Структурно-функциональный анализ механизма действия ДНК-диоксигеназы человека ALKBH2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Чжао Минсин

• Чжао Минсин
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Чжао Минсин

ВВЕДЕНИЕ

1. Роль диоксигеназ человека, принадлежащих семейству AlkB, в удалении алкилированных повреждений ДНК (Обзор литературы)

1.1. Повреждения ДНК и их репарация

1.2. История исследования ферментов семейства Л1кВ

1.3. Функциональная характеристика гомологов AlkB человека

1.4. Структура ЛЬКВН2

1.5. Функциональная роль некоторых аминокислотных остатков ЛЬКВН2 в каталитическом механизме выворачивания и распознавания поврежденных оснований ЛЬКВН2

1.6. Механизм каталитической реакции окислительного деметилирования

1.7. Взаимодействие ЛЬКВН2 с другими репарационными белками

1.8. Заболевания, связанные с ЛЬКВН2

1.9. Заключение

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Олигодезоксирибонуклеотиды

2.2. Сайт-направленный мутагенез

2.3. Получение биомассы клеток-продуцентов и очистка ферментов

2.4. Анализ электрофоретической подвижности комплексов ферментов с ДНК-субстратами (EMSA)

2.5. Анализ ферментативной активности мутантных форм ЛЬКВН2

2.6. Молекулярно-динамическое моделирование

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. МД-моделирование мутантных форм ферментов ЛЬКВН2

3.1.1. ЛЬКВН2 У99Л

3.1.2. ЛЬКВН2 Ю10Л

3.1.3. ЛЬКВН2 Б124Л

3.1.4. ЛЬКВН2 Б125Л

3.1.5. ЛЬКБН2 1168А

3.1.6. АЬКБН2 Ю72А

3.1.7. ЛЬКБН2 Е175Л

3.2. Связывание метилированной ДНК и каталитическая активность мутантной формы ЛЬКБН2 1168А

3.3. Анализ влияния аминокислотных замен белка ALKBH2, вызванных природными однонуклеотидными полиморфизмами

3.4. МД моделирование фермент-субстратных комплексов, содержащих природные аминокислотные замены ЛЬКБН2 в положении Аг§203

3.5. Проверка эффективности деметилирования модельных ДНК-субстратов природными полиморфными вариантами ЛЬКБН2

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СОКРАЩЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ механизма действия ДНК-диоксигеназы человека ALKBH2»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Сохранение целостности генетической информации, записанной в последовательности нуклеотидов ДНК, критично для выживания и нормального функционирования клетки и организма в целом, однако ДНК постоянно подвергается повреждениям под воздействием различных эндогенных и экзогенных факторов [1,2]. Среди различных типов повреждений метилирование представляет один из наиболее распространенных видов модификации оснований [3]. ДНК-диоксигеназы семейства А1кВ, использующие негемовое железо в качестве кофактора и а-кетоглутарат (аКО) в качестве косубстрата, активизируют молекулу О2 для каталитического окисления метильной группы, что обеспечивает прямое восстановление поврежденного нуклеотида [3-5]. АККВН2 является одним из важнейших гомологов этого семейства у человека, обеспечивающим репарацию широкого спектра повреждений в геномной ДНК и влияющим на устойчивость злокачественных опухолей к терапии алкилирующими агентами [6-13].

Целью данной работы были структурно-функциональный анализ механизма действия ДНК-диоксигеназы человека АЕКВН2 в процессе формирования каталитического фермент-субстратного комплекса с различными ДНК-субстратами и определение роли ряда аминокислотных остатков активного центра фермента в этом процессе.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести молекулярно-динамическое (МД) моделирование фермент-субстратных комплексов АЕКВН2 с ДНК-субстратами, содержащими ^-метиладенозин (т1А) или метилцитидин (т3С), и определить сеть функциональных контактов ключевых аминокислотных остатков активного центра Va199, Аг§П0, РЬе124, Ser125, 11е168, Аг§172 и О1и175.

2. Провести исследование кинетики взаимодействия мутантной формы фермента АЕКВН2, несущей замену 1168А, с модельными ДНК-субстратами, содержащими в качестве повреждения т1А или т3С, для экспериментальной верификации данных, полученных с помощью МД моделирования.

3. Провести МД моделирование фермент-субстратных комплексов мутантных форм АЕКВН2, содержащих вызванные природными полиморфизмами замены Я203С, Я203Н и

Я203Р, с ДНК-субстратами, содержащими т1А или т3С, и определить сеть функциональных контактов аминокислотного остатка Л^203.

4. Получить ряд природных полиморфных вариантов А^КВН2, содержащих три аминокислотные замены Л^203 с разной частотой встречаемости ^203Н, К203С и R203P) и определить эффективность окисления метильных групп в модельных ДНК-субстратах, содержащих т1А или т3С полученными мутантными формами.

Положения, выносимые на защиту

1. Замены аминокислотных остатков Val99 и 11е168, формирующих гидрофобное ядро активного центра ДНК-диоксигеназы человека А^КВН2, на аланин приводят к дестабилизации положения косубстрата aKG в активном центре. Замена У99Л нарушает гидрофобную сеть контактов, вызывая нестабильность петель Ь1 и Ь2 и смещение ключевых остатков Phe102, Туг122 и Glu175, участвующих в распознавании субстрата. Замена 1168А расширяет внутреннее пространство активного центра фермента, что приводит к снижению эффективности связывания и каталитического окисления дцДНК-субстрата, содержащего метилированное повреждение т3С.

2. Замены аминокислотных остатков ЛЬКВН2 Лг§110 и Бег125 на аланин приводят к нарушению позиционирования ДНК-субстрата в активном центре фермента. При этом потеря функционально важного взаимодействия между Туг122 и т1А, вызванная заменой Б125Л, частично компенсируется изменением положения остатков А^110 и А^172. При замене Ю72Л изменение положения Lys200 компенсирует функцию Arg172 в позиционирования ДНК-субстрата в активном центре ЛЬКВН2.

3. Замены аминокислотных остатков Phe124 и Glu175, опосредующих распознавание метилированных оснований через систему стэкинг- и электростатических взаимодействий, приводят к значительному нарушению ключевых контактов в активном центре ЛЬКВН2. В том числе замена F124A нарушает координацию иона железа остатками поверхностного триплета (Н^171, His236, Asp173), а замена Е175А приводит к изменению ориентации каталитических остатков Туг122 и Phe124.

4. Вызванные природными полиморфизмами гена ЛЬКБИ2 замены Л^203, расположенного в петле L3, участвующей в стабилизации комплекса ДНК-субстрата с ферментом, приводят к значительному снижению каталитической активности фермента

по отношению к дцДНК-субстратам, содержащим метилированные основания т1А и т3С.

Научная новизна работы и практическая значимость работы.

В данной работе впервые было проведено комплексное МД исследование влияния замен ключевых аминокислотных остатков активного центра ДНК-диоксигеназы человека АЪКВШ (Уа199, А^110, Phe124, Ser125, 11е168, Arg172 и Glu175) на аланин в процессе формирования каталитического фермент-субстратного комплекса с двуцепочечными ДНК (дцДНК)-субстратами, содержащими т1А или т3С в качестве метилированного повреждения. Полученные данные позволили детально установить сеть функциональных контактов этих остатков с поврежденными основаниями, сахарофосфатным остовом ДНК, кофактором Бе2+ и косубстратом аКО. Были получены данные об эффективности связывания субстратов и каталитической активности мутантной формы АЬКБН2 1168А по отношению к дцДНК-субстратам, содержащим т1А или т3С. Полученные данные вносят вклад в понимание роли ключевых аминокислотных остатков ДНК-диоксигеназы человека АЬКБН2 в осуществлении каталитического окисления метильных повреждений в ДНК. Впервые было проведено комплексное МД исследование влияния замен А^203, вызванных природными полиморфизмами (К203Н, К203С и R203P), в процессе формирования каталитического фермент-субстратного комплекса с дцДНК-субстратами, содержащими т1А или т3С. Были получены данные об эффективности связывания субстратов и каталитической активности мутантных форм АЬКБН2 R203H, К203С и R203P по отношению к дцДНК-субстратам, содержащим т1А или т3С. В совокупности полученные данные позволили установить влияние этих замен, встречающихся в популяции с различной частотой, на каталитическую эффективность ДНК-диоксигеназы человека АЪКБН2. Выявленные различия в активности природных полиморфных вариантов АЕКВН2, содержащих различные замены А^203, могут служить основой для разработки методик прогнозирования индивидуальной чувствительности пациентов к лекарственным препаратам, содержащим алкилирующие агенты.

Личный вклад автора. Представленные в работе результаты по МД-моделированию всех мутантных форм фермента АЪКБН2 получены самим автором или при непосредственном его участии. Процедуры по сайт-направленному мутагенезу и

выделению рекомбинантных препаратов исследуемых мутантных форм ALKBH2 I168A, R203C, R203P и R203H проведены самим автором или при непосредственном его участии. Результаты анализа каталитической активности и эффективности связывания с ДНК-субстратами для мутантных форм ALKBH2 I168A, R203C, R203P и R203H, представленные в работе, получены самим автором или при непосредственном его участии. Автор принимал активное участие в анализе полученных результатов и написании статей.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 3 научных статьи, индексируемых в базах Web of Science и Scopus.

Результаты, изложенные в диссертации, были представлены на конференции Биоинформатика Геномной Регуляции и Структурной/Системной Биологии (BGRS-SB), Новосибирск, 2022.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 88 страницах, содержит 31 рисунок и 15 таблиц. Библиография включает 149 литературных источников.

1. Роль диоксигеназ человека, принадлежащих семейству AlkB, в удалении алкилированных повреждений ДНК

(Обзор литературы)

1.1. Повреждения ДНК и их репарация

Возникающие в ДНК повреждения можно разделить на цитотоксические и мутагенные. Цитотоксические повреждения нарушают спаривание оснований, блокируют ДНК-полимеразу, их возникновение приводит к остановке репликации, в результате чего зачастую происходит гибель клеток; мутагенные повреждения приводят к изменению изначальной последовательности нуклеотидов и закреплению мутаций при репликации ДНК [14,15].

Алкилирующие агенты, часто встречающиеся в окружающей среде и применяемые в клинической практике, обладают высокой активностью по отношению к молекулам ДНК [5,16-18]. В то же время, собственная ДНК клеток может повреждаться при взаимодействии с основным эндогенным донором метильных групп - S-аденозилметионином (SAM), который является распространенным кофактором в биохимических реакциях, катализируемых метилтрансферазами [3,18,19].

Метилирование является одним из наиболее распространенных типов алкилирования, и метильные повреждения могут возникать в различных положениях азотистого основания (рисунок 1) или 2'-дезоксирибозофосфатного остова [3,18,20].

Рисунок 1. Сайты алкилирования азотистых оснований ДНК [18]. Основные сайты и биологические эффекты алкилирования азотистых оснований ДНК отмечены красными и зелеными стрелками, а второстепенные повреждения, которые встречаются реже, обозначены серыми стрелками.

Для защиты от вредоносного эффекта повреждений оснований ДНК живые организмы используют две основных стратегии: прямое восстановление исходного основания или расщепление поврежденной молекулы с последующей вставкой правильных нуклеотидов [21-23]. В клетках живых организмов в ходе эволюции были развиты множество систем репарации, включая эксцизионную репарацию оснований (BER), эксцизионную репарацию нуклеотидов (NER), репарацию ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR), гомологичную рекомбинацию (HR) и негомологичное соединение концов (NHEJ) [5,16,19,24,25].

Среди ферментов, отвечающих за репарацию поврежденных оснований и являющихся частью названных выше путей можно выделить: 1) ДНК-гликозилазы, непосредственно удаляющие поврежденные основания, тем самым инициируя BER [19,20,26]; 2) Об-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазу (AGT), переносящую алкильную группу на собственный цистеиновый остаток [4,20,25,27]; 3) фотолиазы, устраняющие фотоповреждения, вызванные УФ-излучением (такие как CPD-фотолиаза, репарирующая циклобутан-пиримидиновые димеры (CPD) и 6-4 PP-фотолиаза, репарирующая пиримидин-(6,4)-пиримидиновые фотопродукты (6-4PP)) [25]; 4) диоксигеназы семейства AlkB, катализирующие прямое окисление алкильных групп в модифицированных основаниях [3-5]. ALKBH2 является одним из первых идентифицированных у человека гомологов семейства диоксигеназ AlkB и является предметом настоящего исследования

[13].

1.2. История исследования ферментов семейства AlkB

В 1977 г. исследователи впервые обнаружили ферменты семейства AlkB у E. coli [28]. В 1983 г. Kataoka и Sekiguchi выделили ряд мутантов E. coli, чувствительных к Sn2 метилирующему агенту MMS (метилметансульфонат), и идентифицировали новый ген alkB [29]. Однако функция этого гена оставалась неясной до 2001 года, когда Aravind и Koonin, используя анализ последовательностей и структурное моделирование, установили, что AlkB принадлежит к суперсемейству Fe(П)/aKG-зависимых диоксигеназ [30-33]. В 2002 году сразу несколько независимых групп исследователей продемонстрировали окисляющую активность белка AlkB in vitro, подтвердив теоретические предсказания [4,34,35].

Первый гомолог AlkB у млекопитающих был идентифицирован Wei и коллегами в 1996 году, а ген был картирован в области хромосомы 14q24 [24,36]. В начале 2000-х годов Duncan и Aas последовательно описали ALKBH2 (хромосома 12q24.11) и ALKBH3 (хромосома 11q11), демонстрирующие 30,8% и 23,1% идентичности с коровой частью белка AlkB E. coli, соответственно [27,37,38]. К 2003 году Kurowski и коллеги идентифицировали ещё шесть гомологов бактериальной AlkB у человека - ALKBH4-ALKBH8), а также FTO (ALKBH9) [3,17,24,32,39].

1.3. Функциональная характеристика гомологов AlkB человека

ALKBH1, первый идентифицированный у человека гомолог AlkB, состоит из 389 аминокислотных остатков, локализован в цитоплазме и митохондриях и служит тРНК-деметилазой, окисляя 5-метилцитидин (m5C) в митохондриальной тРНКМе* до 5-формилцитидина (f^C) [3,16,40]. Кроме того, было показано, что ALKBH1 также обладает

лиазной активностью на апуриновых/апиримидиновых (АР)-сайтах и регулирует метилирование гистонов Н2А, влияя на ранние этапы нейрального развития [41,42]. Результаты недавних исследований указывают на способность АККВШ окислять также метиладенозин (т6А) в ДНК [43].

Фермент АЕКВН2, состоящий из 261 аминокислотного остатка, локализуется в ядре и предпочтительно катализирует окисление повреждений в дцДНК [26,44]. Такая субстратная специфичность вместе со способностью АЬКВН2 связываться с белком ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), который действует как фактор процессивности для многих ферментов репликации и репарации, вероятно, указывают на важную роль АЬКВН2 в исправлении алкильных повреждений в геномной ДНК [45].

На данный момент подтверждено, что 8 типов повреждений оснований являются субстратами АЬКВН2, а именно: #1-метиладенозин (т1А), #3-метилцитидин (т3С), 5-метилцитидин (т5С), #3-метилтимидин (т3Т), #3-этилтимидин (#3-БЛ), 1,Л^-этеноаденозин (в А), 3Д4-этеноцитидин (вС), 1Д2-этеногуанозин (1,N2-8G, рисунок 2).

ЫН2 МН, N>12 о

ш'А ш3С т5С т3Т

^-ЕЯ вА еС Ь^-ев

Рисунок 2. Типы поврежденных оснований, которые выступают в качестве субстратов АЬКВН2.

Недавнее исследование также выявило слабую активность диоксигеназы АЬКВН2 по отношению к одно- и двухцепочечной ДНК, содержащей эпигенетическую метку т5С [46]. АЕКВН2 не проявлял способности репарировать повреждения в РНК [47] и проявляет слабую активность в отношении оцДНК [48]. При взаимодействии с гибридами ДНК/РНК АЕКВН2 более активен в отношении поврежденной ДНК (ДНК*/РНК, * указывает на метилированное повреждение), чем в отношении оцДНК, но не действует на гибриды РНК*/ДНК и двуцепочечную РНК. Активность АККВН2 зависит от концентрации Mg2+ и достигает максимума при 10 мМ [48].

Помимо АЬКВН2, АЬКВНЗ также является основной ДНК-деметилазой среди белков семейства А1кВ у человека. Установлено, что концентрация АЬКВНЗ увеличена в тканях селезенки, предстательной железы, мочевого пузыря и толстой кишки, в основном фермент локализуется в нуклеоплазме, реже в ядрышке, а также может присутствовать в цитоплазме, но в меньшей степени, чем в ядре, и не локализуется совместно с PCNA [27]. АЬКВНЗ состоит из 286 аминокислотных остатков [49], обладает субстратной специфичностью к т1А и т3С в ДНК, причем активность фермента выше на одноцепочечных ДНК-субстратах (оцДНК) [26,27,50]. Кроме того, было показано, что АЬКБНЗ также обладает активностью по отношению к т5С [46] и с низкой эффективностью способен удалять еС [27,51]. АЬКВНЗ также эффективно репарировал т1А, т3С и т6А в РНК [52,53].

Исследователи доказали, что АЬКВНЗ также взаимодействовал с другими белками, способствуя репарации поврежденных оснований. Dango и его коллеги доказали, что АЬКВНЗ мог взаимодействовать с комплексом коинтегратора 1 сигнала активации (ASCC) [54]. Самая большая субъединица этого комплекса ASCC3 имеет 3'-5'-ДНК-хеликазную активность, поэтому связывание АЬКВНЗ с этим комплексом улучшает активность фермента.

Bj0mstad и др. в 2011 году подтвердили, что АЬКВН4 является членом семейства А1кВ, может декарбоксилировать aKG в отсутствие субстрата, и обладает Fe(П)-связывающим мотивом His169-Asp171-His254 [55]. АЬКВН4 содержит 302 аминокислотных остатка и присутствует как в ядре, так и в цитоплазме [56]. Было доказано, что АЬКВН4 мог взаимодействовать с белками, связанными с хроматином, такими как коактиваторы транскрипции (р300, АБ9 и ЕКЬ), факторы транскрипции (HSF4 и ATBF1), и ко-локализировался с ними в клетках, это указывает на то, что АЬКВН4 играет роль в регуляции транскрипции и модификации хроматина [57]. Было показано, что АЬКВН4 катализировал деметилирование посттрансляционно модифицированного актина (монометилирование Lys84), тем самым регулируя взаимодействие между актином и немышечным миозином II (КМ II) и влияя на клеточную миграцию и цитокинез [58]. Недавно сообщалось, что АЬКВН4 мог удалять т6А из ДНК [59]. №кеп и др. показали, что процесс сперматогенеза у мышей с нокаутом АЬКБН4 был нарушен, предполагая, что этот белок может влиять на зародышевые клетки и даже на ранний эмбриогенез [60].

^аШаттег и др. в 2011 году сообщили, что ALKBH5 катализирует декарбоксилирование aKG, является прямой мишенью транскрипции фактора, индуцируемого гипоксией 1а (НГР-1а), и индуцируется в условиях гипоксии [61]. АЬКБН5 содержит 394 аминокислоты, в основном расположен в ядерных спеклах, где он

связывается с определенными факторами процессинга мРНК [12,62]. Было показано, что АЬКБН5 обладает субстратной специфичностью по отношению к т6А в мРНК [62], а также может деметилировать диметилированный аденозин т62А в рибосомной РНК (рРНК) [63]. т6А представляет собой основную модификацию метилирования мРНК, которая связана с возникновением многих заболеваний, что указывает на то, что А^КВН5 играет роль в регуляции метаболизма РНК и экспрессии генов [62]. В последние годы было доказано, что А^КВН5 также является фактором, влияющим на возникновение рака молочной железы [64], рака поджелудочной железы [65], глиобластомы [66], немелкоклеточного рака легкого [67] и других опухолей, что свидетельствует о том, что можно использовать А^КВН5 в качестве терапевтической мишени.

До сих пор было проведено относительно немного исследований белка А^КВН6. А^КВН6 содержит 238 аминокислот и, как было показано с помощью экспрессии слитого белка EmGFP-ALKBH6, присутствует как в ядре, так и в цитоплазме [56]. В недавнем исследовании Хуонг и др. показали, что гомолог А^КВН6 Arabidopsis ЛаНапа мог связывать РНК, содержащую модификации т6А и т5С, и уровень транскрипции гена А^КВН6 значительно изменялся в условиях различных абиотических стрессов [68]. Субстратная специфичность и трехмерная структура белка АЬКБН6 еще не определены, и активность и функция белка должны быть подтверждены дальнейшими исследованиями.

ALKBH7 содержит 221 аминокислоту и имеет митохондриальную целевую последовательность (MTS) на К-конце (первые 20 аминокислот), обеспечивающую транспорт ALKBH7 в митохондрии [12,49,69]. Согласно некоторым данным, повышенная активность АЬКБН7 может играть роль в запрограммированном некрозе клеток, приводя к коллапсу потенциала митохондриальной мембраны [69]. В структуре ALKBH7 отсутствует короткая гидрофобная шпилька, «крышка распознавания нуклеотидов (К^)», необходимая для связывания азотистых оснований, из-за чего активный сайт не может позиционировать поврежденные азотистые основания, следовательно ЛЬКВН7 может не репарировать поврежденные нуклеиновые кислоты. Предполагается, что субстратом ALKBH7 могут быть белки, однако точный субстрат, катализируемый ALKBH7, до сих пор неизвестен [70].

Белок ALKBH8 состоит из 664 аминокислотных остатков и локализован только в цитоплазме клеток [56]. ALKBH8 представляет собой многофункциональный белок с несколькими доменами, за исключением консервативного домена оксигеназы Fe(П)/аKG, содержащегося во всех диоксигеназах семейства А1кВ, этот белок имеет мотив распознавания ДНК/РНК (ЯЕМ) на К-конце, и SAM-зависимый домен метилтрансферазы (MTase) на С-конце (см. таблицу 1) [24,25,56]. И действительно, было показано, что

ALKBH8 обладает как метилирующей, так и деметилирующей активностью по отношению к мРНК [25,30,56,71,72]. Каталитическую активность и другие функции ALKBH8 необходимо дополнительно изучить.

Белок, связанный с жировой массой и ожирением FTO, также известен как ALKBH9, содержит 505 аминокислотных остатков, локализуется в ядрах, а также присутствует в цитоплазме и имеет высокий уровень экспрессии в гипоталамусе [73]. Было установлено, что сверхэкспрессия гена Fto у мышей приводила к чрезмерному потреблению пищи, что приводило к ожирению, а нокаут гена Fto приводил к остановке роста, потере жира и истощению [49,74,75]. Исследование Frayling и др. показало, что распространенный вариант FTO у людей влиял на индекс массы тела и увеличивал риск развития диабета 2 типа [76]. Jia и др. доказали, что нокдаун FTO значительно увеличивал содержание m6A в мРНК, и подтвердили, что FTO является диоксигеназой, исправляющей повреждения метилирования РНК [77]. Кристаллическая структура FTO, связанного с m6A в оцДНК, позволяет заключить, что фермент предпочитает одноцепочечные субстраты по сравнению с двуцепочечными субстратами [78]. Mauer и др. доказали, что ^6,2'-0-диметиладенозин (m6Am) (модификация на 5'-кэпе) мРНК также является субстратом FTO, при этом эффективность окисления m Am выше, чем m6A [79]. Кроме того, FTO также может репарировать m3T в оцДНК и 3-метилурацил (m3U) в РНК [80].

1.4. Структура ALKBH2

Структура белка ALKBH2 включает высококонсервативный каталитический домен - двуцепочечный ß-спиральный домен (DSBH) суперсемейства Fe(ПУaKG-зависимых диоксигеназ, также известный как укладка типа «желейный рулет» [12]. На N-конце также имеется мотив APIM связывания PCNA (рисунок 3). В домене DSBH имеется два ß-листа (один большой и один малый), каждый из них состоит из четырех антипараллельных ß-цепей, большой ß-лист содержит ß-цепи ß8, ß10, ß13 и ß15, малый - ß-цепи ß9, ß11, ß12 и ß14, эти цепи располагаются попарно, образуя в сочетании с Fe2+ и aKG каталитический активный центр, наподобие плетёной корзины [81-83].

1

Субстрат-связывающие сайты (102-104,122-124,174)

152

257 261

(3-7)

PCNA-связывающий домен

(171,173,236) (159,161,248,252,254) Ре2+-связывающие aKG-связывающие

Рисунок 3. Домены фермента ALKBH2. Показаны мотив APIM, отвечающий за связывание PCNA (оранжевый), двуцепочечный в-спиральный домен DSBH (зеленый) и аминокислотные остатки, отвечающие за связывание ДНК-субстрата и координацию иона Fe(II) и aKG.

Ион Fe2+ связывается с поверхностным триплетом, состоящим из двух остатков гистидина (His171, His236) и одного остатка аспарагиновой кислоты (Asp173), а мотив связывания ионов железа обычно представляет собой HXDX...H [12,84]. Fe2+ связывается с этими аминокислотными остатками через координационные связи и повышает стабильность активного центра. Asp173 также повышает стабильность через водородные связи с Arg254, а остаток гистидина, связанный с Fe2+, также стабилизируется за счет образования п-п взаимодействий с остатками Phe195 и Phe197 [85]. Исследование Lee и др. показало, что мутантные формы ALKBH2, содержащие замену D173A или H236A, обладают значительно сниженной эффективность репарации по отношению к m1A и m3C [9]. Сайтами связывания с aKG в активном центре являются Asn159, Tyr161, Arg248, Thr252 и Arg254, которые образуют мотив связывания N-Y-R-T-R. Водородные связи между aKG и Tyr161 и Arg248 очень стабильны, а O4 образует водородную связь с гуанидиновой группой Arg248 [85]. В то же время aKG также связан с Fe2+, как молекулярный мостик, один конец которого соединяется с остатками белка, а другой конец соединяется с Fe2+, таким образом соединяя два в-листа в каталитическом центре [12,81].

Вокруг активного центра имеется четыре петельных структуры: Loop 1, Loop 2, Loop 3 и Loop 4 (рисунок 4, далее L1, L2, L3, и L4 соответственно), которые играют ключевую роль в «закреплении» ДНК-субстрата [12]. Петля L1 содержит короткую гидрофобную шпильку V101-F102-G103. Петля L2 представляет собой NRL, крышку распознавания нуклеотидов, участвующую в распознавании субстрата, и играет роль в выворачивании поврежденных оснований [86]. Петля L3 (расположенная между Р11 и Р12) содержит длинную гибкую петлю, а петля L4 (расположенная между Р14 и в 15) содержит петлю RKK, состоящую из положительно заряженных аминокислотных остатков Arg241, Lys242 и

Lys243 [4].

Рисунок 4. Топологическая структура фермента ALKBH2. На рисунке а-спирали обозначены желтыми прямоугольниками, восемь Р-цепей, формирующих активный центр, показаны синими стрелками. Области, выделенные пунктирными рамками, обозначают расположение четырёх петель, среди которых петля L1 (розовая) и петля L2 (фиолетовая) образованы двумя Р-цепями каждая. Функциональная роль двух Р-цепей (зелёные) в начальной области пептидной цепи и Р-цепи красного цвета не установлена.

Различия в субстратной специфичности ALKBH2 и ALKBH3 во многом определяются ключевыми мотивами: гидрофобный VFG мотив (Val101-Phe102-Gly103) в ALKBH2 и гидрофильный RED мотив (Arg122-Glu123-Asp124) в ALKBH3. RED мотив ALKBH3 препятствует проникновению дцДНК в активный сайт, тогда как VFG мотив ALKBH2 обеспечивает связывание с дцДНК. Мутант ALKBH2-RED потерял способность репарировать повреждения в ДНК, а ALKBH3-VFG приобрел активность ALKBH2 дикого типа (далее ALKBH2 WT), подтверждая решающую роль этих мотивов [26,86]. Дополнительные исследования показали, что мутант ALKBH2A89-108 потерял деметилирующую активность, но сохранил способность к декарбоксилированию aKG, указывая на сохранение структуры активного центра [87].

1.5. Функциональная роль некоторых аминокислотных остатков ALKBH2 в каталитическом механизме выворачивания и распознавания поврежденных оснований ALKBH2

При связывании ALKBH2 с дцДНК гидрофобная шпилька L1, включающая остатки V101-F102, инициирует выворачивание поврежденного основания в активный центр фермента за счет уменьшения стабильности комплементарных взаимодействий с поврежденным основанием (рисунок 5). После инициации процесса выворачивания поврежденного нуклеотида остаток F102 встраивается в освобождаемое пространство и

взаимодействует с соседними основаниями, тем самым стабилизируя структуру и конформацию двойной спирали ДНК [12,13,26,86]. Эксперименты с использованием сайт-направленного мутагенеза, проведенные Chen и др., показали, что при окислении m1A-содержащих субстратов одиночные замены V101A и F102A приводили к значительному снижению активности фермента по отношению к оцДНК, в то время как только двойная замена V101A-F102A приводила к снижению активности к дцДНК [26,86]. В то же время Monsen и др. показали, что одиночная замена F102A мало влияла на эффективность репарации к m3C в оцДНК и дцДНК, а одиночная замена V101A снижала эффективность репарации до 40% (оцДНК) и 20% (дцДНК), а двойная мутантная форма ALKBH2 V101A-F102A полностью утратила каталитическую активность [87].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чжао Минсин, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Travers A., Muskhelishvili G. DNA structure and function // FEBS J. 2015. Т. 282, № 12. С. 2279-2295.

2. Tubbs A., Nussenzweig A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer // Cell. 2017. Т. 168, № 4. С. 644-656.

3. Kuznetsov N. A., Kanazhevskaya L. Y., Fedorova O. S. DNA Demethylation in the Processes of Repair and Epigenetic Regulation Performed by 2-Ketoglutarate-Dependent DNA Dioxygenases // Int J Mol Sci. 2021. Т. 22, № 19. С. 10540.

4. Yang C.-G., Garcia K., He C. Damage detection and base flipping in direct DNA alkylation repair // Chembiochem. 2009. Т. 10, № 3. С. 417-423.

5. Yi C., Yang C.-G., He C. A non-heme iron-mediated chemical demethylation in DNA and RNA // Acc Chem Res. 2009. Т. 42, № 4. С. 519-529.

6. Cetica V. и др. Pediatric brain tumors: mutations of two dioxygenases (hABH2 and hABH3) that directly repair alkylation damage // J Neurooncol. 2009. Т. 94, № 2. С. 195-201.

7. Gao W. и др. Frequent down-regulation of hABH2 in gastric cancer and its involvement in growth of cancer cells // J Gastroenterol Hepatol. 2011. Т. 26, № 3. С. 577-584.

8. Johannessen T.-C. A. и др. The DNA repair protein ALKBH2 mediates temozolomide resistance in human glioblastoma cells // Neuro Oncol. 2013. Т. 15, № 3. С. 269-278.

9. Lee D.-H. и др. Repair of methylation damage in DNA and RNA by mammalian AlkB homologues // J Biol Chem. 2005. Т. 280, № 47. С. 39448-39459.

10. Shimada K. и др. ALKBH3 contributes to survival and angiogenesis of human urothelial carcinoma cells through NADPH oxidase and tweak/Fn14/VEGF signals // Clin Cancer Res. 2012. Т. 18, № 19. С. 5247-5255.

11. Wu S. и др. Down-regulation of ALKBH2 increases cisplatin sensitivity in H1299 lung cancer cells // Acta Pharmacol Sin. 2011. Т. 32, № 3. С. 393-398.

12. Xu B. и др. Multi-substrate selectivity based on key loops and non-homologous domains: new insight into ALKBH family // CMLS. 2021. Т. 78, № 1. С. 129-141.

13. Yi C. и др. Duplex interrogation by a direct DNA repair protein in search of base damage // Nat Struct Mol Biol. 2012. Т. 19, № 7. С. 671-676.

14. Falnes P. 0., Klungland A., Alseth I. Repair of methyl lesions in DNA and RNA by oxidative demethylation // Neuroscience. 2007. Т. 145, № 4. С. 1222-1232.

15. Falnes P. 0., Rognes T. DNA repair by bacterial AlkB proteins // Res Microbiol. 2003. Т. 154, № 8. С. 531-538.

16. Müller T. A., Hausinger R. P. AlkB and its homologues - DNA repair and beyond // RSC Metallobiology. Royal Society of Chemistry, 2015. Т. 2015-January, № 3. С. 246-262.

17. Sundheim O. u gp. AlkB demethylases flip out in different ways // DNA Repair. 2008. T. 7, № 11. C. 1916-1923.

18. Fu D., Calvo J. A., Samson L. D. Balancing repair and tolerance of DNA damage caused by alkylating agents // Nat Rev Cancer. 2012. T. 12, № 2. C. 104-120.

19. Li P. u gp. ABH2 couples regulation of ribosomal DNA transcription with DNA alkylation repair // Cell Reports. 2013. T. 4, № 4. C. 817-829.

20. Ringvoll J. u gp. Repair deficient mice reveal mABH2 as the primary oxidative demethylase for repairing 1meA and 3meC lesions in DNA // Embo Journal. 2006. T. 25, № 10. C.2189-2198.

21. Caffrey P. J. u gp. Comparison of the Base Excision and Direct Reversal Repair Pathways for Correcting 1,N6-Ethenoadenine in Strongly Positioned Nucleosome Core Particles // Chem. Res. Toxicol. American Chemical Society, 2020. T. 33, № 7. C. 1888-1896.

22. Chatterjee N., Walker G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis // Environ Mol Mutagen. 2017. T. 58, № 5. C. 235-263.

23. Hakem R. DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly // EMBO J. 2008. T. 27, № 4. C. 589-605.

24. Ougland R. u gp. Non-homologous functions of the AlkB homologs // J Mol Cell Biol. 2015. T. 7, № 6. C. 494-504.

25. Yi C., He C. DNA repair by reversal of DNA damage // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2013. T. 5, № 1. C. a012575.

26. Chen B. u gp. Mechanistic insight into the recognition of single-stranded and double-stranded DNA substrates by ABH2 and ABH3 // Mol Biosyst. 2010. T. 6, № 11. C. 2143-2149.

27. Duncan T. u gp. Reversal of DNA alkylation damage by two human dioxygenases // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. T. 99, № 26. C. 16660-16665.

28. Benson S. u gp. Fractionation of inducible alkane hydroxylase activity in Pseudomonas putida and characterization of hydroxylase-negative plasmid mutations // J Bacteriol. 1977. T. 132, № 2. C. 614-621.

29. Kataoka H., Yamamoto Y., Sekiguchi M. A new gene (alkB) of Escherichia coli that controls sensitivity to methyl methane sulfonate // J Bacteriol. 1983. T. 153, № 3. C. 1301-1307.

30. A. Alemu E., He C., Klungland A. ALKBHs-facilitated RNA modifications and de-modifications // DNA Repair. 2016. T. 44. C. 87-91.

31. Aravind L., Koonin E. V. The DNA-repair protein AlkB, EGL-9, and leprecan define new families of 2-oxoglutarate- and iron-dependent dioxygenases. // Genome biology. BioMed Central, 2001. T. 2, № 3. C. research0007.1.

32. Kurowski M. A. u gp. Phylogenomic identification of five new human homologs of

the DNA repair enzyme AlkB // BMC Genomics. 2003. Т. 4, № 1. С. 48.

33. Mishina Y., He C. Oxidative dealkylation DNA repair mediated by the mononuclear non-heme iron AlkB proteins // Journal of Inorganic Biochemistry. 2006. Т. 100, № 4. С. 670678.

34. Falnes P. 0., Johansen R. F., Seeberg E. AlkB-mediated oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia coli. // Nature. 2002. Т. 419, № 6903. С. 178-182.

35. Trewick S. C. и др. Oxidative demethylation by Escherichia coli AlkB directly reverts DNA base damage // Nature. 2002. Т. 419, № 6903. С. 174-178.

36. Wei Y. F. и др. Molecular cloning and functional analysis of a human cDNA encoding an Escherichia coli AlkB homolog, a protein involved in DNA alkylation damage repair // Nucleic Acids Res. 1996. Т. 24, № 5. С. 931-937.

37. Christmann M. и др. Mechanisms of human DNA repair: an update // Toxicology. 2003. Т. 193, № 1-2. С. 3-34.

38. Drabl0s F. и др. Alkylation damage in DNA and RNA - Repair mechanisms and medical significance // DNA Repair. 2004. Т. 3, № 11. С. 1389-1407.

39. Muller T. A., Hausinger R. P. CHAPTER 8:AlkB and Its Homologues - DNA Repair and Beyond [Электронный ресурс] // SciSpace - Paper. Royal Society of Chemistry, 2015. С. 246-262. URL: https://scispace.com/papers/chapter-8-alkb-and-its-homologues-dna-repair-and-beyond-154d8tm73u (дата обращения: 26.05.2025).

40. Haag S. и др. NSUN 3 and ABH 1 modify the wobble position of mt -1 RNA Met to expand codon recognition in mitochondrial translation // The EMBO Journal. Springer Science and Business Media LLC, 2016. Т. 35, № 19. С. 2104-2119.

41. Müller T. A., Andrzejak M. M., Hausinger R. P. A covalent protein-DNA 5' -product adduct is generated following AP lyase activity of human ALKBH1 (AlkB homologue 1) // Biochemical Journal. 2013. Т. 452, № 3. С. 509-518.

42. Müller T. A., Meek K., Hausinger R. P. Human AlkB homologue 1 (ABH1) exhibits DNA lyase activity at abasic sites // DNA Repair (Amst). 2010. Т. 9, № 1. С. 58-65.

43. Zhang M. и др. Mammalian ALKBH1 serves as an N6-mA demethylase of unpairing DNA // Cell Res. 2020. Т. 30, № 3. С. 197-210.

44. Yang C. G. и др. Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA // Nature. 2008. Т. 452, № 7190. С. 961-965.

45. Fu D. и др. The interaction between ALKBH2 DNA repair enzyme and PCNA is direct, mediated by the hydrophobic pocket of PCNA and perturbed in naturally-occurring ALKBH2 variants // DNA Repair. 2015. Т. 35. С. 13-18.

46. Bian K. h gp. DNA repair enzymes ALKBH2, ALKBH3, and AlkB oxidize 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine in vitro // Nucleic Acids Res. 2019. T. 47, № 11. C. 5522-5529.

47. Ougland R. h gp. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation // Molecular Cell. 2004. T. 16, № 1. C. 107-116.

48. Falnes P. 0. h gp. Substrate specificities of bacterial and human AlkB proteins // Nucleic Acids Res. 2004. T. 32, № 11. C. 3456-3461.

49. Xiao M.-Z. h gp. Therapeutic potential of ALKB homologs for cardiovascular disease // Biomed Pharmacother. 2020. T. 131. C. 110645.

50. Aas P. A. h gp. Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA // Nature. 2003. T. 421, № 6925. C. 859-863.

51. Zdzalik D. h gp. Differential repair of etheno-DNA adducts by bacterial and human AlkB proteins // DNA Repair. Elsevier, 2015. T. 30. C. 1-10.

52. Ueda Y. h gp. AlkB homolog 3-mediated tRNA demethylation promotes protein synthesis in cancer cells // Sci Rep. 2017. T. 7. C. 42271.

53. Zhang L. h gp. The Molecular Basis of Human ALKBH3 Mediated RNA N1-methyladenosine (m1A) Demethylation // Angew Chem Int Ed Engl. 2024. T. 63, № 7. C. e202313900.

54. Dango S. h gp. DNA unwinding by ASCC3 helicase is coupled to ALKBH3-dependent DNA alkylation repair and cancer cell proliferation // Mol Cell. 2011. T. 44, № 3. C. 373-384.

55. Bj0rnstad L. G. h gp. Spectroscopic and magnetic studies of wild-type and mutant forms of the Fe(II)- and 2-oxoglutarate-dependent decarboxylase ALKBH4 // Biochemical Journal. 2011. T. 434, № 3. C. 391-398.

56. Tsujikawa K. h gp. Expression and sub-cellular localization of human ABH family molecules // J Cell Mol Med. 2007. T. 11, № 5. C. 1105-1116.

57. Bj0rnstad L. G. h gp. Human ALKBH4 interacts with proteins associated with transcription // PLoS One. 2012. T. 7, № 11. C. e49045.

58. Li M. M. h gp. ALKBH4-dependent demethylation of actin regulates actomyosin dynamics // Nature Communications. 2013. T. 4.

59. Kweon S.-M. h gp. An Adversarial DNA N6-Methyladenine-Sensor Network Preserves Polycomb Silencing // Mol Cell. 2019. T. 74, № 6. C. 1138-1147.e6.

60. Nilsen A. h gp. ALKBH4 depletion in mice leads to spermatogenic defects // PLoS One. 2014. T. 9, № 8. C. e105113.

61. Thalhammer A. h gp. Human AlkB homologue 5 is a nuclear 2-oxoglutarate

dependent oxygenase and a direct target of hypoxia-inducible factor 1a (HIF-1a) // PLoS One. 2011. T. 6, № 1. C. e16210.

62. Zheng G. h gp. ALKBH5 Is a Mammalian RNA Demethylase that Impacts RNA Metabolism and Mouse Fertility // Molecular Cell. 2013. T. 49, № 1. C. 18-29.

63. Ensfelder T. T. h gp. ALKBH5-induced demethylation of mono- and dimethylated adenosine // Chem Commun (Camb). 2018. T. 54, № 62. C. 8591-8593.

64. Zhang C. h gp. Hypoxia induces the breast cancer stem cell phenotype by HIF-dependent and ALKBH5-mediated m6A-demethylation of NANOG mRNA // Proc Natl Acad Sci U S A. 2016. T. 113, № 14. C. E2047-2056.

65. He Y. h gp. ALKBH5 Inhibits Pancreatic Cancer Motility by Decreasing Long Non-Coding RNA KCNK15-AS1 Methylation // Cell Physiol Biochem. 2018. T. 48, № 2. C. 838-846.

66. Zhang S. h gp. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program // Cancer Cell. 2017. T. 31, № 4. C. 591-606.e6.

67. Jin D. h gp. m6A demethylase ALKBH5 inhibits tumor growth and metastasis by reducing YTHDFs-mediated YAP expression and inhibiting miR-107/LATS2-mediated YAP activity in NSCLC // Mol Cancer. 2020. T. 19, № 1. C. 40.

68. Huong T. T., Ngoc L. N. T., Kang H. Functional Characterization of a Putative RNA Demethylase ALKBH6 in Arabidopsis Growth and Abiotic Stress Responses // Int J Mol Sci. 2020. T. 21, № 18. C. 6707.

69. Fu D., Jordan J. J., Samson L. D. Human ALKBH7 is required for alkylation and oxidation-induced programmed necrosis // Genes Dev. 2013. T. 27, № 10. C. 1089-1100.

70. Wang G. h gp. The atomic resolution structure of human AlkB homolog 7 (ALKBH7), a key protein for programmed necrosis and fat metabolism // J Biol Chem. 2014. T. 289, № 40. C. 27924-27936.

71. Fu D. h gp. Human AlkB homolog ABH8 Is a tRNA methyltransferase required for wobble uridine modification and DNA damage survival // Mol Cell Biol. 2010. T. 30, № 10. C. 2449-2459.

72. Van Den Born E. h gp. ALKBH8-mediated formation of a novel diastereomeric pair of wobble nucleosides in mammalian tRNA // Nature Communications. 2011. T. 2, № 1. C. 172.

73. Gulati P. h gp. Fat mass and obesity-related (FTO) shuttles between the nucleus and cytoplasm // Biosci Rep. 2014. T. 34, № 5. C. e00144.

74. Dina C. h gp. Variation in FTO contributes to childhood obesity and severe adult obesity // Nat Genet. 2007. T. 39, № 6. C. 724-726.

75. Wu Q. h gp. The obesity-associated Fto gene is a transcriptional coactivator //

Biochem Biophys Res Commun. 2010. T. 401, № 3. C. 390-395.

76. Frayling T. M. u gp. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity // Science. 2007. T. 316, № 5826. C. 889894.

77. Jia G. u gp. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO // Nat Chem Biol. 2011. T. 7, № 12. C. 885-887.

78. Zhang X. u gp. Structural insights into FTO's catalytic mechanism for the demethylation of multiple RNA substrates // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. National Academy of Sciences, 2019. T. 116, № 8. C. 2919-2924.

79. Mauer J. u gp. Reversible methylation of m6Am in the 5' cap controls mRNA stability // Nature. 2017. T. 541, № 7637. C. 371-375.

80. Jia G. u gp. Oxidative demethylation of 3-methylthymine and 3-methyluracil in single-stranded DNA and RNA by mouse and human FTO // FEBS Lett. 2008. T. 582, № 23-24. C.3313-3319.

81. Bleijlevens B. u gp. Changes in protein dynamics of the DNA repair dioxygenase AlkB upon binding of Fe(2+) and 2-oxoglutarate // Biochemistry. 2012. T. 51, № 16. C. 33343341.

82. Deepa A., Naveena K., Anindya R. DNA repair activity of Fe(II)/2OG-dependent dioxygenases affected by low iron level in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Yeast Res. 2018. T. 18, № 2.

83. Fedeles B. I. u gp. The AlkB family of Fe(II)/a-ketoglutarate-dependent dioxygenases: Repairing nucleic acid alkylation damage and beyond // Journal of Biological Chemistry. 2015. T. 290, № 34. C. 20734-20742.

84. Giri N. C. u gp. X-ray absorption spectroscopy structural investigation of early intermediates in the mechanism of DNA repair by human ABH2 // Biochemistry. 2011. T. 50, № 22. C. 5067-5076.

85. Waheed S. O. u gp. Role of Structural Dynamics in Selectivity and Mechanism of Non-heme Fe(II) and 2-Oxoglutarate-Dependent Oxygenases Involved in DNA Repair // ACS Cent Sci. 2020. T. 6, № 5. C. 795-814.

86. Chen B., Gan J., Yang C. The complex structures of ALKBH2 mutants cross-linked to dsDNA reveal the conformational swing of P-hairpin // Science China Chemistry. 2014. T. 57, № 2. C. 307-313.

87. Monsen V. T. u gp. Divergent P-hairpins determine double-strand versus singlestrand substrate recognition of human AlkB-homologues 2 and 3 // Nucleic Acids Research. 2010. T. 38, № 19. C. 6447-6455.

88. Kanazhevskaya L. Yu. h gp. Conformational Dynamics of Human ALKBH2 Dioxygenase in the Course of DNA Repair as Revealed by Stopped-Flow Fluorescence Spectroscopy // Molecules. 2022. T. 27, № 15. C. 4960.

89. Lenz S. A. P., Li D., Wetmore S. D. Insights into the Direct Oxidative Repair of Etheno Lesions: MD and QM/MM Study on the Substrate Scope of ALKBH2 and AlkB // DNA Repair (Amst). 2020. T. 96. C. 102944.

90. Fletcher S. C., Coleman M. L. Human 2-oxoglutarate-dependent oxygenases: nutrient sensors, stress responders, and disease mediators // Biochem Soc Trans. 2020. T. 48, № 5. C. 1843-1858.

91. Chin R. M. h gp. The metabolite a-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR // Nature. 2014. T. 510, № 7505. C. 397-401.

92. Tran T. Q. h gp. Glutamine deficiency induces DNA alkylation damage and sensitizes cancer cells to alkylating agents through inhibition of ALKBH enzymes // PLoS Biol. 2017. T. 15, № 11. C. e2002810.

93. Morin A. h gp. Oncometabolites-driven tumorigenesis: From genetics to targeted therapy // Int J Cancer. 2014. T. 135, № 10. C. 2237-2248.

94. Ploumakis A., Coleman M. L. OH, the Places You'll Go! Hydroxylation, Gene Expression, and Cancer // Molecular Cell. 2015. T. 58, № 5. C. 729-741.

95. Blaschke K. h gp. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells // Nature. 2013. T. 500, № 7461. C. 222-226.

96. Chen J. h gp. Vitamin C modulates TET1 function during somatic cell reprogramming // Nat Genet. 2013. T. 45, № 12. C. 1504-1509.

97. Kuiper C., Vissers M. C. M. Ascorbate as a co-factor for fe- and 2-oxoglutarate dependent dioxygenases: physiological activity in tumor growth and progression // Front Oncol. 2014. T. 4. C. 359.

98. Perry G. S., Das M., Woon E. C. Y. Inhibition of AlkB Nucleic Acid Demethylases: Promising New Epigenetic Targets // J Med Chem. 2021. T. 64, № 23. C. 16974-17003.

99. Li P. h gp. ABH2 couples regulation of ribosomal DNA transcription with DNA alkylation repair // Cell Rep. 2013. T. 4, № 4. C. 817-829.

100. Wilson D. L. h gp. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses // Angew Chem Int Ed Engl. 2018. T. 57, № 39. C.12896-12900.

101. Fujii T. h gp. ALKBH2, a novel AlkB homologue, contributes to human bladder cancer progression by regulating MUC1 expression // Cancer Sci. 2013. T. 104, № 3. C. 321-327.

102. Wang L. h gp. Characterization of the prognostic and diagnostic values of ALKBH

family members in non-small cell lung cancer // Pathol Res Pract. 2022. T. 231. C. 153809.

103. Calvo J. A. u gp. DNA repair is indispensable for survival after acute inflammation // J Clin Invest. 2012. T. 122, № 7. C. 2680-2689.

104. Ke B., Ye K., Cheng S. ALKBH2 inhibition alleviates malignancy in colorectal cancer by regulating BMI1-mediated activation of NF-kB pathway // World J Surg Oncol. 2020. T. 18, № 1. C. 328.

105. Nelson M. R. u gp. Large-scale validation of single nucleotide polymorphisms in gene regions // Genome Res. 2004. T. 14, № 8. C. 1664-1668.

106. Sali A., Blundell T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints // J Mol Biol. 1993. T. 234, № 3. C. 779-815.

107. Anandakrishnan R., Aguilar B., Onufriev A. V. H++ 3.0: automating pK prediction and the preparation of biomolecular structures for atomistic molecular modeling and simulations // Nucleic Acids Res. 2012. T. 40, № Web Server issue. C. W537-541.

108. Abraham M. J. u gp. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers // SoftwareX. 2015. T. 1-2. C. 19-25.

109. Joung I. S., Cheatham T. E. Determination of alkali and halide monovalent ion parameters for use in explicitly solvated biomolecular simulations // J Phys Chem B. 2008. T. 112, № 30. C. 9020-9041.

110. Cornell W. D. u gp. A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 5179-5197 // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society, 1996. T. 118, № 9. C. 2309-2309.

111. Maier J. A. u gp. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB // J Chem Theory Comput. 2015. T. 11, № 8. C. 3696-3713.

112. Zgarbova M. u gp. Refinement of the Sugar-Phosphate Backbone Torsion Beta for AMBER Force Fields Improves the Description of Z- and B-DNA // J Chem Theory Comput. 2015. T. 11, № 12. C. 5723-5736.

113. Zgarbova M. u gp. Refinement of the Cornell et al. Nucleic Acids Force Field Based on Reference Quantum Chemical Calculations of Glycosidic Torsion Profiles // J Chem Theory Comput. 2011. T. 7, № 9. C. 2886-2902.

114. Bayly C. I. u gp. A well-behaved electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges: the RESP model - ScienceOpen // The Journal of Physical Chemistry. 1993. T. 97, № 40. C. 10269-10280.

115. Vanquelef E. u gp. R.E.D. Server: a web service for deriving RESP and ESP charges and building force field libraries for new molecules and molecular fragments // Nucleic Acids Res. 2011. T. 39, № Web Server issue. C. W511-517.

116. Wang J. h gp. Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations // J Mol Graph Model. 2006. T. 25, № 2. C. 247-260.

117. Sousa da Silva A. W., Vranken W. F. ACPYPE - AnteChamber PYthon Parser interfacE // BMC Res Notes. 2012. T. 5. C. 367.

118. Jiang Y., Zhang H., Tan T. Rational Design of Methodology-Independent Metal Parameters Using a Nonbonded Dummy Model // J Chem Theory Comput. 2016. T. 12, № 7. C. 3250-3260.

119. Essmann U. h gp. A smooth particle mesh Ewald method // The Journal of Chemical Physics. 1995. T. 103, № 19. C. 8577-8593.

120. Wennberg C. L. h gp. Lennard-Jones lattice summation in bilayer simulations has critical effects on surface tension and lipid properties // Journal of Chemical Theory and Computation. 2013. T. 9, № 8. C. 3527-3537.

121. Hess B. h gp. LINCS: A Linear Constraint Solver for molecular simulations // Journal of Computational Chemistry. 1997. T. 18, № 12. C. 1463-1472.

122. Bussi G., Donadio D., Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling // J Chem Phys. 2007. T. 126, № 1. C. 014101.

123. Popov A. V., Vorobjev Y. N., Zharkov D. O. MDTRA: A molecular dynamics trajectory analyzer with a graphical user interface // Journal of Computational Chemistry. 2013. T. 34, № 4. C. 319-325.

124. Phan L. h gp. The evolution of dbSNP: 25 years of impact in genomic research // Nucleic Acids Res. 2025. T. 53, № D1. C. D925-D931.

125. Ng P. C., Henikoff S. Accounting for human polymorphisms predicted to affect protein function // Genome Res. 2002. T. 12, № 3. C. 436-446.

126. Ng P. C., Henikoff S. Predicting Deleterious Amino Acid Substitutions // Genome Res. 2001. T. 11, № 5. C. 863-874.

127. Adzhubei I. A. h gp. A method and server for predicting damaging missense mutations | Nature Methods // Nature Methods. 2010. T. 7. C. 248-249.

128. Kircher M. h gp. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants // Nat Genet. 2014. T. 46, № 3. C. 310-315.

129. Cheng J. h gp. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense // Science. 2023. T. 381, № 6664. C. eadg7492.

130. Ioannidis N. M. h gp. REVEL: An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants // The American Journal of Human Genetics. 2016. T. 99, № 4. C. 877885.

131. Choi Y., Chan A. P. PROVEAN web server: a tool to predict the functional effect of

amino acid substitutions and indels // Bioinformatics. 2015. T. 31, № 16. C. 2745-2747.

132. Capriotti E. u gp. WS-SNPs&GO: a web server for predicting the deleterious effect of human protein variants using functional annotation // BMC Genomics. 2013. T. 14 Suppl 3, № Suppl 3. C. S6.

133. Tang H., Thomas P. D. PANTHER-PSEP: predicting disease-causing genetic variants using position-specific evolutionary preservation // Bioinformatics. 2016. T. 32, № 14. C. 2230-2232.

134. Bendl J. u gp. PredictSNP: robust and accurate consensus classifier for prediction of disease-related mutations // PLoS Comput Biol. 2014. T. 10, № 1. C. e1003440.

135. Stone E. A., Sidow A. Physicochemical constraint violation by missense substitutions mediates impairment of protein function and disease severity // Genome Research. 2005. T. 15, № 7. C. 978-986.

136. Karczewski K. u gp. The genome Aggregation Database (gnomAD) | MacArthur Lab // MacArthur Lab. 2017. C. 1-10.

137. Landau M. u gp. ConSurf 2005: the projection of evolutionary conservation scores of residues on protein structures // Nucleic Acids Res. 2005. T. 33, № Web Server issue. C. W299-302.

138. Ben Chorin A. u gp. ConSurf-DB: An accessible repository for the evolutionary conservation patterns of the majority of PDB proteins // Protein Sci. 2020. T. 29, № 1. C. 258267.

139. Nakamura T. u gp. Parallelization of MAFFT for large-scale multiple sequence alignments // Bioinformatics. 2018. T. 34, № 14. C. 2490-2492.

140. Dolinsky T. J. u gp. PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations // Nucleic Acids Res. 2007. T. 35, № Web Server issue. C. W522-525.

141. Bakan A., Meireles L. M., Bahar I. ProDy: protein dynamics inferred from theory and experiments // Bioinformatics. 2011. T. 27, № 11. C. 1575-1577.

142. Pfeifer G. P., Besaratinia A. Mutational spectra of human cancer // Hum Genet. 2009. T. 125, № 5-6. C. 493-506.

143. Zhang Y., Sagui C. Secondary structure assignment for conformationally irregular peptides: comparison between DSSP, STRIDE and KAKSI // J Mol Graph Model. 2015. T. 55. C. 72-84.

144. Sefidbakht Y., Ranaei Siadat O., Taheri F. Homology modeling and molecular dynamics study on Schwanniomyces occidentalis alpha-amylase // J Biomol Struct Dyn. 2017. T. 35, № 3. C. 574-584.

145. Bhagwat A. S. h gp. Strand-biased cytosine deamination at the replication fork causes cytosine to thymine mutations in Escherichia coli // Proc Natl Acad Sci U S A. 2016. T. 113, № 8. C. 2176-2181.

146. Hajjari M. M., Sharif N. In-silico behavior of dissolved prolamins under electric field effect applied by electrospinning process using molecular dynamics simulation // Journal of Molecular Liquids. 2021. T. 344. C. 117778.

147. Jiang Z. h gp. The complementary neighborhood patterns and methylation-to-mutation likelihood structures of 15,110 single-nucleotide polymorphisms in the bovine genome // Genetics. 2008. T. 180, № 1. C. 639-647.

148. Khodyreva S. N., Dyrkheeva N. S., Lavrik O. I. Proteins Associated with Neurodegenerative Diseases: Link to DNA Repair // Biomedicines. 2024. T. 12, № 12. C. 2808.

149. Konopka A., Atkin J. D. DNA Damage, Defective DNA Repair, and Neurodegeneration in Amyotrophic Lateral Sclerosis // Front Aging Neurosci. 2022. T. 14. C. 786420.