Свойства мутантов пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и стереоселективного гидролиза амидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Ямскова, Ольга Васильевна

• Ямскова, Ольга Васильевна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ямскова, Ольга Васильевна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1. 1. Общие сведения о пенициллинацилазе из Е. coli

1. 2. Методы определения ферментативной активности пенициллинацилазы

1.3. Очистка пенициллинацилазы

1. 3. 1. Источники пенициллинацилазы и способы её первичного выделения

1. 3. 2. Очистка пенициллинацилазы 22 1. 4. Применение ПА из Е.coli для получения энантиомерно чистых соединений

1. 5. Применение ПА из Е. coli в реакциях ферментативного ацильного переноса 43 1.6. Изменение каталитических свойств ПА при помощи мутагенеза 2. Экспериментальная часть

2. 1. Материалы 49 2. 2. Методы

2. 2. 1. Культивирование клеток, содержащих пенициллинацилазу и её 50 мутантные формы

2. 2. 2. Выделение пенициллинацилазы и её мутантных форм методом 51 осмотического шока

2. 2. 3. Очистка пенициллинацилазы и её мутантных форм при помощи 51 гидрофобной хроматографии

2. 2. 4. Определение активности пенициллинацилазы и её мутантных форм

2. 2. 5. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы и её 52 мутантных форм

2. 2. 6. Исследование термостабильности пенициллинацилазы и её мутантных 53 форм

2. 2. 7. Исследование рН-стабильности пенициллинацилазы и её мутантных

2. 2. 8. Количественное определение компонентов реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2. 2. 9. Определение энантиомеров первичных аминосоединений методом предколоночной дериватизации ортофталевым альдегидом 2. 2. 10. Определение энантиоселективности реакции ферментативного гидролиза

И-фенилацетильных производных аминокислот, аминов и аминоспиртов 2. 2. 11. Определение энантиоселективности реакции ферментативного гидролиза ч[-(К)-манделил-производных аминосоединений 2. 2. 12. Химический синтез И-фенилацетильных производных аминосоединений 57 2. 2. 13. Определение кинетических параметров ферментативного ацильного переноса на 6-аминопенициллановую кислоту 2. 2. 14. Определение соотношения скоростей синтеза/гидролиза и 58 максимального выхода цлевого продукта в реакции ферментативного синтеза ампициллина

2. 2. 15. Исследование кинетики ферментативного ацилирования аминосоединений Л- и Э-амидом миндальной кислоты 2. 2. 16. Исследование кинетики ферментативного ацилирования первичного 60 аминосоединения амидом Я-миндальной кислоты

2. 2. 17. Исследование кинетических параметров ацильного переноса, катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы, на Э-энантиомеры аминосоединений с использованием фенилацетамида в качестве ацильного донора и определение максимального выхода целевого продукта

3. Обсуждение результатов 62 3. 1. Очистка рекомбинантных пенициллинацилаз 64 3.2. Каталитическая активность мутантных форм пенициллинацилазы 69 3. 3. Стабильность мутантных форм 71 3. 4. Мутантные формы пенициллинацилазы в реакции гидролиза Т\т-ацильных производных аминосоединений 3. 4. 1. Ферментативный гидролиз К-фенилацетильного производного аспарагиновой кислоты 3. 4. 2. Ферментативный гидролиз ТЧ-ацильных производных первичных аминов 76 и аминоспиртов

3. 5. Мутантные формы пенициллинацилазы как катализаторы реакции ацильного 78 переноса

3. 5. 1. Влияние введения мутаций на эффективность ферментативного синтеза 78 ампициллина

3. 5. 2. Использование мутантной формы аА^145Ьеи и рРЬе71Ьеи в качестве катализатора ацилирования аминосоединений в водной среде

4. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства мутантов пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и стереоселективного гидролиза амидов»

Актуальность проблемы. Использование биокатализаторов в тонком органическом синтезе находит все более широкое применение. Привлекательность биокаталитических превращений заключается в уникальной субстратной и стереоспецифичности действия ферментов, возможности проведения реакций в "мягких", экологически благоприятных условиях. Успешным примером является применение пенициллинацилазы из Escherichia coli для модификации бета-лактамных антибиотиков как на стадии гидролиза природного пенициллина с целью получения ядра пенициллинов б-аминопенициллановой кислоты, так и на стадии ферментативного ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты с целью получения новых «полусинтетических» антибиотиков этого класса. На основании исследований последних лет, показавших высокую стереоселективность пенициллинацилазы, следует " предположить, что этот фермент найдет широкое применение и при получении энантиомерно чистых соединений. Детальные исследования выявили, что пенициллинацилаза обладает широкой субстратной специфичностью и высокой стереоселективностью в реакциях ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производнь!^'"аминокислот. В "то же время было установлено, что каталитическая эффективность и стереоселективность фермента дикого типа в реакциях ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных первичных аминов и аминоспиртов недостаточна для эффективного расщепления рацематов этих' соединений. На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из Escherichia coli ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения4 способности фермента катализировать синтез бета-лактамных антибиотиков. Следует отметить, что поиск мутантных форм пенициллинацилазы с улучшенной способностью катализировать ферментативный ацильный перенос на первичные амины не может быть сведен к использованию мутаций, которые улучшали способность к синтезу антибиотиков из-за принципиальных отличий в структуре субстратов и в условиях проведения соответствующих реакций. Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, задачей диссертационной работы было также увеличение стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены.

Цель и задачи исследования. Основной задачей настоящей работы явилось изучение мутантных препаратов пенициллинацилазы из Е.соН по положению 145, 149 альфа цепи, а также 71, 384, 385 бета цепи с целью поиска форм фермента с увеличенной стереоселективностью и каталитической эффективностью в реакциях ацилирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих М-ацильных производных. В соответствии с этим, было необходимо изучить каталитические свойства мутантных препаратов пенициллинацилазы, в частности, получить гомогенные препараты мутантных форм пенициллинацилазы, провести первичную характеристику их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселективного ацильного переноса на первичные амины и аминоспирты, а также гидролиза соответствующих Ы-ацильных проиводных.

Обзор литературы 1.1. Общие сведения о пенициллинацилазе из Е. coli

Пенициллинацилаза (ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз (К.Ф.3.5.1.11). Впервые ПА выделили в 50-х годах из грибов Pénicillium chrysogenum и Aspergillus oryzae [1, 2], а в дальнейшем обнаружили у разных микроорганизмов [3, 4, 5, 6, 7, 8]. Хотя ПА из разных продуцентов характеризуются достаточно высокой степенью гомологичности [9], они могут достаточно сильно отличаться между собой по каталитическим свойствам [10, 11, 12, 13]. Уникальным свойством ферментов данного семейства является их способность избирательно катализировать расщепление амидной связи пенициллина, не затрагивая более лабильную ß-лактамную связь ядра антибиотика.

ПА из E.coli АТСС 11105 состоит из а- и ß- цепей (23.9 кДа и 61.5 кДа, соответственно) [14], которые получаются в результате протеолитической активации общего мембран но-связанного предшественника (стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы представлено на рис. 1).

Рис. 1. Стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы: а-субъединица показана красным цветом, (3-субъединица — зеленым.

Предшественник синтезируется как полипептид 92 кДа, состоящий из сигнального пептида, содержащего 26 аминокислот (а.к.), а также а- и р-субъединиц (209 а.к. и 557 а.к., соответственно), разделенных эндопептидом (54 а.к.) [15]. Обе цепи, из которых состоит пенициллинацилаза, тесно переплетены и формируют пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой в центре, на дне которой находится активный центр фермента.

В структуре ПА выделяют 3 участка связывания субстрата: участок связывания ацильной части субстрата, участок связывания карбоксильной группы (или ее аналога) и участок связывания бокового радикала. Из анализа структуры комплекса фермента с фенилуксусной кислотой, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри глубокой выемки в поверхности белковой глобулы, на дне которой находится гидрофобный "карман", образованный многочисленными ароматическими боковыми радикалами аминокислот. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого "кармана", а карбоксильная группа взаимодействует с серином р1. Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы И-концевого серина Р1 увеличивается за счет взаимодействия с собственной а-аминогруппой при участии молекулы воды.

Предложенный механизм катализа можно описать следующим образом. Атака атома О7 Ы-концевого серина по карбонильному атому углерода субстрата сопровождается передачей протона от гидроксильной группы на собственную □аминогруппу при участии мостиковой молекулы воды. При этом образуется оксианион, который затем предположительно стабилизируется путем взаимодействия с амидной группой РАбп241 и атомом азота полипептидного остова, принадлежащим рА1а69. Аминокислотные остатки рАзп241 и РА1а69 образуют оксианионный центр. Далее протон, акцептированный аминогруппой серина, передается по той же самой цепочке на уходящую группу, тетраэдрический атом углерода промежуточного комплекса вновь возвращает себе статус карбонильного и происходит завершение стадии ацилирования. Деацилирование протекает в общем случае в последовательности, зеркально симметричной той, что была описана выше. Предполагаемый механизм катализа схематично представлен ниже (рис. 2):

Asn241 n ончн

Seri о—н nh2 н'

Nv ßAla69 V

NH r2 h2n—r2 nu J

Seri r>H nh2 Ф to-h о X r" "nu „OH

Seri

Seri

-NH,

Рис. 2. Механизм катализа ПА из Е. coli.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Ямскова, Ольга Васильевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫ ВОДЫ

1. Показана возможность значительного улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы из Е. coli путём замены единичных аминокислотных остатков в структуре фермента.

2. Путем замены ßPhe71Leu и aArgl45Leu можно увеличить каталитическую активность и стереоселективность в реакциях ферментативного гидролиза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективность ацильного переноса и стереоселективность в реакциях ацилирования аминоспиртов.

3. Путем замены aArgl45Leu можно увеличить нуклеофильную реакционную способность аминов, аминоспиртов и эфиров аминокислот в реакциях ферментативного ацильного переноса.

4. Путем замены aSerl49Arg можно увеличить нуклеофильную реакционную способность 6-аминопенициллановой кислоты в реакции ферментативного синтеза ампициллина.

5. Путем введения глутамата в положении 149 альфа-цепи можно увеличивать стабильность пенициллинацилазы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ямскова, Ольга Васильевна, 2011 год

1. Sakaguchi К. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23, 411-414.

2. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29, 404-407.

3. Hamilton-Miller J.M.T. Penicillinacylase. Bacteriol. Rev. 1966, 30, 761-771.

4. Vandamme E.J. and Voets J.P. Microbial penicillin acylases. Adv. Appl. Microbiol. 1974, 17,311-369.

5. Huang H.T., Seto T.A. and Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 11, 1-6.

6. Mahajan P.B. Review. Penicillin acylases an update. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9, 537-554.

7. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз. Антибиотики мед. биотехнол. 1986, 31(10), 729-740.

8. Virden R. "Structure, processing and catalytic action of penicillin acylase". Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1990, 8, 189-218.

9. Verhaert R.M.D:,' Riemens A.M., van der Laan J.-M., van Duin J. and Quax W.J. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from A.faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63(9), 3412-3418.

10. Svedas, V., Guranda, D., van Langen, L., van Rantwijk, F. and Sheldon, R. (1997) Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 417, 414-418.

11. Verhaert, R.M.D., Riemens, A.M., van der Laan, J.-M., van Duin, J. and Quax, W.J. (1997) Molecular cloning and analysis of the gene encoding thethermostable penicillin G acylase from A.faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 63,3412-3418. 1

12. Galunsky B., Lummer K. and Kasche V. Comparative study of substrate-and stereospecificity of penicillin G amidases from different sources and hybrid isoenzymes. Monatsh. Chem. 2000, 131(6), 623-632

13. Guranda, D.T., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A. and Svedas, V.K. (2001) Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. 12, 1645-1650.

14. Oh S.-J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli. Gene. 1987, 56, 87-97

15. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., Buckel P. and Bock A. Penicillin acylase from E.coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acid. Res. 1986, 14, 57135727.

16. Rolinson G. N., Batchelor F. R., Butterworth D., Cameron-Wood J., Cole M., Eustace G. C., Hart M. V., Richards M., Chain E. B. Formation of 6-Aminopenicillanic Acid from Penicillin by Enzymatic Hydrolysis. Nature. 1960, 187:236-237

17. Claridge C. A., Gourevitch A., Lein J. Bacterial Penicillin Amidase. Nature. 1960, 187:237-238. ' '

18. Huang H.T., Seto T.A., Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. microbiol. 1963, 11:1-6.

19. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

20. Bomstein J., Evans W. G. Automated colorimetric determination of 6aminopenicillanic acid in fermentation media. Anal. Chem. 1965, 37:576-578.96

21. Ныс П.С., Савицкая Е.М., Колыгина Т.С. Метод определения активности пенициллинамидазы. Антибиотики. 1973, 18(3):270-273.99

22. Balasingham К., Warburton D., Dunnill P., Lilly M.D. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1972, 276(l):250-256.

23. Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Метод количественного определения активности пенициллинацилазы по образованию фенилуксусной кислоты. Антибиотики. 1976, 21(8):694-697.

24. Shaikh K.j TalatbP.G.v Gang'D.M.-Spectrophotometric method for the estimation of 6-aminopenicillanic acid. Antimicrob Agents Chemother. 1973, 3(2): 194-197.

25. Baker W. L. A note on the detection of penicillin acylase activity in Escherichia coli by the reaction ampicillin with biuret reagent. J. Appl. Bacteriol. 1980,49:225-229.

26. Baker W. L., Blake B. D. Estimation of penicillin concentrations and penicillin metabolizing enzyme activities by the Lowry reaction. The Journal of Antibiotics. 1980, Nov:1386-1387.

27. Baker W. L. Application of the fluorescamine reaction with 6-aminopenicillanic acid to estimation and detection of penicillin acylase activity. Antimicrobal Agents and Chemotherapy. 1983, Jan., 26-30.

28. Baker W. L., Lonergan G. T. Chemistry of some fluorescamine-amine derivatives with relevance to the biosynthesis of benzylpenicillin by fermentation. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002, 77:1283-1288.

29. Baker W. L. Modified fluorimetric assay for estimation ampicilloate concentration and its use for detecting p-lactamase and penicillin acylase activity in bacteria. Analyst. 1997, 122:447-453.

30. Ninkovic M., Riester D., Wirsching F., Dietrich R., Schwienhorst A. Fluorogenic assay for penicillin G acylase activity. Analytical Biochemistry. 2001, 292:228-233.

31. Cole M, Sutherland R. The role of penicillin acylase in the resistance of gram-negative bacteria to penicillins. J. Gen. Microbiol. 1966, 42(3):345-356

32. Oostendorp J.G. A quantitative microbiological determination of 6-aminopenicillanic acid. Antonie Van Leeuwenhoek. 1972, 38(2):201-206

33. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia'coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

34. Cole M. Formation of 6-aminopenicillanic acid, penicillins and penicillin acylase by various fungi. Appl. Microbiol. 1966,14(1):98-103.

35. Manni P.E., Lipper R.A., Blaha J.M., Hem S.L. Analysis of potassium penicillin G and ' its : degradation products" by thin-layer chromatography. J. Chromatogr. 1973, 76(2):512-515.

36. Vandamme E.J., Voets J.P. Separation and detection of degradation products of penicillins and cephalosporins by means of thin-layer chromatography. J. Chromatogr. 1972,71 (1):141-148.-.-.

37. Никольский Jl.M. Экпресс-метод определения фенилуксусной кислоты в культуральной жидкости при биосинтезе бензилпенициллина. Антибиотики. 1979, 24(12):893-895.

38. Точёная Н.Пг,---Чайковская С.М., Серова Л.И. Определение пенициллинацилазы и ацилазы методом хроматографии в тонком слое сорбента при их совместном образовании штаммами. Антибиотики. 1975, 20(3):239-243.

39. Pruess D.L., Johnson MJ. Enzymatic deacylation of S35-benzylpenicillin. J Bacteriol. 1965, 90:380-383.

40. Cole M. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Esherichia coli. Nature, 1964, 203(4944):519-520.

41. Березин И.В., Клёсов A.A., Швядас В.-Ю.К., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинамидазой. Антибиотики, 1974, 10:880-887.

42. Березин И.В., Клёсов А.А., Марголин A.JL, Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из Е. coli рН-зависимость константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6):519-523.

43. Plaskie A., Roets E.,-Vanderhaeghe Н. Substrate specificity of penicillin acylase of E. coli. J. Antibiot. (Tokyo). 1978, 31(8):783-788.

44. Simons H., Gibson T.D. Rapid continuous colorimetric enzyme assay for penicillin G acylase. Biotechnology Techniques. 1999, 13:365-367.

45. Findlater J;D., Orsi B.A-. Assay for the enzymic hydrolysis of penicillin and acylhydroxamates. Anal. Biochem. 1974, 58:294-300.

46. Walton R. Search for microorganisms producing cephalosporin С amidase. Dev. Ind. Microbiol. 1964, 5:349-353.

47. Kutzbach C, Rauenbusch Ei Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11 105. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1974 Jan;355(l):45-53

48. Ныс П.С., Колыгина T.C., Гараев M.M. Пенициллинамидаза из Е. coli. Прямой спектрофотометрический метод определения активности фермента. Антибиотики. 1977, 22(3):211-216.

49. Zhang Q., Zhang L., Han H., Zhang Y. A method for screening penicillin G scylase-producing bacteria by means of 2-nitro-5-phenylacetaminobenzoic acid. Anal. Biochem. 1986,156:413-416.

50. Szewczuk A., Siewinski M., Slowinska R. Colorimetric assay of penicillin amidase activity using phenylacetyl-aminobenzoic acid as substrate. Anal. Biochem. 1980,5:349-353.

51. Szewczuk A., Siewinski M., Slowinska R. Colorimetric assay of penicillin amidase activity using phenylacetyl-aminobenzoic acid as substrate. Anal. Biochem. 1980,103:166-169.

52. Kerr D.E. A colorimetric assay for penicillin-V amidase. Analytical Biochemistry. 1993,-209:332-334: •

53. Юшко М.И., Шамолина T.A., Гуранда Д.Ф., Синев А.В., Швядас В.К. Высокоспецифические субстраты для спектрофотометрического определения активности пенициллинацилазы, Биохимия 1998, 63(9): 1295-1300.

54. Марголин AJIv (1978) Кинетико-термодинамическое изучение ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, Москва.

55. Sakaguchi К. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23:411-414.

56. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29:404-407.

57. Hamilton-Miller J.M.T. Penicillin acylase. Bacteriol. Rev. 1966, 30:761-771.

58. Vandamme E.J. and Voets J.P. Microbial penicillin acylases. Adv. Appl. Microbiol. 1974, 17:311-369.

59. Huang H.T., Seto T.A. and Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 11:1-6.

60. Mahajan P.B. Review. Penicillin acylases an update. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9:537-554.

61. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз. Антибиотики мед. биотехнол. 1986, 31(10):729-740.

62. Virden R. Structure, processing and catalytic action of penicillin acylase. Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1990, 8:189-218.

63. Cole M. Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115:747-756.

64. Schumacher G., Sizmann D., Haung H., Buckel P., Böck A. Penicillin acylase from E. coli: unique gene protein relation. Nucleic Acid Research. 1986, 14(14):5713-5727

65. Alkema W.B.L., Dijkhuis A.-J., de Vries E., Janssen D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. 2002, 269:2093-2100.

66. Alkema W.B., Prins A.K., de Vries E., Janssen D.B., Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. 2002, 365(l):303-309.

67. Choi K.S., Kim J.A., Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J Bacterid. 1992, 174(19):6270-6276.

68. De Leon A., Garcia B., Barba de la Rosa A.P., Villasenor F., Estrada A., Löpez-Revilla R. Periplasmic penicillin G acylase activity in recombinant Escherichia coili cells permeabilized with organic solvent. Process Biochemistry. 2003, 39(3):301-305.

69. Hiersbach H., Kühne A., Tisher W., Weber M., Wedekind F., Plapp R. Improvement of the catalytic properties of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 43:679-684.

70. Forney L.J., Wong D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(10):2556-2560.

71. Chou C.P., Lin W.-J., Kuo B.-Y., Yu C.-C. Genetic strategies to enhance penicillin acylase production in Escherichia coli. Enzyme and Microbal Technology. 2007, 27:766-773.

72. Dvorak H.F., Heppel L.A. .Metallo-enzymes released from Escherichia coliby osmotic shock. II. Evidence that 5'-nucleotidase and cyclic phosphodiesterase arezinc metallo-enzymes. J. Biol. Chem. 1968, 243(10):2647-53.102

73. Kutzbach С., Rauenbusch E. Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1974, 355(l):45-53.7Я

74. Forney L., Wong D.C. L., Ferber D.M. Selection of amidases with novel substrate specificities from penicillin amidase mutants of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55:2550-2555.

75. Erarslan A., Terzi I., Güray A., Bermek E. Purification and kinetics of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1991, 51:27-40.

76. Van den Tweel W.J.J., Harder A., Buitelaar R.M. Stability and stabilization of enzymes. Proceedings of an international symposium held in Maastricht, The Netherlands, 22-25 November 1993, 398-405.

77. Karyekar S. K., Hegde M. V. Affinity purification of penicillin acylase on phenylacetic acid linked to INDION 48-R: effect of spacer variation. Biotechnology Techniques. 1989, 3(3):145-148.

78. Гуранда Д.Т., Воловик T.C., Швядас B.K. pH-Зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli. Биохимия. 2004, 69(12): 1700-1705. • .-

79. Szewczuk A., Kuropatwa М., Prusak Е., Wieczorek J. Two immunologically different penicillin amidases synthesized by Escherichia coli PCM 271. Archivum immonologiae ettherapiae experimentalis. 1984, 32:121-126.

80. Ht M ♦ I \ I * « ♦ ♦ 4 -»4 »\ '«

81. Fargues C., Chanel S., Grevillot G. An efficient three step preparative purification of penicillin acylase from Escherichia coli cells. Bioseparation. 1997, 6:343-351.

82. Rodrigues M., Güereca L., Valle F., Quintero R., Löpez-Munguia A. Penicillin acylase extraction by osmotic shock. Process Biochemistry. 1992, 27:217223.

83. Tiselius A., Hjerten S., Levin Ö. Protein chromatography on calcium phosphate columns. Arch. Biochem. Biophys. 1969, 65:132-155.

84. Mahajan P.B.-, BorkarP.B.'Novel'approaches to purification of penicillin acylase. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9:421-437.

85. Sudharan V.K., Shewale J.G. Hydrophobic interaction chromatography of penicillin amidase. Biotechnol. Let. 1987, 9(8):539-542.

86. Kasche V-Löffler F.-, Scholzen T., Krämer D.M., Boller T. Rapid protein purification using phenylbutylamine-Eupergit: a novel method for large-scale procedures. J. Chromatogr. 1990, 510:149-154.

87. Fonseca L.P., Cabral J.M.S. Evaluation of affinity and pseudo-affinity adsorption process-for-penicillin acylase-purification. Bioseparation. 1996, 6:293302.

88. Fonseca L. P., Cabral J. M. S. Optimization of pseudo-affinity process for penicillin acylase purification. Bioprocess Engineering. 1999, 20:513-524.li 1 . 11

89. Fonseca L.P., Cabral J.M.S. An integrated downstream processing strategy for the recovery and partial purification of penicillin acylase from crude media. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002, 77:1176-1185.

90. Santarelli X., Fitton V., Verdony N., Cassagne C. Preparation, evaluation and application of new pseudo-affinity chromatographic supports for penicillin acylase purification. Journal of Chromatography B, 2000. 739:63-72.

91. Kefili R., Ridvan S., Yavuz H. Synthesis and characterization of pseudo-affinity ligand for penicillin acylase purification. International Journal of Biological Macromolecules. 2006, 39:250-255.

92. Fitton V., Santarelli X. Evaluation of immobilized affinity metal chromatography for purification of penicillin acylase. Journal of Chromatography B. 2001,754:135-140. * ' """< v *.

93. Sanches J., Verdoni N., Fitton V., Santarelli X. Efficient two-step chromatograph purification of penicillin acylase from clarified Escherichia coli ultrasonic homogenate. Journal of Chromatography B. 2001, 753:45-50.

94. Marcos J.C., Fonseca L., Ramalho M.T., Cabral J.M.S. 10th Portuguese Congress of Biochemistry, 1996, Braga, Portugal, book of abstracts.

95. Gavasane M. R., Gaikar V. G. Aqueous two-phase affinity partitioning of penicillin acylase from E. coli in presence of PEG-derivatives. Enzyme and Microbial Technology. 2003. 32:665-675.

96. Banzal-Mutalic R., Gaikar V. G. Purification and concentration of alkaline phosphatase by selective permeabilization of Escherichia coli using reverse micellar solutions.Enzyme and Microbial Technology. 2003, 32:14-26.i лл ш

97. Cheng S., Wei D., Song Q. Extraction penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis in recombinant Escherichia coli with cetyl-trimethylammoniumbromide. Biochemical Engineering Journal. 2006, 32:56-60.

98. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes feacalis. Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. 2000.

99. Liu S., Song Q., Wei D., Zhang Y., Wang X. Preparation of optically pure tret-leucine by penicillin G acylase-catalyzed resolution. Preparative Biochemistry & Biotechnology 2006, 36:235-241.

100. Li D., Cheng S., Wei D., Ren Y., Zhang D. Production of enantiomerically pure (S)- р-phenylalanine and (R)- р-phenylalanine by penicillin G acylase from Escherichia coli in aqueous mediumJ Biotechnolv Lett. 2007, 29:1825-1830.

101. Guy A., Dumant A. and Sziraky P. Kinetic resolution of p-hydroxyphenyl acetamides by hydrolysis with pen-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3(6):1041-1044.

102. Basso A., Braiuca P., Clementi S., Ebert C. Computational analysis of the aminic subsite of PGA explains the influence of amine structure on enantioselectivity. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2002, 19-20:423430.

103. Lummer K., Rieks A., Galunsky B., Kasche V. pH dependence of penicillin amidase enantioselectivity for charged substrates. Biochimica et Biophysica Acta 1999,1433: 327-334.

104. Svedas, V. K., Margolin, A. L., Borisov, I. L., and Berezin, I. V., Kinetics of enzymatic synthesis of benzylpenicillin, Enzyme Microb. Technol., 1980, 2:313317.

105. Wu Q., Chen С.-Х., Du L.-L., Lin X.-F. Enzymatic synthesis of amoxicillin via a one-pot emzymatic hydrolysis and condensation cascade process in the presence of organic co-solvents. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 160(7):2026-2035.

106. Буханов A. JI. Катализируемый пенициллинацилазой синтез бета-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах. Канд. дис. Хим. ф-т. МГУ. М. 2005.

107. Lindsay J.P., Clark D.S., Dordik J.S. Combinatorial formulation of biocatalyst preparations for increased activity in organic solvents: salt activation of penicillin amidase. Biotechnology and bioengineering. 2004, 85(5):553-560.

108. Illanes A., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts, Appl Biochem Bioteclmol, 2009, 157:98-110.

109. Bernardino S.M.S.A., Fernandes P., Fonseca L.P. A new biocatalyst: penicillin G acylase immobilized in sol-gel micro-particles with magnetic properties. Biotechnol. J. 2009, 4:695-702.

110. Illanes A., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts. Appl biochem biotechnol, 2009, 157:98-110.

111. Bergeron L.M., Tokatlian T., Gomez L., Clark D.S. Redirecting the inactivation pathway of penicillin amidase and increasing amoxicillin production via a thermophilic molecular chaperone. Biotechnology and bioengineering, 2009, 102(2):417-424.

112. Bergeron L.M., Gomez L., Whitehead T.A., Clark D.S. Self-renaturing enzymes: design of an enzyme-chaperone chimera as a new approach to enzyme stabilization. Biotechnology and bioengineering, 2009, 102(5):1316-1322.

113. Oh B., Kim K., Park J., Yoon J., Han D., Kim Y. Modifying the substratespecificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-siteresidues. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 319(2):486-492. 1

114. Flores G., Soberon X. and Osuna J. Production of a fully functional, permuted single-chain penicillin G acylase. Protein Sci, 2004,13:1677-1683.

115. Forney L. J., Wong D. C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 1989, 55(10):2556-2560.

116. Roa A., Garcia J. L., Salto F., Cortes E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. 1994, 303:869-875

117. Svedas V., Guranda D., van Langen L., van Rantwijk F., Sheldon R. Kineticstudy of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 1997, 417:414-418.109

118. Гуранда Д.Т., Воловик Т.С., Швядас В.К. pH-зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli., Биохимия, 2004, 69(12):1700-1705.

119. Alkema W.B., Prins A.K., de Vries E., Janssen D.B., Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. 2002, 365(l):303-309.

120. Van der Laan J. M., Riemens A. M., Quax W. J. W09605318 Mutated penicillin G acylase genes, 22.02.1996.

121. You L., Usher J. J., White B. J., Novotny J. W09820120 Mutant penicilling acylases, 14.05.1998.

122. You L., Usher J. J., White B. J., Novotny J. US6403356 Mutant penicillin g acylases, 11-06-2002 •1.IO

123. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions. Factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann N Y Acad Sei. 1996, 799:659-69.

124. Шаповалова И. В. Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli. Канд. дис. хим. ф-т МГУ. М. 2007.

125. Химюк А. Я. Стереоселективное ацилирование аминосоединений в водной среде. Канд. дис. хим. ф-т МГУ. М. 2005.