Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Тартаковская, Дина Игоревна

  • Тартаковская, Дина Игоревна
  • кандидат науккандидат наук
  • 2014, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.02.03
  • Количество страниц 137
Тартаковская, Дина Игоревна. Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila: дис. кандидат наук: 03.02.03 - Микробиология. Москва. 2014. 137 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Тартаковская, Дина Игоревна

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila

1.1.1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila

1.1.2. Эффекторные белки L. pneumophila

1.2. Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов

1.3. Гликозилтрансферазы

1.4. Lgt - семейство цитотоксичных глюкозилтрансфераз L. pneumophila

1.5. Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы для синтеза и модификации ДНК

2.1.2. Общелабораторные реагенты

2.1.3. Питательные среды и вещества

2.1.4. Олигонуклеотиды

2.1.5. Радиоактивные материалы

2.1.6. Лабораторное оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Культивирование микроорганизмов

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.3. Постановка ПЦР

2.2.4. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК

2.2.5. Трансформация

2.2.6. Создание делеционных штаммов S. cerevisiae

2.2.7. Определение токсического фенотипа у дрожжей титрационным методом

2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков

2.2.9. Выделение фактора элонгации 1А из клеток S. cerevisiae

2.2.10. Экстракция белков из клеток S. cerevisiae

2.2.11. Получение поликлональных антител

2.2.12. Электрофорез в SDS полиакриламидном геле

2.2.13. Иммуноблоттинг

2.2.14. In vitro трансляция в системе S. cerevisiae

2.2.15. Определение ГТФазной активности

2.2.16. Реакция глюкозилирования

2.2.17. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Глюкозилирующая активность Lgtl в отношении нативного и обработанного трипсином белка EF1A S. cerevisiae

3.2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1А

3.3. Идентификация нового субстрата фермента Lgtl - белка Hbsl

3.4. Подавление белкового синтеза ферментом Lgtl и его мутантными формами в системе S. cerevisiae

3.5. Создание коллекций штаммов cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации

3.6. Токсическое действие 1^1 в генетически-сконструированных штаммах

3.7. Заключение

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

иптг изопропил-(3-0-тиогалактопиранозид

КД килодальтон

ьв среда Луриа - Бертани

УРБ среда дрожжевой экстракт-пептон-декстроза

ЭБ синтетическая минимальная среда

ЭДТА этилендиамин тетраацетат

С8Т глутатион - Б - трансфераза

сЮТР дезоксинуклеозидтрифосфат

ЗББ додецилсульфат натрия

ТАЕ трис - ацетатный буфер

ТЕМЕБ тетраметилэтилендиамин

ТВБ трис солевой буфер

ПААГ полиакриламидный гель

УДФ уридиндифосфат

ЭР эндоплазматический ретикулум

ГТФ гуанозинтрифосфат

ГДФ гуанозиндифосфат

АДФ аденозиндифосфат

АМФ аденозинмонофосфат

АТФ аденозинтрифосфат

ОРС открытая рамка считывания

НЕРЕЭ К-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота

ТЕ трис - буфер

ДТТ дитиотреитол

РМ8Б фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция

г грамм

нг нанограмм

мкл микролитр

мкМ микромоль

мкг микрограмм

V вольт

А ампер

мА миллиампер

ед единица

а/к аминокислота

ОДбоо оптическая плотность, длина волны

ТХУ трихлоруксусная кислота

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Микробиология», 03.02.03 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Инфекционным агентом острой пневмонии человека -легионеллеза, является грамотрицательная бактерия рода легионелла (Fields В., Benson R., et al., 2002). Среди множества видов данного рода бактерии наиболее опасным патогеном для человека является L. pneumophila, которая служит возбудителем болезни легионеров более чем в 90% случаев заболевания (Diederen В., 2008). Именно этот вид занимает приоритетное место в исследованиях, направленных на изучение механизмов вирулентности легионелл.

Развитие острой инфекции определяется способностью L. pneumophila активно размножаться в клетке-мишени за счет формирования так называемой «репликативной вакуоли» и транспортировать бактериальные белки в инфицированную клетку (Isberg R., O'Connor Т., et al., 2009). Патогенная бактерия продуцирует и доставляет посредством системы секреции IV типа в эукариотические ьслетки около 300 эффекторных белков (Segal G., 2013; Zhu W., Banga S., et al., 2011). Эти молекулы обладают высокоспециализированной биохимической активностью и воздействуют на различные клеточные процессы (везикулярный транспорт, метаболизм фосфолипидов, апоптоз, синтез белка, убиквитинирование и др.), за счет чего бактерия способна как создавать удобную нишу для пролиферации внутри эукариотической клетки, так и убивать ее. Определение функций эффекторов, поиск их мишеней и изучения их взаимодействия приводит к пониманию их роли в развитии инфекции, вызванной патогеном.

Первый бактериальный белок, обладающий глюкозилирующей активностью, был выделен из L. pneumophila штамма Philadelphia-1 и назван Lgtl (Legionella glucosyltransferase J_) (Belyi Y., Popoff M., et al., 2003). Биоинформатический анализ геномов известных штаммов L. pneumophila,

направленный на поиск новых глюкозилирующих эффекторов, показал, что патоген продуцирует целую группу гомологичных глюкозилтрансфераз, и они образуют три семейства: Lgtl, Lgt2 и Lgt3 (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Доставку в клетку-мишень всех представителей глюкозилтрансфераз Lgt осуществляет система секреции IV типа легионелл Dot/Icm (de Felipe К., Glover R., et al., 2008; Hurtado-Guerrero R., Zusman Т., et al., 2010).

Как было показано, синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю. Глюкозилтрансферазы Lgtl и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста в отличие от Lgt3, который определяется в культурах на ранней стадии роста и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Разрешение кристаллической структуры фермента Lgtl значительно способствовало характеристике механизма действия глюкозилтрансферазы, дало возможность выделить три структурных домена белка и отнести Lgtl к глюкозилтрансферазам типа A (Hurdato-Guerrero R., Zusman Т., et al., 2010; Lu W., Du J., et al., 2010).

Все глюкозилтрансферазы L. pneumophila модифицируют эукариотический фактор элонгации 1А и имеют единый сайт глюкозилирования - остаток серина в положении 53 (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). Эукариотический фактор элонгации 1А является одним из самых распространенных белков в клетке и неотъемлемым компонентом аппарата трансляции. Помимо своей основной роли в процессе синтеза белков, фактор элонгации участвует и во многих других жизненно важных клеточных процессах (Mateyak М., Kinzy Т., 2010). В системе in vitro добавление глюкозилтрансфераз Lgt приводит к остановке трансляции, а интоксикация клеток млекопитающих ферментами приводит к цитотоксическому эффекту (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). В какой мере эти нарушения связаны с модификацией фактора элонгации 1 А, остается неясным.

Таким образом, предшествующие исследования, проведенные в первую очередь совместно в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ и Университете Альберта-Людвига (Фрайбург, Германия), привели к значительному прогрессу в понимании различных аспектов функционирования глюкозилирующих эффекторов легионелл. В то же время работы, посвященные изучению субстратной специфичности Lgt и детальной характеристике фактора элонгации 1А как мишени L. pneumophila не проводились. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.

Цели диссертационной работы. Целью работы являлись выявление и характеристика мишени глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila, модификация которой приводит к гибели эукариотических клеток.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

• Осуществить анализ структуры эукариотического фактора элонгации 1А как субстрата, модифицируемого глюкозилтрансферазой Lgtl L. pneumophila;

• С применением компьютерных алгоритмов провести поиск новых потенциальных мишеней для глюкозилтрансферазы Lgtl L. pneumophila и оценить уровень их субстратной активности в реакции глюкозилирования;

• Разработать модель для изучения токсического действия Lgtl с использованием эукариотических микроорганизмов S. cerevisiae;

• Установить роль обнаруженных субстратов глюкозилирования в цитотоксическом эффекте Lgtl на дрожжевой модели.

Научная новизна работы. Впервые показана особенность субстратной специфичности глюкозилирующего эффекторного белка L. pneumophila, заключающаяся в модификации фрагмента белка eEFIA, состоящего из 10 аминокислотных остатков - 50-GKGSFKYAWV-59. Впервые обнаружена новая мишень фермента Lgtl - эукариотический белок Hbsl. Впервые была разработана модельная система дрожжей S. cerevisiae для изучения молекулярных механизмов интоксикации эукариотических клеток глюкозилтрансферазой Lgtl L. pneumophila, а также других ингибиторов белкового синтеза бактериальной природы. С использованием данной модели было установлено, что глюкозилирование именно эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к цитотоксическому эффекту. Впервые показано, что аминокислотные остатки, входящие в распознаваемую Lgtl область фактора элонгации 1А (фенилаланин-54, тирозин-56 и триптофан-58), необходимы как для нормального функционирования эукариотического фактора элонгации, так и для глюкозилирования белковой мишени ферментом легионелл.

Практическое значение работы. Разработана живая система на основе организма S. cerevisiae, позволяющая выявлять новые токсические факторы бактериальной природы, а также моделировать их взаимодействие с соответствующими эукариотическими субстратами in vivo. Разработанная модель может быть использована для поиска новых лечебных (антидотных) препаратов в отношении возбудителей опасных инфекционных заболеваний человека, а также токсинов. Выявление пептида - фрагмента фактора элонгации 1А, - может послужить основой для разработки низкомолекулярного структурного ингибитора реакции глюкозилирования для подавления токсического эффекта Lgt на клетки млекопитающих. По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по

внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Субстратами эффекторной глюкозилтрансферазы Lgtl являются два эукариотических белка-компоненты аппарата трансляции - фактор элонгации eEFlA и Hbsl.

2. Участком узнавания и моноглюкозилирования ферментом Lgtl возбудителя легионеллеза является декапептид с последовательностью GK(G/S)SFKYAWV.

3. Глюкозилирование эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к гибели эукариотических клеток под действием Lgtl. Аминокислотные остатки фактора элонгации 1А F54, Y56 и W58 являются необходимыми не только для узнавания ферментом белковой мишени, но и для выполнения основной функции eEFl А в клетке.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 8-й международной конференции по легионеллезной инфекции (Мельбурн, Австралия, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные статьи в издательствах, рекомендованных ВАК: Tartakovskaya D., Belyi Y., Tais A., Fitzke E.,Tzivelekidis Т., Jank Т., Rospert S., Aktories K. Elongation factor 1A is the target of growth inhibition in yeast caused by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgtl. J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287, № 31. - P. 26029 - 26037; Vertieva E., Kobozev M., Tartakovskaya D., Araslanova V., Belyi Y. Genetic constructions, hyperexpressing

recombinant fragments of cytolethal distending toxin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. World J. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - Vol. 27. - P. 11891196; Тартаковская Д.И., Арасланова В.А., Белый Ю.Ф. Факторы патогенности бактерий с гликозилирующей активностью. Вестник РАМН. - 2011. - 10. 28 - 31 е., а также опубликованы тезисы: «Эукариотические мишени цитотоксической глюкозилтрансферазы Legionella pneumophila», «Дрожжевая модель для изучения токсина Lgtl L. pneumophila и механизмов трансляции эукариотической клетки», "Glucosyltransferases Lgt Legionella pneumophila'''' (Y.Belyi, D.Tartakovskaya, N.Levanova, T.Jank and K.Aktories. 8-я международная конференция по легионеллезной инфекции, Мельбурн, Австралия, 2013).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 128 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 29 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма

L. pneumophila

Факторы вирулентности являются неотъемлемой характеристикой патогенных микробов и определяют их способность вызывать инфекционное заболевание. К факторам, определяющим вирулентность бактерии можно отнести: адгезию, колонизацию, инвазивность, подавление иммунного ответа, токсины и эффекторы (Casadevall A., Pirofski L., 2009). Микробные токсины и эффекторы являются основными факторами вирулентности различных патогенных бактерий. Эффекторы направленно проникают в эукариотические клетки за счет специальных мультибелковых комплексов - систем секреции (Boyer L., Paquette N., et al., 2012). Эффекторные белки способны проявлять свою функциональную активность совместно с множеством других эффекторных белков, которые были доставлены в клетку посредством одной и той же системы секреции. Функциональная активность многих эффекторов зачастую малозаметна и направлена в большей степени на регуляцию клеточных функций, чем на необратимое нарушение клеточного гомеостаза, приводящее к гибели клетки (Galan J., 2009).

Интересной особенностью некоторых эффекторных белков является их способность мимикрировать эукариотические молекулы, используя каталитическую активность и механизм действия белков клетки-хозяина, обеспечивая выполнение своих функций в клетке-мишени (Stebbins С., Galan J., 2001). Помимо этого, многие эффекторы способны проявлять биохимическую активность за счет ковалентной модификации своих клеточных мишеней. Они проявляют ферментативную активность к различным молекулам и отделам клетки-хозяина. К их мишеням относятся: цитоплазматические и ядерные белки,

митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), цитоскелет, плазматическая мембрана и др. Многие эффекторные молекулы способны влиять на сигнальные пути клетки хозяина, ответственные за внутриклеточную репликацию, организацию нуклеосом, межклеточную коммуникацию и иммунный ответ (Geissler В., 2012).

Продукция бактериальных белков строго координируется патогеном и зависит от этапа инфекции. После проникновения эффекторов в эукариотическую клетку, они могут быть доставлены к своим мишеням за счет сигнальных последовательностей или специальных модификаций, которым подвергается бактериальный фактор после попадания в цитозоль клетки-мишени (Rabin J., Veesenmeyer К., et al., 2006; Schlumberger M., Käppeli R., et al., 2007; Zhang Y., Barbieri J., 2005).

Подавляющее большинство известных и охарактеризованных эффекторных молекул транспортируются микробами в клетку-мишень с помощью систем секреции III и IV типа. Система секреции III типа образует белковый комплекс похожий на шприц (с иглой), который называется «инжектосомой» — «injectosome» (Coburn В., Sekirov I., et al., 2007). Эффекторы системы секреции III типа являются важными факторами вирулентности многих патогенных бактерий человека и насекомых. К числу таких бактерий относятся: Р. aeruginosa, Yersinia pestis, S. enteric, Shigella flexneri, Bordetella pertussis, E. coli, Vibrio cholera и Photorhabdus luminescens и др. (Geissler В., 2012). Система секреции IV типа представляет собой мультибелковый комплекс, подобный «инжектосоме» (Cascales Е., Christie Р., 2003). Эффекторы четвертой системы секреции не всегда выделяются непосредственно в цитозоль эукариотической клетки, а также могут секретироваться во внеклеточное пространство или в вакуоли внутри клетки-мишени (Backert S., Meyer T., 2006; Fronzes R., Christie P., et al., 2009). Система секреции IV типа отвечает за доставку токсинов и эффекторов таких

внеклеточных патогенов как: Helicobacter pylori и В.pertussis, а также бактерий, которые реплицируются внутри клетки хозяина, например, Bartonella spp., Coxiella burnetii, Legionella pneumophila (Geissler В., 2012).

1.1.1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila

L. pneumophila - это грамотрицательная подвижная палочковидная бактерия рода Legionella. Бактерия обитает в теплых пресных водоемах и является внутриклеточным паразитом некоторых простейших, например, амебы (Rowbotham Т., 1980). L. pneumophila патогенна для человека и вызывает острую инфекционную пневмонию - легионеллез. Заболевание развивается после попадания в организм человека контаминированной воды из систем кондиционирования воздуха, водопроводной системы, а также при непосредственном попадании амебы, содержащей легионеллу (Muder R., Yu V., et al., 1986). Благодаря способности бактерии проникать и расти в клетках разных видов простейших, легионелла способна успешно инфицировать и размножаться в альвеолярных макрофагах человека (Isberg R., O'Connor Т., et al., 2009).

Движущей силой проникновения Legionella в хозяйскую клетку является естественный клеточный фагоцитоз. В результате фагоцитоза образуется вакуоль, содержащая Legionella. Чтобы избежать деградации вакуоли и создать удобную нишу для пролиферации бактерии, вакуоль претерпевает ряд изменений, превращаясь в органеллу похожую на везикулы ЭР (Рис. 1) (Hubber A., Roy С., 2010).

Созревание вакуоли, содержащей легионеллу (L. pneumophila-containing vacuoles (LCVs)), проходит за счет ее слияния с мембранными компонентами секреторного аппарата клетки-хозяина (Kagan J., Roy С., 2002). Через несколько минут после проникновения бактерии в клетку, вакуоль LCV притягивает к себе

митохондрии и сливается с везикулами ЭР, на что указывает наличие на ней специфических для ЭР белков. В результате мембрана вакуоли LCV истончается и становится более похожей на мембрану везикул ЭР, чем на плазматическую мембрану (Tilney L., Harb О., et al., 2001). Через несколько часов после фагоцитоза, мембрана вакуоли LCV полностью состоит из мембранных компонентов шероховатого ЭР. Затем происходит инициация репликации бактерии внутри вакуоли, в которой поддерживается нейтральный pH (Wieland Н., Goetz F., et al., 2004). Питательная среда вакуоли достаточно бедная, но содержит необходимое количество аминокислот и нутриентов для эффективного деления и размножения бактерии. В результате образуется вакуоль, содержащая множество клеток бактерий, которая ассоциирована с рибосомами и содержимое ее не подвергается закислению (Newton Н. J., Ang D.K., et al., 2010).

Рис. 1. Жизненный цикл L. pneumophila и биогенез репликативной вакуоли LCV. 1. 5 минут после заражения. 2. 30 минут после заражения. 3. 4-6 часов после заражения. 4. 14 часов после заражения.

Важнейшим шагом в развитии инфекции является способность внутриклеточного патогена покидать клетку хозяина после остановки его репликации для заражения новых клеток. Существуют факты, которые подтверждают наличие регуляции выхода легионеллы из инфицированной клетки

(Newton H. J., Ang D.K., et al., 2010). Возможно, активация цитолизинов играет роль в формировании пор в мембране клетки и ее последующем лизисе. Бактерия способна использовать различные механизмы выхода из инфицированных клеток, в зависимости от природы организма хозяина и окружающих условий (Hubber А., Roy С., 2010).

Способность бактерии, заключенной во внутриклеточную вакуоль, регулировать клеточные процессы клетки-хозяина обусловлена наличием специфической системы. В случае L. pneumophila этой системой является система секреции IV типа (Dot/Icm система), которая представляет собой крупный мультибелковый комплекс (Segal G., Shuman Н., 1998; Vogel J. P., Andrews H. L., et al., 1998; Segal G., Russo J., et al., 1999). Для эффективного формирования репликативной вакуоли и успешного внутриклеточного размножения L. pneumophila использует около 27 генов группы dot/icm (defect in organelle trafficking/ intracellular multiplication) (Vogel J. P., Andrews H. L., et al., 1998). Мутации в генах группы dot/icm приводят к неправильной сборке везикул ЭР на вакуоли. Большинство предполагаемых продуктов генов dot/icm гомологичны компонентам бактериального конъюгативного аппарата передачи ДНК (Komano Т., Yoshida Т., et al., 2000). При участии системы Dot/Icm L. pneumophila способна передавать генетический материал в другие бактериальные клетки, что указывает на возможность этой системы переносить макромолекулы в клетки-мишени. И действительно, система секреции Dot/Icm транспортирует в клетку хозяина более 270 эффекторных белков, включая белки, схожие с эукариотическими и способные участвовать в различных клеточных процессах (Newton Н. J., Ang D.K., et al., 2010).

1.1.2. Эффекторные белки L. pneumophila

Эффекторные белки системы секреции IV типа L. pneumophila можно разделить на несколько групп на основании их биохимических функций и роли в клетке-мишени (Таб. 1).

Регуляция везикулярного транспорта

К первой группе можно отнести эффекторы, которые нарушают транспорт везикул за счет взаимодействия с компонентами везикулярного транспорта эукариотической клетки - низкомолекулярными ГТФазами. При этом эффекторные белки способны эффективно конкурировать со своими эукариотическими аналогами. ГТФазы регулируют везикулярный транспорт в эукариотической клетке за счет образования активной формы при связывании с ГТФ и неактивной формы при связывании с ГДФ в процессе, который называется - цикл ГТФаз. Взаимодействие эффекторов с этими компонентами везикулярного транспорта позволяет L. pneumophila обеспечивать успешное формирование репликативной вакуоли LCV. Эффекторы Legionella способны специфически активировать и инактивировать такие ГТФ-связывющие белки, как Arfl, Rabl и др. (Derre I., Isberg R., 2004).

Субстрат системы секреции Dot/Icm - белок RalF является фактором активации АДФ-рибозилирующего белка Arfl (Nagai Н., Kagan J., et al., 2002). Низкомолекулярная ГТФаза Rabl является мишенью нескольких эффекторных белков L.pneumophila - SidM (DrrA), LidA, LepB, SidD, AnkX и Lem3 (Ingmundson A., Delprato A., et al., 2007; Machner M.P., Isberg R.R., 2007; Murata Т., Delprato A., et al., 2006; Schoebel S., Cichy A. L., et al., 2011; Neunuebel M. R., Chen Y., et al., 2011; Tan Y., Luo Z. Q., 2011).

Эффекторные белки L. pneumophila: VipD, VipE, YlfB, LegC3 и YlfA, нарушают везикулярный транспорт клетки-мишени, но биохимическая функция этих белков к настоящему времени не установлена (Isberg R., O'Connor Т., et al., 2009). Для некоторых эффекторов биохимическая роль может быть известна, но клеточная мишень не найдена. Например, эффекторный белок L. pneumophila Set А влияет на процессы секреторного транспорта и обладает глюкозилтрансферазной активностью. Однако молекулярная мишень его ферментативной активности неизвестна (Heidtman М., Chen Е. J., et al., 2009).

Все вышеперечисленные модификации низкомолекулярных ГТФаз происходят сразу после проникновения патогена в клетку-мишень. Комплексное воздействие эффекторов позволяет L. pneumophila контролировать везикулярный транспорт и все активности ГТФаз для «захвата» клетки-мишени.

Взаимодействие эффекторов с фосфолипидами

Важной ролью в функционировании многих эффекторных белков системы Dot/Icm является их локализация на мембране вакуоли LCV за счет взаимодействия с молекулами фосфолипидов. Эти молекулы являются глицеролипидами и принимают активное участие во многих клеточных процессах, в том числе в клеточных сигнальных путях и везикулярном транспорте. Продукт модификации фосфатидилинозитола - фосфатидилинозитол-4-фосфат в большом количестве расположен на поверхности вакуоли LCV, хотя обычно местом его локализации служит система Гольджи, в которой он играет роль вторичного посредника, координируя экспорт секреторных везикул из ЭР. Эффекторные молекулы SidC и его гомолог SdcA закреплены на мембране LCV за счет специфического связывания с молекулой фосфатидилинозитол-4-фосфата (Weber S. S., Ragaz С., et al., 2006; Ragaz С., Pietsch H., et al., 2008). Для двух других эффекторов L. pneumophila -SidM и LidA, показано высокое сродство к

предшественникам фосфатидилинозитола (Brombacher Е., Urwyler S., et al, 2009). Эти примеры указывают на способность L. pneumophila контролировать фосфолипиды для формирования внутриклеточной вакуоли за счет присоединения к ее мембране множества эффекторов и эукариотических белков (Newton Н. J., Ang D.K., et al., 2010).

Воздействие эффекторов на трансляционный аппарат клетки-мишени

К еще одной группе эффекторов L. pneumophila относятся недавно открытые белки, которые способны вызывать цитотоксичный эффект в отношении клетки хозяина. К этой группе относятся глюкозилтрансферазы Lgtl, Lgt2, Lgt3, которые действуют на трансляционный аппарат клетки-мишени, а именно на фактор элонгации eEFIA (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). Для другого субстрата системы секреции Dot/Icm - эффектора SidI, выявлена его способность связываться с фактором элонгации eEFIA и eEFlBy, что, как следствие, приводит к аресту белкового синтеза в клетке хозяина (Shen X., Banga S., 2009). Этот пример демонстрирует возможность патогена L. pneumophila модифицировать один и тот же процесс в эукариотической клетки посредством нескольких эффекторов, имеющих независимый механизм действия (Newton Н. J., Ang D.K., et al., 2010).

Подавление апоптоза

Рост и размножение бактерии внутри макрофага является результатом борьбы эукариотической клетки за выживание. Для внутриклеточной репликации патогену L. pneumophila необходимо поддерживать клетку-мишень в живом состоянии, несмотря на наличие токсических продуктов жизнедеятельности микроба и ответа иммунной системы эукариотической клетки. Несмотря на то, что L. pneumophila способна индуцировать клеточную смерть путем активации каспазы-3 (Gao L. Y., Abu Kwaik Y., 1999), она также способна подавлять апоптоз

до поздней стадии инфекции (Abu-Zant A., Jones S., et al., 2007). Эффектор L. pneumophila LegKl участвует в активации фактора транскрипции NF-kB за счет фосфорилирования его ингибитора - белка IkB (Ge J., Xu H., et al., 2009). Для других эффекторов четвертой транспортной системы легионелл - белков SdbA и LubX, показано участие в активации NF-kB, но механизм их действия неизвестен. Эффекторы SdhA и SidF играют прямую роль в остановке клеточной гибели клетки-мишени во время инфекции, но механизм действия белка SdhA неясен (Laguna R. К., Creasey Е. A., et al., 2006). Белок SidF останавливает апоптоз за счет связывания с двумя белками-регуляторами апоптоза семейства Bcl-2: BNIP3 и Bcl-rambo (Banga S., Gao P., et al., 2007).

Мимикрия комплекса убиквитинирования белков

К еще одной группе эффекторов Dot/Icm относятся белки, родственные компонентам системы убиквитинирования белков эукариотической клетки. Такие субстраты Dot/Icm содержат эукариотический домен F, который участвует в специфическом связывании белка-мишени с лигазным комплексом убиквитинирования. Эффектор LubX функционирует как убиквитин-лигаза в модификации киназы Clkl. Хотя и неизвестно, как активность эффекторного белка LubX способствует развитию инфекции, отсутствие киназы Clkl снижает уровень внутриклеточной репликации L. pneumophila (Kubori, 2008). Эффекторный белок AnkB координирует локализацию убиквитинированных белков на поверхности вакуоли LCV и является необходимым для внутриклеточной репликации бактерии. Белок AnkB связывается с белком Skpl, который входит в состав лигазного комплекса убиквитинирования, а также влияет на убиквитинирование и деградацию белка фокальной адгезии ParvB. В эукариотических клетках, в которых отсутствуют белки Skpl и ParvB, понижен уровень репликации L. pneumophila, что свидетельствует о возможном участии этих белков в биогенезе вакуоли LCV (Price С. Т., Al-Khodor S., et al., 2009).

Идентификация и анализ субстратов системы секреции Ио^ст существенно облегчает изучение патогенеза заболевания. В связи с этим поиск эффекторных молекул является приоритетной задачей во многих лабораториях мира.

Таблица 1. Эффекторные белки L. pneumophila и их функции.

Эффекторный белок Функция/описание

AnkB присоединяет убиквитинированные белки к вакуоли LCV связывается с белком Skp 1 участвует в убиквитинировании белка фокальной адгезии ParvB

AnkX фосфохолинтрансфераза взаимодействует с компонентом цитоскелета клетки - микротрубочками влияет на везикулярный транспорт

LegKl активирует фактора транскрипции NF-kB фосфорилирует белок IkB - ингибитор фактора транскрипции NF-kB

Lem3 переносит остаток фосфохолина с модифицированной молекулы

LepB белок-активатор ГТФаз ускоряет гидролиз ГТФ на белке Rabí инактивирует Rabí

Lgtl глюкозилтрансфераза модифицирует фактор элонгации eEFlA

Lgt2, Lgt3 глюкозилтрансфераза модифицирует фактор элонгации eEFlA

LidA связывает белок Rab 1, обеспечивая его нахождения на вакуоли LCV

LubX убиквитинирует киназу Clkl

RalF активирует АДФ-рибозилирующий фактор Arfl участвует в формировании вакуоли LCV

SdbA LubX активация фактора транскрипции NF-kB

SdhA останавливает апоптоз клетки-мишени

SetA глюкозилтрансфераза нарушает везикулярный транспорт

SidC SdcA закреплены на мембране LCV за счет связывания с фосфатидилинозитол-4-фосфатом

SidF связывается с белками-регуляторами апоптоза семейства Bcl-2: BNIP3 и Bcl-rambo

SidI связывается с факторами элонгации eEFlA и eEFlBy

SidM (DrrA) фактор активации Rabí за счет замены ГДФ на ГТФ активность фактора ингибитора диссоциации ГДФ активность АМФ-трансферазы

Похожие диссертационные работы по специальности «Микробиология», 03.02.03 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тартаковская, Дина Игоревна, 2014 год

Список использованной литературы

1. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.:Высшая школа, 1990. - 352 с.

2. Садретдинова, О. В. Распространение глюкозилтрансферазы Lgt среди штаммов Legionella pneumophila, выделенных из различных источников / О. В. Садретдинова, К. Люк, Т. И. Карпова, Ю. Ф. Белый, И. С. Тартаковский // ЖМЭИ. — 2012. - 3. 8 - 12 с.

3. Abu-Zant, A. Anti-apoptotic signalling by the Dot/Icm secretion system of L. pneumophila I A. Abu-Zant, S. Jones, R. Asare, J. Suttles, C. Price, J. Graham, Y. Kwaik // Cell. Microbiol. - 2007. - Vol. 9, №1. - P. 246 - 264.

4. Alegado, R. A. Characterization of mediators of microbial virulence and innate immunity using the Caenorhabditis elegans host-pathogen model / R. A. Alegado, M. C.Campbell, W. C.Chen, S. S. Slutz, W. C. Tan // Cell. Microbiol. - 2003. Vol. 5, №7. - P. 435 - 444.

5. Amimoto, K. A novel toxin homologous to large clostridial cytotoxins found in culture supernatant of Clostridium perfringens type С / К. Amimoto, Т. Noro, E. Oishi, M. Shimizu//Microbiology. -2007. Vol.153. - P. 1198 - 1206.

6. Andersen G. R. Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in the yeast elongation factor complex eEFlA:eEFlBalpha / G. R. Andersen, L. Pedersen, L. Valente, I. Chatterjee, T. G. Kinzy, M. Kjeldgaard, J. Nyborg // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 6, №5. - P. 1261 - 1266.

7. Backert, S. Type IV secretion systems and their effectors in bacterial pathogenesis / S. Backert, T. Meyer // Curr. Opin. Microbiol. - 2006. - Vol. 9, №2.-P. 207-217.

8. Banga, S. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 proteinfamily / S. Banga, P. Gao, X. Shen, V. Fiscus, W. X. Zong, L. Chen, Z. Q. Luo // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. -2007.-Vol. 104, №12.-P. 5121-5126.

9. Bartlett, J. G. Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection / J. G. Bartlett, D. N. Gerding I I Clin. Infect. Dis. - 2008. Vol. 46, Suppl 1. - P. 12-18.

10. Beltrao, P. Evolution of phosphoregulation: comparison of phosphorylation patterns across yeast species / P. Beltrao, J. C. Trinidad, D. Fiedler, A. Roguev, W. A. Lim, K. M. Shokat, A. L. Burlingame, N. J. Krogan // PLoS. Biol. - 2009. -Vol. 7, №6.-P. el000134.

11.Belyi Y., Effector glycosyltransferases in Legionella / Y. Belyi, T. Jank, K. Aktories // Front. Microbiol. - 2011.- Vol. 2. - P. 76.

12.Belyi, I. Purification and characterization of a UDP-glucosyltransferase produced by Legionella pneumophila / I. Belyi, M. R. Popoff, and N. P. Cianciotto // Infect Immun. -2003.-Vol. 71.-P. 181 - 186.

13. Belyi, Y. Bacterial toxin and effector glycosyltransferases / Y. Belyi, K. Aktories // Biochim. Biophys. Acta. -2010. - Vol. 1800, № 2. - P. 134 - 143.

14.Belyi, Y. Legionella pneumophila glucosyltransferase inhibits host elongation factor 1A / Y. Belyi, R. Niggeweg, B. Opitz, M. Vogelsgesang, S. Hippenstiel, M. Wilm, K. Aktories // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2006. - Vol. 103. - P. 16953- 16958.

15. Belyi, Y. Legionella pneumophila glucosyltransferase inhibits host elongation factor 1A / Y. Belyi, R. Niggeweg, B. Opitz, M. Vogelsgesang, S. Hippenstiel,

M. Wilm, K. Aktories // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. - Vol. 103. - P. 16953- 16958.

16.Belyi, Y. Lgt: a family of cytotoxic glucosyltransferases produced by Legionella pneumophila / Y. Belyi, I. Tabakova, M. Stahl, K. Aktories // J. Bacteriol. -2008. - Vol. 190. - P. 3026 - 3035.

17.Belyi, Y. Region of elongation factor 1A1 involved in substrate recognition by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgtl: identification of Lgtl as a retaining glucosyltransferase / Y. Belyi, M. Stahl, I. Sovkova, P. Kaden, B. Luy, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284, №30. - P. 20167 - 20174.

18. Botham, C. M. A transgenic Drosophila model demonstrates that the Helicobacter pylori CagA protein functions as a eukaryotic Gab adaptor / C. M. Botham, A. M. Wandler, K. Guillemin // PLoS. Pathog. - 2008. Vol. 4, №5. - P. el000064.

19.Botstein, D. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology / D. Botstein, G. R. Fink // Genetics. - 2011. - Vol. 189, №3. - P. 695 - 704.

20.Boyer, L. Bacterial effectors: learning on the fly / L. Boyer, N. Paquette, N. Silverman, L. Stuart // Adv. Exp. Med. Biol. - 2012. - Vol. 710. - P. 29 - 36.

21. Breton, C. Structures and mechanisms of glycosyltransferases / C. Breton, L. Snajdrova, C. Jeanneau, J. Koca, A. Imberty // Glycobiology. - 2006. Vol. 16, №2.-P. 29R-37R.

22. Brombacher, E. Rabl guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-

binding effectorprotein of Legionella pneumophila / E. Brombacher, S. Urwyler, C. Ragaz, S. S. Weber, K. Kami, M. Overduin, H. Hilbi // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284, №8. - P. 4846 - 4856.

23.Browne, G. J. Regulation of peptide-chain elongation in mammalian cells / G. J. Browne, C. G. Proud // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269, №22. - P. 5360 -5368.

24.Briiggemann, H. Adaptation of Legionella pneumophila to the host environment :role of protein secretion, effectors and eukaryotic-like proteins / H. Bruggemann, C. Cazalet, C. Buchrieser // Curr. Opin. Microbiol. - 2006. Vol. 9, №1. - P. 86-94.

25. Campodonico, E. M. A yeast genetic system for the identification and characterization of substrate proteins transferred into host cells by the Legionella pneumophila Dot/Icm system / E. M. Campodonico, L. Chesnel, C. R. Roy // Mol. Microbiol. -2005. Vol. 56, №4. - P. 918-933.

26.Carlson, J. H. Polymorphisms in the Chlamydia trachomatis cytotoxin locus associated with ocular and genital isolates / J. H. Carlson, S. Hughes, D. Hogan, G. Cieplak, D. E. Sturdevant, G. McClarty, H. D.Caldwell, R. J. Belland // Infect. Immun. - 2004. Vol. 72, №12. - P. 7063 - 7072.

27.Carr-Schmid, A. Novel G-protein complex whose requirement is linked to the translational status of the cell / A. Carr-Schmid, C. Pfund, E. A. Craig, T. G. Kinzy // Mol. Cell. Biol. - 2002. Vol. 22, №8. - P. 2564 - 2574.

28.Casadevall, A. Virulence factors and their mechanisms of action: the view from a damage-response framework / A. Casadevall, L. Pirofski // J. Water Health -2009.-Vol. 7.-P. 2-18.

29. Cascales, E. The versatile bacterial type IV secretion systems / E. Cascales, P. Christie // Nat. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol. 1, №2. - P. 137 - 149.

30.Cavallius, J. Site-directed mutagenesis of yeast eEFl A. Viable mutants with altered nucleotide specificity / J. Cavallius, W.C. Merrick // J. Biol. Chem. -1998. Vol. 273, №44. - P. 28752 - 28758.

31. Coburn, B. Type III secretion systems and disease / B. Coburn, I. Sekirov, B. Finlay // Clin. Microbiol. Rev. - 2007. - Vol. 20, №4. - P. 535 - 549.

32. Curak, J. Yeast as a tool to study bacterial effectors / J. Curak, J. Rohde, I. Stagljar // Curr. Opin. Microbiol. - 2009. Vol. 12, №1. - P. 18 - 23.

33.de Felipe, K. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking / K. de Felipe, R. Glover, X. Charpentier, O. Anderson, M. Reyes, C. Pericone, H. Shuman // PLoS. Pathog. - 2008. - Vol. 4, №8. - P. elOOOl 17.

34.de Felipe, K. S. Evidence for acquisition of Legionella type IV secretion substrates via interdomain horizontal gene transfer / K. S. de Felipe, S. Pampou, O. S. Jovanovic, C. D. Pericone, S. F. Ye, S. Kalachikov, H. A. Shuman // J. Bacteriol. - 2005. - Vol. 187, №27. - P. 7716 - 7726.

35. DeRisi, J. L. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale / J. L. DeRisi, V. R. Iyer, P. O. Brown // Science. - 1997. Vol. 278, №5338.-P. 680-686.

36. Derre, I. Legionella pneumophila replication vacuole formation involves rapid recruitment of proteins of the early secretory system / I. Derre, R. Isberg // Infect. Immun. - 2004. - Vol. 72, №5. - P. 3048 - 3053.

37. Derre, I. LidA, a translocated substrate of the Legionella pneumophila type IV secretion system, interferes with the early secretory pathway / I. Derre, R. R. Isberg // Infect. Immun. - 2005. Vol. 73, №7. - P. 4370 - 4380.

38.Diederen, B. Legionella spp. and Legionnaires' disease / B. Diederen // J. Infect. - 2008. - Vol. 56, №1. - P. 1 - 12.

39.Fields, B. Legionella and Legionnaires' Disease: 25 Years of Investigation / B. S. Fields, R. F. Benson, R. E. Besser // Clin. Micr. Rew. - 2002. - Vol. 15, №3. - P. 506-526.

40. Fronzes, R. The structural biology of type IV secretion systems / R. Fronzes, P. Christie, G. Waksman // Nat. Rev. Microbiol. - 2009. - Vol. 7, №10. - P. 703 -714.

41. Galán, J. Common themes in the design and function of bacterial effectors / J. Galán // Cell. Host. Microbe. - 2009. - Vol. 5, №6. - P. 571 - 579.

42. Gao, L. Y. Activation of caspase 3 during Legionella pneumophila-induced apoptosis / L. Y. Gao, Y. Abu Kwaik // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, №9.-P. 4886-4894.

43. Ge, J. A Legionella type IV effector activates the NF-kappaB pathway by phosphorylating the IkappaB family of inhibitors / J. Ge, H. Xu, T. Li, Y. Zhou, Z. Zhang, S. Li, L. Liu, F. Shao // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2009. - Vol. 106, №33. - P. 13725 - 13730.

44. Geissler, B. Bacterial toxin effector-membrane targeting: outside in, then back again / B. Geissler // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2012. - Vol. 2, №75. - P. 1 -13.

45. Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection / D. M. Gelperin, M. A. White, M. L. Wilkinson, Y. Kon, L. A. Kung, K. J. Wise, N. Lopez-Hoyo, L. Jiang, S. Piccirillo, H. Yu, M. Gerstein, M. E. Dumont, E. M. Phizicky, M. Snyder, E. J. Grayhack // Genes. Dev. - 2005. Vol. 19, №23. - P. 2816 - 2826.

46. Ghaemmaghami, S. Global analysis of protein expression in yeast / S. Ghaemmaghami, W. K. Huh, K. Bower, R. W. Howson, A. Belle, N. Dephoure, E. K. O'Shea, J. S. Weissman // Nature. - 2003. Vol. 425, №6959. - P. 737 - 741.

47. Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome / G. Giaever, A. M. Chu, L. Ni, C. Connelly, L. Riles, S. Veronneau, et al. // Nature. -2002. Vol. 418, №6896.-P. 387-391.

48. Goffeau, A. Life with 6000 genes / A. Goffeau, B. G. Barrell, H. Bussey, R. W. Davis, B. Dujon, H. Feldmann, F. Galibert, J. D. Hoheisel, C. Jacq, M. Johnston, E. J. Louis, H. W. Mewes, Y. Murakami, P. Philippsen, H. Tettelin, S. G. Oliver // Science. - 1996. Vol. 274, №5287. - P. 563 - 567.

49. Goody, P.R. Reversible phosphocholination of Rab proteins by Legionella pneumophila effector proteins / P.R. Goody, K. Heller, L.K. Oesterlin, M.P. Muller, A. Itzen, R.S. Goody // EMBO. J. - 2012. - Vol. 31, №7. - P. 1774 -1784.

50. Guttenberg, G. Molecular characteristics of Clostridium perfringens TpeL toxin and consequences of mono-O-GlcNAcylation of Ras in living cells / G. Guttenberg, S. Hornei, T. Jank, C. Schwan, W. Lu, O. Einsle, P. Papatheodorou, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 2012. Vol. 287, №30. - P. 24929 - 24940.

51. Hayward, R. D. Exploiting pathogenic Escherichia coli to model transmembrane receptor signaling / R. D. Hayward, J. M. Leong, V. Koronakis, K. G. Campellone // Nat. Rev. Microbiol. - 2006. Vol. 4, №5. - P. 358 - 370.

52. Heidtman, M. Large-scale identification of Legionella pneumophila Dot/Icm substrates that modulate host cell vesicle trafficking pathways / M. Heidtman, E. J. Chen, M. Y. Moy, R. R. Isberg // Cell. Microbiol. - 2009. - Vol. 11, №2. - P. 230-248.

53. Higashide, W. Involvement of SipA in modulating actin dynamics Salmonella invasion into cultured epithelial cells / W. Higashide, S. Dai, V. P. Hombs, D. Zhou I I Cell. Microbiol. - 2002. Vol. 4, №6. - P. 357 - 365.

54. Hubber, A. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors / A. Hubber, C. Roy I I Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. -2010.-Vol. 26.-P. 261 -283.

55. Huh, W. K. Global analysis of protein localization in budding yeast / W. K. Huh, J. V. Falvo, L. C. Gerke, A. S. Carroll, R. W. Howson, J. S. Weissman, E. K. O'Shea // Nature. - 2003. Vol. 425, №6959. - P. 686 - 691.

56. Hurtado-Guerrero, R. Molecular mechanism of elongation factor 1A inhibition by a Legionella pneumophila glycosyltransferase / R. Hurtado-Guerrero, T. Zusman, S. Pathak, A. Ibrahim, S. Shepherd, A. Prescott, G. Segal, D. van Aalten // Biochem. J. - 2010. - Vol. 426, №3. - P. 281- 292.

57.Hurtado-Guerrero, R. Molecular mechanism of elongation factor 1A inhibition by a Legionella pneumophila glycosyltransferase / R. Hurtado-Guerrero, T. Zusman, S. Pathak, A. F. Ibrahim, S. Shepherd, A. Prescott, G. Segal, D. M. van Aalten // Biochem. J. - 2010. Vol. 426, №3. - P. 281 - 292.

58. Ingmundson, A. Legionella pneumophila proteins that regulate Rabl membrane cycling / A. Ingmundson, A. Delprato, D. Lambright, C. Roy // Nature. - 2007. -Vol. 450, №7168. - P. 365 - 369.

59.1sberg, R. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells / R. R. Isberg, T. J. O'Connor, M. Heidtman // Nat. Rev. Microbiol. - 2009. - Vol. 7, №1. - P. 13 - 24.

60.Jank, T. Exchange of a single amino acid switches the substrate properties of RhoA and RhoD toward glucosylating and transglutaminating toxins / T. Jank,

U. Pack, T. Giesemann, G. Schmidt, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281, №28.-P. 19527- 19535.

61. Just, I. Large clostridial cytotoxins /1. Just, R. Gerhard // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 2004. Vol. 152. - P. 23 - 47.

62.Kagan, J. Legionella phagosomes intercept vesicular traffic from endoplasmic reticulum exit sites / J. Kagan, C. Roy I I Nat. Cell. Biol. - 2002. - Vol. 4, №12. -P. 945 - 954.

63.Klapproth, J. M. A large toxin from pathogenic Escherichia coli strains that inhibits lymphocyte activation / J. M. Klapproth, I. C. Scaletsky, B. P. McNamara, L. C. Lai, C. Malstrom, S. P. James, M. S. Donnenberg // Infect. Immun.-2000. Vol. 68, №4.-P. 2148-2155.

64. Komano, T. The transfer region of Incll plasmid R64: similarities between R64 tra and Legionella icm/dot genes / T. Komano, T. Yoshida, K. Narahara, N. Furuya // Mol. Microbiol. - 2000. - Vol. 35, №6. - P. 1348 - 1359.

65. Kramer, R. W. Yeast functional genomic screens lead to identification of a role for a bacterial effector in innate immunity regulation / R. W. Kramer, N. L. Slagowski, N. A. Eze, K. S. Giddings, M. F. Morrison, K. A. Siggers, M. N. Stambach, C. F. Lesser // PLoS. Pathog. - 2007. Vol. 3, №2. - P. e21.

66. Ku, B. VipD of Legionella pneumophila targets activated Rab5 and Rab22 to to interfere with endosomal trafficking inmacrophages / B. Ku, K. H. Lee, W. S. Park, C. S. Yang, J. Ge, S. G. Lee, S. S. Cha, F. Shao, W. D. Heo, J. U. Jung, B. H. Oh // PLoS. Pathog. - 2012. - Vol. 8, №12. - P. el003082.

67. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4/ U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680 - 685.

68. Laguna, R. K. A Legionella pneumophila - translocated substrate that is required for growth within macrophages and protectionfrom host cell death / R. K. Laguna, E. A. Creasey, Z. Li, N. Valtz, R. R. Isberg // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A.-2006.-Vol. 103, №49.-P. 18745- 18750.

69. Lairson, L. L. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms / L. L. Lairson, B. Henrissat, G. J. Davies, S. G. Withers // Annu. Rev. Biochem. -2008. Vol. 77.-P. 521 -555.

70. Lesser, C. F. Expression of microbial virulence proteins in Saccharomyces cerevisiae models mammalian infection / C. F. Lesser, S. I. Miller // EMBO. J. -2001. Vol. 20, №8. - P. 1840 - 1849.

71.Lu, W. Structural basis of the action of glucosyltransferase Lgtl from Legionella pneumophila / W. Lü, J. Du, M. Stahl, T. Tzivelekidis, Y. Belyi, S. Gerhardt, K. Aktories, O. Einsle // J. Mol. Biol. - 2010. - Vol. 396, №2. - P. 321 - 331.

72.Machner, M. A bifunctional bacterial protein links GDI displacement to Rabl activation / M.P. Machner, RR Isberg // Science. - 2007. - Vol. 318, №5852. -P. 974-977.

73.Mager, W.H. Stress response of yeast / W.H. Mager, P.M. Ferreira // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 290 - P. 1-13.

74.Mateyak, M. eEFIA: thinking outside the ribosome / M. Mateyak, T. Kinzy // J. Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285, №28. - P. 21209 - 21213.

75.Muder, R. Mode of transmission of Legionella pneumophila. A critical review / R. Müder, V. Yu, A. Woo // Arch. Intern. Med. - 1986. - Vol. 146, №8. - P. 1607-1612.

76. Mukherjee, S. Modulation of Rab GTPase function by a protein phosphocholine transferase / S. Mukherjee, X.Liu, K. Arasaki, J. McDonough, J.E. Galán, C. R. Roy // Nature. - 2011. - Vol. 477, №7362. - P. 103-106.

77. Murata, T. The Legionella pneumophila effector protein DrrA is a Rabl guanine nucleotide-exchange factor / T. Murata, A. Delprato, A. Ingmundson, D.K. Toomre, D.G. Lambright, C.R. Roy // Nat. Cell. Biol. - 2006. - Vol. 8, №9. -P. 971 -977.

78. Nagai, H. A bacterial guanine nucleotide exchange factor activates ARF on Legionella phagosomes / H. Nagai, J. Kagan, X. Zhu, R. Kahn, C. Roy // Science. - 2002. - Vol. 295. - P. 679 - 682.

79. Neunuebel, M. R. De-AMPylation of the small GTPase Rabl by the pathogen Legionella pneumophila / M. R. Neunuebel, Y. Chen, A.H. Gaspar, P.S. Backlund, A. Yergey, M.P. Machner // Science. - 2011. - Vol. 333, №6041. -P. 453-456.

80.Newton, H.J. Molecular pathogenesis of infections caused by Legionella pneumophila / H. J. Newton, D. K. Ang, I. R.van Driel, E. L. Hartland // Clin. Microbiol. Rev. -2010. - Vol. 23. - P. 274 - 298.

81.Ninio, S. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila', strength in numbers / S. Ninio, C. R. Roy // Trends Microbiol. - 2007. - Vol. 15, № 8. - P. 372-380.

82.Noble, C. G. Structural studies of elongation and release factors / C. G. Noble, H. Song // Cell. Mol. Life. Sci. - 2008. - Vol. 65, №9. - P. 1335 - 1346.

83. O'Connor T. J. Aggravating genetic interactions allow a solution to redundancy in a bacterial pathogen / T. J. O'Connor, D. Boyd, M. S. Dorer, R. R. Isberg // Science. - 2012. - Vol. 338, №6113. - P. 1440 - 1444.

84. Piers, K. L. Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of yeast / K. L. Piers, J. D. Heath, X. Liang, K. M. Stephens, E. W. Nester // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. Vol. 93, №4. - P. 1613 - 1618.

85.Pittman, Y. R. Coordination of eukaryotic translation elongation factor 1A (eEFIA) function in actin organization and translation elongation by the guanine nucleotide exchange factor eEFlBalpha / Y. R. Pittman, K. Kandl, M.Lewis, L. Valente, T. G. Kinzy // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284, №7. - P. 4739 -4747.

86. Price, C. T. Molecular mimicry by an F- box effector of Legionella pneumophila hijacks a conserved polyubiquitination machinery within macrophages and protozoa / C. T. Price, S. Al-Khodor, T. Al-Quadan, M. Santic, F. Habyarimana, A. Kalia, Y. A. Kwaik // PLoS. Pathog. -2009. - Vol. 5, №12. - P. el000704.

87.Ptacek, J. Global analysis of protein phosphorylation in yeast / J. Ptacek, G. Devgan, G. Michaud, H. Zhu, X. Zhu, J. Fasolo et al. // Nature - 2005. - Vol. 438, №7068.-P. 679-684.

88.Rabin, S. A C-terminal domain targets thq Pseudomonas aeruginosa cytotoxin ExoU to the plasma membrane of host cells / S. Rabin, J. Veesenmeyer, K. Bieging, A. Hauser // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74. - P. 2552 - 2561.

89. Rabin, S. D. Pseudomonas aeruginosa ExoU, a toxin transported by the type III secretion system, kills Saccharomyces cerevisiae / S. D. Rabin, A. R. Hauser//Infect. Immun. -2003. Vol. 71, №7. - P. 4144-4150.

90. Ragaz, C. The Legionella pneumophila phosphatidylinositol-4 phosphate-binding type IV substrate SidC recruits endoplasmic reticulum vesicles to a replication-permissive vacuole / C. Ragaz, H. Pietsch, S. Urwyler, A. Tiaden, S. S. Weber, H. Hilbi // Cell. Microbiol. - 2008. - Vol. 10, №12. - P. 2416 - 2433.

91. Rodríguez-Pachón, J. M. A novel connection between the yeast Cdc42 GTPase and the Slt2-mediated cell integrity pathway identified through the effect of secreted Salmonella GTPase modulators / J. M. Rodríguez-Pachón, H. Martin, G. North, R. Rotger, C. Nombela, M. Molina // J. Biol. Chem. - 2002. Vol. 277, №30.-P. 27094-27102.

92. Rohde, J. R. Type III secretion effectors of the IpaH family are E3 ubiquitin ligases / J. R. Rohde, A. Breitkreutz, A. Chenal, P. J. Sansonetti, C. Parsot // Cell. Host. Microbe. - 2007. Vol. 1, № 1. - P. 77 - 83.

93.Rowbotham, T. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae / T. Rowbotham // J. Clin. Pathol. — 1980. - Vol. 33, №12. - P. 1179 - 1183.

94.Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989

95. Sato, H. The mechanism of action of the Pseudomonas aeruginosa-encoded type III cytotoxin, ExoU / H. Sato, D. W.Frank, C. J. Hillard, J. B. Feix, R. R. Pankhaniya, K. Moriyama, V. Finck-Barban5on, A. Buchaklian, M. Lei, R. M. Long, J. Wiener-Kronish, T. Sawa // EMBO. J. - 2003. Vol. 22, №12.-P. 2959-2969.

96.Schlumberger, M. Two newly identified SipA domains (Fl, F2) steer effector protein localization and contribute to Salmonella host cell manipulation / M.

Schlumberger, R. Kâppeli, M. Wetter, A. Mailer, B. Misselwitz, S. Dilling, M. Kremer, W. Hardt // Mol. Microbiol. - 2007. - Vol. 65, №3. - P. 741 - 760.

97. Schoebel, S. Protein LidA from Legionella is a Rab GTPase supereffector / S. Schoebel, A.L. Cichy, R.S. Goody, A. Itzen // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -2011.-Vol. 108, №44.-P. 17945-17950.

98. Segal, G. How is the intracellular fate of the Legionella pneumophila phagosome determined / G. Segal, H. Shuman // Trends. Microbiol. - 1998. - Vol. 6, №7. -P. 253-255.

99. Segal, G. Identification of legionella effectors using bioinformatic approaches /

G. Segal // Methods Mol. Biol. - 2013. Vol. 954. - P. 595 - 602.

100. Segal, G. Relationships between a new type IV secretion system and the icm/dot virulence system of Legionella pneumophila / G. Segal, J. Russo,

H. Shuman // Mol. Microbiol. - 1999. - Vol. 34, №4. - P. 799 - 809.

101. Selzer, J. Clostridium novyi alpha-toxin- catalyzed incorporation of GlcNAc into Rho subfamily proteins / J. Selzer, F. Hofmann, G. Rex, M. Wilm, M. Mann, I. Just, K. Aktories // J. Biol. Chem. - 1996. Vol. 271, №41. - P. 25173 -25177.

102. Shen, X. Targeting eEFIA by a Legionella pneumophila effector leads to inhibition of protein synthesis and induction of host stress response / X. Shen, S. Banga, Y. Liu, L. Xu, P. Gao, I. Shamovsky, E. Nudler, Z. Luo // Cell. Microbiol. - 2009. - Vol. 11, №6. - P. 911 - 926.

103. Sherman, F. Getting started with yeast / F. Sherman // Methods Enzymol. -2002.-Vol. 350.-P. 3-41.

104. Siggers, K. A. The Yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins / K.A. Siggers, C. F. Lesser// Cell. Host. Microbe. -2008. Vol. 4, №1. - P. 8 - 15.

105. Sisko, J. L. Multifunctional analysis of Chlamydia-specific genes in a yeast expression system / J. L. Sisko, K. Spaeth, Y. Kumar, R. H. Valdivia // Mol. Microbiol. - 2006. Vol. 60, №1. - P. 51 - 66.

106. Slagowski, N. L. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins / N. L. Slagowski, R. W. Kramer, M. F. Morrison, J. LaBaer, C. F. Lesser // PLoS. Pathog. - 2008. Vol. 4, №1. - P. e9.

107. Slagowski, N. L. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins / N. L. Slagowski, R. W. Kramer, M. F. Morrison, J. LaBaer, C. F. Lesser // PLoS. Pathog. - 2008. Vol. 4, №1. - P. e9.

108. Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression / R. Sopko, D. Huang, N. Preston, G. Chua, B. Papp, K. Kafadar, M. Snyder, S. G. Oliver, M. Cyert, T. R. Hughes, C. Boone, B. Andrews // Mol. Cell. - 2006. Vol. 21, №3. - P. 319 - 330.

109. Stebbins, C, Galân, J. Structural mimicry in bacterial virulence / C. Stebbins // Nature. - 2001. - Vol. 412, № 6848. - P. 701 - 705.

110. Tabish, S. Analysis of glycosylation motifs and glycosyltransferases in Bacteria and Archaea / S.Tabish, A. Raza, A. Nasir, S. Zafar, H. Bokhari // Bioinformation.-2011. Vol. 6, №5.-P. 191 - 195.

111. Tan, Y. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rabl / Y. Tan, Z. Q. Luo // Nature. - 2011. - Vol. 475, №7357. - P. 506 - 509.

112. Thiele, D. Elongation factor 1 alpha from Saccharomyces cerevisiae. Rapid large-scale purification and molecular characterization / D. Thiele, P. Cottrelle,

F. Iborra, J. M. Buhler, A. Sentenac, P. Fromageot // J. Biol. Chem. - 1985. -Vol. 260, №5. - P. 3084 - 3089.

113. Tilney, L. How the parasitic bacterium Legionella pneumophila modifies its phagosome and transforms it into rough ER: implications for conversion of plasma membrane to the ER membrane / L.Tilney, O. Harb, P. Connelly, C. Robinson, C. Roy // J. Cell. Sci. - 2001. - Vol. 114. - P. 4637 - 4650.

114. Trosky, J. E. VopA inhibits ATP binding by acetylating the catalytic loop of MAPK kinases / J. E.Trosky, Y. Li, S. Mukherjee, G. Keitany, H. Ball, K. Orth // J. Biol. Chem. - 2007. Vol. 282, №47.-P. 34299-34305.

115. Tsokos, M. Pathology of fatal traumatic and nontraumatic clostridial gas gangrene: a histopathological,immunohistochemical, and ultrastructural study of six autopsy cases / M. Tsokos, S. Schalinski, F. Paulsen, J. P. Sperhake, K. Piischel, I. Sobottka // Int. J. Legal. Med. - 2008. Vol. 122, №1. - P. 35-41.

116. Uetz, P. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae / P. Uetz, L. Giot, G. Cagney, T. A. Mansfield, R. S. Judson, J. R. Knight, D. Lockshon, V. Narayan, M. Srinivasan, P. Pochart, A. Qureshi-Emili, Y.Li, B.Godwin, D. Conover, T. Kalbfleisch,

G. Vijayadamodar, M. Yang, M. Johnston, S. Fields, J. M. Rothberg // Nature. -2000. Vol. 403, №6770. - P. 623 - 627.

117. Valdivia, R. H. Modeling the function of bacterial virulence factors in Saccharomyces cerevisiae / R. H. Valdivia // Eukaryot. Cell. - 2004. - Vol. 3, №4.-P. 827-834.

118. Vogel J. P. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila / J. P. Vogel, H. L. Andrews, S. K. Wong, R. R. Isberg // Science. -1998. - Vol. 279, №5352. - P. 873 - 876.

119. Von Eichel-Streiber, C. Large clostridial cytotoxinsa family of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins / C. Von EichelStreiber, P. Boquet, M. Sauerborn, M. Thelestam // Trends Microbiol. - 1996. -Vol. 4, №10.-P. 375-382.

120. Von Pawel-Rammingen, U. GAP activity of the Yersinia YopE cytotoxin specifically targets the Rho pathway: a mechanism for disruption of actin microfilament structure / U. Von Pawel-Rammingen, M. V. Telepnev, G. Schmidt, K. Aktories, H. Wolf-Watz, R. Rosqvist // Mol. Microbiol. - 2000. Vol. 36, №3.-P. 737-748.

121. Wallrapp, C. The product of the mammalian orthologue of the Saccharomyces cerevisiae HBS1 gene is phylogenetically related to eukaryotic release factor 3 (eRF3) but does not carry eRF3-like activity / C. Wallrapp, S. B. Verrier, G. Zhouravleva, H. Philippe, M. Philippe, T. M. Gress, O. Jean-Jean // FEBS. Lett. - 1998. Vol. 440, №3. - P. 387 - 392.

122. Weber, S. S. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole / S. S. Weber, C. Ragaz, K. Reus, Y. Nyfeler, H. Hilbi // PLoS. Pathog. - 2006. - Vol. 2, №5. - P. e46.

123. Wieland, H. Phagosomal acidification is not a prerequisite for intracellular multiplication of Legionella pneumophila in human monocytes / H. Wieland, F. Goetz, B. Neumeister // J. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 189, №9. - P. 1610 - 1614.

124. Yoon, S. Yersinia effector YopJ inhibits yeast MAPK signaling pathways by an evolutionarily conserved mechanism / S. Yoon, Z. Liu, Y. Eyobo, K. Orth //J. Biol. Chem.-2003. Vol. 278, №4.-P. 2131 -2135.

125. Zhang, Y. A leucine-rich motif targets Pseudomonas aeruginosa ExoS within mammalian cells / Y. Zhang, J. Barbieri // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, №12.-P. 7938-7945.

126. Zhu, H. Analysis of yeast protein kinases using protein chips / H. Zhu, J.

F. Klemic, S. Chang, P. Bertone, A. Casamayor, K. G. Klemic, D. Smith, M. Gerstein, M. A. Reed, M. Snyder // Nat. Genet. - 2000. Vol. 26, №3. - P. 283 -289.

127. Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila / W. Zhu, S. Banga, Y. Tan, C. Zheng, R. Stephenson, J. Gately, Z. Luo // PLoS. One. - 2011. - Vol. 6, №3. -P. el7638.

128. Zusman, T. The response regulator PmrA is a major regulator of the icm/dot type IV secretion system in Legionella pneumophila and Coxiella burnetii / T. Zusman, G. Aloni, E. Halperin, H. Kotzer, E. Degtyar, M. Feldman,

G. Segal // Mol. Microbiol. - 2007. Vol. 9, №1. - P. 86 - 94.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.