализу общих взаимосвязей между структурой и функцией формиатдегидрогеназ из различных источников, поиску и клонированию новых генов этого фермента из патогенных бактерий, дрожжей и растений, определению трехмерных структур

новых формиатдегидрогеназ, а также выявлению и определению роли ключевых аминокислотных остатков методами белковой инженерии.

1.2. Цели и задачи исследования.

Целью работы было выявление и изучение основных закономерностей

взаимосвязей между структурой и свойствами формиатдегидрогеназ из различных источников. Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:

- проведение поиска и клонирования новых генов, кодирующих формиатдегидрогеназы из патогенных бактерий Staphylococcus aureus, термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha, растений сои Glycine max и мха Physcomitrella patens;

- создание генно-инженерных конструкций, обеспечивающих успешную экспрессию этих ферментов в клетках E.coli в активной и растворимой форме, а также разработка эффективной системы очистки, позволяющей получить рекомбинантные ферменты в виде препаратов с высокой степенью чистоты;

- изучение каталитических свойств и термостабильности ферментов;

- наработка ферментов в достаточных количествах для кристаллизации, получение кристаллов и определение трехмерной структуры;

- исследование роли отдельных аминокислотных остатков в катализе и стабильности ФДГ методами белковой инженерии.

1.3. Научная новизна.

Впервые проведен детальный анализ первичных структур

формиатдегидрогеназ из различных организмов и существенно расширен список источников этой группы ферментов. Для наиболее интересных природных источников проведено клонирование новых генов, кодирующих формиатдегидрогеназу. В том числе проведено клонирование гена формиатдегидрогеназы из патогенного микроорганизма S.aureus, дрожжей O.parapolymorpha, сои G.max, низшего растения - мха P. patens. Из последнего источника впервые в мире получена рекомбинантная формиатдегидрогеназа растений, представляющая собой активный белок предшественник с полноразмерным сигнальным пептидом. Ранее попытки экспрессировать

полноразмерный вариант растительных про ФДГ заканчивались получением неактивных телец включения. Систематически исследованы основные свойства формиатдегидрогеназ дикого типа из большого количества источников и показаны взаимосвязи между свойствами ферментов и их структурой. В результате получены новые ферменты, обладающие или самой высокой каталитической константой, или самыми лучшими значениями констант Михаэлиса по коферменту и субстрату. Получены кристаллы четырех новых ФДГ, и определены их трехмерные структуры. Всего проведено решение шести новых трехмерных структур. Для двух ферментов - формиатдегидрогеназ из термотолерантных дрожжей O. parapolymorpha и патогенных бактерий S. aureus получены структуры ферментов как для апо, так и для холо форм. Для растительных ферментов (SoyFDH и PpaFDH) получены структуры тройных комплексов формиатдегидрогеназы с NAD+ и азидом. Проведен детальный сравнительный анализ трехмерных структур ФДГ из различных источников и определены структурно-эквивалентные аминокислотные остатки и последовательности, играющие ключевую роль в катализе и стабильности формиатдегидрогеназ. Методом направленного мутагенеза получены точечные мутантные формы формиатдегидрогеназ из различных источников, содержащие замены в ряде полуконсервативных последовательностей, и проведена оценка их влияния на свойства фермента, а также установлены основные взаимосвязи между структурой и функцией фермента. Найдены аминокислотные остатки, оказывающие значительное влияние на температурную стабильность формиатдегидрогеназ из различных источников. За счет одной аминокислотной замены удалось повысить стабильность ФДГ при высоких температурах более чем в 100 раз. Получены новые данные о механизме субстратной специфичности формиатдегидрогеназы. С помощью одной замены впервые удалось изменить специфичность от NAD+ к NADP+. За счет точечных аминокислотных замен удалось добиться значительного улучшения кинетических параметров у ФДГ из S. aureus. Заменой одного остатка цистеина в дрожжевой ФДГ удалось повысить химическую стабильность ФДГ более чем на два порядка. Полученные данные могут быть использованы при разработке подходов к получению других ферментов с заданными характеристиками методами белковой инженерии.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы.

Получены новые рекомбинантные формиатдегидрогеназы дикого типа из

патогенных бактерий, дрожжей и растений. Показано влияние N-концевой последовательности на уровень экспрессии белка в клетках E.coli. Полученные ферменты обладают уникальными свойствами: самой высокой каталитической константой или самыми низкими значениями констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату среди всех изученных на настоящий момент формитатдегидрогеназ. На примере наименее стабильной ФДГ сои опробовано несколько различных подходов по стабилизации фермента методами белковой инженерии, и выявлены подходы, обладающие наибольшей эффективностью, которые впоследствии могут быть использованы для других ферментов. Проведен мутагенез структурно-эквивалентных аминокислотных остатков в последовательностях ФДГ из различных источников. На примере ФДГ из патогенных бактерий, дрожжей и растений показана чрезвычайная важность полуконсервативной последовательности XP(A)QP для катализа и стабильности при высоких температурах. Термостабильность лучшей мутантной формы SoyFDH при повышенных температурах возросла на два порядка, а каталитическая активность - на 76%. За счет точечных аминокислотных замен получены две мутантные формы PpaFDH, обладающие более высокой стабильностью в 9 и 90 раз соответственно. В работе описаны три мутантные формы OpaFDH, две из которых обладают повышенной температурной стабильностью, одна обладает повышенной химической стабильностью. Объединение двух лучших замен позволило получить фермент, который может быть успешно применен на практике в качестве биокатализатора для регенерации кофактора. Выявлены аминокислотные остатки в последовательности ФДГ, которые отвечают за кинетические параметры фермента. Получены мутантные SauFDH, обладающие более высоким сродством к коферменту и субстрату в 3 и 2 раза соответственно. Получены мутантные формы PseFDH с измененной коферментной специфичностью от NAD к NADP+. Данные ферменты могут быть использованы для разработки биокатализаторов регенерации кофактора. Полученные данные можно успешно использовать при анализе структурно-функциональных взаимосвязей других ферментов. Проведены

исследования свойств ФДГ в ионных жидкостях (ИЖ). Заложены основы по оптимальному применению ферментов в водных растворах и ИЖ.

1.5. Методология и методы исследования.

В рамках данной работы были использованы следующие методы и подходы:

методы биоинформатики (поиск последовательностей генов и ферментов по базам данных, построение множественных выравниваний, конструирование последовательностей праймеров); методы генетической инженерии (полимеразная цепная реакция, методы работы с нуклеиновыми кислотами); методы молекулярной биологии (экспрессия штаммов-продуцентов рекомбинантных ФДГ, трансформация); хроматографические методы (гидрофобная хроматография, гель-фильтрация); физико-химические методы анализа белковых молекул (спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, дифференциальная сканирующая калориметрия), методы структурной биологии (кристаллизация белковых молекул, анализ структуры белковых молекул), методы белковой инженерии (моделирование аминокислотных замен).

1.6. Положения, выносимые на защиту:

1. Клонированные последовательности соответствуют последовательностям,

кодирующим формиатдегидрогеназы из патогенных бактерий S. aureus (SauFDH), термотолерантных дрожжей O. parapolymorpha (OpaFDH), а также растений сои G. max (SoyFDH) и мха P. patens (PpaFDH). У растительных ферментов оптимальный уровень экспрессии наблюдается для конструкций, которые не содержат сигнальные последовательности.

2. SauFDH является одной из самых стабильных формиатдегидрогеназ, а также имеет самое высокое значение каталитической константы по сравнению с ФДГ из других источников. SoyFDH и OpaFDH характеризуются самыми низкими значениями констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату.

3. Формиатдегидрогеназы из растений (SoyFDH и PpaFDH) кристаллизуются только в виде тройного комплекса в закрытой конформации. Для OpaFDH апо и холо формы являются открытыми. В структуре комплекса SauFDH-NAD+ только одна из субъединиц является закрытой.

4. Подход, в результате которого происходит заполнение полостей внутри белковой глобулы, приводит к увеличению стабильности ФДГ из сои. Точечная (A267M) и двойная (A267M/I272V) замены приводят к увеличению термостабильности SoyFDH в 2,8-3,6 и 5,4-11 раз соответственно при повышенных температурах.

5. Замены остатков цистеина на остатки аланина приводят к увеличению химической стабильности ФДГ. В случае OpaFDH замена C230A привела к снижению константы скорости инактивации пероксидом водорода более чем на два порядка.

6. Замены аминокислотного остатка в положении X в канонической полуконсервативной последовательности XP(A)QP приводят к существенному изменению свойств ФДГ из различных источников. Наиболее эффективными для температурной стабильности в положении X являются отрицательно заряженные аминокислотные остатки. Остаток пролина является критически важным для стабильности и каталитических свойств формиатдегидрогеназ. В случае SoyFDH добавление аминокислотных замен F290D, F290N и F290S в положении X к заменам A267M/I272V приводит к повышению стабильности фермента более чем в 100 раз при повышенных температурах без существенного изменения каталитических свойств.

7. Каноническая последовательность GXGXXG оказывает существенное влияние на каталитические свойства формиатдегидрогеназ из различных источников. Замены аминокислот в этой последовательности у SauFDH приводят к значительному изменению констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату.

8. Остаток аспарагиновой кислоты, находящийся в кофермент-связывающем домене формиатдегидрогеназы, определяет специфичность ФДГ к NAD+.

9. Формиатдегиддрогеназы сохраняют высокую активность и достаточно стабильны в водных смесях с ионными жидкостями (ИЖ). Влияние ИЖ зависит от источника фермента. Свойства фермента в растворах ИЖ меняются в зависимости от типа и положения изменяемого остатка.

1.7. Степень достоверности и апробация работы.

Достоверность данных экспериментов обеспечена использованием большого

количества современных методов исследования, проведением ряда независимых

14

экспериментов с использованием положительных и отрицательных контролей. Все эксперименты проводили в трех и более независимых повторах, и для анализа данных использовали адекватные и современные методы статистической обработки.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: International Conference "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Санкт-Петербург, 2005; Москва - Санкт-Петербург, 2007; Архангельск, 2009; Москва, 2013; Московская область, 2015, 2017), 4, 5, 6, 7, 8 и 9-ый Московский международные конгрессы "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007, 2009, 2011, 2013, 2015, 2017), 14th International Biotechnology Symposium. (Rimini, Italy, 2010), International Conference INPEC (International Network of Protein Engineering Centres) (Sweden, Uppsala, 2010; Taipei, Taiwan, 2012; St. Petersburg Region, Russia, 2014; Daejeon, Republic of Korea,

2016), 9th and 10th International Conferences on Protein Stabilisation, (Lisbon, Portugal, 2012; Stresa, Italy, 2014), 38th, 42nd, 43d and 44th FEBS Congresses, (St.Petersburg, Russia, 2013; Jerusalem, Israel, 2017; Prague, Czech Republic, 2018, Krakov, Poland, 2019), Oxizymes (Vienna, Austria, 2014; Wageningen, The Netherlands, 2016), 29th Annal Symposium of the Protein Society (Spain, Barcelona, 2015), 5th International Conference on "Biocatalysis in Non-Conventional Media (BNCM)" (Rostock, Germany,

2017), COST CM1206 EXIL - EXchange on Ionic Liquids: WG1 and WG4 Workshop Advances on Green Technologies (Poznan, Poland, 2016), Ionic liquids winter school (Porto, Portugal, 2017), 3rd International Conference on the Pathophysiology of Staphylococci (Tübingen, Germany, 2016), МОБИ-Хим (Новый Свет, 2014, г. Севастополь, Россия, 2017), V Съезд физиологов СНГ, V Съезд Биохимиков России (Сочи, Россия, 2016), VIII Российский симпозиум "Белки и пептиды" (Москва, Россия, 2017), V International Conference-Symposium "Ecological Chemistry" (Chishinau, Republic of Moldova, 2012), V International Meeting "Early events in Human Pathologies" (Listvyanka, Baikal, Russia, 2012), International BioForum (Puschino, Russia, 2014), II-ая Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященная 85-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2011), XIX и ХХ Менделеевские съезды по общей и прикладной химии, (Волгоград, Россия, 2011, Екатеринбург, Россия, 2016), International inference "Lomonosov and

Humboldt: Science Collaboration of Russia and Germany" (Москва, 2011), VIII, XI, XII, XV, XVI, XVII Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии» (Москва - Сочи, 2008; Брянск, Россия, 2011; Браслав (Белоруссия) и Игналина (Литва), 2012; Вологда, 2013, Барнаул - Горно-Алтайск, Россия, 2015; Бишкек, Кыргызстан, 2016; Казань, Россия, 2017, Сербия и Республика Сербская, 2018).

1.8. Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 16 статей (в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus), 3 патента и 85 тезисов докладов конференций.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные взаимосвязи и белковая инженерия формиатдегидрогеназ»

1.9. Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 309 страницах и содержит 91 рисунок, 46 таблиц и 381 ссылку.

II. Обзор литературы

2.1. Общая характеристика формиатдегидрогеназ

Формиатдегидрогеназа найдена в различных живых организмах: бактериях,

дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. Все природные ФДГ можно условно разделить на две большие группы . К первой группе можно отнести ферменты из археобактерий и анаэробных микроорганизмов. Такие ФДГ представляют собой сложные гетероолигомерные структуры, часто содержат в своем составе железо-серные кластеры, ионы металлов, такие как селен, молибден, вольфрам [1,27-30]. Кроме того, эти ферменты часто являются мембранными белками, имеют большую молекулярную массу, сложную четвертичную структуру [31] и отличаются высокой чувствительностью к кислороду [32]. Также отличительной чертой таких ферментов может считаться возможность катализа обратной реакции, что позволяет говорить о возможности фиксации углекислого газа с помощью формиатдегидрогеназ [33-36].

Вторая группа образована ферментами, которые состоят из двух одинаковых субъединиц, не содержащих в своем активном центре которых ни ионов металлов, ни простетических групп [37,38]. Такие ферменты были найдены в бактериях [8-10], растениях [20,39], дрожжах [40] и микроскопических грибах [41]. Объектами исследования в настоящей работе являются формиатдегидрогназы из различных источников, относящиеся ко второй группе. Это NAD(P)+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2.), которые катализируют реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD(P)+ до NAD(P)H [2].

НСОО- + NAD+ ^ С02| + NADH.

Такие ФДГ можно отнести к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2

оксикислот [3]. Они отличаются сравнительно простым механизмом действия и

тем, что реакция является практически необратимой при нормальных условиях. В

каталитическом механизме нет стадий переноса и скорость-лимитирующей стадией

является перенос гидрид-иона от формиат-иона на С-4 атом никотинамидного

кольца кофермента [42]. Поэтому формиатдегидрогеназу из второй группы можно

рассматривать как модель для изучения механизма переноса гидрид-иона в

активном центре дегидрогеназ, входящих в суперсемейство D-специфичных

17

дегидрогеназ 2 оксикислот [2]. Физиологическая роль, структурные особенности, получение и свойства формиатдегидрогеназ второй группы будут рассмотрены в последующих разделах.

2.2. Ретроспектива исследований ФДГ

Впервые формиатдегидрогеназная активность была обнаружена в растении

фасоль (Phaseolus vulgaris) еще в 1921 г. [43] Инструменты, которыми обладала наука в то время, не позволяли проводить подробных исследований биологических молекул. Поэтому роль этого фермента в жизнедеятельности растительной клетки стали изучать значительно позже. Так, в 1951 г. в работе [5] было впервые выдвинуто предположение о том, что функция ФДГ в растениях заключается в синтезе молекул NADH, необходимых для дальнейшего метаблизма, а также рассмотрено несколько вариантов возникновения формиата в клетке. До развития методов генетической инженерии ферменты выделяли непосредственно из живых организмов. Формиатдегидрогеназу выделяли из бактерий [44], дрожжей [7], растений [45-47] и проводили изучение свойств фермента.

В конце XX века стало возможным проводить клонирование генов и изучение физиологической роли ферментов, а также их структуры перешло на новый уровень. Первое клонирование ФДГ было сделано для металлсодержащего фермента [48]. В начале 90-х годов было осуществлено клонирование гена, кодирующего NAD+-зависимую ФДГ из бактерий Pseudomonas sp 101 [8].

В 1992 г. в митохондриях картофеля был обнаружен полипептид размером

40 кДа, количество которого составляло приблизительно 10% от всех

митохондриальных белков [49]. Вскоре этими же исследователями было

опубликовано клонирование гена, кодирующего данный полипептид. Анализ

последовательности показал более чем 55% гомологию с ФДГ из бактерий

Pseudomonas уже известную в то время. Клонированный полипептид отличался от

ФДГ, выделенной непосредственно из растений, 23 аминокислотными остатками -

сигнальной последовательностью, необходимой для транспорта фермента из

цитоплазмы в митохондрии. Полипептиды примерной такой же молекулярной

массы были найдены в других растениях [39], т.е. было установлено, что многие

растительные ФДГ содержат на своем N-конце сигнальную последовательность.

Эти же исследователи впервые показали, что ФДГ синтезируется в клетке в ответ

18

на стресс: в частях растений, растущих без достаточного доступа света, количество ФДГ было значительно выше [49]. Впоследствии было проведено большое количество подобных исследований. Было клонировано более 20 генов, кодирующих NAD-зависимую формиатдегидрогеназу.

Ранние исследования структуры ФДГ проводили используя иммуноферментный анализ с применением пептидов. Такие эксперименты показали наличие пептидов, которые связываются с ферментом. Этим методом можно проводить картирование эпитопов и подбирать пептидные ингибиторы ферментов. [50]. Всего через несколько лет была получена структура PseFDH с разрешением менее 2 анкстрем и структурные исследования вышли на более высокий уровень [51].

В 90-х годах ФДГ начали активно применять на практике в процессах регенерации кофактора [52-54]. В основном, для этого использовали ФДГ из дрожжей Candida boidinii. Именно с помощью этого фермента был проведен самый крупномасштабный синтез L-tert-Leu, с использованием очищенных ферментов. [53] Поэтому много сил было положено на создание CboFDH с повышенной стабильностью и активностью. В настоящее время показано, что ФДГ является важным ферментом для функционирования многих организмов, в том числе патогенных [19,55,56]. ФДГ широко используется для регенерации кофактора, как в качестве отдельного фермента [24,25], так и в составе ферментов живой клетки [57,58]. ФДГ активно изучается: проводится поиск и клонирование новых генов [16,18,20], мутагенез с целью получения ферментов с необходимыми характеристиками [4], а также получение биокатализаторов на основе формиатдегидрогеназы [57,59].

2.3. Физиологическая роль формиатдегидрогеназ

2.3.1. Бактерии

Формиатдегидрогеназа найдена практически во всех описанных в настоящее

время микроорганизмах. Реакция, катализируемая ФДГ, является последней

стадией в метаболизме формальдегида, получаемого из метанола в метанол-

утилизирующих организмах [60,61]. При этом в бактериях, растущих на метаноле,

в основном присутствует гетероолигомерная ФДГ, содержащая ионы молибдена и

других металлов [1]. Среди бактерий, в которых была найдена NAD -зависимая

19

ФДГ (КФ 1.2.1.2) следует выделить Pseudomonas sp 101 [8], Moraxella [62], Mycobacterium vaccae [2], Bacillus [13] и др.. В этих организмах роль ФДГ заключается в утилизации образующегося формиата и обеспечении клетки энергией за счет образования молекул NADH, которые впоследствии участвуют в синтезе молекул АТФ [2]. В некоторых бактериях можно найти как гетероолигомерную формиатдегидрогеназу, содержащую в своем составе ионы металлов, так и NAD -зависимую ФДГ, состоящую из двух одинаковых субъединиц, которой посвящена настоящая работа [1,63].

Примером таких микроорганизмов может служить Paracoccus denitrificans: в этом организме содержится NAD+^ависимая ФДГ без ионов металлов [UniProtKB -A1B174] и гетероолигомерная ФДГ, содержащая ионы металлов [UniProtKB -A1B5Z6; A0A2W5BVH2 и др.]. Физиологическая роль этих двух ферментов, состоит в снабжении клетки энергией, а также дыхании (в случае ФДГ, содержащей ионы металлов). В этом случае, по всей видимости, один из ферментов экспрессируется в цитоплазму, а другой является мембранным белком. Аналогичная картина наблюдается и для ФДГ из Ralstonia eutropha [1].

NAD-зависимая ФДГ была найдена в ряде патогенных бактерий, таких как Staphylococcus aureus (WP_001557559.1), Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (AE017240.1 AAS06230.1), Bordetella bronchiseptica (BX640441.1), Legionella pneumophila (AE017354; AAU26390.1), Francisella tularensis (WP_003041408.1). Для бактерий S.aureus было показано, что ФДГ является ключевым ферментом их жизнедеятельности в условиях роста биопленок - уровень экспрессии данного фермента был в 20 раз выше, чем при росте клеток в виде планктона. [19]. Кроме того, получены культуры S.aureus, где выполнен нокаут генов двух ферментов: пируватформиатлиазы и ФДГ. Подтверждено, что эти два фермента играют ключевую роль в существовании биопленок этого патогена. [64]. При этом роль ФДГ заключается в утилизации формиата в микроаэробных условиях биопленок, а также продукции NADH. Биопленки S. aureus представляют огромную опасность для жизни людей, так как являются причиной серьезных инфекционных заболеваний [65,66]. Так как, с высокой долей вероятности можно сказать, что ФДГ является ключевым ферментом для жизнедеятельности этих патогенных организмов, то нахождение специфических высокоэффективных и

нетоксичных для человека ингибиторов этого фермента могло бы помочь в создании эффективных препаратов против S.aureus. Для поиска таких ингибиторов необходимо иметь детальную информацию о структуре и свойствах ФДГ этого патогена.

2.3.2. Дрожжи и грибы

В большинстве метилотрофных дрожжей была обнаружена формиатдегидрогеназная активность. Для дрожжей Hansenula.polymorpha было показано, что ФДГ катализирует последнюю стадию метаболизма метанола, а также производит NADH, который восполняет энергетические затраты клетки [67]. Метанол в данном случае образуется за счет метаболизма пектина - компонента растений, на которых произрастают дрожжи [68]. Выращивание дрожжей H.polymorpha в среде, содержащей дополнительный метанол приводит к изменению уровня экспрессии около 30% генов. При этом только у 0,2 % от всех генов уровень экспрессии увеличивается более чем в 100 раз. Увеличение уровня экспрессии гена, кодирующего ФДГ, составило более 300 раз в этих условиях, что может свидетельствовать о чрезвычайной важности реакции, катализируемой ФДГ для жизнедеятельности H.polymorpha [69]. В целом, можно сказать, что в метилотрофах формиатдегидрогеназа катализирует конечную стадию катаболизма С1-соединений. Все известные метилотрофные дрожжи окисляют метанол до СО2 через формальдегид, где на последней стадии используется ФДГ [70]. Регуляция активности ФДГ осуществляется за счет количества ATP: при недостатке энергии ФДГ активируется и начинает окислять формиат до углекислого газа, обеспечивая клетку дополнительной энергией за счет образующихся молекул NADH [71].

Анализ генома пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae показал наличие двух генов ФДГ, последовательность которых довольно сильно отличается от других ферментов [72]. Физиологическая роль ФДГ в этом организме заключается в утилизации образующегося формиата. Так, было показано, что добавление формиата в питательную среду, на которой росли эти дрожжи, индуцирует экспрессию генов ФДГ [73]. Также для этого организма было показано, что в обычных аэробных условиях формиат не накапливается, в то время как нокаут генов, кодирующих ФДГ приводит к значительному накоплению формиата в дрожжевых клетках [74]. Встраивание генов, кодирующих ФДГ и ФМДГ из

дрожжей H.polymorpha в штамм S. cerevisae приводило к ускорению роста культуры при добавлении формальдегида в питательную среду, что говорит о важности этих ферментов в метаболизме формальдегида. [75]. Этими же авторами утверждается, что при использовании формальдегида происходит образование молекул NADH, которые идут на синтез ATP, восполняя энергетические потребности клетки [75].

В некоторых грибах, как и в растениях формиатдегидрогеназа существует в виде нескольких изоформ. Так, для гриба Ceriporiopsis subvermispora было найдено две изоформы ФДГ (CsFDH1 и CsFDH2), которые различаются несколькими аминокислотами. Было показано, что добавление формиата 0-20 мМ приводило к увеличению количества транскриптов CsFDH1 в 19 раз. Количество транскриптов CsFDH2 увеличивалось в 9 раз при увеличении концентрации формиата до 2 мМ, но далее увеличения количества транскриптов не происходило. При этом, в целом происходил рост активности ФДГ примерно в 3 раза при увеличении концентрации формиата до 10 мМ. Также авторы отмечают возможность вовлечения формиатдегидрогеназы в метаболизм оксалоацетата как и у растений [41].

ФДГ является одним из важнейших ферментов патогенных грибов. Для Candida albicans, вызывающих грибковые инфекционные заболевания было показано, что одним из ключевых генов, экспрессируемых при фагоцитозе является ген, кодирующий формиатдегидрогеназу. [76]. Для патогенного гриба человека Aspergillus fumigatus, вызывающего легочные заболевания было показано, что количество мРНК ФДГ возрастает примерно в 4 раза при контакте с нейтрофилами [77]. Причем по сравнению с другими ферментами, уровень экспрессии именно ФДГ возрос в большее число раз. В 2011 г. эти данные были подтверждены посредством анализа транскриптома данного патогенного ораганизма при его контакте с клетками эпителия бронхов человека [78]. Также в литературе есть информация, что ген ФДГ в этих патогенах экспрессируется в большом количестве при росте этого гриба в форме биопленок [56].

Для патогена растений Moniliophthora perniciosa, который вызывает заболевание деревьев какао было показано, что при инфицировании растения происходит метаболизм пектина до метанола ферментом пектинметилестеразой, затем происходит образование формальдегида с помощью фермента метанолоксидазы. Далее формальдегид метаболизируется двумя путями: в

результате первого происходит образование компонентов, необходимых для роста патогенных клеток, а во втором пути формальдегид метаболизируется до углекислого газа через 2 реакции: формальдегиддегидрогеназы до формиата и ФДГ далее до углекислого газа. Попутно образуется NADH, который идет на удовлетворение нужд клетки, восполняя ее энергетический баланс [79]. Дальнейшие исследования протеома этого патогенного организма показало, что ФДГ действительно является одним из ключевых ферментов для его метаболизма. [80]

Из исследований последних лет стоит отметить работу [81] 2018 г., согласно которой воздействие пестицида на патогенный гриб Phoma sp, заражающий чайные кусты, вызывало экспрессию ряда генов у этого гриба, в том числе формиатдегидрогеназы.

В общем, можно сказать, что NAD-зависимая ФДГ присутствует во многих штаммах дрожжей и грибов и ее роль заключается в утилизации формиата, а также обеспечении клетки энергией аналогично тому как это происходит у бактерий.

2.3.3. Растения

Изучение физиологической роли и локализации ФДГ в растениях было начато еще в 50-х годах прошлого века. ФДГ была найдена в семенах, листьях, корнях и плодах различных растений [82,83]. Было показано, что величина формиатдегидрогеназной активности выше в растениях и частях растений с более высоким потреблением кислорода [84,85]. В 1978 году впервые было показано, что в условиях стресса в растительной клетке синтезируется формиат, что может косвенно свидетельствовать о важности формиатдегидрогеназной реакции при стрессовых воздействиях на растения [86]. Авторами [84] было впервые высказано предположение о том, что образующийся в ходе реакции, NADH используется далее в синтезе ATP, тем самым восполняя энергетические потребности клетки. Изучение распределения ФДГ по органеллам растительной клетки показало, что преимущественно ФДГ находится в митохондриях растений [6]. Впоследствии было высказано предположение о нахождении ФДГ также и в хлоропластах [87]. Исследования последних лет показали, что ФДГ в растениях находится преимущественно в митохондриях. Так, исследователи [88] проводили анализ протеомного состава плодов перца и показали наличие ФДГ среди ферментов

митохондрий в карбронилированном состоянии как в созревших, так и в несозревших плодах.

Опубликовано большое количество работ, где утверждается, что ФДГ синтезируется в растительной клетке в ответ на стрессовые воздействия различного характера. Так, мРНК ФДГ синтезируется в ответ на механическое повреждение стеблей растений [85,89]. Количество фермента увеличивается в ответ на значительные изменения температуры [85], при воздействии различными химическими агентами, при засухе [85,90,91], пониженной температуре [85,92], в условиях ограничения доступа света [85], кислорода [93,94] а также микроэлементов [95,96]. Увеличение количеств ФДГ наблюдается при выращивании растений в почве, загрязненной алюминием [97,98] и медью [99], при повышении кислотности почвы [98], а также при добавлении нитратов и иона аммония [100]. Интересно, что в случае добавления хрома в почву, наоборот, происходит уменьшение количества ФДГ, как было показано для злакового растения Miscanthus sinensis. [101] Увеличение синтеза ФДГ наблюдается при биотическом стрессе - заражении растений патогенными организмами. Так, значительный рост количества ФДГ в растениях детектировали при заражении льна - патогенным грибом Fusarium culmorum и Fusarium oxysporum [102], пшеницы -грибом Blumeria graminis f. sp. Tritici [103], дуба (Quercus robur) патогенным грибом Piloderma croceum [104], Arabidopsis thaliana - патогенным грибом Sclerotinia sclerotiorum [105], перца патогенными бактериями Xanthomonas campestris [106], фасоли грибом Colletotrichum lindemuthianum [21]. Также было показано, что вирус мозаики огурца вызывает экспрессию гена ФДГ в перце [107]. Авторами [105] установлено, что ген ФДГ экспрессируется наравне с несколькими другими генами, кодирующими ферменты, которые катализируют катаболизм оксалата. Известно, что некоторые патогенные грибы, например, Sclerotinia sclerotiorum, продуцируют оксалат в качестве токсичного вещества. Это может частично объяснить увеличение биосинтеза ФДГ, так как согласно предложенной авторами схеме, оксалат метаболизируется в формиат через оксалил-СоА и формил CoA и уже на последней стадии происходит реакция, катализируемая ФДГ. Также ФДГ синтезируется в растениях при атаке насекомыми вредителями. Так, ФДГ

экспрессируется в табаке Nicotiana attenuate после атаки гусениц Manduca sexta [108].

Исследование метаболизма модельного растения A. thaliana показало, что при нокауте гена, кодирующего одну из ключевых киназ, участвующих в метаболизме при солевом стрессе, происходит изменение протеомного состава. В этих условиях происходит значительное увеличение синтеза ФДГ [109].

Кроме того, было показано, что ФДГ в растениях синтезируется в виде различных изоформ в зависимости от вида стресса, состояния растения и может определять видовую принадлежность. Так, в работе [21] было показано, что в фасоли Phaseolus vulgaris существует кластер из трех генов, кодирующих ФДГ, которые экспрессируются в ответ на различные виды воздействий. Для пальм Pericopsis mooniana было установлено, что при здоровом и больном состоянии растения можно детектировать синтез изоформ ФДГ, отличающихся между собой. Для них был разработан метод определения больных растений, основанный на различиях в формах формиатдегидрогеназы. [23]. Для миндаля Prunus dulcis [110] и Prunus amygdalus [111] была предложена методика определения видовой принадлежности растения по анализу изоферментного состяния ФДГ.

Возможные схемы метаболизма, в которых принимает участие формиатдегидрогеназа предложены в работах [21,22,105,112,113]. Формиат в растительной клетке может быть источником С1-соединений [114-117]. Формиат может синтезироваться в растительной клетке в результате фотодыхания, неферментативного декарбоксилирования глиоксилата с помощью пероксида водорода, метаболических путей с участием ферментов, а также в результате восстановления углекислого газа [112]. Можно выделить три метаболических пути, в ходе которых происходит образование формиата: гидролиз 10-формилтетрагидрофолата, окисление формальдегида ФМДГ через промежуточное соединение - S-формилглутатион (источником формальдегида является метанол, получающийся в результате деметилирования пектина в клеточных стенках листьев растений), а также окисление саркозина и других N-метиламинокислот [113]. В нефотосинтезирующих частях растений формиат образуется в результате гликолитических путей. Также отмечается, что формиат в растительной клетке образуется в результате метаболизма серина, глицина, оксалата и других

соединений. ФДГ в данном контексте выполняет функцию утилизации формиата, токсичного для клетки, а также восполняет количество потребляемого NADH. В 2003 году на примере картофеля было показано, что ФДГ является одним из ключевых ферментов, которые опосредованно принимают участие в цикле трикарбоновых кислот в митохондриях [118].

В работе [119] показано, что регуляция активности ФДГ в растениях происходит за счет фосфорилирования, при этом в ФДГ фосфорилированы конкретные аминокислотные остатки, а также, что ФДГ вместе с пируватформиатлиазой может участовать в цикле трикарбоновых кислот за счет получения в результате двух реакций ацетилкофермента А. В то время как непосредственное получение ацетилкофермента А без образования формиата происходит по реакции, катализируемой пируватдегидрогеназой. Авторами найдена пируватформиатлиаза в ряде растений и предложено 2 альтернативных пути получения ацетилкофермента А. Добавление субстратов ФДГ - NAD+ и формиат иона, а также пирувата ингибировало фосфорилирование ФДГ. Исследования последних лет показали, что регуляция количества ФДГ в растительной клетке осуществляется за счет системой убиквитинилирования [120].

Добавление формиата, формальдегида, 20% метанола (опрыскивание растений картофеля) приводило к увеличению количеств ФДГ в растениях. [22]. В этой же работе показано, что растения, в которых была остановлена экспрессия гена: кодирующего ФДГ накапливают пролин при недостатке влаги [22].

В работе [121] были получены трансгенные растения Л. thaliana, дополнительно экспрессирующие формиатдегидрогеназу. Было показано, что такие растения гораздо лучше выживают в условиях увеличения концентрации формиата - молекулы, которая синтезируется в результате стресса. При этом, формиат не подавлял физиологические процессы в растениях полностью, но сильно замедлял их (развитие корней и семян).

Исследования физиологической роли ФДГ в растениях, проводимые в последнее время дают более детальную информацию о биохимических процессах, в которые вовлечен данный фермент. Так, авторами [122] была проведена суперэкспрессия гена, кодирующего AthFDH в табаке. Ранее [87] было показано, что этот фермент экспрессируется в табаке как в хлоропластах, так и в

митохондриях. В данной работе экспрессия была показана только для хлоропластов, но не для митохондрий. Это может быть обусловлено наличием rbcS последовательности на N-конце фермента. Участок, ее кодирующий, был сшит в единую конструкцию с геном, кодирующим ФДГ. В работе [87] наблюдалось увеличение активности ФДГ в листьях в 8-58 раз. В работе [122] отмечалось 2-х кратное увеличение. Возможно, это связано с использованием rbcS промотора, в отличии от 35S промотора. Авторами [122] показано, что суперэкспрессия AthFDH в табаке приводит к увеличению синтеза таких соединений как оксалат, Asn, Gln при добавлении формальдегида. Также в митохондриях табака наблюдался синтез собственной ФДГ (NtFDH). При этом при добавлении формальдегида происходит следующее. Вначале формальдегид окисляется до формиата с помощью формальдегиддегидрогеназы, а затем часть формиата оксиляется NtFDH в митохондриях, а часть формиата окисляется рекомбинантной AthFDH в хлоропластах. CO2 диффундирует в цитоплазму и затем захватывается фосфоенолпируваткарбоксилазой и образуется оксалоацетат, из которого далее получается оксалат. Альтернативный путь заключается в том, что Оксалоацетат может включиться в цикл трикарбоновых кислот и использоваться для синтеза Asn и Gln. Это было показано с помощью меченного углерода. Добавление формальдегида увеличивало количество пролина в листьях табака гораздо больше в трансгенном растении, чем в том, где не было дополнительной экспрессии ФДГ. Также наблюдалось увеличение количества Gln. Авторы предполагают, что Gln, получаемый в результате метаболизма формальдегида, превращется в Glu, а далее в Pro, который впоследствии накапливается в листьях. [122]

В целом, можно сказать, что суперэкспрессия гена ФДГ в растениях табака увеличивает степень устойчивости к формальдегиду. При этом предыдущие исследования [121] показали, что трансгенные растения A. thaliana с суперэкспрессией AthFDH в митохондриях и хлоропластах были толерантны к добавлению формиата, но не формальдегида. При этом, в 2010-2013 гг было показано, что в A.thaliana есть ферментный комплекс, который отвечает за переработку формальдегида [123], и семена могут выдерживать до 4 мМ концентрации этого соединения [124]. В работе [121] были рассмотрены

концентрации формальдегида гораздо ниже: 0,2-0,4 мМ, поэтому, возможно, авторы и не увидели разницу в устойчивости.

Обобщая вышесказанное, следует отметить, что данные, представленные в настоящем разделе, свидетельствуют о ключевой роли ФДГ при стрессовых воздействиях. Это выполняется для различных организмов. Так для бактерий набюдается увеличение количеств ФДГ в условиях биопленок, для дрожжей и грибов - при контакте с организмом хозяином, а также при воздействии пестицидами, для растений - при различных видах стресса.

В общем, физиологическая роль NAD-зависимой формиатдегидрогеназы в различных организмах заключается в утилизации образующегося в ходе метаболических путей формиата, а также в образовании молекул NAD(P)H, участвующих в восстановлении энергетического баланса клетки. Изучение взаимосвязи между структурой и функцией формиатдегидрогеназ из различных источников, которые рассмотрены в настоящей работе, может помочь более детально понять роль ФДГ в метаболизме различных живых систем.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Пометун Анастасия Александровна, 2019 год

источников

В рамках настоящей работы были получены формиатдегдрогеназы дикого типа из четырех новых источников - патогенных бактерий S. aureus,

термотолерантных дрожжей O. parapolymorpha, растений G. max и P. patens. Для того чтобы оценить, как именно связаны структура и свойства полученных ферментов, необходимо проводить множественные выравнивания последовательностей аминокислот, а также иметь данные о пространственном расположении аминокислотных остатков в молекуле фермента. Данный раздел посвящен кристаллизации полученных рекомбинантных формиатдегидрогеназ. Все четыре фермента были наработаны в активной и растворимой форме в достаточном количестве для проведения экспериментов по кристаллизации. Для получения кристаллов использовался метод висячей капли (см. Материалы и методы исследования). В таблице 4.10 представлены данные по кристаллизации ФДГ дикого типа, полученные в рамках данной работы.

Таблица 4.10.

Кристаллизация формиатдегидрогеназ из различных источников

Тип кристаллизации Условия кристаллизации Время роста кристаллов Форма и размеры кристаллов

Тройной комплекс [SoyFDH-NAD+-Nз-] 0,1 М Bis-Tris, pH 5,6, 6,5, AS, 2,3M, 22оС, 10 мМ NaN3, 10 мМ NAD+ Микрокристаллы - 24 часа, большие одиночные кристаллы - 2 недели Кристаллы палочкообразной формы, (0,3x0,1x0,1) мм

Тройной комплекс [PpaFDH MAF-NAD+-N3-] 0,1M Трис, pH 8,0, 2.1M сульфат аммония, 22оС, 10 мМ NaN3, 10 мМ NAD+ 4 дня Кристаллы ромбовидной формы, (0,2x0,1x0,05) мм

Свободная апо-wt-OpaFDH 0.1M HEPES pH 7,0, 2% PEG 400, 0.1M NaCl, 1,9M AS, 15оС 7 дней Кристаллы в виде пластин, (0,05x0,05x0,02) мм

Холо форма [OpaFDH NAD+] 0.1M HEPES pH7.5, 1.4M цитрата натрия, 10% трегалозы, 7мМ NAD+, 7 дней Кристаллы в виде пластин, (0,05x0,05x0,02) мм

Апо-SauFDH 200 мМ ацетат кальция, pH 7,0 + 25% ПЭГ 3350 7 дней Кристаллы ромбовидной формы (0,2x0,2x0,3) мм

Холо-SauFDH 200 мМ ацетат кальция, pH 7,0 + 25% ПЭГ 3350 7 дней Кристаллы ромбовидной формы (0,2x0,2x0,3) мм

В случае ФДГ из сои опыты по кристаллизации проводили, меняя значения таких параметров как pH противораствора (5,6, 6,5, 7,0, 8,0), температура (5, 12, 20 и 22оС) и время кристаллизации (24 часа, 3 дня, 2 недели), а также концентрацию осаждающего агента (1,9-2,3 М). Работы по кристаллизации свободного SoyFDH, а также двойного [SoyFDH-NAD+] и тройного [SoyFDH-NAD-Ns-] комплексов проводились в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН совместно с к.х.н. И.Г. Шабалиным. При температуре 5оС рост одиночных кристаллов практически не происходил, а в конце периода наблюдения (2 недели) происходило выпадение осадка. При 12оС через 3 дня произошло образование микрокристаллов, но затем образовались сростки. При 20оС примерно через 3 дня произошло образование кристаллов палочкообразной формы, а после также произошло образование

т~ч __и и _

сростков. В итоге в случае двойного и тройного комплекса удалось получить одиночные кристаллы, используя условия, указанные в таблице 4.10, в то время как для свободного фермента происходило выпадение осадка. Вероятно, такой результат можно объяснить невысокой стабильностью ФДГ сои, а также значительной стабилизацией при переходе от свободного фермента в комплекс. Так, разница в Тм для апо и холо форм SoyFDH, согласно данным ДСК, составила 16,2оС, в то время как для AthFDH (для этого фермента получены кристаллы и решены структуры как апо, так и холо форм - коды pdb 3JTM и 3N7U соответственно) наблюдается значительно более высокая стабильность, и разница ATM при переходе от свободного фермента к комплексу составляет всего 7,1оС [152]. Следует отметить, что свободные формы формиатдегидрогеназ из растений и дрожжей кристаллизуются очень плохо. Например, несмотря на то, что согласно данным по кинетике инактивации апо-AthFDH стабильнее апо-SoyFDH в 120-20 раз в диапазоне температур 40-60оС более, чем в 50 раз, а при комнатной температуре рассчитанный эффект стабилизации составляет более 1000 раз (см. таблица 4.7), кристаллы высокого качества для апо-AthFDH удалось получить только в космосе [37].

Работы по кристаллизации OpaFDH, PpaFDH и SauFDH проводили в НИЦ

«Курчатовский институт» совместно с к.б.н. К.М. Бойко и м.н.с. А.Ю. Николаевой.

178

В случае PpaFDH, как и в случае ФДГ сои, были получены кристаллы только для холо-формы белка (тройной комплекс [PpaFDH_MAF-NAD+-N3"]. По всей видимости, это также связано с низкой стабильностью ФДГ мха в свободной форме (см. таблица 4.6). Что касается OpaFDH и SauFDH, для этих ферментов были получены кристаллы как свободного фермента, так и в комплексе с NAD+.

/ V

В Г

Рисунок 4.27. Фотографии кристаллов: А - тройной комплекс [SoyFDH-NAD+-N3"] и Б -апо форма SauFDH, В - OpaFDH Г - холо форма PpaFDH

Для успешной кристаллизации OpaFDH проводили дополнительные

эксперименты по подбору различных добавок, улучшающих растворимость белка,

поскольку в стандартных буферных растворах (0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH

7.0; 0,1 М Трис^О pH 8,0) происходило выпадение осадка фермента. Было

показано, что фермент с активностью 25 единиц/мл (примерно 4,2 мг/мл) не

179

выпадал в осадок в буфере HEPES с концентрацией 0,1 М. Было установлено, что добавление NaCl в концентрации 0,15 М не влияет на активность фермента, но положительно сказывается на растворимости (в течение нескольких дней не происходило снижения значения активности и не образовывался осадок при хранении при +4оС). Для OpaFDH аналогичным образом были получены кристаллы холо-формы.

Для кристаллизации ФДГ из мха использовали форму PpaFDH_MAF с измененной N-концевой последовательностью. Основной причиной использования именно этой формы стали результаты экспрессии, согласно которым Ppa_MAF экспрессируется примерно в 5 раз лучше, чем фермент дикого типа. Подробное описание структуры N-концевой последовательности, выбора делеций и свойства ферментов приведены ранее в разделе 4.1. Для подбора условий кристаллизации использовались наборы Scrin Cryo. Успешная кристаллизация для холо-формы PpaFDH_MAF была проведена в следующих условиях: 0,1М Трис, pH 8,0, 2.1М сульфат аммония, 10 мМ NaN3, 10 мМ NAD+. Апо-форму PpaFDH_MAF, к сожалению, так и не удалось закристаллизовать. По всей видимости, это связано с низкой стабильностью этого фермента в свободном состоянии. Подобная ситуация наблюдалась также для ФДГ из сои. В случае холо-формы PpaFDH_MAF были получены кристаллы ромбовидной формы с размерами 200х100х50 мкм (см. рисунок 4.27).

4.3.2. Определение трехмерных структур формиатдегидрогеназ из

различных источников

Сбор данных для расчета структуры тройного комплекса ФДГ из сои был

выполнении к.ф.-м.н. Поляковым К.М. (Институт молекулярной биологии

им.В.А.Энгельгардта РА) на синхротроне DESY (EMBL Outstation, Гамбург,

Германия). Решение трехмерной структуры проводилось совместно с к.ф.-м.н.

Поляковым К.М. и к.х.н. Шабалиным И.Г. Анализ структуры показал, что общая

укладка полипептидной цепи SoyFDH близка к таковой у фермента из A. thaliana.

На рисунке 4.28 показана структура тройного комплекса [SoyFDH-NAD+-N3-] с

разрешением 1,9 Â. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц, одна из

180

которых выделена синим цветом, а другая - зелёным. Молекулы NAD+ выделены розовым, молекулы азида - желтым цветом. В структуре можно выделить кофермент и субстрат-связывающие домены. Видно, что между двумя субъединицами наблюдается довольно сильное перекрывание. Это говорит об относительно прочном межсубъединичном контакте. Параметры решенной структуры представлены в таблице 4.11.

Рисунок 4.28. Структура тройного комплекса [SoyFDH-NAD+ - разрешение 1,9 А.

Таблица 4.11.

Характеристики структур ФДГ, полученных в данной работе

Название параметра [SoyFDH-NAD+-N3■] apo SauFDH [SauFDH-NAD+] apo-OpaFDH холо [OpaFDH-NAD+] холо [PpaFDH_MAF-NAD+-Nз"]

Пространственная группа С2 Р4з212 Р21212 Р21 Р212121 Рэ221

Параметры ячейки, А

а 132,85 116,91 69,73 53,29 71,29 68,36

Ь 85,23 116,91 87,09 118,64 94,92 68,36

с 85,75 186,77 117,57 67,0 118,22 203,44

а, в, у 90, 127.86, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 109.75, 90 90, 90, 90 90, 90, 120

Разрешение, А 1,9 2,2 2,7 2,3 2,4 2,15

Rf, % 16.9 16,3 19,6 26,2 22,5 19,9

Rfree, % нд 20,7 27,6 30,1 29,8 26,0

Для холо-формы SauFDH была определена другая пространственная группа - Р 212121. На рисунках 4.29-4.30 представлены структуры для апо и холо формы SauFDH. Из рисунка 4.30 видно, что в отличие от SoyFDH связывание в комплекс с NAD+ не приводит к образованию полностью «закрытой» конформации фермента. Изначально фермент присутствует в частично закрытой конформации, и отличие комплекса от апо-формы заключается лишь в наличии молекулы кофермента в трехмерной структуре. Это может говорить о рассогласованном действии двух субъединиц фермента и косвенно объяснять столь высокие значения костант Михаэлиса по NAD+, которые наблюдаются для SauFDH.

OpaFDH: Дифракционные наборы были сняты на Spring8 (апо-форма) и ESRF (холо-форма). В результате обработки полученного набора данных были определены структуры для апо- и холо-форм wt-OpaFDH с разрешением 2,3 и 2,0 А и пространственными группами Р21 и Р2Д21 соответственно. На рисунке 4.31 представлено наложение трехмерных структур апо- и холо- конформаций OpaFDH. Для удобства показана одна из молекул NAD+. Из рисунка видно, что в случае OpaFDH связывание NAD+ в комплекс с белком вообще не приводит к «схлопыванию» структуры. Аналогичный эффект частично наблюдался и для SauFDH, для которой холо-форма была открыта частично, и наблюдались существенные различия в пространственном расположении двух субъединиц фермента (см предыдущий раздел).

Рисунок 4.29. Структура апо-формы БаиРБН, разрешение 2,2А.

Рисунок 4.30. Структура холо-формы SauFDH в комплексе с NAD+, разрешение 2,7А. (Наложение на апо-форму)

Рисунок 4.31. Наложение пространственных структур апо (выделена зеленым цветом) и холо (выделена розовым) форм OpaFDH.

Сравнение с уже имеющимися в базе данных pdb структурами ФДГ показало, что максимальное сходство наблюдается между соответствующими структурами апо форм OpaFDH и AthFDH. Интересно, что эти ферменты схожи по своей температурной стабильности (см. раздел 4.5), но при этом наблюдаются существенные различия в связывании кофермента (KM по NAD+ у AthFDH более чем в 3 раза превышает таковое значение для OpaFDH - таблица 4.5).

В случае холо-формы PpaFDH_MAF дифракционный набор был снят на

синхротроне в Гренобле (http://www.esrf.eu/home.html). Была определена

пространственная группа - P3221, и решена структура тройного комплекса с

разрешением 2.15 Ä. На рисунке 4.32 представлена структура холо-формы

PpaFDH_MAF в комплексе с NAD+ и азидом. Сравнительный анализ новой

структуры с уже известными для ФДГ из других источников показал значительное

сходство со структурой ФДГ из бактерий Moraxella (на рисунке 4.32 показано

наложение этих двух структур для одной из субъединиц). Из рисунка видно, что

холо-форма PpaFDH_MAF кристаллизуется в закрытой конформации, что также

согласуется с данными, полученными для PseFDH, MorFDH и SoyFDH. Ранее было

показано, что связывание ФДГ сои в тройной комплекс приводит к значительной

184

стабилизации молекулы [152], что и может частично объяснять возможность получения кристаллов для закрытой конформации растительных ферментов.

Рисунок 4.32 Наложение структуры PpaFDH_MAF на холо-форму ФДГ из Moraxella sp.C2 зеленым показана одна из субъединиц PpaFDH, синим - MorFDH, красным - вторая субъединица PpaFDH.

Обобщая полученные результаты, можно выделить несколько основных моментов:

В результате проделанной работы было проведно клонирование генов формиатдегидрогеназ из четырех новых источников, ферменты получены в активной и растворимой форме.

Изучено влияние структуры N-концевой последовательности на экспрессию генов ФДГ из различных источников. Показано, что отщепление сигнального пептида положительно влияет на экспрессию генов растительных ФДГ. Изучены кинетические параметры и температурная стабильность ФДГ. Показано, что лучшими кинетическими параметрами обладают ФДГ эукариот, в то время как ФДГ бактерий обладает более высокой стабильностью при высоких температурах. Получены кристаллы четырех новых ферментов, для двух из них - апо и хло форм, а также решены шесть новых структур формиатдегидрогеназ. Установлены

взаимосвязи между структурой и свойствами новых ферментов и проведено сравнение с ранее изученными ФДГ.

Связь между структурой и свойствами ФДГ растений. Степень гомологии между последовательностями ФДГ растений довольно большая - больше 70%. Ферменты имеют схожую температурную стабильность, а также способность к кристаллизации - PpaFDH и SoyFDH кристаллизуются только в случае тройного комплекса с NAD+ и азидом. Кристаллов апо-формы получить не удалось, что по всей видимости, связано именно с низкой стабильностью. Уровень экспрессии у SoyFDH и PpaFDH коррелирует с длиной сигнального пептида. При соответствии ^концевого участка зрелой природной последовательности фермента происходит увеличение уровня экспрессии. При этом, удаление нескольких аминокислотных остатков с Оконца - приведение последовательности к виду, аналогичному PseFDH, приводит к снижению уровня экспрессии как SoyFDH так и PpaFDH.

Особенностями OpaFDH можно назвать низкие значения констант Михаэлиса, а также относительно высокая температурная стабильность. При этом кристаллизация фермента происходит только в открытой конформации, а кристаллы холо-формы получены для комплекса с NAD+ мутантной формы с заменами, повышающими химическую и температурную стабильность (см. следующий раздел). Возможно, связывание с коферментом и субстратом у OpaFDH происходит настолько эффективно и быстро, что не требуется дополнительная стабилизация фермента за счет «закрытия» структуры.

Отличительной чертой SauFDH является высокая стабильность как у других бактериальных ФДГ, константа скорости инактивации слабо зависит от температуры по сравнению с другими бактериальными ферментами, но при этом фермент характеризуется очень высокими значениями констант Михаэлиса. Одна из субъединиц даже в случае кристаллизации комплекса с NAD+ находится в открытом состоянии, в то время как у PseFDH апо-форма открытая, холо-форма зактрытая. Возможно, такие особенности кристаллической структуры и обусловливают высокие значения констант Михаэлиса.

4.4. Белковая инженерия ФДГ из различных источников

4.4.1. Использование различных подходов для стабилизации белковой

глобулы на примере формиатдегидрогеназы сои

На примере ФДГ сои методом направленного мутагенеза было изучено влияние различных аминокислотных замен на свойства фермента. Так как ФДГ сои дикого типа обладает довольно низкой температурной стабильностью по сравнению с ФДГ из других источников, было решено прежде всего применить те подходы, которые могут повлиять на температурную стабильность данного фермента. Для сайт-направленного мутагенеза SoyFDH были выбраны такие подходы как введение дополнительных ионных связей в молекуле белка, увеличение жесткости полипептидной цепи за счет замен на остатки пролина, модификация электростатических взаимодействий поверхностных аминокислотных остатков, а также заполнение полостей внутри белковой глобулы. Некоторые из этих подходов ранее были успешно использованы для повышения стабильности ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH) [2,4,155,164].

Выбор аминокислотных замен осуществлялся путем анализа трехмерной структуры апо- и холо- форм SoyFDH, а также выравнивания аминокислотных последовательностей формиатдегидрогеназ из различных растений. Для тройного комплекса [SoyFDH-NAD-N3-] были получены кристаллы и решена структура с разрешением 1,9 Ä, а для апо-формы было проведено компьютерное моделирование на основе известной структуры апо формы AthFDH (код pdb 3JTM, разрешение 1,3 Ä). Среднеквадратичное отклонение RMSD между экспериментальной структурой апо-AthFDH и модельной структуры апо-SoyFDH составило всего 0,2 Ä. Гомология между аминокислотными последовательностями SoyFDH и AthFDH составляет 85%. Поэтому (согласно [379]) полученная модельная структура апо-SoyFDH является достоверной, и ее точность более чем достаточна для изучения механизма катализа и использования подхода рационального дизайна для выбора аминокислотных остатков для улучшения свойств фермента.

Выбор аминокислотных замен

В SoyFDH субъединицы связаны меньшим количеством связей, чем в ФДГ из A. thaliana, поэтому было решено ввести замены незаряженных аминокислотных остатков на заряженные, в результате чего становится возможным образование дополнительных электростатических взаимодействий, или ионных пар, на границе взаимодействия субъединиц. Анализ модельной структуры апо-формы ФДГ сои показал наличие двух таких положений. Это остаток Val127, который согласно результатам моделирования при замене на Arg может образовывать ионную пару с Glu169 из второй субъединицы (Рисунок 4.33). Аналогичным образом был выбран остаток Leu24, который при замене на Asp может образовывать ионную пару с остатком Arg164 из другой субъединицы.

А Б

Рисунок 4.33. Моделирование замены остатка A_Val127 (А) на остаток А_А^127 (Б) с образованием ионной пары с остатком B_Glu169.

Было решено ввести в последовательность SoyFDH несколько дополнительных остатков Pro. Были предложены замены Lys109Pro и Ser254Pro.

Анализ структуры тройного комплекса [SoyFDH-NAD-N3] позволил выявить два заряженных аминокислотных остатка, локализованных на поверхности белка и которые ни с чем не связаны: это Lys 23 и Glu 247. Сравнение со структурой более стабильной AthFDH показало, что наличие в ней в 23 положении остатка Thr приводит к связыванию с белковой глобулой дополнительных молекул воды. Таким образом, было решено провести замену Lys23Thr. Результаты

выравнивания аминокислотных последовательностей также показали, что в положении 247 (Рисунок 4.34) у всех растительных ФДГ находится остаток последовательностей Glu, и только в SoyFDH и в LjaFDH в этом положении находится остаток Asn. Анализ структуры SoyFDH показал, что рядом с остатком Asn247 расположен остаток Lys. На рисунке 4.35 показано моделирование замены Asn247Glu. Видно, что в случае Asn не происходит нейтрализации положительного заряда соседнего остатка Lys. При введении в это положение Glu должна образоваться дополнительная ионная пара. По этой причине было целесообразно произвести замену Asn247Glu.

ZmaFDH DKNPNFVGCVEGALGIRGWLESQGH~

SbiFDH2 DRNPNFVGCAEHALGIRGWLESQGH~

LjaFDHl ALNPNFVGCVEGALGIREWLEAQGH~

SoyFDH3 KLNPNFVGCVEGALGIREWLESQGH~

NTPLTEKTRGMFNKERIAKMKKGVI NMPLTEKTRGMFDKERIARMKKGVI NTPLTDKTRGLFDKNRIAKLKKGVL NTPLTEQTRGLFDKNRIAKCKKGVL

SoyFDH2 KLNPNFVGCVEGALGIREWLESQGH~

LesFDHl EMNPNFLGCAENALGIREWLESKGH~

StuFDHl EMNPNFLGCAENALGIREWLESKGH~

GhiFDHl TKNPNFVGCVEGALGLRPWLESQGH~

ApuFDHl SMNPNFVGCAE GALGIRDWLE SQGH~

ZofFDHl SMNPKFVGCVEGSLGIRDWLESQGH~

BnaFDH2 SKNPNFLGCVENALGIRNWLESQGH~

PpeFDHl ELNPNFLGCEERALGIKDWLESQGH~

CpaFDHl TENPNFVGCVENALGIRNWLESQGH~

AthFDH TKNPNFLGCVENALGIRDWLESQGH~

PpiFDHl SLNPNFLGCVENALGIREWLESNGH~

PsiFDH SLNPNFLGCVENALGIREWLESKGH~

PtmFDHl SLNPNFVGSLEGALGIRDWLESQGH~

23 * ** * ~

NTPLTEQTRGLFDKNRIAKCKKGVL NTPLTEKTKGMFDKERIAKLKKGVL NTPLTEKTKGMFDKERIAKLKKGVL NMPLTEKTRGMFDKDRIAKMKKGVL NMPLTEKTAGMFNKEKIAKLKKGVL NT PLTEKTRGLFNKE RIGKLKKGVL NT PLTEKTRGMFNKEMIGKMKKGVL NTPLTEKTRGLFDKERIAKCKKGVL NT PLTEKTRGMFNKE RIAKMKKGVR NMPLTEKTRGMFNKELIGKLKKGVL NMPLSDKTRGMFNKEKISKMKKGVL NMPLSDKTRGMFNKEKISKMKKGVL NTPLTEKTRGMFDKERIAKMKKGVL ** 247 * *

Рисунок 4.34. Фрагмент выравнивания аминокислотных последовательностей растительных ФДГ в районе 23 остатка Lys и 247 остатка Asn, выделены желтым. Голубым цветом выделена последовательность SoyFDH.

А Б

Рисунок 4.35 Моделирование замены в SoyFDH остатка Asn247 (А) на остаток Glu (Б).

Анализ пространственных структур свободного фермента и тройного комплекса, а также сравнение аминокислотной последовательности SoyFDH с более стабильным ферментом из A. thaliana позволили выявить ряд аминокислотных остатков, замена которых на остатки большего размера могла бы привести к стабилизации белковой глобулы SoyFDH.

В окружении остатка Gly18 находится небольшая полость, размер которой позволяет расположить в ней боковой радикал Ala. Кроме того, как видно из выравнивания последовательностей ФДГ в районе выбранного остатка (Рисунок 4.36), в AthFDH и во многих ФДГ из других растений в этом положении стоит Ala, что является дополнительным доводом в пользу этой замены. В результате анализа структуры SoyFDH также был найден остаток Ala267, рядом с которым также имеется полость. Положение этого остатка представлено на рисунке 4.36. Результаты моделирования показали, что полость может быть заполнена введением в это положение остатка метионина вместо остатка аланина.

В случае остатка Ile272 ситуация была противоположная - он имел невыгодные взаимодействия с соседними остатками из-за большой боковой группы. Исходя из размера боковой группы и сравнения аминокислотных последовательностей, более выгодным в этом положении является остаток валина.

А Б

Рисунок 4.36. Моделирование замены в SoyFDH остатка Ala267 (А) на остаток Met (Б).

На рисунке 4.37 представлен фрагмент выравнивания аминокислотных последовательностей с остатками, выбранными в этом разделе на основе анализа структуры (нумерация дана относительно фермента из сои SoyFDH2, сокращенные названия ферментов даны согласно таблице 2.3. в Обзоре литературы). Видно, что у растительных ферментов на данном участке наблюдается очень высокая гомология. В 18 положении в большинстве растительных ФДГ (кроме SoyFDH, изоформы 1 и 2, а также ФДГ из риса OsaFDH и сорго SbiFDH) находится аланин, в 267 положении во всех ФДГ из растений стоит остаток метионина. Остаток Val272 является полуконсервативным (из растительных ферментов только у SoyFDH в этом положении стоит изолейцин). Анализ сравнения показал, что практически у всех ферментов, кроме SoyFDH, в этом положении находится остаток изолейцина. У более термостабильной AthFDH в этом положении находится именно остаток валина, что может говорить о возможном положительном эффекте влияния этой замены на свойства белка. Более того, у AthFDH в 281 положении находится изолейцин. На основании этого было предложено изучить еще одну замену Val281Ile.

HvuFDH1 SKKIVGVFYQAGEYA

TaeFDH1 SKKIVGVFYQAGEYA

ZmaFDH SKKIVGVFYKAGEYA

OsaFDHl SKKIVGVFYKGGEYA

SbiFDH2 SKKIVGVFYKGGEYA

LjaFDH1 KKKIVGVFYKANEYA

SoyFDH3 KKKIVGVFYKGNEYA

~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGH—IAGYGGD ~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGH—IAGYGGD ~ VVNNARGAIMDAQAVADACSSGH—IAGYGGD ~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGQ—VAGYGGD ~ IVNNARGAIMDTQAVADACATGH—IAGYGGD ~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGH—IAGYSGD ~IVNNARGAIADTQAIADACSSGH—VAGYSGD

SoyFDH2 KKKIVGVFYKGNEYA ~ IVNNARGAIADTQAIADACSSGH—VAGYSGD

LesFDH1 PKKIVGVFYKANEYA

StuFDH1 PKKIVGVFYKANEYA

ZofFDH1 SKKIVGVFYKANEYA

QroFDHl SKKIVGVFYKANENA

RcoFDH1 SKKIVGVFYKANEYA

BnaFDH2 SKKIVGVFYKANEYA

BolFDH1 SKKIVGVFYKANEYA

MdoFDH SKKIVGVFYKANEYA

AthFDH SKKIVGVFYKANEYA

*18

~IVNNARGAIMDTQAVVDACNSGH—IAGYSGD ~IVNNARGAIMDTQAVVDACNSGH—IAGYSGD ~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGH—IAGYSGD ~IVNNARGAIMDIQAVADACSSGH—VAGYSGD ~IVNNARGAIMDTQAVADACSSGH—IGGYSGD ~IVNNARGAIMDRQAVVEAVESGH—IGGYSGD ~IVNNARGAIMDRQAVVEAVESGH—IGGYSGD ~IVNNARGAIMDTQAVVDACSSGH—IAGYSGD ~IVNNARGAIMERQAVVDAVESGH—IGGYSGD ~ ** 267 272 * 281** *

Рисунок 4.37 Фрагмент выравнивания аминокислотных последовательностей с выделенными остатками, используемыми для мутагенеза. Последовательность 8оуП)1 [ выделена голубым цветом.

Ьуэ23 . |_еи24 01у18

ЬуэЮЭ

5ег354 Д1а267

Рисунок 4.38 Пространственная структура тройного комплекса [SoyFDH-NAD -N3"] с выделенными аминокислотными остатками для мутагенеза.

На рисунке 4.38 для удобства и общего представления о месторасположении выбранных аминокислотных остатков для направленного мутагенеза представлена трехмерная структура тройного комплекса [SoyFDH-NAD-N3"]. Синим выделены

аминокислотные остатки, замена которых должна приводить к образованию новых ионных пар, красным - остатки, замена которых приводит к заполнению полостей внутри белковой глобулы, темно-фиолетовым показаны остатки, которые заменены на пролины для увеличения жесткости полипептидной цепи фермента, малиновым цветом выделены остатки, замены которых должны были привезти к оптимизации электростатических взаимодействий на поверхности белка. Всего в рамках данного раздела было выбрано 10 аминокислотных замен. Ожидаемые эффекты от замен представлены в таблице 4.12.

Таблица 4.12.

Аминокислотные замены, введенные в SoyFDH.

Название мутации Тип модификации белка Ожидаемый эффект от мутации.

Gly18Ala Гидрофобизация внутренней поверхности белковой глобулы Компактизация молекулы

Lys23Thr Модификация электростатических взаимодействий на поверхности белка Уменьшение количества неупорядоченных заряженных остатков на поверхности.

Leu24Asp Образование дополнительных ионных пар. Создание дополнительной связи между 24Asp субъединицы А и 164 А^ субъединицы В.

Lys109Pro Увеличение жесткости полипептидной цепи. Повышение жесткости структуры фермента.

Уа1127А^ Образование дополнительных ионных пар. Возникновение дополнительной связи между 127А^ субъединицы А и 169G1u субъединицы В.

Asn247Glu Модификация электростатических взаимодействий на поверхности белка Уменьшение количества неупорядоченных заряженных остатков на поверхности.

А1а267Ме^ М1 Гидрофобизация внутренней поверхности белковой глобулы Компактизация молекулы

А1а267Ме1/ 11е272Уа1, (М1+М2) Гидрофобизация внутренней поверхности белковой глобулы Компактизация молекулы

Уа128111е Гидрофобизация внутренней поверхности белковой глобулы Компактизация молекулы

8ег354Рго Увеличение жесткости полипептидной цепи. Повышение жесткости структуры фермента.

Получение мутантных форм SoyFDH

Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу проводили с помощью ПЦР (см. раздел 3.2.2. Материалов и методов). Для введения мутации в ген soyfdh использовали праймеры на начало (T7for, прямой) и конец амплифицируемого фрагмента (T7rev, обратный):

T7for 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' T7rev 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'

а также прямой (Pr1) и обратный (Pr2) праймеры, содержащие требуемые мутации в гене soyfdh. В таблице 4.14 праймеры для введения аминокислотных замен.

Таблица 4.13.

Олигонуклеотиды для направленного мутагенеза SoyFDH.

Замена Олигонуклеотид

Gly18Ala Pr1 f 5' -GTTCTACAAAGCGAATGAGTATGCTAAATTGAACC-3'

Pr2 r 5' -GCATACTCATTCGCTTTGTAGAACACCCCCACA-3'

Lys23Thr Pr1 f 5' -GAATGAGTATGCTACCTTGAACCCCAATTTCGTGGG-3'

Pr2 r 5' -GTTCAAGGTAGCATACTCATTCCCTTTGTAG-3'

Leu24Asp Pr1 f 5'-TGAGTATGCTAAAGATAACCCCAATTTCGTGGGGT-3'

Pr2 r 5'-ACGAAATTGGGGTTATCTTTAGCATACTCATTCCCTTTGTA-3'

Lys109Pro Pr1 f 5' -GATCTCCCGGCTGCAGCTGCTGCTGG-3'

Pr2 r 5' -CAGCTGCAGCCGGGAGATCAACGTGATCAGAACC-3'

Val127Arg Pr1 f 5'-AAGCAATGTCAGGTCGGTTGCGGAGGATG-3'

Pr2 r 5' -CAACCGACCTGACATTGCTTCCCGTGAC-3'

Asn247Glu Pr1 f 5' -GTTTGACAAAGAAAGAATTGCGAAGTGCAAGAAAG-3'

Pr2 r 5' -CTTCGCAATTCTTTCTTTGTCAAACAATCCCCTTGTC-3'

Ala267Met Pr1 f 5' -GAGGGGCAATTATGGACACCCAAGCAATTGCA-3'

Pr2 r 5' -TTGGGTGTCCATAATTGCCCCTCGAGCATTGTT-3'

Ile272Val Pr1 f 5'-ACCCAAGCAGTTGCAGATGCTTGCTCCAGT-3'

Pr2 r 5' -AAGCATCTGCAACTGCTTGGGTGTCCATAATTGC-3'

Val281Ile Pr1 f 5'-AGTGGCCACATTGCAGGTTATAGTGGTGATGTTT-3'

Pr2 r 5' -CTATAACCTGCAATGTGGCCACTGGAGCAAG-3'

Ser354Pro Pr1 f 5' -TCAACTTGCACCCCAATACCGGTGAAGAATTCG-3'

Pr2 r 5' -GGTATTGGGGTGCAAGTTGACCCTCCTTGA-3'

После введения мутаций в ген фермента их наличие, как и отсутствие других олигонуклеотидных замен, было подтверждено с помощью секвенирования.

Экспрессию мутантных форм SoyFDH, а также фермента дикого типа проводили согласно методике, приведенной в разделе 3.2.10. Материалы и методы исследования. Плазмиды с заменами в гене soyfdh трансформировали в клетки E.coli BL 21(DE3) Codon plus /pLysS и высевали на чашки с агаризованной средой. Из полученных колоний создавали музейные культуры, которые в дальнейшем использовали для наработки фермента. Результаты экспрессии представлены в таблице 4.14. Для сравнения приведены данные по экспрессии фермента дикого типа.

Таблица 4.14.

Результаты экспрессии мутантных SoyFDH и фермента дикого типа wt-SoyFDH.

Фермент Выход фермента по активности, Ед./л среды Выход биомассы, г/л среды Выход фермента по массе*, мг/л среды Содержание фермента в клетках, Ед/г

wt-SoyFDH 1750 18 438 97

SoyFDH G18A 1500 18 375 83

SoyFDH K23T 1040 13 260 80

SoyFDH L24D 1820 17 455 107

SoyFDH K109P 1800 24 450 75

SoyFDH V127R 780 16 195 49

SoyFDH N247E 1675 22 419 76

SoyFDH A267M 1160 19 290 61

SoyFDH I272V 1450 19 363 76

SoyFDH V281I 1300 17 325 76

SoyFDH S354P 1457 25 364 58

* удельную активность принимали равной 4 ед/мг.

Из таблицы видно, что выходы целевого фермента для ряда мутантных SoyFDH сопоставимы с таковым для wt-SoyFDH (выделены жирным). В целом, можно отметить, что в результате были получены достаточно хорошие выходы -200-450 мг активного белка с литра среды.

Для выделения мутантных SoyFDH была использована та же методика, что и для получения фермента дикого типа. Она включала разрушение клеток ультразвуком, фракционирование сульфатом аммония (40% от насыщения, 85% от насыщения и перерастворение в 45% от насыщения), гидрофобную хроматографию на фенил-Сефарозе и гель-фильтрацию (обессоливание на Sephadex G25). Контроль чистоты препаратов фермента осуществляли методом аналитического фореза в денатурирующих условиях. В случаях всех ферментов было показано, что чистота полученных препаратов ферментов составляет не менее 95%.

Изучение температурной стабильности мутантных SoyFDH методом анализа кинетики инактивации

Для того, чтобы оценить вклад каждой замены в температурную стабильность ФДГ сои, для каждой из полученных мутантных форм фермента было проведено изучение зависимости остаточной активности от времени при двух температурах - 52 и 54оС. В таблице 4.15 представлены значения констант скорости термоинактивации при этих двух температурах для мутантных форм ФДГ сои, которые рассматриваются в данном разделе. Значения, наиболее сильно отличающиеся от фермента дикого типа, выделены жирным. Для этих четырех ферментов изучение кинетики процесса инактивации было выполнено более подробно.

Поскольку в результате сайт-направленного мутагенеза были получены 2 формы фермента, обладающие более низкой стабильностью и 2 формы с повышенной термостабильностью по сравнению с ферментом дикого типа, детальные исследования кинетики инактивации проводили, используя различный диапазон температур. В случае менее стабильных форм с заменами Leu24Asp и VaП27Arg использовали диапазон температур 46-54оС, в случае фермента дикого типа и мутантных SoyFDH с заменами Gly18Ala, Lys23Thr, Lys109Pro, Asn247Glu, Val28Шe, Ser354Pro - при 48-56 оС, а для наиболее стабильных SoyFDH с заменами Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val - в диапазоне 52-60 оС.

Значения констант скорости термоинактивации для всех мутантных форм при двух значениях температуры.

название фермента M54°C), -1 мин k;„(54oC)wt/ M52°C), -1 мин k;„(52oC)wt/

SoyFDH wt (5,3±0,2)* 10-2 1 (3,0±0,1)*10-2 1

SoyFDH G18A (6,9±0,2)* 10-2 0,8 (4,1±0,1)*10-2 0,7

SoyFDH K23T (10,4±0,2)* 10-2 0,5 (5,6±0,1)*10-2 0,5

SoyFDH L24D (20,7±0,5)*10-2 0,3 (10,0±0,3)*10-2 0,3

SoyFDH K109P (9,0±0,1)* 10-2 0,6 (4,3±0,1)*10-2 0,7

SoyFDH V127R (12,6±0,8)*10-2 0,4 (7,4±0,3)*10-2 0,4

SoyFDH N247E (7,2±0,2)* 10-2 0,7 (3,6±0,1)*10-2 0,8

SoyFDH A267M (1,78±0,04)*10-2 3,0 (0,63±0,02)*10-2 4,8

SoyFDH, (A267M/I272V) (0,65±0,01)*10-2 8,2 (0,21±0,01)*10-2 14,6

SoyFDH V281I (6,1±0,1)*10-2 0,9 (2,29±0,04)* 10-2 1,3

SoyFDH S354P (7,6±0,2)* 10-2 0,7 (4,3±0,2)*10-2 0,7

жирным выделены значения, показывающие стабилизирующий и дестабилизирующий эффекты соответственно.

Аналогично ферменту дикого типа было показано, что для всех мутантных SoyFDH зависимости остаточной активности от времени представляют собой простые экспоненты, которые хорошо линеаризуются в координатах ln(A/A0)-t. Величину константы скорости инактивации определяли аналогично ФДГ дикого типа из тангенса углов наклона прямых. Как и для фермента дикого типа, было показано, что изменение концентрации белка в широком диапазоне (0,1-2,5 мг/мл) не влияло на величину константы скорости инактивации kin, т.е. инактивация SoyFDH дикого типа и мутантных форм при повышенных температурах является истинно мономолекулярным процессом. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что при введении аминокислотных замен механизм термоинактивации не изменяется.

^ мин

Рисунок 4.39 Зависимость остаточной активности от времени в полулогарифмических координатах для четырех мутантных SoyFDH, 54оС и фермента дикого типа, 0,1 М натрий-фосфатный буфер, 0,01М ЭДТА

На рисунке 4.39 представлены зависимости остаточной активности от времени в полулогарифмических координатах для наиболее интересных мутантных форм SoyFDH и фермента дикого типа при 54 оС. Из рисунка видно, что введение замен Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val приводит к значительной стабилизации, а для SoyFDH с заменами VaП27Arg и Leu24Asp наблюдается обратный эффект. В случае же замен Gly18Ala, Lys23Thr, Lys109Pro, Asn247Glu, Val28Шe и Ser354Pro существенного изменения термостабильности не происходит, поэтому для них экспериментальные данные не приводятся.

Зависимости константы скорости термоинактивации от температуры были изучены для фермента дикого типа, а также мутантных SoyFDH с заменами, которые демонстрируют наиболее сильные эффекты стабилизации (Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val) и дестабилизации (Leu24Asp и VaП27Arg). Полученные зависимости представлены на рисунке 4.40. Из рисунка видно, что во всех случаях температурные зависимости константы скорости термоинактивации в координатах

1п(кй/2) - 1/Т действительно представляют собой прямые т.е. они могут быть описаны с помощью уравнения из теории активированного комплекса как и данные по ферменту дикого типа (см. раздел 4.3.). Из тангенса угла наклона прямых можно рассчитать энтальпию активации ДИФ, а из отсекаемого отрезка на оси ординат -энтропию В таблице 4.16 представлены значения активационных параметров для четырех отобранных мутантных SoyFDH и фермента дикого типа. Видно, что даже с учетом ошибки измерения, введение аминокислотных замен приводит к изменению этих величин. Это означает, что константы скорости термоинактивации для изученных ферментов по-разному зависят от температуры. Более высокое значение энтальпии активации ДЯ для SoyFDH А267М и SoyFDH A267M/I272V означает, что при уменьшении температуры константа скорости термоинактивации будет снижаться гораздо быстрее, чем в случае фермента дикого типа, т.е. при уменьшении температуры эффект стабилизации для этих ферментов будет расти. Для количественной оценки эффекта стабилизации в широком диапазоне температур (25 - 64 оС) мы использовали полученные из экспериментальных данных значения активационных параметров

ЛИФ и В таблице 4.17

представлены значения эффекта стабилизации, который рассчитывается как отношение константы скорости инактивации фермента дикого типа к константе скорости инактивации мутантной формы при соответствующей температуре. Серым фоном и полужирным шрифтом выделены эффекты стабилизации, определенные экспериментально, а рассчитанные эффекты стабилизации представлены обычным шрифтом на белом фоне. Из таблицы 4.16 видно, что с уменьшением температуры для мутантов SoyFDH А267М и SoyFDH A267M/I272V эффект стабилизации растет и при комнатной температуре составляет 9 и 130 раз соответственно.

А wt-SoyFDH

1/т, к-1

Рисунок 4.40. Зависимость констант скорости термоинактивации мутантных форм и дикого типа SoyFDH от температуры в координатах 1п(кги/Т) - 1/Т, К-1, 0,1 М натрий-фосфатный буфер, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0.

Таблица 4.16

Значения активационных параметров процесса термоинактивации для мутантных SoyFDH.

Фермент АН*, кДж/моль А£>ф, Дж/моль/К

SoyFDH wt 370±20 830±60

SoyFDH Leu24Asp 350±30 780±90

SoyFDH Val127Arg 300±20 610±60

SoyFDH Ala267Met 400±20 900±70

SoyFDH Ala267Met/Иe272Val 450±30 1040±80

Значения эффекта стабилизации мутантных ферментов по отношению к SoyFDH дикого типа при различных температурах (0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,0). Экспериментально полученные эффекты стабилизации выделены жирным.

т, 0С SoyFDH L24D SoyFDH V127R SoyFDH дикий SoyFDH SoyFDH

тип А267М A267M/I272V

25 0,1 0,03 1,0 9,0 130

30 0,1 0,1 1,0 7,0 81

46 0,2 0,2 1,0 4,3 18

48 0,2 0,3 1,0 4,0 15

50 0,2 0,3 1,0 3,8 13

52 0,2 0,4 1,0 3,6 11

54 0,3 0,4 1,0 3,4 8,9

56 0,3 0,5 1,0 3,2 7,5

58 0,3 0,6 1,0 3,0 6,4

60 0,3 0,7 1,0 2,8 5,4

62 0,3 0,8 1,0 2,7 4,6

64 0,3 1,0 1,0 2,5 3,9

Изучение термостабильности методом ДСК

Термостабильность мутантных SoyFDH также была изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Кривые плавления приведены на рисунке 4.41. Из рисунка видно, что в случае мутантных SoyFDH с заменами Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val происходит сдвиг положения максимума кривой плавления (Тт) в сторону более высоких температур (стабилизация), а в случае мутантных SoyFDH с заменами Leu24Asp и Val127Arg значения Тт уменьшаются, что отражает эффект дестабилизации.

Количественные параметры тепловых переходов для мутантных SoyFDH и

ФДГ дикого типа из других источников представлены в таблице 4.18. При

введении в SoyFDH замен, снижающих термостабильность фермента, происходит

снижение величин Л^^ и Тт, а при увеличении термостабильности за счет замен

Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val эти параметры возрастают. Величина

полуширины пика на кривой денатурации Т1/2 является показателем

кооперативности процесса теплового перехода. Чем уже этот пик, тем выше

кооперативность процесса. Из таблицы 4.18 видно, что в случае SoyFDH

кооперативность плавления белковой глобулы ниже по сравнению с таковым для

201

ФДГ из других источников, включая и фермент из растений A. thaliana, причем для полученных мутантных SoyFDH нет никакой корреляции между эффектом стабилизации и величиной Т1/2. 200 180 160

^ 140

¡sé

*

¡S 120

О

^ 100 § 80 О" 60 40 20 0

35 40 45 50 55 60 65 70

T, oc

Рисунок 4.41. Кривые плавления мутантных SoyFDH и фермента дикого типа, полученные с помощью ДСК. 0,1 M натрий-фосфатный буфер, рН 7,0. Концентрация ферментов 2 мг/мл.

Таблица 4.18

Параметры тепловых переходов мутантных SoyFDH и ФДГ дикого типа из других источников

Фермент АН кДж/моль T оС А m? ^ rp rp wtSoyFDH Tm- Tm , оС Тт, оС Источник данных

PseFDH дикий тип 2060 67,6 10,6 5,4 *

PseFDH GAV 1980 68,8 11,8 5,4 *

PseFDH GAV 1940 68,9 11,9 5,3 **

MorFDH дикий тип 1830 63,4 6,4 4,9 *

CboFDH дикий тип 1730 64,5 7,4 5,3 *

AthFDH дикий тип 1330 64,9 7,9 5,9 *

SoyFDH дикий тип 1052 57,0 0,0 7,1 **

SoyFDH L24D 840 53,5 -3,5 8,00 **

SoyFDH V127R 758 55,3 -1,7 6,32 **

SoyFDH А267М 1184 59,7 2,7 7,53 **

SoyFDH A267M/I272V 1340 61,6 4,6 6,82 **

* - [152], ** - данные настоящей работы

SoyFDH Ala267Met/Ile272Val SoyFDH Ala267Met wt-SoyFDH

SoyFDH Val127Arg SoyFDH Leu24Asp /

В заключение этого раздела можно сделать вывод, что данные, полученные методом ДСК, полностью согласуются с результатами исследования термостабильности мутантных форм SoyFDH путем анализа кинетики термоинактивации.

Кинетические свойства мутантных ферментов

В таблице 4.19 приведены значения констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату для всех полученных мутантов SoyFDH, а также величины каталитических констант для четырех мутантных форм. В результате введения замен для некоторых мутантов произошло небольшое увеличение константы Михаэлиса по формиату (максимально в 2,2 раз в случае замены Val127Arg), однако во всех случаях наблюдаемые значения KMHCO° меньше таковых для бактериальных и дрожжевых ФДГ. Кроме того, такое ухудшение несущественно с точки зрения практического применения фермента в процессах хирального синтеза с системой регенерации NADH, поскольку используемые в них концентрации формиата (1-3 М) намного больше значений KMHCO°. Более существенным с этой точки зрения параметром является KmnAD , поскольку рабочая концентрация кофермента выбирается именно в этом диапазоне. Из таблицы 4.19 видно, что в случае трех замен: Lys23Thr, Val127Arg и Ala267Met, - произошло улучшение

v NAD+ Км .

Одним из наиболее важных параметров для характеристики фермента

является величина каталитической константы. Из таблицы 4.19 видно, что в случае

замен Leu24Asp и Val127Arg произошло увеличение kcat на 10 и 25%

соответственно. Для мутанта SoyFDH Ala267Met величина kcat увеличилась гораздо

больше - на 72% . В то же время введение в SoyFDH A267M второй замены

Ile272Val приводит к снижению величины kcat. В случае формиатдегидрогеназ

образование тройного комплекса сопровождается большими конформационными

изменениями [2]. Поэтому можно предполагать, что введение повышающей

термостабильность замены Ile272Val могло привести к снижению подвижности

белковой глобулы и, как результат, уменьшению каталитической константы. Для

203

самого термостабильного мутанта SoyFDH A267M/I272V величина Км практически не изменилась.

Следует особо отметить мутантную форму SoyFDH А267М, у которой каталитическая эффективность возросла как с коферментом, так и с субстратом в 2,3 и 1,2 раза соответственно. Этот мутант по каталитической эффективности является абсолютным лидером среди всех ферментов, перечисленных в таблице 4.20, а также среди ФДГ из других источников.

Таблица 4.19.

Кинетические параметры мутантных SoyFDH и фермента дикого типа. (0,1 М натрий - фосфатный буфер, рН 7,0).

фермент ^ нсоо- Км , мМ ^ NAD+ Км , мкМ kcat, с-1 kcaJKм , (мМ*с)-1 kcaJKм , (мкМ*с)-1

wt-SoyFDH 1,5±0,1 13,3±0,8 2,9±0,1 1,93 0,22

SoyFDH G18A 1,4±0,1 12,1±0,6 НД НД НД

SoyFDH К23Т 2,0±0,2 8,4±0,7 НД НД НД

SoyFDH L24D 2,3±0,1 13,7±0,7 3,2±0,2 1,39 0,19

SoyFDH К109Р 1,2±0,1 11,6±1,1 НД НД НД

SoyFDH V127R 3,4±0,2 9,5±0,5 3,6±0,7 1,06 0,38

SoyFDH Ш47Е 1,7±0,4 8,6±1,1 НД НД НД

SoyFDH М1 2,1±0,2 9,9±0,8 5,0±0,9 2,38 0,51

SoyFDH (М1+М2) 2,4±0,2 13,3±0,9 2,2±0,1 0,9 0,2

SoyFDH V281I 1,7±0,1 11,6±0,6 нд нд нд

SoyFDH S354P 2,1±0,2 12,9±0,4 НД НД НД

Таким образом, среди 10 полученных мутантных форм SoyFDH наиболее интересным является фермент с заменой А267М. Он представляет собой эффективный биокатализатор, обладающий более высокой термостабильностью и лучшим сродством к коферменту по сравнению с ферментом дикого типа.

В целом, можно сказать, что только один подход, основанный на заполнении полостей в белковой глобуле, позволил получить положительный эффект как в случае повышения термостабильности, так и каталитической активности. Отсутствие положительных эффектов по стабилизации SoyFDH с помощью других подходов не означает, что эти подходы неприменимы к данному ферменту в будущем. Как правило, для улучшения свойств фермента необходимо вводить аминокислотные замены в "слабых" точках белковой глобулы, которые и

определяют наблюдаемые каталитические свойства и стабильность. В данном случае одной из таких "слабых" точек в молекуле SoyFDH оказался остаток Ala267[247].

4.4.2. Мутагенез канонической последовательности XP(A)QP

формиатдегидрогеназ из различных источников

Зачастую аминокислотные остатки, находящиеся на поверхности белковой

глобулы, играют важную роль в стабильности и свойствах фермента. Особо

важными для катализа могут оказаться остатки, которые помимо поверхностного

расположения находятся в непосредственной близости к активному центру

фермента. Настоящий раздел посвящен экспериментам по направленному

мутагенезу аминокислоты X в последовательности XP(A)QP, которая является

канонической для формиатдегидрогеназ из различных источников, а также на

примере одного из ферментов показана роль первого остатка пролина.

Каноническая последовательность XP(A)QP содержит остаток глутамина, который

является консервативным для большинства известных формиатдегидрогеназ и

играет важную роль в катализе [380]. Считается, что аминокислотные остатки

пролина, стоящие до и после остатка глутамина, обеспечивают его правильную

конформацию внутри активного центра фермента и являются чрезвычайно

важными для функционирования фермента. Анализ пространственной структуры

тройного комплекса ФДГ сои [SoyFDH-NAD+-N3-] позволил выявить в положении

X остаток Phe290, котрый находится на поверхности белковой глобулы (Рисунок

4.42). Наиболее вероятной его функцией является экранирование молекулы NAD+

от растворителя. С точки зрения термодинамики, нахождение гидрофобного

остатка на поверхности белковой глобулы не выгодно для его стабильности.

Поэтому этот остаток может быть перспективным кандидатом для введения

аминокислотных замен. Анализ литературы и сопоставление нумерации

аминокислотных остатков в ФДГ из других источников показало, что в случае ФДГ

из дрожжей C. boidini в этом положении также имеется остаток Phe285,

аналогичный Phe290 в ФДГ сои. Было показано, что при замене этого остатка на

серин активность фермента возрастала на 70%, однако при этом происходило

205

увеличение КмКАЛ и К^000 в 1,6 и 2,3 раза соответственно. Термостабильность CboFDH при этом существенно не изменилась. Увеличение стабильности CboFDH на 30% наблюдали при замене Phe285Tyr [277]. На основании этих данных и анализа структуры SoyFDH можно было полагать, что и в случае данного фермента замена в этом положении гидрофобного остатка на более гидрофильные может положительно сказаться на стабильности и на каталитических свойствах SoyFDH.

Рисунок 4.42 Трехмерная структура кофермент-связывающего домена тройного комплекса ФДГ сои [SoyFDH-NAD-N3-]c выделенным остатком Phe290. Синим выделена молекула NAD+, малиновым выделена молекула азида.

Далее нами был проведен анализ выравнивания аминокислотных

последовательностей в районе этого остатка (см. Рисунок 4.43) и показано, что в

этом положении во многих ферментах находится Phe, Tyr, Asp, Asn, Ser.

Интересно, что в случае одной из самых термостабильных растительных ФДГ -

AthFDH в этом положении находится остаток аспарагиновой кислоты. Поэтому

было решено провести замену X/Asp на примере фермента из сои, а также, для

проведения сравнительного анализа, на всех исследуемых ферментах в рамках

настоящей работы. Анализ фрагмента выравнивания аминокислотных

последовательностей ФДГ из различных источников показал, что в большинстве

бактериальных ферментов в положении X последовательности XP(A)QP стоит

206

аминокислота фенилаланин, в то время как в SauFDH в этом положении находится остаток тирозина. В OpaFDH также в этом положении находится остаток тирозина. Особенно интересной с точки зрения роли остатка X является последовательность PpaFDH, так как в этом ферменте каноническая последовательность представлена в виде NAQP. В результате проведенного анализа структуры ФДГ из различных источников было решено провести изучение роли аминокислотного остатка X на каталитические свойства и стабильность ФДГ из всех исследуемых источников, а кроме того, провести мутагенез Phe311 (аналогичен Phe290 в SoyFDH) в мутантной форме Sm4s фермента из бактерий Pseudomonas sp 101 (PseFDH Sm4s). Ниже приведено обоснование выбора всех выбранных замен.

Для SoyFDH было выбрано 8 аминокислотных замен (Phe290Asp, Phe290Asn, Phe290Glu, Phe290Gln, Phe290Ala, Phe29Ser, Phe290Thr, Phe290Tyr), так как этот фермент является одним из перспективных по кинетическим параметрам и интересным с точки зрения повышения температурной стабильности. Аминокислотные замены на Asp, Ser, Asn и Tyr были выбраны по выравниванию аминокислотных последовательностей. Замена на Thr была выбрана из-за его аналогичного строения с остатком серина. Замена на глутаминовую кислоту была выбрана, так как интересно было посмотреть влияние дополнительной CH2 группы остатка в этом положении на свойства фермента, а замена на Ala была выбрана, так как этот остаток является одним из наиболее простых по строению бокового радикала и практически полностью исключает влияние этой аминокислоты на свойства фермента.

Pf aG

<->. . . .<->.<

PseFDH LAGYAGDVW F PQPAPKDHPWRTMPY

MorFDH LAGYAGDVW F PQPAPNDHPWRTMPH

ParFDH LAGYGGDVW F PQPAPQDHPWRTMPH

HypFDH LAGYAGDVW F PQPAPQDHPWRKMPH

SmeFDH LAGYAGDVW F PQPAPKDHPWRSMPH

UncFDH LSGYAGDVW F PQPAPNDHVWRTMPN

SauFDH LQGYAGDVW Y PQPAPADHPWRTMPR

SoyFDH2 VAGYSGDVW F PQPAPKDHPWRYMPN

LesFDHl IAGYSGDVW Y PQPAPKDHLWRYMPN

StuFDHl IAGYSGDVW Y PQPAPKDHPWRYMPN

CcaFDHl IGGYSGDVW N PQPAPKDHPWRYMPN

RcoFDHl IGGYSGDVW Y PQPASKDHPWRYMPN

BnaFDH2 IGGYSGDVW D PQPAPKDHPWRYMPN

BolFDHl IGGYSGDVW D PQPAPKDHPWRYMPN

MdoFDH IAGYSGDVW N PQPAPKDHPWRYMPN

AthFDH IGGYSGDVW D PQPAPKDHPWRYMPN

PtaFDH2 IGGYSGDVW S AQPAPKDHPWRSMPN

PpaFDH LGGYGGDVW N AQPAGKDHPWRYMPN

SceFDH LAGYGGDVW D KQPAPKDH PWRTMDN

DhaFDH LRGYGGDVW Y PQPAPKDHPWRQMQN

CmeFDH LRGYGGDVW F PQPAPKDHPWRDMRN

CboFDH LRGYGGDVW F PQPAPKDH PWRDMRN

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.