Судебно-химическое исследование 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Баранов Юрий Николаевич

• Баранов Юрий Николаевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Баранов Юрий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОМ И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АСПЕКТАХ

1.1. Оценка физических характеристик 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана

1.2. Известные схемы синтеза рассматриваемого токсиканта и области его применения

1.3. Токсичность и особенности токсического действия

1.4. Идентификация объекта исследования и близких по структуре и свойствам веществ

1.5. Методики оценки количественного содержания

1.6. Известные варианты изолирования и способы очистки 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и подобных по структуре органических ядов

1.7. Особенности биотрансформации, характер распределения в организмах и устойчивости 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и

веществ с похожей структурой в различных объектах

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. ИССЛЕДУЕМЫЙ ОБЪЕКТ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИБОРЫ,

ПРИМЕНЯЕМЫЕ РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ, ПОСУДА

Глава 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА

3.1. Методы хроматографии

3.1.1. Разработка способа идентификации с использованием ТСХ

3.1.2. Разработка методики определения в колонках твёрдых неподвижных фаз (ВЭЖХ)

3.2. Разработка методики иидентификации комбинированным методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС)

3.3. Разработка методик идентификации по электронным и ИК спектрам

3.3.1. УФ-спектрофотометрия

3.3.2. Колебательная спектрофотометрия

Выводы по главе

Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАССМАТРИВАЕМОГО СОЕДИНЕНИЯ

4.1. Определение на основе использования метода электронной спектрофотометрии

4.1.1. Определение по поглощению в среде этанола

4.1.2. Определение по поглощению в среде ацетонитрила

4.2. Определение на основе использования метода ВЭЖХ

4.2.1. Нормальнофазовый вариант хроматографирования

4.2.2. Обращённофазовый вариант хроматографирования

Выводы по главе

Глава 5. МОДЕЛИРОВАНИЕ СХЕМ ОЧИСТКИ 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

5.1. Применение очистки методами сорбции и особенности хроматографического поведения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана

5.1.1. Макроколоночная нормальнофазовая хроматография

5.1.2. Тонкослойная нормальнофазовая и обращённофазовая хроматография

5.2. Оценка степени очистки извлечений из различных биологических матриц в контрольных опытах

5.2.1. Оценка степени очистки методом жидкостной колоночной хроматографии

5.2.2. Оценка степени очистки извлечений методом ТСХ

3

Выводы по главе

Глава 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3 -БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

6.1. Изолирование рассматриваемого аналита из матриц биологической природы различными жидкими изолирующими агентами в сравнительном аспекте

6.2. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании толуолом

6.2.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования исследуемого аналита

6.2.2. Предлагаемая методика определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов

6.3. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании этилацетатом

6.3.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования исследуемого аналита

6.3.2. Предлагаемые методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов и крови

6.4. Валидация методик определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в биологических объектах с применением метода нормальнофазовой ВЭЖХ

6.4.1. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани печени

6.4.2. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани гнилостно изменённой печени

6.4.3. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в

крови

Выводы по главе

Глава 7. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-

(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В ОРГАНИЗМЕ ТЕПЛОКРОВНЫХ

4

И УСТОЙЧИВОСТЬ ИССЛЕДУЕМОГО АНАЛИТА В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ

7.1. Характер распределения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в различных органах и биожидкостях теплокровных

7.2. Устойчивость исследуемого вещества в смесях с гнилостно

разлагающимися тканями внутренних органов

Выводы по главе

СХЕМАТИЧЕСКИЙ ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ НА НАЛИЧИЕ

2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Судебно-химическое исследование 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан («Банкол») (наиболее известные синонимы: бенсултап, виктенон, рубан) относится к группе веществ, родственных нереистоксину. Данное биологически активное соединение широко применяется в качестве средства борьбы с повреждающими листовые пластины растительных объектов нежелательными насекомыми (чешуекрылыми и жёсткокрылыми) при нормах расхода 350-700 г/га.

2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан обнаруживает достаточную токсичность при попадании в организмы теплокровных. ЛД50 при введении его per os крысам - 1105-1120 мг/кг (по другим данным -980 мг/кг).

За время применения 2-диметиламино-1,3-бис-

(фенилсульфонилтио)пропана в сельскохозяйственной практике во многих странах мира отмечены случаи отравления людей данным токсикантом. Среди подобных отравлений регулярно регистрируются и летальные. Много случаев смертельных исходов отмечено в странах Центральной и Юго-Восточной Азии, Центральной и Восточной Европы (Mikov M. с соавт, 1997; Dasguptaa S. с соавт, 2007; Kurisaki E. с соавт., 2010; Park Y., 2015). На территории России 4 летальных случая от отравления данным соединением зарегистрировано в Курской и Белгородской областях (Григорьев А.М. с соавт., 2009; Шорманов В.К. с соавт., 2010), 2 случая со смертельным исходом имели место на территории Украины (Баранов Ю.Н. с соавт., 2018). Среди отравлений пестицидами в районе г. Киева за 1993-2013 гг. на отравления 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропаном

приходится в среднем около 20% (Курдиль Н.В. с соавт., 2015).

Большинство отравлений 2-диметиламино-1,3-бис-

(фенилсульфонилтио)пропаном людей, как правило, связано с нарушениями технологии его использования, ошибочным приёмом, попытками криминального и суицидального применения. Как важный экотоксикант 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан представляет угрозу

для здоровья человека при попадании в объекты окружающей среды и

6

употреблении недоброкачественных продуктов питания, содержащих рассматриваемый аналит даже в остаточных количествах.

Разнонаправленное применение инсектицида 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана, его высокая биологическая активность, сопряжённая с выраженным токсическим эффектом, значительное количество летальных исходов от отравления как самим рассматриваемым токсикантом, так и прочими близкими химическими структурами делают безусловно важными и необходимыми вопросы, связанные с изучением этого соединения как одного из объектов судебно-химического анализа.

Степень разработанности темы исследования. При оценке данного положения очевидна недостаточность и фрагментарность экспериментальной проработки научной тематики, содержание которой - оптимизация подходов к изолированию 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из различных биологических объектов, очистке от эндогенных компонентов, обнаружению, предварительной и подтверждающей идентификации, количественной инструментальной оценке содержания в биоматрицах. Анализ источников научной литературы показывает весьма ограниченные сведения о характере локализации нативного 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана у теплокровных организмов при летальных отравлениях, а также данные по устойчивости этого аналита в условиях контакта с гнилостно разлагающимися тканями трупных органов. Принимая во внимание всё изложенное выше, можно сделать вывод об актуальности разработки обладающей высокими аналитическими характеристиками методики судебно-химического исследования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана.

Цель исследования. Цель проведённого комплекса научных изысканий - разработка оригинальной схемы судебно-химического исследования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана.

Задачи исследования. Для эффективного достижения поставленной в диссертации цели предстояло комплексно решить следующие задачи:

1. Определить характерные особенности хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях, аналитических и препаративных колонках сорбентов.

2. Исследовать особенности фрагментации 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в режиме нагревания и определить возможность его надёжной идентификации по характеристикам хроматографической активности в колонках капиллярного типа и масс-спектрам устойчивых продуктов его термической фрагментации в испарителе.

3. Определить наиболее характерные особенности поглощения 2-диметиламино- 1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропаном светового излучения в ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах спектра.

4. Обосновать возможность и предложить условия количественной оценки рассматриваемого соединения в нативном виде на основе применения спектрофотометрии в ультрафиолетовой области и ВЭЖХ.

5. Выявить наиболее приемлемые параметры препаративного хроматографирования диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана с целью моделирования режима очистки аналита методами макроколоночной и тонкослойной хроматографии.

6. Определить и обосновать оптимальные режимы изолирования объекта исследования рядом изолирующих агентов из сложных биологических матриц животного происхождения, разработать варианты очистки извлечённого аналита от эндогенных компонентов биоматриц.

7. Изучить характер локализации 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в органах и крови теплокровных животных, оценить устойчивость рассматриваемого вещества во времени при контакте с гнилостно разлагающимся биоматериалом.

Научная новизна исследования. Дана оценка хроматографического поведения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и близких химических структур в нескольких синтетических сорбентах с гидроксильными группами и привитыми алкильными радикалами на их поверхности; определены оптимальные подвижные фазы и рассчитаны

наиболее важные параметры, характеризующие процесс хроматографирования данных объектов в тонких слоях и колонках сорбентов.

По результатам предварительных исследований предложены оригинальные методики предварительной идентификации и количественной оценки 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана вариантами нормальнофазовой и обращённофазовой ТСХ и ВЭЖХ. Разработана методика, сочетающая использование ГЖХ и масс-спектрометрии в ходе косвенного определения аналита по стабильным фрагментам его термической деструкции в инжекторе.

Исследованы особенности электронного и колебательного спектров поглощения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана. Для повышения избирательности качественного спектрофотометрического определения проведён расчёт отдельных оптических характеристик УФ-спектров аналита в некоторых жидких средах.

Впервые с целью наиболее исчерпывающего извлечения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из биологического материала предложено двукратное настаивание с толуолом или этилацетатом. На основе использования жидких изолирующих агентов толуола или этилацетата и вариантов очистки извлекаемого аналита методами ТСХ и колоночной хроматографии разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соединения в органах теплокровных и крови (применительно к образцам свежего и гнилостного биоматериала).

В серии экспериментов на лабораторных животных (крысы) выявлен характер локализации 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в организме всеядных теплокровных.

Изучены сроки сохранения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях органов в процессе их гнилостного разложения в диапазоне температур от -20 до +36оС.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты, которые были получены на основе выполненного комплекса

исследований, расширяют и конкретизируют представления о различных химических и физико-химических свойствах 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана, возможностях и особенностях качественной и количественной оценки его присутствия в объектах биологического происхождения. Полученные данные составляют основу для более широкого внедрения в практику разработанных методик судебно-химического анализа изучаемого соединения.

На основании полученных результатов разработана схема судебно-химического исследования биоматериала при отравлениях 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропаном.

Методология и методы исследования. Роль методологической основы диссертации выполнили нормативные документы, действующие в области фармацевтического и химико-токсикологического анализа (фармакопейные статьи, информационные письма, методические рекомендации МЗ РФ), а также научные работы российских ученых [В.К. Шорманова, 2004; Е.А. Сухомлинова, 2008]. В представленной диссертации широко использованы современные физико-химические аналитические методы (спектрофотометрия в области «кварцевого» ультрафиолета и ИК- диапазоне, ТСХ, ВЭЖХ, комбинация газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС), жидкостная макроколоночная хроматография нормального давления).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения хроматографического поведения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тонких слоях и колонках сорбентов различной полярности;

- параметры, характеризующие экстинкцию света исследуемым аналитом в УФ- и ИК-диапазонах;

- методики идентификации и количественного определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана методами ТСХ, ВЭЖХ, УФ- и ИК-спектрофотометрии, а также комбинацией ГЖХ и масс-селективного детектирования (ГХ-МС);

10

- результаты моделирования оптимальных условий очистки 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана методами ТСХ и макроколоночной хроматографии нормального давления;

- оптимальные условия и методики изолирования объекта исследования из различных биологических матриц на основе двукратного настаивания с толуолом или этилацетатом;

- особенности локализации (распределения) 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в организме теплокровных;

- временные и температурные характеристики степени устойчивости 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана при его контакте с трупными тканями, претерпевающими гнилостное разложение.

Достоверность научных положений и выводов. Высокий уровень достоверности представляемых результатов обусловлен значительным объёмом выполненных экспериментов и использованием современных и высокотехнологичных методов исследования. В пользу достоверности разработанных методик количественного определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана свидетельствуют результаты их валидации и статистической обработки данных по требованиям ГФ XIV с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

Апробация результатов исследования. Основные положения работы апробированы на научно-практической конференции с международным участием «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» (Харьков, 2005), на научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2006), на II Международной научно-практической конференции «Проблемы медицины в современных условиях» (Казань, 2014), на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2014), на III международной научно-практической конференции «Перспективы развития современной медицины» (Воронеж, 2016), на Международной научной конференции, посвященной 83-летию Курского

государственного медицинского университета (Курск, 2018).

11

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в научном процессе на всех этапах выполнения диссертации: им лично предложен общий план и детализирована структура хода выполнения исследований, подвергнут обстоятельному анализу широкий круг отечественных и зарубежных научных публикаций в рамках выбранной тематики диссертации, осуществлены разноплановые экспериментальные исследования, статистически обработаны и проанализированы полученные данные, которые послужили основой для формулирования им выводов и обобщений.

Внедрение результатов исследования:

- информационное письмо «Об определении 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана (бенсултапа) при судебно-химическом исследовании биологического материала» (утверждено ФГБУ РЦСМЭ Минздрава России 15.03.2018);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана (бенсултапа) из животного биологического материала (тканей органов) путём настаивания с этилацетатом, очистки в колонке силикагеля Ь 40/160 мкм, идентификации методами ТСХ и ГХ-МС и количественного определения методом нормальнофазовой ВЭЖХ: внедрена в работу ОБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Комитета здравоохранения Курской области (акт внедрения от 20.12.2017) и ГБУЗ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Республики Северная Осетия-Алания (акт внедрения от 26.12.2017);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана (бенсултапа) из крови путём настаивания с этилацетатом, очистки в колонке силикагеля L 40/160 мкм, идентификации методами ТСХ и ГХ-МС и количественного определения методом нормальнофазовой ВЭЖХ: внедрена в работу ОБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Комитета здравоохранения Курской области (акт внедрения от 20.12.2017) и ГБУЗ «Республиканское бюро судебно-

медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Республики Северная Осетия-Алания (акт внедрения от 27.12.2017);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из биожидкостей и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии после очистки в колонке гидроксилированного сорбента: внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения от 17.03.2014);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из биологического материала (тканей органов) путём настаивания с толуолом и последующей очистки в колонке гидроксилированного сорбента: внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения от 17.03.2014);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из ткани печени этилацетатом и определения методами ТСХ и нормальнофазовой ВЭЖХ: внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии (акт внедрения от 18.04.2014);

- методика изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из крови этилацетатом и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии: внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии (акт внедрения от 18.04.2014);

- методика изолирования банкола из органов трупа, очистки и определения методами ТСХ и ВЭЖХ: внедрена в экспертно-криминалистическом центре УМВД России по Орловской области, акт внедрения от 18.01.2012);

- методика изолирования банкола из трупной крови, очистки и определения методами ТСХ и ВЭЖХ: внедрена в экспертно-криминалистическом центре УМВД России по Орловской области, акт внедрения от 18.01.2012).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертационной работы соответствуют паспорту специальности «14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования отвечают пункту 4 паспорта специальности - фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Работа выполнялась в рамках плана научных исследований кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.00604979.

Публикации. Основное содержание настоящей работы нашло отражение в 18 публикациях, из которых 4 - в журналах, входящих в базы Scopus и Web of Science (BIOSIS Previews), 3 - в журнале перечня ВАК, 2 -патенты РФ на изобретения.

Объём и структура диссертации. Компоновка диссертации традиционна: введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальная часть (главы со 2 по 6), схематический ход исследования, общие выводы, список литературы, а также приложение на 36 страницах. Работа напечатана на 204 страницах, содержит 15 рисунков и 32 таблицы. Список известных цитируемых научных публикаций состоит из 198 источников, среди которых 67 - русскоязычных, а 131 - иностранный.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОМ И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АСПЕКТАХ

1.1. Оценка физических характеристик 2-диметиламино-1,3-бис-

(фенилсульфонилтио)пропана

2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан («Банкол») (синонимы: Z-дорицид, виктеон, бенсултап, рубан, Т1-1671) (далее по тексту 2-ДМА-1,3-БФСТП) - белая с небольшим светло-коричневым оттенком кристаллическая субстанция, не обладающая выраженным запахом [8, 10, 23, 82] или прозрачные кристаллы, имеющие желтоватую окраску, переходящие в жидкое состояние в температурном интервале от 84 до 85оС [23] или при температуре 82,2оС (по другим данным при 83-84оС или при 81,5-82,9оС). 2-ДМА-1,3-БФСТП разрушается в условиях нагревания до 150оС [32, 81, 159].

Растворимость данного вещества (в мг/л) при 200С в гексане - 319, в толуоле - 83300, в воде - 0,75 (или 0,448), в метаноле - 10480, в этилацетате -149000, в дихлорэтане - более 1000000. Коэффициент распределения в системе октанол/вода (рН=7; 200С) - 2,29-103. По другим сведениям, его растворимость при 25°С (%): в бензоле 35,4, в ксилоле 5,5, в толуоле 16, растворимость в воде при 30°С от 0,7 до 0,8 мг/л [23, 53, 81]. Согласно ряду источников, при 25°С растворимость 2-ДМА-1,3-БФСТП (г/кг) в метаноле, этаноле, и н-гексане составляет соответственно 25, 13, 0,17, в ацетоне, ацетонитриле, хлороформе - более 1000. Данное вещество имеет способность быстро гидролизоваться в водных и водно-щелочных растворах, однако обнаруживает устойчивость в кисло-водных средах (рН<5,0) [32, 159, 175].

Структурная формула 2-ДМА-1,3-БФСТП имеет вид:

Брутто-формула: C17H21NO4S4, молекулярная масса 431,6. Название по ИЮПАК: S,S'-2-dimethylaminotrimethylene di(benzenethiosulfonate), название по CAS: S,S'-[2-(dimethylamino)-1,3-propanediyl] di(benzenesulfothioate). 2-ДМА-1,3-БФСТП, так же как картап, тиоциклам и моносултап относится к аналогам нереистоксина [96, 98, 115, 142]:

Н3С .---'-И;

N

S-S

Нереистоксин (N,N-диметил-1,2-дитиолан-4-амин) является одним из доказанных продуктов биотрансформации 2-ДМА-1,3-БФСТП [10, 11]. Он также образуется при гидролизе 2-ДМА-1,3-БФСТП и ряда близких к нему по структуре соединений (1,3-бис(карбамоилтио)-2-Ы^-

диметиламинопропангидрохлорид, тиоциклам, тиосултап) [103].

Брутто-формула нереистоксина - C5HпNS2, молекулярная масса -149,28, температура кипения - 212-213°С [33, 85], рКа - 6,20±0,09 [10].

1.2. Известные схемы синтеза рассматриваемого токсиканта и

области его применения

2-ДМА-1,3-БФСТП получают синтетически, например, путём взаимодействия диметиламино-бис(хлорметил)метана с

бензолтиосульфонатом натрия [59, 186].

Известен способ получения 2-ДМА-1,3-БФСТП, при котором раствор 1-диметиламино-2,3-дихлорпропана хлоргидрата (1-1,1 моль) при 65-70оС вначале обрабатывают 45-50% водным раствором гидроксида натрия (11,1 моль), затем - раствором бензолтиосульфоната натрия (2,05-2,1 моль) в воде в условиях контакта с гидрофобным растворителем [46].

Получение 2-ДМА-1,3-БФСТП может осуществляться двухчасовым взаимодействием бензолтиосульфоната натрия с (СН3)2КСН(СН2С1)гНС1 в присутствии этилата натрия в этанольной среде в условиях нагревания при 80оС или путём двухчасового кипячения в этаноле натрия бензолтиосульфоната с 2-диметиламино-1,3-дихлорпропаном [47].

Описано получение исследуемого соединения в результате реакций натрия бензолтиосульфоната в среде этанола (каждая продолжительностью 120 минут) с такими веществами как (СНз)2К-СН2-СНС1-СН2С1 или (СНз)2К-СН(СН2С1)2 [47].

Синтез 2-ДМА-1,3-БФСТП может заключаться во введении в этанольный раствор №ОН смеси бензолсульфоната натрия и (СНз)2КСН(СН2С1)2-НС1, последующем двухчасовом кипячении, удалении из реакционной смеси натрия хлорида фильтрованием и извлечении конечного продукта из маточника [126].

В соответствии с другим вариантом получения раствор №ОН в воде 45-50%-ной концентрации вводят при 65-70оС в водный раствор гидрохлорида 1-диметиламино-1,3-дихлорпропана, через 30 мин добавляют органическую жидкость (растворитель) и раствор натрия бензолтиосульфоната в воде, смесь перемешивают 2 ч при 70оС. Отделяют органическую фазу, органический растворитель испаряют. Остаток перекристаллизовывают.

Предложено два варианта способа получения 2-ДМА-1,3-БФСТП, заключающегося в обработке водного раствора смеси бензолтиосульфоната натрия и хлоргидрата 1-диметиламино-2,3-дихлорпропана водным раствором карбонатов щелочных металлов при молярном соотношении (1-1,5):(2,0-2,05):(0,5-0,75) при температуре 40-80оС. В одном случае проводят процесс в водной среде, а другом - в водной среде в присутствии гидрофобного растворителя [47].

Известно ещё три варианта получения 2-ДМА-1,3-БФСТП. Согласно

первому вначале диметиламин при 50-55°С 3-4 ч реагирует с аллилхлоридом,

17

образующийся гидрохлорид диметилаллиламина в дальнейшем в течение 810 ч хлорируют при температуре 7-13°С, хлор из реакционной смеси удаляют, полученный 1-диметиламино-2,3-дихлорпропана хлоргидрат нейтрализуют водным раствором гидроксида, слой 2-диметиламино-1,3-дихлорпропана отделяют, подвергают высушиванию, растворяют в гидрофильном растворителе (пропаноле-2), затем при 70-79°С в течение полутора-двух часов конденсируют с бензолтиосульфонатом натрия. Выделяющийся хлорид натрия при 70-75°С отделяют фильтрованием, а реакционную массу охлаждают до 20-10°С и выделяют фильтрованием целевой продукт.

Во втором варианте этого способа получения в качестве щелочи применяют водный раствор гидроксида калия или натрия. Третий вариант рассматриваемого способа получения состоит в том, что пропанол-2 берут в 2-2,5 раза больше по отношению к массе исходных соединений [51].

Известны и другие данные по изучению процессов синтеза 2-ДМА-1,3-БФСТП [191].

Предшественник 2-ДМА-1,3-БФСТП и его метаболит нереистоксин впервые выделен Нитта из полихеты Lumbriconereis heteropoda в 1922 г. В 1960 году профессор Хашимото со своими сотрудниками установил структуру данного вещества [33, 135, 164].

В результате изучения структуры нереистоксина, получены, наряду с 2-ДМА-1,3-БФСТП, такие пестициды, как картап и тиоциклам [107, 138].

2-ДМА-1,3-БФСТП является веществом антихолинэстеразного действия и применяется как кишечный и контактный инсектицид. Он способен проникать во внутренние ткани растений, хотя в большинстве случаев не имеет системного действия [18, 24, 55, 97, 190].

2-ДМА-1,3-БФСТП эффективен в борьбе с жесткокрылыми и

чешуекрылыми вредителями многих культур [24]. Обычно он используется

против вредителей рапса (семенные посевы) (рапсовый цветоед), пшеницы

(хлебная жужелица), томатов, баклажанов (колорадский жук), картофеля

18

(колорадский жук). Известно также его применение для борьбы с медведкой на плантациях земляники и картофеля, цветочных и овощных культур как в Российской Федерации [4, 5, 13], так и за её пределами [121, 192-195]. Норма расхода бенсултапа в виде 50% жидкого препарата для борьбы с насекомыми может составлять 0,15 л/га [161].

Применение «Банкола» при нормах расхода 0,2-0,3 кг/га обеспечивает 100% смертность личинок колорадского жука в первые 5 суток и период защитного действия более 14 суток, в т. ч. при борьбе с резистентными к синтетическим пиретроидам популяциями данного вредителя [6, 15, 21, 28].

Изучен эффект 2-ДМА-1,3-БФСТП на вредителей томатов [94].

Сообщается об использовании 2-ДМА-1,3-БФСТП как инсектицида в борьбе с большим сосновым долгоносиком на саженцах сосны в период их роста [132].

В составе биоцидных комплексов 2-ДМА-1,3-БФСТП может использоваться для защиты технических материалов [150].

2-ДМА-1,3-БФСТП применяется в виде 50%-ого смачивающегося порошка, дуста, эмульсионного концентрата, гранул, микрокапсул [59, 152]. Описан эмульгатор для эмульсионного препарата 2-ДМА-1,3-БФСТП, содержащий по меньшей мере один (мет)акриловый эфир или (мет)акриламид с третичной аминогруппой [151].

Предложено использование 2-ДМА-1,3-БФСТП и близких к нему по структуре тиоциклама и картапа в составе инсектицидных композиций с различными веществами синтетического и природного происхождения [35, 145, 146, 152].

Описана возможность применения 2-ДМА-1,3-БФСТП, картапа, тиоциклама и тиосултапа в качестве компонентов фунгицидных составов [48, 131, 149].

Hoffmann M.P., Gardner J., Curtis P.D. [148] предложили экологически целесообразные физические барьеры для борьбы с вредителями в виде

нетканой волокнистой матрицы и адсорбированных или прикреплённых к ней химических сдерживающих факторов, в частности, 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Баранов Юрий Николаевич, 2019 год

МАТЕРИАЛЕ

6.1. Изолирование рассматриваемого аналита из матриц биологической природы различными жидкими изолирующими агентами в

сравнительном аспекте

Одним из главных фрагментов в ряду мероприятий, составляющих основу судебно-химического исследования можно считать изолирование токсикологически важных аналитов из различного рода биоматриц. На характер самого процесса изолирования влияет ряд условий.

Реализуя задачи данного исследования и применяя отдельные модифицированные варианты ранее разработанных методик [20, 37, 63, 64], на примере модельных композиций аналита с тканью не подвергнутой гнилостным изменениям трупной печени были детально рассмотрены различные аспекты извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП из биоматриц изолирующими агентами обладающими неодинаковой химической природой (ацетоном (группа кетонов), этилацетатом (группа сложных алифатических эфиров), хлороформом (группа галогеналканов), гексаном (группа алканов), 95% этанолом (группа алканолов), ацетонитрилом (группа нитрилов), толуолом (группа аренов), диоксаном-1,4 (группа кислородсодержащих гетероциклов), уксусным ангидридом (группа ангидридов алкилкарбоновых кислот), уксусной (этановой) кислотой (группа алкилкарбоновых кислот) и водой).

Модельные композиции готовили, прибавляя в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 100 мл, определённые массы аналита, диспергированного до частиц с размерами в диапазоне от 5 до 50 мкм и 25 г биоматрицы («свежей» печени от трупа) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м.

Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

Порядок изолирования 2-ДМА-1,3-БФСТП из каждой модельной композиции состоял в том, что 5 г отобранной биоткани, содержащей аналит, обрабатывали порцией изолирующего агента, количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 45 минут, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в пробирке, вместимость которой была равна 20 мл.

Определённый объём содержимого пробирки помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Силуфол» с УФ-индикатором (ИУ-254). Рядом с пятном наносили от 5 до 10 мкл 0,04% этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита. Осуществляли хроматографирование с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2 (8:4:0,8). Хроматограммы исследовали в ультрафиолетовом свете (область 254 нм), рассматриваемое соединение проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне рассматриваемой пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по критерию абсолютной хроматографической подвижности (И), получаемые значения которой колебались от 0,53 до 0,59.

Проведя идентификацию по характеру хроматографической активности

в тонком слое, аналит элюировали из сорбента 95%-ым этанолом 15 минут и

изучали поглощение элюата в диапазоне от 200 до 360 нм (модель прибора

СФ-46, кювета прямоугольная кварцевая, оптический путь составляет 1 см),

используя в качестве раствора сравнения контрольный элюат. Аналит

81

идентифицировали по типичной форме УФ-спектральной кривой и по расположению точек экстремумов. Регистрировали оптическую плотность в области 255 нм и, применяя уравнение градуировочного графика, находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Количества аналита (в % от его массы, добавленной в биоматрицу), которые удавалось извлечь по приводимой схеме из модельной композиции тем или иным жидким изолирующим агентом (значения R, % - степень извлечения), представлены в виде рис. 9.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Рисунок 9 - Диаграмма зависимости степени извлечения %) 2-ДМА-1,3-БФСТП из биоматрицы от химической природы изолирующего агента

Данные представленной диаграммы указывают на то, что степень извлечения аналита водой, этановой (уксусной) кислотой, гексаном и уксусным ангидридом недостаточно высока. 2-ДМА-1,3-БФСТП из модельных композиций в большей степени изолируется такими

I*, %

гидрофильными растворителями как этанол (концентрация 95%), ацетон (диметилкетон), ацетонитрил (этаннитрил), 1,4-диоксан.

Лучше всего исследуемый аналит извлекается из биоматриц некоторыми гидрофобными изолирующими агентами: этилацетатом (этиловым эфиром этановой кислоты), толуолом (метилбензолом) и хлороформом (1,1,1 -трихлорметаном).

При переходе к следующим этапам исследования как наиболее перспективные изолирующие 2-ДМА-1,3-БФСТП агенты выделены толуол и этилацетат.

Преимуществами толуола можно считать возможность достижения наивысших значений степени извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП из животной биоматрицы при условии получения сравнительно чистых извлечений. Этилацетат, по сравнению с толуолом, является более универсальным изолирующим 2-ДМА-1,3-БФСТП агентом, так как, в некоторой степени смешиваясь с водой, позволяет одинаково эффективно изолировать аналит как из плотных тканей органов, так и из биожидкостей (крови).

6.2. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании толуолом

6.2.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования

исследуемого аналита

А. Оценка влияния на степень извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП объёма используемого для изолирования агента и количества этапов (кратности) изолирования

Предварительно, используя модификации известных методик [63, 64] готовили 5 модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с плотной биологической матрицей.

Модельные композиции готовили, прибавляя в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 100 мл,

определённые массы аналита, диспергированного до частиц с размерами в диапазоне от 5 до 50 мкм и 25 г биоматрицы («свежей» печени от трупа) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м. Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС. В таких же условиях и такое же время (1,5 часа) выдерживали мелкодиспергированный до частиц с размерами в диапазоне от 5 до 50 мкм контрольный образец биоматрицы.

Спустя 1,5 часа отбирали по 5 г из каждой модельной композиции или контрольного образца мелкодиспергированной («свежей» печени от трупа). Каждую из отобранных порций модельных композиций и порцию контрольной биоматрицы параллельно обрабатывали различными (по массе) количествами толуола (5 г, 2*5 г, 2,5*5 г, 3*5 г и 4*5 г) и подвергали процессу инфузии (настаивания) четырёхкратно. Время проведения инфузии на каждом этапе составляло % часа. За это время настаиваемые смеси подвергались перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 1012 минут).

По окончании каждого этапа инфузии толуольное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и помещали его в отдельную пробирку вместимостью 50 мл.

Определённый объём содержимого каждой пробирки (0,3 мл

непосредственно из извлечений, полученных на двух первых этапах инфузии

и из сконцентрированных в 4 раза извлечений, полученных на 3 и 4 этапах

инфузии) помещали на стартовую линию стандартной пластины типа

«Силуфол» с УФ-индикатором (иУ-254). Рядом с пятном наносили от 5 до

10 мкл 0,04% этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита.

Осуществляли хроматографирование с применением элюирующей системы

гексан-диоксан-пропанол-2 (8:4:0,8). Хроматограммы исследовали в

ультрафиолетовом свете (область 254 нм), рассматриваемое соединение

84

проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне рассматриваемой пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по критерию абсолютной хроматографической подвижности (И), получаемые значения которой колебались от 0,53 до 0,59.

Проведя идентификацию по характеру хроматографической активности в тонком слое, аналит элюировали из сорбента 95%-ым этанолом 15 минут и изучали поглощение элюата в волновом диапазоне от 200 до 360 нм (модель прибора СФ-46, кювета прямоугольная кварцевая, оптический путь составляет 1 см), используя в качестве раствора сравнения контрольный элюат. Аналит идентифицировали по типичной форме УФ-спектральной кривой и по расположению точек экстремумов. Регистрировали оптическую плотность в области 255 нм и, применяя уравнение градуировочного графика, находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Количества аналита (в г и в % от его массы, добавленной в биоматрицу), которые удавалось извлечь по приводимой схеме из 5 г каждой модельной композиции на каждом из 4 этапов настаивания толуолом (значения R, % - степень извлечения), представлены в виде табл. 14.

Оценивая совокупность результатов, составляющих табл. 14, можно сделать заключение в пользу того, что оптимальными условиями изолирования исследуемого аналита из биоматриц толуолом являются как минимум двухразовая инфузия и соотношение > 2 на каждом этапе инфузии между массами изолирующей жидкости (толуола) и биоматрицы.

Б. Оценка влияния на степень извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП продолжительности контакта изолирующей жидкости (толуола) и биоматрицы

Порядок приготовления и подготовки модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с биоматрицей (числом 5) и образцов контрольной биоматрицы к исследованию был таким же, как указано в разделе 6.1.

Порядок исследования сводился к тому, что 5 г каждой из 5 модельных композиций и 5 образцов контрольной биоматрицы (мелкодиспергированной «свежей» печени от трупа) обрабатывали порцией изолирующего агента (толуола), количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы, осуществляя процесс инфузии различной продолжительности (1/4, У, %, 1 или 5/4 часа). По окончании данного этапа извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили процесс инфузии в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в пробирке, вместимость которой была равна 20 мл.

Определённый объём (0,2 или 0,3 мл) содержимого каждой пробирки непосредственно или после концентрирования содержимого в 4 раза помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Силуфол» с УФ-индикатором (иУ-254) и далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела. Результаты серии пяти параллельных определений изображены в виде рис. 10. Данные рисунка наглядно показывают, что минимально необходимая продолжительность контакта изолирующей жидкости (толуола) и биоматрицы составляет У часа.

100 п

15 30 45 60 75

1, мин

Рисунок 10 - Результаты оценки влияния продолжительности инфузии на

полноту выделения толуолом 2-ДМА-1,3-БФСТП из биоматрицы

86

В. Оценка влияния на полноту перехода 2-ДМА-1,3-БФСТП в извлечение относительного массового соотношения аналита и биоматрицы в модельной композиции

Порядок приготовления и подготовки модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с биоматрицей в различных массовых соотношениях и образцов контрольной биоматрицы к исследованию был таким же как указано в разделе 6.1.

Нижнее и верхнее значения диапазона, в котором колебались задаваемые соотношения аналита и биоматрицы составляли 1:10000 и 20:10000 (т.е. соответственно 0,01% и 0,2%).

Порядок исследования сводился к тому, что 5 г каждой из 5 модельных композиций и 5 образцов контрольной биоматрицы (мелкодиспергированной «свежей» печени от трупа) обрабатывали порцией изолирующего агента (толуола), количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы, осуществляя процесс инфузии продолжительностью часа.

По окончании данного этапа извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили процесс инфузии в вышеописанном режиме.

Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в пробирке, вместимость которой была равна 20 мл.

Определённый объём содержимого каждой пробирки (0,2 или 0,3 мл) помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Силуфол» с УФ-индикатором (иУ-254) и далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела.

Результаты серии пяти параллельных определений составляют табл. 15.

Совокупность данных таблицы позволяет отметить отсутствие значимых различий (<2%) степени извлечения аналита из модельных композиций в заданном диапазоне соотношений аналита и биоматрицы.

Очевидно такой результат демонстрирует отсутствие в выбранном диапазоне сколько-либо устойчивых связей молекулярных фрагментов биоматрицы с малополярными молекулами аналита.

6.2.2. Предлагаемая методика определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов

Порядок изолирования аналита из плотных биоматриц (печень без следов гнилостных изменений и печень, подвергшаяся гнилостным изменениям).

Определённое количество анализируемой биоткани или контрольного образца биоматрицы (масса 25 г) обрабатывали порцией толуола, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа толуольное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в конической стеклянной колбе внутренним объёмом 200 мл в одно общее и в дальнейшем очищали от остатков воды, механических частиц и некоторых молекулярных форм эндогенных компонентов биоматрицы путём пропускания сквозь безводный кристаллический сульфат натрия, сформированный в виде столба высотой 10-15 мм в стеклянном круглом фильтре ФКП диаметром 40 мм. Слой очищающего компонента (сульфата натрия) подвергали последующей промывке порцией изолирующего аналит агента (толуола) массой 20 г.

Первый (жидкая часть извлечения) и второй (промывная жидкость) толуольные фильтраты смешивали в выпарительной чашке и удаляли растворитель в токе воздуха при 18-22оС.

Ход очистки аналита в макроколонке сорбента

Остаток, после удаления растворителя из извлечения, обрабатывали при энергичном перемешивании 4 мл трихлорметана (хлороформа), предполагая полное растворение аналита.

Часть образовавшегося таким образом хлороформного раствора (объёмом 2 мл) тщательно перемешивали с 1 г гидроксилированного сорбента (силикагеля типа L с средним размером частиц от 40 до 100 мкм) в чашке для выпаривания вместимостью от 50 до 100 мл и добивались как можно полного испарения (до исчезновения запаха) растворителя из данной смеси, помещая чашку в ток воздуха с температурой 18-22оС.

В выполненную из стекла хроматографическую колонку высотой 490 и диаметром 11 мм с 9 г силикагеля L (размер частиц от 40 до 100 мкм), добавляли 1 г этого же сорбента, в котором находился аналит, добавленный в виде 2 мл хлороформного раствора.

В дальнейшем, проводя элюирование, через слой сорбента в подготовленной, как указано выше, колонке пропускали малополярный элюент гексан до момента выхода 20 мл элюата. Следующий этап элюирования состоял в том, что, удалив из колонки малополярный гексан, находящийся над слоем неподвижной фазы, в неё добавляли среднеполярный многокомпонентный элюент (смесь органических жидкостей, включающую гексан, диоксан и пропанол-2, взятых в объёмных отношениях 8:3:0,6) и элюировали этой системой. Вытекающий элюат в процессе его сбора собирали в отдельные градуированные пробирки небольшими (по 2 мл) фракциями. Фракции №№ 11-14, содержащие 2-ДМА-1,3-БФСТП, объединяли в выпарительной чашке и удаляли элюент в токе воздуха с температурой 18-22оС. Остаток обрабатывали 5 мл 1,4-диоксана (исходный диоксановый раствор).

В выпарительную чашку № 1 помещали 0,2 мл «исходного диоксанового раствора» (при малых концентрациях аналита этот объём

можно увеличить до 1,5 мл). В чашку № 2 помещали 2 мл того же «исходного» раствора. Растворитель удаляли из чашек в токе воздуха при 18-22оС.

Идентификация по хроматографической активности в тонком слое сорбента

Остаток в чашке № 1 3-4 раза обрабатывали 0,2-0,4 мл хлороформа, нанося образующийся раствор на стартовую линию стандартной пластины типа «Силуфол» с УФ-индикатором (иУ-254). Рядом наносили от 5 до 10 мкл 0,04%-ого этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита. Осуществляли хроматографический процесс с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2 (8:4:0,8).

Хроматограммы исследовали в ультрафиолетовом свете (излучение в области 254 нм), рассматриваемое соединение проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по значению критерия абсолютной хроматографической подвижности (И) (раздел 3.1).

Идентификация по характеру поглощения УФ-излучения и оценка количественного содержания

Проведя идентификацию по характеру хроматографического поведения в тонком слое сорбента, аналит элюировали из сорбента 95% этанолом 1/4 часа и изучали поглощение элюата в диапазоне 200-360 нм, используя в качестве раствора сравнения контрольный элюат. Аналит идентифицировали на основе типичной формы УФ-спектральной кривой, а также по расположению точек экстремумов (раздел 3.3). Регистрировали оптическую плотность при 255 нм и, применяя уравнение линии регрессии (градуировочного графика) (описано в разделе 4.1), находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП в единицах массы и в % к внесённой в биоматрицу навески аналита.

Результаты выполненных определений аналита в плотных биоматрицах (в данном случае - ткань печени и ткань гнилостно изменённой печени) на основе применения УФ-спектрофотометрии составляют табл. 16 и 17.

Совокупность данных этих таблиц позволяет отметить достаточно высокие аналитические характеристики предлагаемых методик.

Идентификация по характеру удерживания в колонке сорбента (метод ВЭЖХ) и оценка количественного содержания

Остаток в чашке № 2 растворяли в смеси 1,0 мл диоксана и 0,2 мл пропанола-2, затем туда прибавляли 3 мл гексана порциями по 0,5-1,0 мл, осуществляя количественное перенесение раствора в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 5 мл) и добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 5 мл. Пробу полученного таким образом раствора объёмом от 2 до 16 мкл вводили в жидкостный хроматограф. Хроматографировали в колонке полярного сорбента марки «Силасорб-600» высотой 64 и диаметром 2 мм. Элюировали среднеполярной подвижной органической фазой гексан-1,4-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объёму), скорость которой 100 мкл в мин. Регистрировали сигнал УФ-детектора при 256 нм.

2-ДМА-1,3-БФСТП идентифицировали по времени удерживания. Количество 2-ДМА-1,3-БФСТП в элюируемой пробе рассчитывали по величине площади пика на хроматограмме, основываясь на предварительно рассчитанном уравнении линии регрессии (градуировочного графика) (описано в разделе 4.2), после чего пересчитывали на навеску.

Результаты определений аналита в плотных биологических матрицах (ткань печени и ткань гнилостно изменённой печени) на основе применения ВЭЖХ составляют табл. 16 и 17.

Совокупность данных этих таблиц позволяет отметить достаточно высокие аналитические характеристики предлагаемых методик.

6.3. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании этилацетатом

6.3.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования

исследуемого аналита

А. Оценка влияния на степень извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП объёма используемого для изолирования агента и количества этапов (кратности) изолирования

Предварительно, используя модификации известных методик [63, 64], готовили 5 модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с плотной биологической матрицей.

Модельные композиции готовили, прибавляя в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 100 мл, определённые массы аналита, диспергированного до частиц с размерами в диапазоне от 5 до 50 мкм и 25 г биоматрицы («свежей» печени от трупа) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м. Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС. В таких же условиях и такое же время (1,5 часа) выдерживали мелкодиспергированный до частиц с размерами в диапазоне от 5 до 50 мкм контрольный образец биоматрицы.

Спустя 1,5 часа отбирали по 5 г из каждой модельной композиции или контрольного образца мелкодиспергированной («свежей» печени от трупа). Каждую из отобранных порций модельных композиций и порцию контрольной биоматрицы параллельно обрабатывали различными (по массе) количествами этилацетата (5 г, 2*5 г, 2,5*5 г, 3*5 г и 4*5 г) и подвергали процессу инфузии (настаивания) четырёхкратно. Время проведения инфузии на каждом этапе составляло 3/4 часа. За это время настаиваемые смеси

подвергались перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 1012 минут).

По окончании каждого этапа инфузии этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и помещали его в отдельную пробирку вместимостью 50 мл.

Определённый объём содержимого каждой пробирки (0,3 мл непосредственно из извлечений, полученных на двух первых этапах инфузии и из сконцентрированных в 4 раза извлечений, полученных на 3 и 4 этапах инфузии) помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (иУ-254). Рядом с пятном наносили от 5 до 10 мкл 0,04% этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита. Осуществляли хроматографирование с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон (8:3:0,8:0,8). Хроматограммы исследовали в ультрафиолетовом свете (область 254 нм), рассматриваемое соединение проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне рассматриваемой пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по критерию абсолютной хроматографической подвижности (И), получаемые значения которой колебались от 0,44 до 0,48.

Проведя идентификацию по характеру хроматографической активности в тонком слое, аналит элюировали из сорбента 95%-ым этанолом 1/4 часа и изучали поглощение элюата в волновом диапазоне от 200 до 360 нм (модель прибора СФ-46, кювета прямоугольная кварцевая, оптический путь составляет 110-2 м), используя в качестве раствора сравнения контрольный элюат. Аналит идентифицировали по типичной форме УФ-спектральной кривой и по расположению точек экстремумов. Регистрировали оптическую плотность в области 255 нм и, применяя уравнение регрессии (градуировочного графика), находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Количества аналита (в г и в % от его массы, добавленной в

биоматрицу), которые удавалось извлечь по приводимой схеме из 5 г каждой

93

модельной композиции на каждом из 4 этапов настаивания этилацетатом (значения R, % - степень извлечения), представлены в виде табл. 18.

Оценивая совокупность результатов, составляющих табл. 18, можно сделать заключение в пользу того, что оптимальными условиями изолирования исследуемого аналита из биоматриц этилацетатом являются как минимум двухразовая инфузия и соотношение >2 на каждом этапе инфузии между массами изолирующей жидкости (этилацетата) и биоматрицы.

Б. Оценка влияния на степень извлечения 2-ДМА-1,3-БФСТП продолжительности контакта изолирующей жидкости (этилацетата) и биоматрицы

Порядок приготовления и подготовки модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с биоматрицей (числом 5) и образцов контрольной биоматрицы к исследованию был таким же, как указано в разделе 6.1.

Порядок исследования сводился к тому, что 5 г каждой из 5 модельных композиций и 5 образцов контрольной биоматрицы (мелкодиспергированной «свежей» печени от трупа) обрабатывали порцией изолирующего агента (этилацетата), количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы, осуществляя процесс инфузии различной продолжительности (1/4, 1/2, 3/4, 1 или 5/4 часа).

По окончании данного этапа извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили процесс инфузии в вышеописанном режиме.

Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в пробирке, вместимость которой была равна 20 мл.

Определённый объём (0,2 или 0,3 мл) содержимого каждой пробирки сразу или после концентрирования содержимого в 4 раза помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (иУ-254) и далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела.

Результаты серии пяти параллельных определений изображены в виде рис. 11. Данные рисунка наглядно показывают, что минимально необходимая продолжительность контакта изолирующей жидкости (этилацетата) и биоматрицы составляет 1/2 часа.

я,% 80 -|

60 -

40 -

20 -

0

15 30 45 60 75

X мин

Рисунок 11 - Результаты оценки влияния продолжительности инфузии на полноту выделения этилацетатом 2-ДМА-1,3-БФСТП из биоматрицы

В. Оценка влияния на полноту перехода 2-ДМА-1,3-БФСТП в извлечение относительного массового соотношения аналита и биоматрицы в модельной композиции

Порядок приготовления и подготовки модельных композиций 2-ДМА-1,3-БФСТП с биоматрицей в различных массовых соотношениях и образцов контрольной биоматрицы к исследованию был таким же, как указано в разделе 6.1.

Нижнее и верхнее значения диапазона, в котором колебались задаваемые соотношения аналита и биоматрицы составляли 1:10000 и 20:10000 (т.е. соответственно 0,01% и 0,2%).

Порядок исследования сводился к тому, что 5 г каждой из 5 модельных композиций и 5 образцов контрольной биоматрицы (мелкодиспергированной «свежей» печени от трупа) обрабатывали порцией изолирующего агента

(этилацетата), количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы, осуществляя процесс инфузии продолжительностью 1/2 часа.

По окончании данного этапа извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили процесс инфузии в вышеописанном режиме.

Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в пробирке, вместимость которой была равна 20 мл.

Определённый объём содержимого каждой пробирки (0,2 или 0,3 мл) помещали на стартовую линию стандартной пластины типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (иУ-254) и далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела.

Результаты серии пяти параллельных определений составляют табл. 19.

Совокупность данных таблицы позволяет отметить отсутствие значимых различий (<2%) степени извлечения аналита из модельных композиций в заданном диапазоне соотношений аналита и биоматрицы. Очевидно такой результат демонстрирует отсутствие в выбранном диапазоне сколько-либо устойчивых связей молекулярных фрагментов биоматрицы с малополярными молекулами аналита.

6.3.2. Предлагаемые методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов и крови

И з о л и р о в а н и е

А. Изолирование из плотной биоматрицы (печень без следов гнилостных изменений)

Анализируемая диспергированная биоткань или контрольный образец биоматрицы (масса 25 г) обрабатывались этилацетатом, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с

определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в конической стеклянной колбе внутренним объёмом 200 мл в одно общее и в дальнейшем очищали от остатков воды, механических частиц и некоторых молекулярных форм эндогенных компонентов биоматрицы путём пропускания сквозь безводный кристаллический сульфат натрия, сформированный в виде столба высотой 10-15 мм в стеклянном круглом фильтре ФКП диаметром 40 мм. Слой очищающего компонента (сульфата натрия) подвергали последующей промывке порцией изолирующего аналит агента (этилацетата) массой 20 г.

Первый (жидкая часть извлечения) и второй (промывная жидкость) этилацетатные фильтраты смешивали в чашке для выпаривания в одно общее и полностью удаляли растворитель при 18-22оС в токе воздуха.

Б. Изолирование из плотной биоматрицы (печень, подвергшаяся гнилостным изменениям)

Анализируемую биоткань или контрольный образец биоматрицы (масса 25 г) обрабатывали этилацетатом, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы и в дальнейшем поступали согласно последовательности действий, определённой для изолирования из печени без следов гнилостных изменений.

В. Изолирование из жидкой биоматрицы (кровь человека)

Определённое количество анализируемой биоткани или контрольного образца биоматрицы (масса 25 г) обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут).

По окончании данного этапа этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы. Жидкое извлечение отделяли от твердых фрагментов биоматрицы, применяя фильтрование через смоченный этилацетатом бумажный фильтр, и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Фильтр и остаток из плотных частиц на фильтре подвергали последующей промывке порцией изолирующего аналит агента (этилацетата) массой 20 г [30].

Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, а также промывную жидкость смешивали в конической стеклянной колбе внутренним объёмом 200 мл в одно общее и в дальнейшем поступали согласно последовательности действий, определённой для изолирования из печени без следов гнилостных изменений.

Схема очистки извлеченного аналита в макроколонке сорбента

Остаток, образовавшийся после удаления органического растворителя из общего извлечения, обрабатывали при энергичном перемешивании 4 мл трихлорметана (хлороформа), предполагая полное растворение аналита.

Часть образовавшегося таким образом хлороформного раствора (объёмом 2 мл) тщательно перемешивали с 1 г гидроксилированного сорбента (силикагеля типа L с средним размером частиц от 40 до 100 мкм) в чашке для выпаривания вместимостью от 50 до 100 мл и добивались как можно полного испарения (до исчезновения запаха) растворителя из данной смеси, помещая чашку в ток воздуха с температурой 18-22оС.

В выполненную из стекла хроматографическую колонку высотой 490 и диаметром 11 мм с 9 г силикагеля L (размер частиц от 40 до 100 мкм) добавляли 1 г этого же сорбента, в котором находился аналит, добавленный в виде 2 мл хлороформного раствора.

В дальнейшем, проводя элюирование, через слой сорбента в подготовленной, как указано выше, колонке пропускали малополярный элюент гексан до момента выхода 20 мл элюата. Следующий этап

элюирования состоял в том, что, удалив из колонки малополярный гексан, находящийся над слоем неподвижной фазы, в неё добавляли среднеполярный многокомпонентный элюент (смесь органических жидкостей, включающую гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в объёмных отношениях 8:3:0,6) и элюировали этой системой. Вытекающий элюат в процессе его сбора собирали в отдельные градуированные пробирки небольшими (по 2 мл) фракциями. Фракции №№ 11-14 объединяли в выпарительной чашке и удаляли элюент в токе воздуха при 18-22оС. Остаток обрабатывали 5 мл диоксана (исходный диоксановый раствор).

В выпарительную чашку № 1 помещали 0,2 мл «исходного диоксанового раствора» (при малых концентрациях аналита этот объём можно увеличить до 1,5 мл). В чашки № 2 и № 3 помещали соответственно 1,0 мл и 2 мл того же «исходного» раствора. Растворитель удаляли из чашек в токе воздуха при 18-22оС.

Идентификация по хроматографической активности в тонком слое сорбента

Остаток в чашке № 1 3-4 раза обрабатывали 0,2-0,4 мл хлороформа, каждый раз нанося раствор на стартовую линию пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ. Рядом наносили от 5 до 10 мкл 0,04%-ого этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита. Осуществляли хроматографический процесс с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон (8:3:0,8:0,8).

Хроматограммы исследовали в ультрафиолетовом свете (излучение в области 254 нм), рассматриваемое соединение проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по значению критерия абсолютной хроматографической подвижности (раздел 3.1).

Идентификация по характеру поглощения УФ-излучения и оценка количественного содержания

Проведя идентификацию по характеру хроматографического поведения в тонком слое сорбента, пятно аналита элюировали из сорбента 95% этанолом 1/4 часа и изучали поглощение элюата в диапазоне 200-360 нм. Аналит идентифицировали на основе типичной формы УФ-спектральной кривой, а также по расположению точек экстремумов (раздел 3.3). Регистрировали оптическую плотность при 255 нм и, применяя уравнение линии регрессии (градуировочного графика) (описано в разделе 3.1), находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП в единицах массы и в % к внесённой в биоматрицу навески аналита.

Результаты выполненных определений аналита в плотных биоматрицах (в данном случае - ткань печени и ткань гнилостно изменённой печени) и жидкой биоматрице (в данном случае - кровь человека) на основе применения УФ-спектрофотометрии составляют табл. 20-22.

Совокупность данных этих таблиц позволяет отметить достаточно высокие аналитические характеристики предлагаемых методик.

Идентификация по характеру удерживания в капиллярной колонке и характеристическим ионам (ГХ-МС)

Остаток в чашке № 2 растворяли в 10 мл хлороформа и брали 2 мкл для исследования.

При определении 2-ДМА-1,3-БФСТП хромато-масс-спектрометрическим методом поступали в соответствии с предложенной ранее методикой, изложенной выше (раздел 3.2 настоящей диссертации). На газо-жидкостной хроматограмме при этом можно было видеть два интенсивных пика, соответствующих двум летучим фрагментам 2-ДМА-1,3-БФСТП со значениями времени удерживания 3,078 мин и 3,911 мин. Соединением, которое удерживается в колонке в течение 3,078 мин, являлся

дифенилдисульфид, а соединением, удерживаемым в течение 3,911 мин, являлся S-фенилбензолтиосульфонат.

В приводимом масс-спектре дифенилдисульфида обнаруживались характеристические положительно заряженные осколки (ионы) с массами 39, 51, 65, 77, 109, 121, 140, 154, 185, 218.

В приводимом масс-спектре S-фенилбензолтиосульфоната присутствовали характеристические осколки (ионы) с массами 51, 65, 77, 97, 109, 125, 141, 152, 185, 250.

Исследуемое вещество с высокой селективностью идентифицировали на основе совпадения времени удерживания двух его летучих фрагментов в капиллярной колонке и массовых чисел характерных осколков данных летучих фрагментов с этими же характеристиками стандартов дифенилдисульфида и S-фенилбензолтиосульфоната.

Идентификация по характеру удерживания в колонке сорбента (метод ВЭЖХ) и оценка количественного содержания

Остаток, находящийся в чашке для выпаривания № 3, подвергали растворению в смеси 1,0 мл диоксана и 0,2 мл пропанола-2, прибавляли 3 мл гексана порциями по 0,5-1,0 мл, количественно перенося раствор в мерную колбу вместимостью 5 мл и добавляли туда гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 5 мл. Пробу полученного таким образом раствора объёмом от 2 до 16 мкл вводили в жидкостный хроматограф. Хроматографировали в колонке полярного сорбента марки «Силасорб-600» высотой 64 и диаметром 2 мм. Элюировали среднеполярной подвижной органической фазой гексан-диоксана-пропанол-2 (15:5:1 по объёму) со скоростью 100 мкл в мин. Регистрировали сигнал УФ-детектора при 256 нм.

Аналит идентифицировали по времени удерживания.

Количество 2-ДМА-1,3-БФСТП в элюируемой пробе рассчитывали по величине площади пика на хроматограмме, основываясь на предварительно

рассчитанном уравнении линии регрессии (градуировочного графика) (описано в разделе 4.2), после чего пересчитывали на навеску.

Результаты определений аналита в плотных биологических матрицах (в данном случае - ткань печени и ткань гнилостно изменённой печени) и жидкой биоматрице (в данном случае - кровь человека) на основе применения ВЭЖХ составляют табл. 20-22.

Совокупность данных этих таблиц позволяет отметить достаточно высокие аналитические характеристики предлагаемых методик.

Определяемый минимум 2-диметиламино-1,3-бис-

(фенилсульфонилтио)пропана в 100 г биоматериала: 0,3-0,4 мг (ткань печени), 0,2-0,25 мг (кровь), 0,4-0,5 мг (ткань печени, подвергшейся гнилостным изменениям).

6.4. Валидация методик определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в биологических объектах с применением метода нормальнофазовой

ВЭЖХ

6.4.1. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП

в ткани печени

Проводя валидацию предлагаемой группы методик, руководствовались принципами, изложенными в ряде нормативных документов, признаваемых в сфере биоаналитических и судебно-химических исследований [25, 113, 114].

А. Разработка градуировочной модели. Оценка линейности

Решая задачу разработки градуировочной модели, в рамках каждого

аналитического цикла готовили ряд из 9 модельных композиций «свежей»

печени от трупа с различным (диапазон от 3,125^ 10-5 до 1,0-10-3 г)

содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматрице, следуя указаниям раздела

6.1. Для реализации этого в ряд термостойких тёмного стекла сосудов

(баночек), чья вместимость составляла около 100 мл, вносили в виде 0,025%

или 0,1% хлороформных растворов различные количества аналита. Летучий

102

растворитель из содержимого сосудов удаляли, помещая их в ток воздуха с температурой, колеблющейся в диапазоне 18-20оС. Затем к остаткам в каждой баночке из представленного ряда добавляли 10 г биоматрицы («свежей» печени от трупа) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м, и активно (2-3 минуты) перемешивали биоматрицу с аналитом. При этом образовывались модельные композиции, в которых содержание аналита в биоматрице составляло 3,125, 6,25, 10, 20, 40, 50, 70, 80 и 100 мкг/г.

Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

Аналогичным описанному являлся порядок приготовления и подготовки к исследованию образцов контрольной биоматрицы.

В дальнейшем определённое количество анализируемой модельной композиции или контрольного образца биоматрицы (масса 10 г) обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы.

Порядок изолирования 2-ДМА-1,3-БФСТП из каждой модельной композиции состоял в том, что каждую модельную композицию (масса 10 г), содержащую аналит, обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут).

Дальнейшие действия воспроизводили этапы изолирования и очистки в соответствии с методикой, приведённой в пункте А раздела 6.3.2.

Остаток, полученный после удаления элюента из фракций элюата с

№ 11 по № 14, которые содержат 2-ДМА-1,3-БФСТП, подвергали

растворению в смеси 1,0 мл диоксана и 0,2 мл пропанола-2, прибавляли 3 мл

гексана порциями по 0,5-1,0 мл, количественно перенося раствор в мерную

103

колбу вместимостью 5 мл, и добавляли туда гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 5 мл.

Пробу полученного таким образом раствора объёмом 16 мкл вводили в жидкостный хроматограф.

Порядок дальнейших операций по хроматографированию методом ВЭЖХ соответствовал представленному в разделе 3.1.2.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствовал 2-ДМА-1,3-БФСГП [57].

Выполняли по 5 измерений каждой концентрации из 5 воспроизведённых аналитических циклов. Вычисляли площади пиков на хроматограммах. Для каждого цикла рассчитывали угол наклона линии регрессии (к), свободный член (Ь) и коэффициент корреляции (г).

Находили средние значения и определяли стандартные отклонения. Рассчитанные таким образом значения к и Ь в данном случае составили соответственно 0,062611 (стандартное отклонение 0,01975) и -0,000859 (стандартное отклонение 0,00598), г=0,99766.

Отсюда уравнение регрессии (градуировочного графика) выглядит следующим образом: 8=кС+Ь=0,062611С-0,000859, где S - площадь пика аналита на хроматограмме, С - концентрация 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматериале, мкг/г. Градуировочный график представлен на рис. 12. Методика приемлема по критерию линейности.

Рисунок 12 - Градуировочный график для определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани печени методом нормальнофазовой ВЭЖХ

Б. Характеристика селективности

Для оценки селективности брали на исследование 6 чистых образцов ткани печени и образцов этого же вида биоматериала, в каждый из которых добавляли стандарт 2-ДМА-1,3-БФСТП в диапазонах концентраций от 1,0-10-5 до 8,0-10-5 г/г. На хроматограммах, соответствующих образцам чистой биоматрицы, не наблюдалось пиков со значениями времени удерживания, совпадающими с временем удерживания аналита или близкими к этому значению.

В. Оценка возможности переноса аналита

Проводя для данной методики оценку возможности переноса аналита, трижды последовательно анализировали пробу очищенного извлечения с высоким содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП (80 мкг/г) и пробу очищенного контрольного извлечения. На хроматограммах, соответствующих очищенным контрольным извлечениям, не наблюдались пики с временем удерживания 2-ДМА-1,3-БФСТП. Это демонстрировало отсутствие явления переноса аналита.

Г. Оценка стабильности

Оценка стабильности стандартного раствора аналита

Для приготовления стандартного (0,04%-ого) раствора 2-ДМА-1,3-

БФСТП его навеску массой 0,01 г подвергали растворению в стеклянной

мерной колбе (внутренний объём 25 мл) в смеси, состоящей из 5,0 мл

диоксана и 1,0 мл пропанола-2, после чего к данному раствору прибавляли

15 мл гексана и добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в

соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 25 мл. Оценку стабильности

приготовленного подобным образом стандартного раствора осуществляли,

выдерживая его в течение 7 суток при температуре 2-4оС. Исследование

сохраняемого стандартного раствора в рамках оценки его стабильности

проводили в начале и в конце указанного временного отрезка (на первый и

105

седьмой дни сохранения). Для этого стандартный раствор перед исследованием разбавляли, получая по три рабочих раствора низкой и высокой концентрации, соответствующих рабочим растворам, получаемым в результате пробоподготовки образцов печени с низким и высоким уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП (соответственно 1,0-10-5 и 8,0-10-5 г/г).

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора низкой концентрации сводилось к тому, что 0,36 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл), после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора высокой концентрации сводилось к тому, что 3,01 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл), после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

По 16 мкл каждого из рабочих растворов низкой концентрации и рабочих растворов высокой концентрации, приготовленных в начале и в конце временного отрезка изучения стабильности стандартного раствора аналита, подвергали хроматографированию. Стабильность оценивали по характеру колебаний значений площади хроматографического пика. Результаты проведённых определений составляют табл. 23.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 23, сравнение результатов исследований первого дня сохранения с результатами исследований последнего дня заданного временного интервала показывает отсутствие заметных изменений значений площадей пиков, полученных для рабочих растворов как с низкой, так и с высокой концентрациями.

Таким образом, стандартный раствор 2-ДМА-1,3-БФСТП является стабильным в условиях его недельной выдержки при заданной температуре.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП, входящего в состав плотной биоматрицы (ткани печени), в условиях замораживания и размораживания

Готовили по 12 образцов ткани «свежей» печени от трупа с низким (1,0-10-5 г/г) и высоким (8,0-10-5 г/г) уровнями содержания аналита.

По три образца каждой концентрации анализировали сразу после приготовления образцов по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела. Все оставшиеся образцы подвергали замораживанию при температуре от -35 до -40оС. Через 10 дней сохранения при выбранной температуре образцы размораживали (режим - комнатная температура), по три образца каждой концентрации подвергали исследованию. Оставшиеся образцы снова замораживали при заданной температуре. Исследования в обозначенном режиме повторяли ещё дважды - через 20 и 30 дней после приготовления образцов. Результаты исследований по изучению долговременной стабильности аналита в модельных композициях с тканью «свежей» печени от трупа в условиях замораживания и размораживания составляют табл. 24.

Сравнение результатов исследований образцов до начала процесса сохранения с результатами исследований после 10, 20 и 30 дней выдерживания при температуре от -35 до -40оС в режиме заморозки-разморозки показывает, что средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых подобным образом образцов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 5,4%.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП стабилен в составе плотной биоматрицы (ткани печени) в течение месяца при температуре от -35 до -40оС после трёх циклов заморозки и разморозки образцов.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП в составе растворов, полученных из образцов «свежей» печени от трупа в результате пробоподготовки

Готовили по 6 образцов ткани «свежей» печени от трупа с низким (1,0-10-5 г/г) и высоким (8,0-10-5 г/г) уровнями содержания аналита.

Все приготовленные образцы подвергали пробоподготовке по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела, получая в итоге растворы (по 5 мл) аналита в подвижной фазе (смеси гексана, диоксана и пропанола-2, взятых в соотношении 15:5:1 по объёму).

Половину приготовленных растворов (три с низкой и три с высокими концентрациями) подвергали исследованию непосредственно после их получения. Через неделю сохранения при температуре 2-4оС исследовали по три раствора каждой концентрации из числа оставшихся.

Результаты исследований по изучению стабильности аналита в составе растворов, полученных из образцов «свежей» печени от трупа в результате пробоподготовки составляют табл. 25.

Сравнение результатов исследований растворов аналита, полученных в результате пробоподготовки, до начала процесса сохранения с результатами исследований после недельного выдерживания при 2-4оС, показывает, что средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых растворов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 1,4%.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП, изолированный из образцов «свежей» печени от трупа, стабилен после пробоподготовки в течение недели при температуре 2-4оС.

Д. Характеристика правильности и одновременно прецизионности

Оценку по критерию правильности проводили одновременно с оценкой прецизионности, используя объединенную группу результатов

анализа образцов исходно «чистой» биоматрицы, в которую добавлялись стандартные массы аналита [57].

При этом в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 50 мл, вносили 0,1, 0,4 и 0,8 мл 0,1% раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП в хлороформе. В этих внесённых объёмах содержалось соответственно 100, 400 и 800 мкг исследуемого вещества. После испарения растворителя из внесённых порций растворов, в каждую баночку прибавляли 10 г мелкоизмельчённой (размер частиц от 2 до 5 мм) ткани печени (холостые образцы биоматрицы) и тщательно, в течение 2-3 минут, перемешивали биологический материал с исследуемым веществом. Таким образом, получали образцы биоматрицы с условно нижним (10 мкг/г), условно средним (40 мкг/г) и условно высоким (80 мкг/г) уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматериале.

За нижний уровень в нашем случае выбиралось содержание аналита 10 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее примерно трёхкратному ПКО (пределу количественного определения), за верхний уровень принималось содержание аналита 80 мкг в 1 г биоматрицы, составляющее 4/5 верхнего предела рабочего диапазона данной методики. Средним уровнем являлось содержание аналита 40 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее середине между верхним и нижним уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Приготовленные модельные композиции (образцы биоматрицы с обозначенными уровнями содержания аналита) выдерживались 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

По истечении обозначенного времени проводили по 5 параллельных измерений в отношении каждой модельной композиции (образца) в течение двух следующих друг за другом аналитических циклов (в первый и во второй (последующий) дни) так, как описано выше для разработки градуировочной модели.

Количества аналита (в г и в % от его массы, добавленной в биоматрицу) в образцах определяли на основе оценки площади пика, используя уравнение регрессии.

Результаты для оценки правильности и одновременно прецизионности методики в отдельных сериях (аналитических циклах) сведены в табл. 26.

Е. Характеристика прецизионности между сериями определений

Принимая во внимание результаты, полученные при определении правильности и одновременно прецизионности внутри отдельных серий, проводили оценку методики по критерию прецизионности между сериями определений.

При этом результаты определений количества аналита в биоматрице для каждого уровня концентрации, полученные в отдельных сериях (аналитических циклах), группировали в одну общую выборку. Рассчитывали генеральное среднее значение, а затем - значения стандартного отклонения (Б) и относительного стандартного отклонения генерального среднего значения (Бг, %). Последнее являлось величиной, характеризующей прецизионность методики.

Результаты валидационной оценки методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани печени по критерию прецизионности между сериями определений представлены в табл. 27.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 27, разработанная методика удовлетворяет критерию прецизионности, т.к. значения Бг, % не превышают 10%.

6.4.2. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани гнилостно изменённой печени

А. Разработка градуировочной модели. Оценка линейности

Решая задачу разработки градуировочной модели, в рамках каждого

аналитического цикла готовили ряд из 9 модельных композиций гнилостно

110

изменённой печени от трупа с различным (диапазон от 4,0-10-5 до 1,0-10-3 г) содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматрице, следуя указаниям раздела 6.1. Для реализации этого в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 100 мл, вносили в виде 0,025% или 0,1% хлороформных растворов различные количества аналита. Летучий растворитель из содержимого сосудов удаляли, помещая их в ток воздуха с температурой, колеблющейся в диапазоне 18-20оС. Затем к остаткам в каждой баночке из представленного ряда добавляли 10 г биоматрицы (гнилостно изменённой печени от трупа) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м, и активно (2-3 минуты) перемешивали биоматрицу с аналитом. При этом образовывались модельные композиции, в которых содержание аналита в биоматрице составляло 4,0, 6,25, 12,5, 20, 40, 50, 70, 80 и 100 мкг/г.

Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

Аналогичным описанному являлся порядок приготовления и подготовки к исследованию образцов контрольной биоматрицы.

В дальнейшем определённое количество анализируемой модельной композиции или контрольного образца биоматрицы (масса 10 г) обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы.

Порядок изолирования 2-ДМА-1,3-БФСТП из каждой модельной композиции состоял в том, что каждую модельную композицию (масса 10 г), содержащую аналит, обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут).

Дальнейшие действия воспроизводили этапы изолирования и очистки в

111

соответствии с методикой, приведённой в пункте Б раздела 6.3.2.

Остаток, полученный после удаления элюента из фракций элюата №№ 11-14, растворяли в смеси 1,0 мл диоксана и 0,2 мл пропанола-2, прибавляли 3 мл гексана порциями по 0,5-1,0 мл, количественно перенося раствор в мерную колбу вместимостью 5 мл и добавляли туда гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 5 мл.

Пробу полученного таким образом раствора объёмом 16 мкл вводили в жидкостный хроматограф.

Порядок дальнейших операций по хроматографированию методом ВЭЖХ соответствовал представленному в разделе 3.1.2.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствовал 2-ДМА-1,3-БФСТП [56].

Выполняли по 5 измерений каждой концентрации из 5 воспроизведённых аналитических циклов. Вычисляли площади пиков на хроматограммах. Для каждого цикла рассчитывали угол наклона линии регрессии (к), свободный член (Ь) и коэффициент корреляции (г).

Находили средние значения и определяли стандартные отклонения. Рассчитанные таким образом значения к и Ь в данном случае составили соответственно 0,060836 (стандартное отклонение 0,02204) и 0,018226 (стандартное отклонение 0,04326), г=0,995618.

Отсюда уравнение регрессии (градуировочного графика) выглядит следующим образом: 8=кС+Ь=0,060836 С+0,018226, где S - площадь пика аналита на хроматограмме, С - концентрация 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматериале, мкг/г.

Градуировочный график представлен на рис. 13.

Методика приемлема по критерию линейности.

в, см3

20 40 60 80 100

С, мкг/г

Рисунок 13 - Градуировочный график для определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани гнилостно изменённой печени методом нормальнофазовой ВЭЖХ

Б. Характеристика селективности

Для оценки селективности брали на исследование 6 чистых образцов ткани гнилостно изменённой печени и образцов этого же вида биоматериала, в каждый из которых добавляли стандарт 2-ДМА-1,3-БФСТП в диапазонах концентраций от 1,0-10-5 до 8,0-10-5 г/г. На хроматограммах, соответствующих образцам чистой биоматрицы, не наблюдалось пиков со значениями времени удерживания, совпадающими с временем удерживания аналита или близкими к этому значению.

В. Оценка возможности переноса аналита

Проводя для данной методики оценку возможности переноса аналита, трижды последовательно анализировали пробу очищенного извлечения с высоким содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП (80 мкг/г) и пробу очищенного контрольного извлечения. На хроматограммах, соответствующих очищенным контрольным извлечениям, не наблюдались пики с временем удерживания 2-ДМА-1,3-БФСТП. Это демонстрировало отсутствие явления переноса аналита.

Г. Оценка стабильности

Оценка стабильности стандартного раствора аналита

Для приготовления стандартного (0,04%-ого) раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП его навеску массой 0,01 г подвергали растворению в стеклянной мерной колбе (внутренний объём 25 мл) в смеси, состоящей из 5,0 мл диоксана и 1,0 мл пропанола-2, после чего к данному раствору прибавляли 15 мл гексана и добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 25 мл. Оценку стабильности приготовленного подобным образом стандартного раствора осуществляли, выдерживая его в течение 7 суток при температуре 2-4оС. Исследование сохраняемого стандартного раствора в рамках оценки его стабильности проводили в начале и в конце указанного временного отрезка (на первый и седьмой дни сохранения). Для этого стандартный раствор перед исследованием разбавляли, получая по три рабочих раствора низкой и высокой концентрации, соответствующих рабочим растворам, получаемым в результате пробоподготовки образцов печени с низким и высоким уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП (соответственно 1,2-10-5 и 8,0-10-5 г/г).

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора низкой концентрации сводилось к тому, что 0,44 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл), после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора высокой концентрации сводилось к тому, что 2,77 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл), после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

По 16 мкл каждого из рабочих растворов низкой концентрации и

рабочих растворов высокой концентрации, приготовленных в начале и в

114

конце временного отрезка изучения стабильности стандартного раствора аналита, подвергали хроматографированию. Стабильность оценивали по характеру колебаний значений площади хроматографического пика. Результаты проведённых определений составляют табл. 23.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 23, сравнение результатов исследований первого дня сохранения с результатами исследований последнего дня заданного временного интервала показывает отсутствие заметных изменений значений площадей пиков, полученных для рабочих растворов как с низкой, так и с высокой концентрациями.

Таким образом, стандартный раствор 2-ДМА-1,3-БФСТП является стабильным в условиях его недельной выдержки при заданной (2-4оС) температуре.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП, входящего в состав плотной биоматрицы (гнилостно изменённой ткани печени), в условиях замораживания и размораживания

Готовили по 12 образцов ткани гнилостно изменённой печени от трупа с низким (1,2-10-5 г/г) и высоким (8,0-10-5 г/г) уровнями содержания аналита.

По три образца каждой концентрации анализировали сразу после приготовления образцов по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела. Все оставшиеся образцы подвергали замораживанию при температуре от -35 до -40оС. Через 10 дней сохранения при выбранной температуре образцы размораживали (режим - комнатная температура), по три образца каждой концентрации подвергали исследованию. Оставшиеся образцы снова замораживали при заданной температуре. Исследования в обозначенном режиме повторяли ещё дважды - через 20 и 30 дней после приготовления образцов. Результаты исследований по изучению долговременной стабильности аналита в модельных композициях с тканью гнилостно изменённой печени от трупа в условиях замораживания и размораживания составляют табл. 24.

Сравнение результатов исследований образцов до начала процесса сохранения с результатами исследований после 10, 20 и 30 дней выдерживания при температуре от -35 до -40оС в режиме заморозки-разморозки показывает, что средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых подобным образом образцов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 5,5%.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП стабилен в составе плотной биоматрицы (ткани гнилостно изменённой печени) в течение месяца при температуре от -35 до -40оС после трёх циклов заморозки и разморозки образцов.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП в составе растворов, полученных из образцов ткани гнилостно изменённой печени в результате пробоподготовки

Готовили по 6 образцов ткани гнилостно изменённой печени от трупа с низким (1,2-10-5 г/г) и высоким (8,0-10-5 г/г) уровнями содержания аналита.

Все приготовленные образцы подвергали пробоподготовке по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела, получая в итоге растворы (по 5 мл) аналита в подвижной фазе (смеси гексана, диоксана и пропанола-2, взятых в соотношении 15:5:1 по объёму).

Половину приготовленных растворов (три с низкой и три с высокими концентрациями) подвергали исследованию непосредственно после их получения. Через неделю сохранения при температуре 2-4оС исследовали по три раствора каждой концентрации из числа оставшихся.

Результаты исследований по изучению стабильности аналита в составе растворов, полученных из образцов гнилостно изменённой печени от трупа в результате пробоподготовки составляют табл. 25.

Сравнение результатов исследований растворов аналита, полученных в результате пробоподготовки, до начала процесса сохранения с результатами исследований после недельного выдерживания при 2-4оС, показывает, что

средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых растворов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 2,3%.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП, изолированный из образцов гнилостно изменённой печени от трупа, стабилен после пробоподготовки в течение недели при температуре 2-4оС.

Д. Характеристика правильности и одновременно прецизионности

Оценку по критерию правильности проводили одновременно с оценкой прецизионности, используя объединенную группу результатов анализа образцов исходно «чистой» биоматрицы, в которую добавлялись стандартные массы аналита [56].

При этом в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 50 мл, вносили 0,125, 0,4 и 0,8 мл 0,1% раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП в хлороформе. В этих внесённых объёмах содержалось соответственно 125, 400 и 800 мкг исследуемого вещества. После испарения растворителя из внесённых порций растворов в каждую баночку прибавляли 10 г мелкоизмельчённой (размер частиц от 2 до 5 мм) ткани гнилостно изменённой печени (холостые образцы биоматрицы) и тщательно, в течение 2-3 минут, перемешивали биологический материал с исследуемым веществом. Таким образом, получали образцы биоматрицы с условно нижним (12,5 мкг/г), условно средним (40 мкг/г) и условно высоким (80 мкг/г) уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматериале.

За нижний уровень в нашем случае выбиралось содержание аналита 10 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее примерно трёхкратному ПКО (пределу количественного определения), за верхний уровень принималось содержание аналита 80 мкг в 1 г биоматрицы, составляющее 4/5 верхнего предела рабочего диапазона данной методики. Средним уровнем являлось содержание аналита 40 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее середине между верхним и нижним уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП. Приготовленные модельные композиции (образцы биоматрицы с

обозначенными уровнями содержания аналита) выдерживались 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

По истечении обозначенного времени проводили по 5 параллельных измерений в отношении каждой из заданных модельных композиций (образца) в течение двух следующих друг за другом аналитических циклов (в первый и во второй (последующий) дни) так, как описано выше для разработки градуировочной модели.

Количества аналита (в г и в % от его массы, внесённой в биоматрицу) в образцах определяли на основе оценки площади пика, используя уравнение регрессии.

Результаты для оценки правильности и одновременно прецизионности предлагаемой методики в отдельных сериях (аналитических циклах) сведены в табл. 28.

Е. Характеристика прецизионности между сериями определений

Принимая во внимание результаты, полученные при определении правильности и одновременно прецизионности внутри отдельных серий, проводили оценку методики по критерию прецизионности между сериями определений.

При этом результаты определений количества аналита в биоматрице для каждого уровня концентрации, полученные в отдельных сериях (аналитических циклах), группировали в одну общую выборку. Рассчитывали генеральное среднее значение, а затем значения стандартного отклонения (Б) и относительного стандартного отклонения генерального среднего значения (Бг, %). Последнее являлось величиной, характеризующей прецизионность методики.

Результаты валидационной оценки методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани гнилостно изменённой печени по критерию прецизионности между сериями определений представлены в табл. 29.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 29, разработанная методика удовлетворяет критерию прецизионности, т.к. значения Бг, % не превышают 10%.

6.4.3. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП

в крови

А. Разработка градуировочной модели. Оценка линейности

Решая задачу разработки градуировочной модели, в каждом аналитическом цикле готовили ряд из 9 модельных композиций человеческой крови с различным (диапазон от 2,25-10-5 до 1,0-10-3 г) содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматрице, следуя указаниям раздела 6.1. Для реализации этого в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 100 мл, вносили в виде 0,025% или 0,1% хлороформных растворов различные количества аналита. Летучий растворитель из содержимого сосудов удаляли, помещая их в ток воздуха с температурой, колеблющейся в диапазоне 18-20оС. Затем к остаткам в каждой баночке из представленного ряда добавляли 10 г биоматрицы (крови человека) в виде частиц, размер которых колебался в диапазоне от 2-10-3 до 5-10-3 м, и активно (2-3 минуты) перемешивали биоматрицу с аналитом. При этом образовывались модельные композиции, в которых содержание аналита в биоматрице составляло 2,25, 3,75, 7,50, 20, 40, 50, 70, 80 и 100 мкг/г.

Каждая из таких смесей в соответствующей баночке, герметично закрытой полиэтиленовой (под резиновую обхватку) или пищевой плёнкой, оставлялась на 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне 18-20оС.

Аналогичным описанному являлся порядок приготовления и подготовки к исследованию образцов контрольной биоматрицы. В дальнейшем определённое количество анализируемой модельной

композиции или контрольного образца биоматрицы (масса 10 г) обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы.

Порядок изолирования 2-ДМА-1,3-БФСТП из каждой модельной композиции состоял в том, что каждую модельную композицию (масса 10 г), содержащую аналит, обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (20 г) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут).

Дальнейшие действия воспроизводили этапы изолирования и очистки в соответствии с методикой, приведённой в пункте В раздела 6.3.2.

Остаток, полученный после удаления элюента из фракций элюата №№ 11-14, растворяли в смеси 1,0 мл 1,4-диоксана и 0,2 мл пропанола-2, прибавляли 3 мл гексана порциями по 0,5-1,0 мл, количественно перенося раствор в мерную колбу вместимостью 5 мл и добавляли туда гексан, 1,4-диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 5 мл.

Пробу полученного таким образом раствора объёмом 16 мкл вводили в жидкостный хроматограф.

Порядок дальнейших операций по хроматографированию методом нормальнофазовой ВЭЖХ соответствовал представленному в разделе 3.1.2.

Пик с временем удерживанием 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствовал 2-ДМА-1,3-БФСТП [2].

Выполняли по 5 измерений каждой концентрации из 5 воспроизведённых аналитических циклов. Вычисляли площади пиков на хроматограммах. Для каждого цикла рассчитывали угол наклона линии регрессии (к), свободный член (Ь) и коэффициент корреляции (г).

Находили средние значения и определяли стандартные отклонения. Рассчитанные таким образом значения к и Ь в данном случае составили

соответственно 0,064223 (стандартное отклонение 0,02763) и 0,015659 (стандартное отклонение 0,03371), г = 0,99918.

Отсюда уравнение градуировочного графика выглядит следующим образом: Б= кС+Ь = 0,064223 С+0,015659, где S - площадь пика аналита, С - масса 2-ДМА-1,3-БФСГП в элюируемой (хроматографируемой) пробе, мкг.

Градуировочный график изображён на рис. 14.

Рисунок 14 - Градуировочный график для определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в крови методом нормальнофазовой ВЭЖХ

Б. Характеристика селективности

Для оценки селективности брали на исследование 6 чистых образцов крови и образцов этого же вида биоматериала, в каждый из которых добавляли стандарт 2-ДМА-1,3-БФСТП в диапазонах концентраций 7,5-10-68,0-10-5 г/г. На хроматограммах, соответствующих образцам чистой биоматрицы, не наблюдалось пиков со значениями времени удерживания, совпадающими с временем удерживания аналита или близкими к этому значению.

В. Оценка возможности переноса аналита

Проводя для данной методики оценку возможности переноса аналита, трижды последовательно анализировали пробу очищенного извлечения с высоким содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП (80 мкг/г) и пробу очищенного контрольного извлечения. На хроматограммах, соответствующих очищенным контрольным извлечениям, не наблюдались пики с временем удерживания 2-ДМА-1,3-БФСТП. Это демонстрировало отсутствие явления переноса аналита.

Г. Оценка стабильности

Оценка стабильности стандартного раствора аналита

Для приготовления стандартного (0,04%-ого) раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП его навеску массой 0,01 г подвергали растворению в стеклянной мерной колбе (внутренний объём 25 мл) в смеси, состоящей из 5,0 мл диоксана и 1,0 мл пропанола-2, после чего к данному раствору прибавляли 15 мл гексана и добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 25 мл. Оценку стабильности приготовленного подобным образом стандартного раствора осуществляли, выдерживая его в течение 7 суток при температуре 2-4оС. Исследование сохраняемого стандартного раствора в рамках оценки его стабильности проводили в начале и в конце указанного временного отрезка (на первый и седьмой дни сохранения). Для этого стандартный раствор перед исследованием разбавляли, получая по три рабочих раствора низкой и высокой концентрации, соответствующих рабочим растворам, получаемым в результате пробоподготовки образцов печени с низким и высоким уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП (соответственно 7,5-10-6 и 8,0-10-5 г/г).

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора низкой концентрации сводилось к тому, что 0,37 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл),

после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

Получение из сохраняемого исходного стандартного раствора рабочего раствора высокой концентрации сводилось к тому, что 3,18 мл исходного раствора помещали в стеклянную мерную колбу (внутренний объём 10 мл), после чего добавляли в колбу гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в соотношении 15:5:1 по объёму, до отметки 10 мл.

По 16 мкл каждого из рабочих растворов низкой концентрации и рабочих растворов высокой концентрации, приготовленных в начале и в конце временного отрезка изучения стабильности стандартного раствора аналита, подвергали хроматографированию. Стабильность оценивали по характеру колебаний значений площади хроматографического пика. Результаты проведённых определений составляют табл. 23.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 23, сравнение результатов исследований первого дня сохранения с результатами исследований последнего дня заданного временного интервала показывает отсутствие заметных изменений значений площадей пиков, полученных для рабочих растворов как с низкой, так и с высокой концентрациями.

Таким образом, стандартный раствор 2-ДМА-1,3-БФСТП является стабильным в условиях его недельной выдержки при заданной (2-4оС) температуре.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП, входящего в состав жидкой биоматрицы (крови), в условиях замораживания и размораживания

Готовили по 12 образцов крови с низким (7,5-10-6 г/г) и высоким (8,0-10-5 г/г) уровнями содержания аналита.

По три образца каждой концентрации анализировали сразу после приготовления образцов по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела. Все оставшиеся образцы подвергали замораживанию при 35-40оС.

Через 10 дней сохранения при выбранной температуре образцы размораживали (режим - комнатная температура), по три образца каждой концентрации подвергали исследованию. Оставшиеся образцы снова замораживали при заданной температуре. Исследования в обозначенном режиме повторяли ещё дважды - через 20 и 30 дней после приготовления образцов. Результаты исследований по изучению долговременной стабильности аналита в модельных композициях с кровью в условиях замораживания и размораживания составляют табл. 24.

Сравнение результатов исследований образцов до начала процесса сохранения с результатами исследований после 10, 20 и 30 дней выдерживания при температуре от -35 до -40оС в режиме заморозки-разморозки показывает, что средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых подобным образом образцов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 3,1 %.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП стабилен в составе жидкой биоматрицы (крови) в течение месяца при температуре от -35 до -40оС после трёх циклов заморозки и разморозки образцов.

Оценка стабильности 2-ДМА-1,3-БФСТП в составе растворов, полученных из образцов жидкой биоматрицы (крови) в результате пробоподготовки

Готовили по 6 образцов крови с низким (7,5-10-6 г/г) и высоким (8,010-5 г/г) уровнями содержания аналита.

Все приготовленные образцы подвергали пробоподготовке по схеме, приводимой выше в пункте «А» данного раздела, получая в итоге растворы (по 5 мл) аналита в подвижной фазе (смеси гексана, диоксана и пропанола-2, взятых в соотношении 15:5:1 по объёму).

Половину приготовленных растворов (три с низкой и три с высокими концентрациями) подвергали исследованию непосредственно после их получения. Через неделю сохранения при температуре 2-4оС исследовали по

три раствора каждой концентрации из числа оставшихся.

Результаты исследований по изучению стабильности аналита в составе растворов, полученных из образцов крови в результате пробоподготовки составляют табл. 25.

Сравнение результатов исследований растворов аналита, полученных в результате пробоподготовки, до начала процесса сохранения с результатами исследований после недельного выдерживания при 2-4оС, показывает, что средние значения площадей пиков, полученных для сохраняемых растворов, изменяются в процессе сохранения не более, чем на 0,9%.

Таким образом, 2-ДМА-1,3-БФСТП, изолированный из образцов крови, стабилен после пробоподготовки в течение недели при температуре 2-4оС.

Д. Характеристика правильности и одновременно прецизионности

Оценку правильности проводили одновременно с оценкой прецизионности, используя объединенную группу результатов исследования образцов исходно «чистой» биоматрицы, в которую добавлялись стандартные массы аналита [2].

При этом в ряд термостойких тёмного стекла сосудов (баночек), чья вместимость составляла около 50 мл, вносили 0,075, 0,4 и 0,8 мл 0,1% раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП в хлороформе. В этих внесённых объёмах содержалось соответственно 75, 400 и 800 мкг исследуемого вещества. После испарения растворителя из внесённых порций растворов в каждую баночку прибавляли 10 г человеческой крови (холостые образцы биоматрицы) и тщательно, в течение 2-3 минут, перемешивали биологический материал с исследуемым веществом. Таким образом, получали образцы биоматрицы с условно нижним (7,5 мкг/г), условно средним (40 мкг/г) и условно высоким (80 мкг) уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП в биоматериале.

За нижний уровень в нашем случае выбиралось содержание аналита 7,5 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее примерно трёхкратному ПКО (пределу количественного определения), за верхний уровень принималось

содержание аналита 80 мкг в 1 г биоматрицы, составляющее 4/5 верхнего предела рабочего диапазона данной методики. Средним уровнем являлось содержание аналита 40 мкг в 1 г биоматрицы, соответствующее середине между верхним и нижним уровнями содержания 2-ДМА-1,3-БФСТП. Приготовленные модельные композиции (образцы биоматрицы с обозначенными уровнями содержания аналита) выдерживались 1,5 часа при внешней температуре, колеблющейся в диапазоне от 18 до 20оС.

По истечении обозначенного времени выполняли по 5 измерений в отношении каждой заданной модельной композиции (образца) в течение двух следующих друг за другом аналитических циклов (в первый и во второй (последующий) дни) так, как описано выше для разработки градуировочной модели.

Количества аналита (в г и в % от его массы, внесённой в биоматрицу) в образцах определяли на основе оценки площади пика на хроматограмме, применяя уравнение градуировочного графика. Результаты оценки правильности и одновременно прецизионности предлагаемой методики составляют табл. 30.

Е. Характеристика прецизионности между сериями определений

Принимая во внимание результаты, полученные при определении правильности и одновременно прецизионности внутри отдельных серий, проводили оценку методики по критерию прецизионности между сериями определений.

При этом результаты определений количества аналита в биоматрице для каждого уровня концентрации, полученные в отдельных сериях (аналитических циклах), группировали в одну общую выборку. Рассчитывали генеральное среднее значение, а затем значения стандартного отклонения (Б) и относительного стандартного отклонения генерального среднего значения (Бг, %). Последнее являлось величиной, характеризующей прецизионность методики.

Результаты валидационной оценки методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в крови по критерию прецизионности между сериями определений представлены в табл. 31.

Как свидетельствуют совокупные данные табл. 31, разработанная методика удовлетворяет критерию прецизионности, т.к. значения Sг, % не превышают 10%.

Выводы по главе 6

1. Проведено изучение особенностей изолирования 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана из различных биологических матриц.

Наилучшее извлечение рассматриваемого вещества наблюдается при использовании в качестве изолирующих жидкостей толуола и этилацетата.

2. Установлено, что оптимальными для изолирования аналита толуолом и этилацетатом являются: двукратное настаивание, соотношение экстрагент-биоматрица 2:1 по массе, продолжительность каждого настаивания 30 минут.

3. Разработаны методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в биоматериале на основе изолирования толуолом (для трупных органов) или этилацетатом (для трупных органов и крови) и хроматографической очистки.

4. Выявлено, что при концентрации аналита 2,5-10-2 г в 25 г биоматериала методики изолирования толуолом позволяют определить в ткани печени и гнилостно изменённой печени 75,75-75,89% и 75,39-75,42% вещества, а этилацетатом, в этих же органах и крови, соответственно 73,7773,82%; 73,66-73,71% и 76,73-77,82%.

Определяемый минимум 2-диметиламино-1,3-бис-

(фенилсульфонилтио)пропана в 100 г животного биоматериала составляет 312,5-350,0 мкг (ткань печени), 400-475 мкг (ткань печени, подвергшейся гнилостным изменениям), 225-250 мкг (кровь).

5. Валидированы методики определения аналита в ткани печени, ткани гнилостно измененной печени и крови с использованием метода нормальнофазовой ВЭЖХ после изолирования аналита этилацетатом и его очистки колоночной адсорбционной хроматографией. Методики приемлемы по показателям линейности, правильности и прецизионности.

Для методики определения в ткани печени (интервал концентраций 1080 мкг в 1 г матрицы) относительная погрешность составляет от -8,36 до 9,16, стандартное отклонение - 0,7496-3,3881, относительное стандартное отклонение (%) - 4,3368-7,336. Для методики определения в ткани гнилостно изменённой печени (интервал концентраций 12,5-80,0 мкг в 1 г матрицы) данные параметры составляют соответственно от -8,58 до 12,51, 1,07293,7479, 4,8670-8,495, для методики определения в крови (интервал концентраций 7,5-80,0 мкг в 1 г матрицы) - соответственно от -7,20 до 5,62, 0,4568-3,4521 и 4,0526-6,6207.

ГЛАВА 7. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 2-ДИМЕ ТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В ОРГАНИЗМЕ ТЕПЛОКРОВНЫХ И УСТОЙЧИВОСТЬ ИССЛЕДУЕМОГО АНАЛИТА

В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ

7.1. Характер распределения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в различных органах и биожидкостях

теплокровных

Для определения органов или биожидкостей - возможных объектов исследования в рамках проведения судебно-химических экспертиз случаев отравления субстанцией или препаратами 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана (2-ДМА-1,3-БФСТП) - проанализирован характер распределения данного аналита у теплокровных.

Объектом поведённого исследования являлась субстанция 2-ДМА-1,3-БФСТП, содержащая более чем 97% действующего начала (стандартный образец предприятия 342-034-2003).

В качестве модели теплокровных организмов, подвергшихся отравляющему воздействию анализируемого вещества - объекта исследования, рассмотрены крысы.

В процессе исследования 25 крысам, объединённым в пять исследуемых групп по пять животных в каждой, вводили при помощи зонда (внутренний диаметр 2 мм) в желудок две ЬБ50 2-ДМА-1,3-БФСТП (2240 мг субстанции на один кг живой массы особи). После гибели крыс производили вскрытие трупов. Одинаковые биологические матрицы (органы, их содержимое и биожидкости), взятые от трупов животных, относящихся к определённой группе, объединяли и осуществляли действия по обнаружению в них 2-ДМА-1,3-БФСТП.

Наряду с этим анализировали биологические жидкости, органы и их содержимое, отобранные из трупов особей группы контроля, состоящей из пяти подопытных животных [39, 40, 58].